Các týp gen caga, vaca và gen kháng levofloxacin của helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm loét dạ dày tại bệnh viện chợ rẫy từ tháng 10 2015 đến 05 2016

Việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán có thể giúp phát hiện được các chủng Helicobacter pylori có tiềm năng gây bệnh viêm loét và ung thư ở dạ dày thông qua các týp ge

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

PHẠM MINH TUẤN

BỆNH NHÂN VIÊM LOÉT DẠ DÀY TẠI BỆNH VIỆN CHỢ RẪY

TỪ THÁNG 10/2015 ĐẾN 05/2016

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH



PHẠM MINH TUẤN

BỆNH NHÂN VIÊM LOÉT DẠ DÀY TẠI BỆNH VIỆN CHỢ RẪY

TỪ THÁNG 10/2015 ĐẾN 05/2016

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Chuyên ngành: VI SINH Y HỌC

Mã số: 60 72 01 15

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS.BS CAO MINH NGA

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và

chưa từng được ai công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác.

Tác giả luận văn

Phạm Minh Tuấn

Ban Giám đốc và Trung tâm Đào tạo - Chỉ đạo tuyến bệnh viện Chợ Rẫy cùng toàn thể các bác sĩ đồng nghiệp, điều dưỡng và nhân viên tại Khoa Nội soi Tiêu hóa.

Ban Giám đốc và các nhân viên tại Trung tâm Đào tạo và Chẩn đoán Y Sinh học phân tử - Bệnh viện Đại học Y Dược Tp.HCM.

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS BS Cao Minh Nga, người đã dành nhiều thời gian quý giá, tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.

Tôi cũng xin cảm ơn những bệnh nhân đã giúp đỡ tôi có được

số liệu nghiên cứu luận văn này.

Tôi xin biết ơn đến những người thân trong gia đình, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Tp HCM, tháng 9 năm 2016

Phạm Minh Tuấn

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BV TƯQĐ 108 bệnh viện Trung ương Quân đội 108

CagA cytotoxin-associated gene A

D91G (Asp91Gly) đột biến codon 91, aspartic acid chuyển thành glycineD91N (Asp91Asn) đột biến codon 91, aspartic acid chuyển thành asparagineD91Y (Asp91Tyr) đột biến codon 91, aspartic acid chuyển thành tyrosine

DD-TT dạ dày - tá tràng

N87K (Asn87Lys) đột biến codon 87, asparagine chuyển thành lysine

NSAID non-steroidal anti-inflammatory drug

(thuốc kháng viêm không steroid)PPI proton pump inhibitor (thuốc ức chế bơm proton)

T87I (Thr87Ile) đột biến codon 87, threonine chuyển thành isoleucine

VacA vacuolating cytotoxin A

YSHPT Trung tâm Đào tạo và Chẩn đoán Y Sinh học phân tử

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm loét dạ dày là bệnh khá phổ biến ở Việt Nam và các nước trên thếgiới Bệnh tiến triển dai dẳng, gây ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng cuộc sống,đồng thời tiềm ẩn nguy cơ dẫn đến nhiều biến chứng đe dọa đến tính mạng củangười bệnh như: xuất huyết tiêu hóa, thủng dạ dày, ung thư dạ dày [10], [1], [41], [73]

.Bệnh nguyên của viêm loét dạ dày rất đa dạng Stress, thói quen sinhhoạt và ăn uống, tiền sử dùng thuốc… đã được chứng minh có liên quan đếncăn bệnh này Từ năm 1982, với phát hiện của John Robin Warren và BarryJames Marshall, cùng với rất nhiều công trình nghiên cứu gần đây về

Helicobacter pylori đã tác động rất lớn đến các quan điểm về nguyên nhân, cơ

chế bệnh sinh và phương thức điều trị bệnh viêm loét dạ dày hiện nay [10], [1], [76],

[11], [24], [65]

Ở vi khuẩn Helicobacter pylori, protein cagA và vacA đã được chứng minh là hai yếu tố độc lực chính của vi khuẩn Protein cagA do gen cagA (cytotoxin-associated gene A) mã hóa và protein VacA do gen vacA (vacuolating cytotoxin A) mã hóa Các chủng Helicobacter pylori mang các kiểu gene cagA và vacA khác nhau sẽ có tiềm năng gây bệnh khác nhau Trong

đó, chủng vi khuẩn mang tổ hợp gene cagA(+)

vacAs1m1 đã được nhiều nghiêncứu chứng minh có liên quan chặt chẽ với bệnh cảnh viêm loét dạ dày nặng vàung thư dạ dày [11], [65], [3], [8], [18], [19]

Việc điều trị tiệt trừ Helicobacter pylori cũng gặp rất nhiều khó khăn do

vi khuẩn đã dần kháng lại với các thuốc trong các phác đồ truyền thống Phác

đồ levofloxacin phối hợp với amoxicillin và thuốc ức chế bơm proton đã đượckhuyến cáo sử dụng trong những trường hợp thất bại với các phác đồ truyền

thống Tuy nhiên, phác đồ này sẽ trở nên kém hiệu quả khi Helicobacter pylori

đề kháng được với levofloxacin Trong vài năm gần đây, đã có nhiều báo cáocho thấy vi khuẩn đã đề kháng lại kháng sinh này với tỉ lệ khá cao [14], [36], [39],

[65], [45], [52], [59]

.

Có rất nhiều phương pháp chẩn đoán Helicobacter pylori được đề xuất.

Tuy nhiên, đa số chỉ cho biết có sự hiện diện của vi khuẩn này trong cơ thểngười bệnh, mà vẫn chưa thực sự cung cấp được đầy đủ dữ kiện để khẳng địnhchúng có thực sự là tác nhân gây nên bệnh cảnh viêm loét dạ dày của bệnhnhân hay không [24], [11], [58] Việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn

đoán có thể giúp phát hiện được các chủng Helicobacter pylori có tiềm năng gây bệnh viêm loét và ung thư ở dạ dày thông qua các týp gen cagA và vacA đặc trưng của Helicobacter pylori, đồng thời có thể giúp xác định được các

kiểu gen kháng levofloxacin của vi khuẩn này trong thời gian ngắn, với độnhạy và độ đặc hiệu cao, giúp ích rất nhiều cho công tác chữa lành bệnh viêmloét dạ dày và phòng ngừa biến chứng [19], [8], [3], [77], [52]

Bệnh viện Chợ Rẫy là một trong những bệnh viện thuộc tuyến cuối củacác tỉnh phía Nam, bệnh nhân đến khám bệnh tại khoa Tiêu hóa của bệnh viện

đa số ở xa, mang bệnh đã lâu và đã điều trị bệnh ở nhiều nơi không hiệu quả,nên tâm lý rất căng thẳng và lo lắng Để nhanh chóng tìm được chẩn đoán phùhợp, lập kế hoạch tư vấn và điều trị cho bệnh nhân, tập thể y bác sĩ ở đây phảithường xuyên cập nhật rất nhiều thông tin về dịch tễ lâm sàng của bệnh viêm

loét dạ dày, nhất là tỉ lệ phân bố của các chủng vi khuẩn Helicobacter pylori có

độc lực cao và vấn đề kháng thuốc kháng sinh của các vi khuẩn này Nghiêncứu xác định Các týp gen cagA, vacA và gen kháng levofloxacin của Helicobacter pylori ở các bệnh nhân viêm loét dạ dày tại bệnh viện Chợ Rẫy từ

tháng 10/2015 đến 5/2016 được thực hiện với mong muốn góp phần làm sáng

tỏ một số vấn đề về tỉ lệ phân bố của các chủng Helicobacter pylori mang tổ

hợp gen có độc lực cao, tình trạng kháng thuốc levofloxacin (kháng sinh chủlực của phác đồ cứu vãn hiện nay) của các vi khuẩn này và mối liên hệ với cácyếu tố tuổi, giới tính, vùng dịch tễ, chẩn đoán lâm sàng và hình ảnh nội soi dạdày của bệnh nhân

khám tại bệnh viện Chợ Rẫy trong thời gian từ tháng 10/2015 - 05/2016.

Mục tiêu chuyên biệt:

1 Xác định tỉ lệ phân bố các týp gen cagA, vacA và đột biến gen kháng levofloxacin của Helicobacter pylori trong các mẫu sinh thiết dạ dày có thử

nghiệm urease dương tính ở bệnh nhân bị viêm loét dạ dày

2 Khảo sát mối liên quan giữa nhóm tuổi, giới tính, vùng dịch tễ, chẩn đoánlâm sàng và hình ảnh nội soi của người bệnh với tỉ lệ phân bố các tổ hợp gen

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ - LÂM SÀNG CỦA VIÊM LOÉT DẠ DÀY 1.1.1 Định nghĩa

Viêm dạ dày (gastritis) là thuật ngữ dùng để chỉ tất cả những tổn

thương viêm ở niêm mạc dạ dày, thể hiện sự đáp ứng của niêm mạc dạ dày vớicác yếu tố tấn công [45]

Loét dạ dày (gastric ulcer) là hệ quả cuối cùng của quá trình viêm do

mất cân bằng giữa các yếu tố tấn công và các yếu tố bảo vệ niêm mạc dạ dày.Loét dạ dày được chẩn đoán khi tổn thương niêm mạc ≥ 5 mm với độ sâu đáng

kể phát hiện qua nội soi hay có bằng chứng mô học cho thấy tổn thương lanđến lớp dưới niêm mạc [30], [73], [45]

1.1.2 Đặc điểm dịch tễ - lâm sàng

Viêm loét dạ dày là một bệnh lý trong nhóm bệnh về viêm loét đườngtiêu hóa Bệnh có thể gặp ở mọi quốc gia và hầu hết ở các lứa tuổi, chiếmkhoảng 35% bệnh lý của đường tiêu hóa [10] Biểu hiện của bệnh rất đa dạng,khoảng 50% bệnh nhân có triệu chứng điển hình, 40 - 45% có triện chứng rất

mơ hồ và 5 - 10% hoàn toàn không có triệu chứng Nếu không được phát hiện

và chữa trị hợp lý, bệnh có thể đưa đến nhiều biến chứng nguy hiểm như xuấthuyết tiêu hóa (15 - 20%), thủng dạ dày (5 - 10%), hẹp môn vị (5 - 10%) và cóthể thoái hóa đưa đến ung thư dạ dày, nhất là trong những trường hợp viêm loét

dạ dày có Helicobacter pylori [10], [1], [73], [41], [72]

1.1.3 Chỉ định nội soi dạ dày

Nội soi dạ dày đã được giới thiệu từ năm 1881 bởi tác giả Johann vonMikulicz và các cộng sự Nhưng thực sự phải đến năm 1958, sự ra đời củanguồn sáng lạnh, kỹ thuật ghi hình hiện đại cùng với ống nội soi mềm có tích

hợp các kênh hút rửa, sinh thiết , chỉ định nội soi dần trở nên quen thuộc vàkhông thể thiếu trong chẩn đoán và điều trị nhiều bệnh lý của đường tiêu hóanói chung và dạ dày nói riêng [55]

Nội soi dạ dày là một phần của nội soi đường tiêu hóa trên, thườngđược chỉ định trong những trường hợp nghi ngờ các bệnh ở thực quản, dạ dày

và tá tràng, nghi ngờ có xuất huyết tiêu hóa trên, có dị vật ở thực quản, dạ dày Trong quá trình nội soi, có thể kết hợp sinh thiết mô để tiến hành thêm các xétnghiệm bổ sung cho chẩn đoán, cầm máu khi có xuất huyết tiêu hóa, cắt polyp,lấy dị vật khi cần thiết Ngoài ra, nội soi tiêu hóa trên còn giúp theo dõi và xử

lý những trường hợp dãn tĩnh mạch thực quản trên bệnh nhân xơ gan, truy tìmnguyên nhân ở người lớn tuổi sụt cân không rõ nguyên nhân

Cũng như những kỹ thuật xâm nhập khác, trước khi ra chỉ định nội soitiêu hóa trên, bệnh nhân cần phải được bác sĩ thăm khám cẩn thận để đảm bảorằng bệnh nhân không nằm trong nhóm chống chỉ định nội soi Các chống chỉđịnh nội soi tiêu hóa trên thường gặp là: các bệnh nhân rối loạn tâm thần, bệnhnhân không hợp tác, bệnh nhân bị hôn mê, động kinh, nhồi máu cơ tim, nghingờ thủng dạ dày hay tá tràng, bệnh nhân mới mổ dạ dày, tá tràng hay tụy trongkhoảng 2 tuần, hay bệnh nhân mới mổ vùng hầu họng (nguy cơ chảy máu) vàđặc biệt là những trường hợp bệnh nhân không đồng ý nội soi [55], [66], [65]

1.1.4 Phân loại theo hình ảnh tổn thương đại thể qua nội soi

Có nhiều cách phân loại, nhưng cách phân loại của Hội nghị tiêu hóaThế giới năm 1990 tại Sydney - Australia và có bổ sung năm 1994, được nhiềutác giả công nhận và sử dụng [55], [66], [65] Theo cách phân loại này, hình ảnh tổnthương viêm dạ dày trên nội soi được chia thành 7 dạng:

- Viêm dạ dày xung huyết (phù nề, ban đỏ hoặc giả mạc): niêm mạc kém nhẵnbóng, nhạt màu, có những vùng phù nề xung huyết

- Viêm dạ dày trợt phẳng (viêm sướt phẳng): niêm mạc có những vết trợt nhỏ,

có giả mạc bám ở rìa và có viền đỏ bao quanh hoặc không bao quanh, hoặctrợt nông chạy dài trên các nếp niêm mạc ở thân vị

- Viêm dạ dày trợt nổi (viêm sướt nhô cao): các cục viêm riêng biệt hoặc sátnhau nổi gồ trên niêm mạc, đỉnh hơi lõm và có thể trợt hoặc chấm xuấthuyết

- Viêm dạ dày xuất huyết: có xuất huyết dưới niêm mạc hoặc những đám xuấthuyết, máu tụ đen hoặc hơi rỉ máu

- Viêm dạ dày trào ngược dịch mật: niêm mạc xuất huyết đỏ rực, có dịch mậttrào qua lỗ môn vị hoặc cặn mật trong dạ dày

- Viêm dạ dày phì đại: nếp niêm mạc to, thô, dày, các nếp niêm mạc khôngxẹp khi bơm căng hơi

- Viêm teo niêm mạc dạ dày: niêm mạc mỏng, nhẵn, trắng nhạt, các nếp niêmmạc thưa thớt và nhìn rõ các mạch máu

1.1.5 Cơ chế bệnh sinh của viêm loét dạ dày

Cơ chế bệnh sinh của viêm loét dạ dày được đưa ra vào đầu thế kỷ XX.Theo đó, bệnh xảy ra là do sự gia tăng các yếu tố tấn công, gây phá hủy niêmmạc dạ dày (stress, thuốc kháng viêm non-steroid và steroid, rượu…) và suygiảm của các yếu tố bảo vệ niêm mạc dạ dày (giảm tưới máu niêm mạc dạ dày,thuốc lá, bệnh gan mạn tính…) [1], [10], [41], [76]

Năm 1979, nhà nghiên cứu bệnh học người Úc là John Robin Warrenquan sát thấy trong lớp niêm mạc của tiêu bản giải phẫu bệnh ở các bệnh nhân

bị viêm loét dạ dày - tá tràng thường có một loại vi khuẩn dạng xoắn khiến ôngnghi ngờ chúng có liên quan đến căn bệnh này Năm 1983, bác sĩ Vi sinh lâmsàng người Úc là Barry James Marshall đã thành công trong việc nuôi cấy phân

lập vi khuẩn này, lúc đầu Warren và Marshall đặt tên là Campylobacter pyloridis, sau đó đổi thành Campylobacter pylori Đến năm 1989, Goodwin và

các cộng sự nghiên cứu cấu trúc tế bào, tính chất sinh học và cấu trúc chuỗi

ARN ribosom 16s đã chứng minh vi khuẩn này khác hẳn các Campylobacter, nên sau đó đã đổi tên Campylobacter pylori thành Helicobacter pylori như

ngày nay [24], [57], [65], [11]

7Cho đến nay, đã phát hiện được hơn l5 loài khác nhau thuộc giống

Helicobacter, nhưng trong số này, chỉ có Helicobacter pylori được chứng

minh là gây bệnh ở người

1.2 HELICOBACTER PYLORI VÀ BỆNH VIÊM LOÉT DẠ DÀY

1.2.1 Đặc điểm hình thể

Helicobacter pylori là vi khuẩn Gram âm, có dạng hơi cong như hình

chữ S hay cánh chim hải âu, kích thước khoảng (0,3 - 1) x (1,5 - 5) µm, nhưngkhi nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo một thời gian dài chúng có

thể chuyển sang dạng hình cầu Trong môi trường lỏng, Helicobacter pylori rất

di động nhờ có từ 1 - 6 lông ở 1 đầu tế bào (hình 1.1 và 1.2) [11], [2], [24], [34], [53]

1.2.2 Nuôi cấy phân lập và định danh

Helicobacter pylori là vi khuẩn vi hiếu khí, có thể phát triển ở nhiệt độ

từ 300Cđến 400

C (tốt nhất là ở 370C), pH từ 5,5 đến 8,5

Việc nuôi cấy phân lập Helicobacter pylori gặp rất nhiều khó khăn do

vi khuẩn chết rất nhanh khi tiếp xúc với khí trời trong quá trình lấy mẫu, vận

chuyển mẫu và xử lý mẫu Môi trường nuôi cấy H pylori phải là môi trường

giàu dinh dưỡng, thường dùng thạch máu có thêm và một số yếu tố đặc biệt đểkích thích vi khuẩn tăng trưởng (vitamin, huyết thanh bào thai bê…) Ngoài ra,

để ức chế sự phát triển của các tạp khuẩn và vi nấm hoại sinh, cần phải chothêm vào môi trường một số loại kháng sinh như trimethoprim, nalidixic acid,vancomycin, amphotericin B… Khí trường để ủ vi khuẩn phải là khí trường vi

Hình 1.2 Mô hình Helicobacter pylori

ở độ phóng đại 10.000 lần (Nguồn Vi sinh Y học [2])

Hình 1.1 H pylori trên tiêu bản nhuộm

Gram ở độ phóng đại 1.000 lần (Nguồn Vi Khuẩn Y học [11]

)

được trong môi trường acid nhờ tổng hợp được men urease có hoạt tính rất

mạnh, đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt Helicobacter pylori với Campylobacter Ngoài ra, H pylori có khả năng tiết men catalase, oxidase,

phosphatase, nhưng không khử được nitrate và không phân giải được hippurate

Ở Việt Nam, nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn H pylori từ mẫu

sinh thiết dạ dày vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng Tuy nhiên, kết quả nuôi cấy

chẩn đoán nhiễm H pylori vẫn còn chưa cao so với các thử nghiệm khác, nuôi

cấy chỉ đạt độ nhạy từ 36,8% đến 68,7% [34], [24], [21], [72], [31]

1.2.3 Khả năng gây bệnh của Helicobacter pylori

Helicobacter pylori lây truyền chủ yếu là đường ăn uống (phân - miệng)

hoặc lây trực tiếp thông qua nước bọt (miệng - miệng) Ở những nơi có điềukiện vệ sinh kém, nước và thức ăn bị nhiễm là nguồn lây lan quan trọng ban

đầu Nhiễm H pylori là một trong những nhiễm khuẩn mạn tính thường gặp nhất ở người Tần suất nhiễm H pylori thay đổi tùy theo nhóm tuổi, tình trạng

kinh tế - xã hội và chủng tộc Theo thống kê cho thấy, có hơn 50% dân số trên

thế giới đã bị nhiễm H pylori, chủ yếu ở các nước đang phát triển với tần suất

nhiễm rất cao từ 50% đến 90% ở lứa tuổi trên 20, trẻ em có thể bị nhiễm ở độ

tuổi từ 2 đến 8 tuổi Việt Nam cũng thuộc vùng có tỷ lệ nhiễm H pylori cao,

khoảng trên 70% ở người lớn, tần suất này có thể tăng thêm 10% mỗi năm [2], [3],

[11], [56], [68], [53], [33]

Tỉ lệ nhiễm Helicobacter pylori trong viêm loét dạ dày đã được rất

nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước ghi nhận: 51.9% ở Brasil năm 2011(Laura Lúcia Cogo và các cộng sự [27]), 46,98% ở Hà Nội năm 2007 (Lê TrungThọ và các cộng sự [15]), 66,4% ở Hà Nội và 64,7% ở Tp.HCM năm 2010

9năm 2012 (Hồ Đăng Quý Dũng và các cộng sự [3]

), 59,3% ở Thái Bình năm

2013 (Lê Thanh Hải và các cộng sự [5])

Về cơ chế gây bệnh viêm loét dạ dày của Helicobacter pylori, đã có rất

nhiều giả thuyết được đưa ra Tuy nhiên, cơ chế gây bệnh được nhiều tác giả

nghiên cứu ủng hộ là: H pylori được tìm thấy ở phần sâu của lớp niêm mạc,

nơi tiếp xúc với bề mặt của tế bào biểu mô tuyến của dạ dày (nơi có pH = 7,4)

Tại đây, H pylori tiết protease làm giảm bớt pH acid của niêm mạc; tiết urease

để phân hủy urea tạo ra amoniac làm kiềm hóa môi trường Nhờ đó, H pylori

có thể sống và di động dễ dàng trong lớp màng nhày hay trên bề mặt tế bào

biểu mô dạ dày Helicobacter pylori xâm lấn vào bề mặt tế bào biểu mô, tiết

độc tố gây độc tế bào và lipopolysaccharide làm phá hủy lớp tế bào nhày, gâytổn thương viêm, loét và ung thư Ngoài ra, sự sản xuất ra NH3 bởi men ureasecũng góp phần tham gia trực tiếp vào các quá trình gây tổn thương tại niêmmạc dạ dày Các nghiên cứu cũng cho thấy, bình thường khi thức ăn vào đến dạdày, gastrin được tiết ra sẽ tác động trực tiếp lên tế bào thành của dạ dày làmtăng tiết acid Sau đó, cơ chế phản hồi qua trung gian ion H+

sẽ làm tắt sự kích

thích của gastrin H pylori sẽ can thiệp vào cơ chế phản hồi bình thường này,

làm cho gastrin tăng tiết bất thường Tình trạng tăng tiết gastrin bất thường kéodài sẽ gây viêm loét và chuyển sản mô dạ dày [2], [53], [11], [34], [24]

Năm 1993, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã công nhận H pylori là nhân tố

hàng đầu gây ung thư biểu mô dạ dày Ngoài ra, các công trình nghiên cứu củaChao Hung Kuo và các cộng sự, Yasunori Sawayama và các cộng sự, JamshidVafaeimanesh và các cộng sự, Laura Llorca Otero và các cộng sự… cũng đã

chứng minh H pylori còn có mối liên quan rất chặt chẽ với các bệnh hệ thống,

bệnh tim mạch, và nhiều căn bệnh về da [43], [64], [71], [58], [31]

Khả năng gây bệnh của H pylori đã được chứng minh có liên quan mật thiết đến một số yếu tố độc lực của chúng Hai độc tố của H pylori được đề cập nhiều nhất là protein cagA do gen cagA (cytotoxin-associated gene A) mã hóa

Protein cagA có trọng lượng phân tử khoảng 120 - 140 kDa, có tính

sinh miễn dịch cao Phân tử protein cagA được Helicobacter pylori bài xuất

trực tiếp vào bên trong tế bào biểu mô dạ dày thông qua cơ chế bài xuất protein

loại IV (type IV secretion system) Khi vào bên trong tế bào, protein cagA sẽ

được phosphoryl hóa, sau đó tạo nên một loạt các tác động với một số thànhphần bên trong tế bào biểu mô dạ dày, dẫn đến làm tăng khả năng tăng sinh vàbiến đổi hình thái của tế bào biểu mô dạ dày, gây nên sự chuyển dạng của các

tế bào Dựa trên đặc điểm mô-típ (motif) EPIYA (Glu - Pro - Ile - Tyr - Ala)

thuộc đầu carboxyl tận (- COOH) của phân tử protein cagA (hay thuộc phía đầu

3′ của gen cagA), phân tử protein cagA có thể được chia làm hai loại chính: Tây Âu (Western cagA) và Đông Á (East Asian cagA) Trong đó, protein cagA

loại Đông Á có khả năng gây viêm dạ dày mạn tính dai dẳng với độ hoạt độngcao hơn, mức độ viêm teo nhiều hơn, có khả năng làm biến thể tế bào và nguy

cơ ung thư dạ dày cao hơn so với protein cagA loại Tây Âu Theo nghiên cứu

của tác giả Võ Thị Chi Mai và các cộng sự, protein cagA của H pylori ở bệnh

nhân tại thành phố Hồ Chí Minh chủ yếu thuộc loại Đông Á [9], [28], [46]

Protein cagA do gen cagA, kích thước khoảng 349 bp, nằm trên vùng cagPAI (pathogenicity island) mã hóa Gen cagA chỉ hiện diện 50 - 60% ở các chủng H pylori thuộc các nước phương Tây và Bắc Mỹ Tuy nhiên, ở khu vực Đông Á và Đông Nam Á, gần như toàn bộ các chủng H pylori đều mang gen cagA Nguồn gốc gen cagA và vùng cagPAI hiện nay vẫn chưa được biết rõ,

các nhà khoa học vẫn đang nỗ lực chứng minh cho giả thuyết: vùng cagPAI và

gen cagA đã thâm nhập vào bộ gen của H pylori theo một cơ chế lây nhiễm

ngang từ một loài vi khuẩn Gram âm Cho đến nay, đã có rất nhiều kết quả các

nghiên cứu trên thế giới và trong nước cho thấy, dòng vi khuẩn H pylori có

kiểu gen cagA(+) có liên quan chặt chẽ với viêm dạ dày thể nặng, viêm teo dạdày, loét dạ dày và ung thư dạ dày [29], [46], [70]

1.2.3.2 Protein vacA

Protein vacA có trọng lượng phân tử khoảng 95 kDa, là độc tố gây độc

tế bào, kích thích tạo không bào trong tế bào biểu mô, tạo các lổ trống trênmàng tế bào, phá hủy hoạt động ẩm bào và lysosome, kích thích sự chết theo

chương trình của tế bào (apoptosis).

Protein vacA do gen vacA, kích thước khoảng 3864 bp mã hóa Sự hiện diện của gen vacA được tìm thấy ở hầu hết tất cả các chủng H pylori Độc lực của protein vacA thay đổi rất đáng kể giữa các chủng H pylori khác nhau, sự thay đổi này chủ yếu do sự khác biệt về cấu trúc của gene vacA tại vùng tín

hiệu s (s1 và s2) và m (m1 và m2) Dựa trên các vùng tín hiệu s và m, có 3 kiểu

gen vacA chính thường gặp là vacAs1m1, vacAs1m2 và vacAs2m2 Trong đó, chủng

H pylori mang kiểu gen vacAs1m1 có độc lực cao nhất; kiểu gen vacAs2m2 không

có khả năng tạo độc tố Ngoài ra, tác giả Rhead và các cộng sự cũng ghi nhận

thêm một vùng tín hiệu quan trọng trên gene vacA, được đặt tên là vùng i (intermediate region), vùng này nằm giữa vùng s và vùng m Vùng i có 2 trạng thái biểu hiện: i1 (có hoạt động gây không bào) và i2 (không có hoạt động gây

không bào) [29], [46], [70]

1.2.3.3 Các nghiên cứu gần đây về gen cagA và vacA

- Tác giả Sushil Kumar và các cộng sự (2008) [42] nghiên cứu trên 46 mẫu sinh

thiết dạ dày có nhiễm H pylori từ những bệnh nhân bị viêm loét dạ dày tại Varanasi - Ấn Độ, kết quả cho thấy: cagA(+) chiếm tỉ lệ 70,0% VacAs1 chiếm

tỉ lệ 100% (không tìm thấy vacAs2

); vacAm1 (80,0%) và vacAm2 (20,0%) Kiểu

tổ hợp gen cagA(+)

vacAs1m1 chiếm tỉ lệ 60,0%; cagA(-)vacAs1m1 (20,0%);

cagA(+)vacAs1m2 (10,0%) và cagA(-)vacAs1m2 (10,0%)

- Tác giả Mahsa Molaei và các cộng sự (2010) [47] nghiên cứu trên 166 mẫusinh thiết dạ dày từ những bệnh nhân bị viêm dạ dày mạn tại bệnh viện Đại

học Tehran - Iran, kết quả cho thấy: cagA(+) chiếm tỉ lệ 76,7% VacAs1 chiếm

tỉ lệ 70,5%; vacAs2

(29,5%); vacAm1 (37,2%) và vacAm2 (62,8%) Kiểu gen

vacAs1 có liên quan nhiều đến tình trạng viêm dạ dày nặng

- Tác giả Laura Lúcia Cogo và các cộng sự (2011) [27] nghiên cứu trên 39

chủng H pylori phân lập từ những bệnh nhân bị viêm loét dạ dày tại bệnh viện Paraná - Brasil, kết quả cho thấy: cagA(+)

chiếm tỉ lệ 92,0% VacAs1chiếm tỉ lệ 59,0%; vacAs2

(41,0%); vacAm1 (54,0%) và vacAm2 (46,0%)

- Tác giả Norma Urtiz Estrada và các cộng sự (2013) [32] nghiên cứu trên 135mẫu sinh thiết dạ dày từ những bệnh nhân bị đau dạ dày tại bệnh viện Đa

khoa khu vực I - Durango - Mexico, kết quả cho thấy: cagA(+) chiếm tỉ lệ

49,6% Kiểu tổ hợp gen cagA(+)vacAs1m1 chiếm tỉ lệ 31,8%; cagA(+)

vacAs1m2(2,2%); cagA(+)vacAs2m2 (13,3%) Tổ hợp gen cagA(+)vacAs1m1 có mối liênquan đến viêm dạ dày mạn và chuyển sản ruột

- Tác giả Ines Pinto-Ribeiro và các cộng sự (2016) [60] nghiên cứu trên 234

mẫu sinh thiết dạ dày có nhiễm H pylori từ những bệnh nhân bị viêm loét dạ

dày tại bệnh viện Trung tâm Conde de São Januário - Macau, Trung Quốc,

kết quả cho thấy: cagA(+)

chiếm tỉ lệ 88,9% VacAs1 chiếm tỉ lệ 91,7%; vacAs2(8,3%); không phân biệt được vacAs1/s2 (2,1%); vacAm1 (53,7%) và vacAm2

(46,3%)

- Tác giả Trần Thiện Trung và các cộng sự (2011) [19]

nghiên cứu bệnh chứngvới 71 mẫu sinh thiết từ bệnh nhân được chẩn đoán ung thư dạ dày và 91

mẫu sinh thiết từ bệnh nhân viêm dạ dày (nhóm chứng) có nhiễm H pylori

tại Bệnh viện trường Đại học Y Dược Tp.HCM, kết quả cho thấy:

 Nhóm UTDD: cagA(+) chiếm tỉ lệ 100% VacAs1 chiếm tỉ lệ 100%; vacAm1(63,8%) và vacAm2 (49,4%)

 Nhóm chứng (VDD): cagA(+)

chiếm tỉ lệ 92,3% VacAs1 chiếm tỉ lệ 96,7%;

vacAs2 (3,3%), chỉ gặp ở nhóm VDD; vacAm1 (40,7%) và vacAm2 (59,3%)

 Chủng H pylori có kiểu gen cagA(+)

vacAs1m1 có liên quan với UTDD

- Tác giả Nguyễn Lâm Tùng và các cộng sự (2010) [56] nghiên cứu trên 100

chủng vi khuẩn H pylori phân lập từ bệnh nhân viêm loét dạ dày tại Hà Nội

(53 chủng) và Tp.HCM (47 chủng), kết quả cho thấy:

 Không tìm thấy chủng H pylori có kiểu gen vacAs2 và vacAm1m2

 Kiểu tổ hợp gen cagA(+)

vacAm1 làm tăng nguy cơ viêm loét dạ dày với(OR= 4.2; 95% CI=1.5 - 11.3, p = 0.005)

- Tác giả Hồ Đăng Quý Dũng và các cộng sự (2012) [3] nghiên cứu trên 103

chủng vi khuẩn H pylori phân lập từ bệnh nhân viêm loét dạ dày tại bệnh

viện TƯQĐ 108 - Hà Nội (54 chủng) và bệnh viện Chợ Rẫy - Tp.HCM (49chủng), kết quả cho thấy:

- Tác giả Lê Quý Hưng và các cộng sự (2013) [8]

nghiên cứu bệnh chứng với

32 chủng H pylori phân lập từ 58 bệnh nhân được chẩn đoán ung thư dạ dày

và 52 chủng H pylori phân lập từ 116 bệnh nhân viêm dạ dày (nhóm chứng)

tại bệnh viện trường Đại học Y Dược Huế và bệnh viện Trung ương Huế, kếtquả cho thấy:

 Nhóm UTDD: vacAs1 chiếm tỉ lệ 100% (không tìm thấy vacAs2

); vacAm1(34,4%); vacAm2 (50%) và vacAm1m2 (15,6%) VacAs1m1 chiếm tỉ lệ 34,4%;

vacAs1m2 (50,0%) và vacAs1m1m2 (15,6%) Kiểu tổ hợp cagA(+)vacAs1m1 chiếm

vacAs1m2 (51,9%) và vacAs1m1m2 (5,8%) Kiểu tổ hợp cag A(+)vac As1m1 chiếm tỉ

lệ 11,5%; cag A(-)vac As1m1 ( 30,8%); cagA(+)vac As1m2 ( 26,9%); cagA(-)vacAs1m2(25,0%) và cagA(+)vacAs1m1m2 (5,8%)

 Người nhiễm H pylori có kiểu gene cagA(+)

vacAs1m1 có nguy cơ UTDD gấp

7,1 lần so với nhiễm H pylori có kiểu gene cagA(-)

vacAs1m1, (OR =7,1; 95%CI: 1,4 - 36,1)

 Sự khác biệt về nguy cơ UTDD ở người nhiễm H.pylori kiểu gen cagA(+)vacAs1m2 và người nhiễm H pylori có cagA(-)vacAs1m2 không có ýnghĩa thống kê

- Tác giả Trần Thiện Trung và các cộng sự (2013) [18] nghiên cứu trên 258bệnh nhân viêm dạ dày tại BV ĐHYD Tp.HCM, kết quả cho thấy:

 Tỉ lệ nhiễm H pylori là 66,7%.

 Trong số 172 mẫu sinh thiết ở bệnh nhân viêm dạ dày có nhiễm H pylori: cagA(+) chiếm tỉ lệ 91,3% VacAs1 chiếm tỉ lệ 93,6%; vacAs2 (1,2%); vacAs1s2(0,6%); không xác định được vacAs1/s2 (4,6%); vacAm1 (37,2%); vacAm2(48,3%); vacAm1m2 (9,9%); 4,6% không xác định được vacAm1 và vacAm2

Kiểu tổ hợp cagA(+)

vacAs1m1 chiếm tỉ lệ 41,8%; cagA(+)

vacAs1m2 (46,8%);

cagA(-)vacAs1m2 (8,5%)

1.2.3.4 Các yếu tố độc lực khác của Helicobacter pylori

Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Helicobacter pylori còn phụ thuộc vào

nhiều yếu tố khác như: nhờ có cấu trúc hình xoắn và các lông ở một đầu tế bào,

men urease giúp H pylori phân hủy urea trong dạ dày thành amoniac, gây kiềm

hoá môi trường xung quanh, giúp chúng tránh được sự tấn công của acid và

pepsin trong dịch vị Ngoài ra, các protein màng ngoài của H pylori như OipA,

BabA và AlpAB cũng được xem là yếu tố độc lực của vi khuẩn [34], [11], [65], [24]

Hình 1.3 Các yếu tố độc lực của Helicobacter pylori

(nguồn: http://commons.wikimedia.org)

1.2.4 Chẩn đoán Helicobacter pylori

Hiện nay, có khá nhiều phương pháp chẩn đoán H pylori được giới

thiệu, mỗi phương pháp đều có những ưu và nhược điểm khác nhau, có thể chiathành hai nhóm:

1.2.4.1 Các thử nghiệm ít xâm lấn

Các thử nghiệm này đều được thực hiện trên mẫu sinh thiết dạ dày

- Thử nghiệm urease: nguyên tắc của thử nghiệm là nhằm phát hiện men

urease của H pylori, độ nhạy 85 - 90% và độ đặc hiệu 95 - 98% tùy theo loại

test thời gian đọc kết quả trong vòng 4 giờ [34], [25], [21], [72], [31]

- Nuôi cấy vi khuẩn: được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán nhiễm vi

khuẩn H pylori và có thể kết hợp làm kháng sinh đồ Tuy nhiên, thời gian

cho kết quả khá lâu (khoảng 5 - 10 ngày), độ nhạy phụ thuộc rất lớn vào kỹthuật của người làm xét nghiệm và điều kiện của phòng xét nghiệm, giá

thành còn khá cao Ở Việt Nam, việc ứng dụng nuôi cấy để chẩn đoán nhiễm

H pylori còn chưa phổ biến so với các thử nghiệm khác, nuôi cấy chỉ đạt độ

nhạy từ 36,8% đến 68,7% [34], [24], [21], [72],[31]

- Xác định acid nhân của vi khuẩn (ADN): các kỹ thuật sinh học phân tử

hiện nay (PCR, multiplex PCR, real-time multiplex PCR, sequencing…)

không chỉ cho phép phát hiện sự hiện diện của Helicobacter pylori, mà còn

có thể xác định được chủng H pylori này có mang các tổ hợp gen độc cagA

và vacA hay không, có các đột biến gen kháng thuốc kháng sinh thường

dùng hay không; đồng thời còn có thể giúp lựa chọn và tính liều thuốc ứcchế bơm proton (PPI) thích hợp với từng người bệnh thông qua việc xác định

các týp gen CYP2C19 của bệnh nhân… với độ nhạy 80 - 97% và độ đặc hiệu

83 - 100%, cho kết quả nhanh trong vòng vài giờ Tuy nhiên, kỹ thuật nàyvẫn còn vài hạn chế là phải sinh thiết dạ dày, không phân biệt được vi khuẩnsống hay đã chết và giá thành còn khá cao [4], [54], [21], [72], [31], [17], [18]

- Chẩn đoán mô bệnh học: có thể giúp phát hiện sự hiện diện của H pylori

trong mẫu sinh thiết, đồng thời còn cho biết tình trạng tổn thương mô họccủa dạ dày Tuy nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu phụ thuộc rất lớn vào ngườithực hiện và đọc kết quả giải phẫu bệnh [31], [34], [41], [21]

1.2.4.2 Các thử nghiệm không xâm lấn

- Nghiệm pháp thở C 13 hoặc C 14 : giúp phát hiện hoạt tính men urease của vi

khuẩn H pylori, thử nghiệm này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, không xâm

hại Tuy nhiên, giá thành cao và tiềm ẩn nguy cơ nhiễm phóng xạ nếu dùng

C14[10], [21], [41],[37], [31]

- Chẩn đoán huyết thanh: giúp tìm các kháng thể IgM, IgG và IgA chống

lại H Pylori trong huyết thanh của bệnh nhân Có nhiều kỹ thuật khác nhau

như ELISA, immunoblot, test nhanh bằng huyết thanh… cho kết quả với độnhạy và độ đặc hiệu khác nhau tùy bộ kit sử dụng Ưu điểm của các phươngpháp chẩn đoán huyết thanh là không xâm lấn, ít tốn kém và thích hợp cho

theo dõi điều trị tiệt trừ H pylori, độ nhạy và độ đặc hiệu không cao, không

đánh giá được mức độ tổn thương của dạ dày [21], [37], [72], [37]

- Các kỹ thuật không xâm lấn khác: tìm kháng thể kháng H pylori trong

nước tiểu, dùng PCR tìm H pylori trong phân, nước bọt, mảng bám răng, phát hiện kháng nguyên H pylori trong phân HpSA…cũng đang dần được

hoàn thiện và đưa vào ứng dụng [21], [37], [72], [37], [31]

1.2.5 Điều trị tiệt trừ H pylori

Do việc nuôi cấy phân lập H pylori và làm kháng sinh đồ còn gặp

nhiều khó khăn và tốn kém, độ nhạy chưa cao, mất nhiều thời gian [13]… Cho

nên, hiện nay việc điều trị tiệt trừ H pylori chủ yếu vẫn là phối hợp các thuốc kháng sinh, thuốc ức chế bơm proton (proton pump inhibitors - PPI), thuốc

kháng thụ thể H2… theo các phác đồ: [20], [59], [35], [21], [31], [14], [7], [12], [74], [22], [48]

1.2.5.1 Phác đồ bộ ba kinh điển

Phối hợp thuốc ức chế bơm proton với 2 thuốc kháng sinh, điều trị thờigian 7 ngày hoặc 14 ngày, thường dùng các kiểu phối hợp sau:

PPI + amoxicillin + clarithromycin (PAC)

Rabeprazole + amoxicillin + clarithromycin (RAC)

Esomeprazole + amoxicillin + clarithromycin (EAC)

1.2.5.2 Phác đồ 4 thuốc

PPI + bismuth + metronidazole + tetracycline (PPI + BMT)

1.2.5.3 Phác đồ cứu vãn (salvage therapy)

Được đề xuất tại hội nghị đồng thuận Maastricht III (2005) [49] và đượcđưa ra thảo luận rất nhiều tại hội nghị đồng thuận Maastricht IV (2010) [50]

.Đây là phác đồ điều trị với các kháng sinh mới như levofloxacin, rifabutin,furazolidone… thay thế cho metronidazole và clarithromycin trong các phác đồkinh điển một khi các kháng sinh này bị đề kháng Do rifabutin là kháng sinh

có thể kháng chọn lọc với Mycobacteria; Furazolidone có nhiều tác dụng phụ,

cho nên levofloxacin thường được dùng hơn Như vậy, phác đồ cứu vãn sẽ gồmthuốc PPI và amoxicillin phối hợp với levofloxacin dùng trong 10 ngày và hiệu

quả của phác đồ này sẽ trở nên vô hiệu hóa khi vi khuẩn H pylori kháng với

levofloxacin Do đó, chỉ nên sử dụng cho những trường hợp chọn lọc, khi cácphác đồ điều trị chuẩn không tiệt trừ được vi khuẩn Kiểu phối hợp thuốcthường dùng của các bác sĩ ở Việt Nam là esomeprazole + amoxicillin vàlevofloxacin (EAL) [20] Tuy nhiên, gần đây đã có rất nhiều báo cáo cho thấy vi

khuẩn H pylori đã bắt đầu đề kháng lại levofloxacin trên lâm sàng với tỉ lệ khá

cao, nhất là ở những nước có mức tiêu thụ lớn loại kháng sinh này [50]

- Tác giả John J Carothers và các cộng sự (2007) [26], nghiên cứu trên 125bệnh nhân tại Alaska Native Medical Center (Mỹ) cho thấy, tỉ lệ kháng

levofloxacin chung của H pylori là 8,8% Các tác giả cũng ghi nhận, tỉ lệ kháng levofloxacin chung của H pylori ở Jamaica là 17%, Hàn Quốc 21,5%

và Ý là 31%

- Tác giả Vincenzo De Francesco và các cộng sự (2010) [35], tổng hợp kết quả

từ 31 nghiên cứu (gồm 17 nghiên cứu ở châu Âu, 10 ở châu Á, 2 ở châu Phi

và 2 ở châu Mỹ) hội đủ các tiêu chí thu nhận, báo cáo số liệu của bệnh nhânđược thu nhận từ năm 1993 đến 2009 Kết quả cho thấy, tỉ lệ kháng

levofloxacin chung của H pylori ở Châu Âu (24,1%), Châu Á (11,6%) và

Châu Phi (0%) Đặc biệt ở Ý là 28,4% và nhóm tuổi trên 45 kháng thuốcnhiều hơn nhóm trẻ (p < 0,05; OR: 1,8; 95% CI: 1,2 - 3,9)

- Tác giả Trần Thiện Trung và các cộng sự (2014) [16], khảo sát trên 57 mẫu

sinh thiết ở bệnh nhân viêm dạ dày có nhiễm H pylori, tỉ lệ kháng levofloxacin chung của H pylori ở BV ĐHYD Tp HCM (54,8%).

- Theo tác giả Phan Trung Nam và các cộng sự (2015) [62], tỉ lệ kháng

levofloxacin chung của H pylori ở Việt Nam gia tăng đáng kể từ 18,4% vào

năm 2008 lên đến 41.3% (nguyên phát 35,6%; thứ phát 63,2%) năm 2014.Các tác giả cho rằng, levofloxacin không nên được xem là thuốc thay thế

trong điều trị tiệt trừ H pylori ở Việt Nam.

Fluoroquinolones cho hoạt tính kháng khuẩn bằng cách ức chế các chức

19của ADN, tham gia vào sự sao chép ADN, tái tổ hợp và phiên mã Các enzymeADN gyrase là một tetramer gồm hai tiểu đơn A và hai tiểu đơn vị B, được mã

hóa bởi các gen gyrA và gyrB Trong đó, tiểu đơn vị A của ADN gyrase giữ vai

trò chính trong sự phân tách và tái kết hợp trở lại của các sợi đơn ADN, đâycũng là đích tác động của các fluoroquinolone [51]

Các đột biến điểm xãy ra

trên vùng xác định đề kháng các quinolone (quinolones resistance determining region - QRDR) của gen gyrA ngăn cản sự gắn kết giữa các kháng sinh và

enzyme ADN gyrase, giúp vi khuẩn kháng lại các kháng sinh này Các đột biến

điểm trên vùng QRDR của gen gyrA chủ yếu xãy ra tại các bộ ba mã hóa (codon) 87 (làm cho acid amin asparagine - Asn chuyển thành lysine - Lys hay

tyrosine - Tyr) và codon 91 (làm cho acid amin aspartic - Asp chuyển thànhglycine - Gly, asparagine - Asn hay tyrosine - Tyr) [51], [67], [54], [36] Rimbara vàcác cộng sự (2012) [63] cũng ghi nhận, đột biến ở vị trí 463 trên gen gyrB cũng

có thể giúp H pylori đề kháng lại fluoroquinolone với tỉ lệ khoảng 4,4%.

Theo Toshihiro Nishizawa và các cộng sự (2014) [54], để phát hiện các

đột biến điểm trên gen gyrA, năm 2004 Glocker và Kist đã đề xuất phương

pháp fluorescence resonance energy transferased quantitative PCR, năm 2007Nishizawa và các cộng sự cũng giới thiệu phương pháp allele-specific PCR…Tuy nhiên, các phương pháp này cũng bộc lộ nhiệu hạn chế về kỹ thuật cũngnhư độ nhạy và độ đặc hiệu Gần đây, ứng dụng của phương pháp giải trình tự

gen (sequencing) để phát hiện các đột biến điểm trên gen gyrA được nhiều tác

giả ủng hộ

- Tác giả Hideyuki Miyachi và cộng sự (2006) [52] thực hiện E-test trên 507

chủng H pylori phân lập được từ các mẫu sinh thiết dạ dày của các bệnh

nhân đến khám tại bệnh viện Đại học Kobe (Nhật Bản), kết quả cho thấy tỉ lệkháng thuốc levofloxacin là 15% (76/507) Các tác giả tiến hành chọn 68chủng kháng levofloxacin và 50 chủng nhạy với kháng sinh này để giải trình

tự gen gyrA và gyrB tìm đột biến kháng levofloxacin, kết quả cho thấy:

Ở 68 chủng kháng levofloxacin, có 83,8% đột biến điểm xảy ra ở các codon

Asn-87 và Asp-91của gen gyrA; MIC của các chủng H pylori đột biến ở codon Asn-87 cao hơn codon Asp-91 Có 4% đột biến xảy ra trên gen gyrB.

Ở 50 chủng còn nhạy với levofloxacin, kết quả giải trình tự cũng cho thấy có

14% đột biến trên gen gyrA.

- Tác giả Magali Garcia và các cộng sự (2012) [38] khảo sát sự phân bố của đột

biến ở gen gyrA trên 97 chủng H pylori kháng fluoroquinolone phân lập ở

Pháp, kết quả cho thấy tỉ lệ như sau: N87K = 33,0%; T87I = 23,7%; D91N =30,9%; D91G = 7,2% và D91Y = 6,2%

- Tác giả Jung W Lee và các cộng sự (2011) [44] nghiên cứu trên 73 chủng

Helicobacter pylori phân lập từ những bệnh nhân viêm loét dạ dày tại bệnh

viện Bundang Đại học Quốc gia Seoul - Hàn Quốc, kết quả cho thấy:

 Tỉ lệ đột biến điểm trên vùng QRDR của gen gyrA là 75,3% (55/73) Trong

đó, đột biến kiểu ASN-87 chiếm tỉ lệ 33,7% và kiểu ASP-91 là 36,0%

 Tỉ lệ đột biến trên gen GyrB chiếm tỉ lệ 2,7%.

- Tác giả Alba A Trespalacios-Rangél và các cộng sự (2016) [69] khảo sát sự

phân bố của đột biến điểm ở gen gyrA trên 80 chủng Helicobacter pylori

kháng levofloxacin phân lập ở Bogotá- Colombia, kết quả cho thấy tỉ lệ cácdạng đột biến như sau:

 Các kiểu đột biến N87K chiếm tỉ lệ 11,3%; N87I = 43,8%; N87Y = 1,3%;D91G = 28,8%; D91N = 5,0% và D91Y = 1,3%

 Đồng thời 2 đột biến N87Y/D91N = 1,3%; N87I/D91G = 1,3%

 Không tìm thấy đột biến trên gen gyrA = 5%.

- Tác giả Trần Thiện Trung và các cộng sự (2014) [16] tiến hành giải trình tự

gen theo phương pháp sanger cải tiến vùng QRDR của gen gyrA ở 31 chủng

H pylori thu được ở BV ĐHYD Tp.HCM, kết quả cho thấy tỉ lệ phân phối

các dạng đột biến như sau:

 Tỉ lệ có đột biến trên vùng QRDR của gen gyrA là 54,8% Trong đó các kiểu

đột biến D86N chiếm tỉ lệ 5,9%; N87K = 35,3%; T87I = 11,8%; A88V =17,6%; D91G = 29,4%; D91N = 17,6% và D91Y = 5,9%

 Đồng thời 2 đột biến N87K/D91N, D86N/A88V hoặc A88V/D91G = 23,5%

- Tác giả Phan Trung Nam và các cộng sự (2014) [61] tiến hành giải trình tự

gen gyrA ở 35 chủng H pylori phân lập được ở BV Đại học Y Huế, kết quả

thu được như sau:

 Tỉ lệ đột biến trên gen gyrA là 85,7% Các kiểu đột biến Asn-87 (N87) chiếm

tỉ lệ 28,6% và Asp-91 (D91) = 51,4% Trong đó N87K chiếm tỉ lệ 30%;N87A = 3,3%; D91G = 20%; D91N = 33,3% và D91Y = 6,7%

Đồng thời 2 đột biến ở 2 codon khác nhau chiếm tỉ lệ 40% Các đột biếnkhác chiếm tỉ lệ 6,7%

MIC Asn-87 > MIC Asp-91 (p < 0,05)

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Dân số nghiên cứu

- Dân số mục tiêu là tất cả các bệnh nhân bị viêm loét dạ dày có thử nghiệmurease dương tính tại bệnh viện Chợ Rẫy trong thời gian từ tháng 01/2016đến tháng 05/2016

- Dân số chọn mẫu: gồm các bệnh nhân trong dân số mục tiêu đáp ứng vớitiêu chuẩn chọn mẫu

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu

- Mẫu sinh thiết lấy từ tổn thương viêm loét của dạ dày

- Chỉ chọn mẫu có thử nghiệm urease dương tính

- Kích thước mẫu sinh thiết phải đủ cho việc ly trích ADN của Helicobacter pylori (≥ 2mm3)

- Hồ sơ có ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân, chẩn đoán trước nội soi, kèm chỉđịnh nội soi của bác sĩ lâm sàng, có kết quả nội soi chẩn đoán là viêm loét

dạ dày (kết quả này do bác sĩ nội soi đọc)

- Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

- Mẫu sinh thiết từ những bệnh nhân có tiền sử từng được phẫu thuật cắt dạdày

- Mẫu bị lẫn quá nhiều tạp chất

2.2 PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế dưới dạng nghiên cứu cắt ngang mô tả có

phân tích (descriptive and analytical cross-sectional study)

 p = 0,11 (dựa theo tỉ lệ týp gen cagA(+)vacAs1m1 ở bệnh nhân viêm loét

dạ dày trong nhóm chứng của nghiên cứu bệnh - chứng trong đề tài

"Nghiên cứu xác định kiểu gen cagA và vacA của H pylori ở bệnh

nhân ung thư dạ dày" của các tác giả Lê Quý Hưng và Hà Thị MinhThi năm 2013) [8]

2.2.3 Nơi thực hiện đề tài

- Phòng nội soi tiêu hóa trên - Bệnh viện Chợ Rẫy: chọn và bảo quản nhữngmẫu sinh thiết dạ dày đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn chọn mẫu

- Trung tâm Đào tạo và Chẩn đoán Y Sinh học phân tử - Bệnh viện Đại học YDược Tp.HCM: xử lý các mẫu sinh thiết dạ dày, chiết tách ADN của vi

khuẩn H pylori, thực hiện kỹ thuật multiplex PCR để xác định các týp gen cagA, vacA và thực hiện PCR để nhân bản vùng xác định đột biến kháng quinolone (quinolones resistance determining region - QRDR) trên gen gyrA của H pylori sau đó gửi đến công ty Macrogen (Hàn Quốc) để giải trình tự (sequencing) tìm kiểu đột biến gen kháng thuốc levofloxacin của vi khuẩn.

p x q

d2

2.2.4 Các bước tiến hành nghiên cứu

- Tại phòng nội soi tiêu hóa trên - Bệnh viện Chợ Rẫy, những mẫu sinh thiết

dạ dày có kết quả thử nghiệm urease (+) và thỏa điều kiện chọn mẫu sẽđược chọn và bảo quản

- Bệnh nhân được trực tiếp tư vấn về mục đích của nghiên cứu, quyền lợi vànghĩa vụ khi tham gia nghiên cứu bởi nghiên cứu viên hoặc thông qua bác sĩcủa bệnh nhân Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu sẽ ký tên vào giấychấp thuận tham gia nghiên cứu (mẫu giấy chấp thuận tự nguyện tham gianghiên cứu ở phần phụ lục 4) Sau khi ký giấy chấp thuận tự nguyện thamgia nghiên cứu, bệnh nhân được lấy các biến số nghiên cứu bao gồm cácthông số về tuổi, giới và nơi cư ngụ, và lúc này mẫu sẽ được mã hóa theoqui ước (đánh số thứ tự từ 1 đến n)

- Tất cả mẫu được chọn sẽ được mang về Trung tâm Đào tạo và Chẩn đoán YSinh học phân tử - Bệnh viện Đại học Y Dược Tp.HCM để xử lý, chiết tách

ADN của vi khuẩn H pylori, thực hiện kỹ thuật Multiplex PCR để xác định các kiểu gen (týp gen) cagA và vacA của vi khuẩn Sau đó, ADN của 30 chủng vi khuẩn H pylori mang kiểu tổ hợp gen cagA(+)vacAs1m1 sẽ đượcchọn ra một cách ngẫu nhiên (bằng phần mềm Excel 2010) để đưa vào nhân

bản vùng QRDR trên gen gyrA với cặp mồi đặc hiệu do công ty TNHH

Công nghệ Sinh học Khoa Thương cung cấp, rồi gửi đến công ty

Macrogen (Hàn Quốc) để giải trình tự (sequencing) tìm các kiểu đột biến

điểm kháng levofloxacin (nếu có) của vi khuẩn

- Ghi nhận kết quả

- Xử lý và phân tích số liệu

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.2.5 Tiến hành các xét nghiệm

2.2.5.1 Xác định các mẫu sinh thiết có thử nghiệm urease dương tính

Mẫu sinh thiết dạ dày được tiến hành thử nghiệm urease bằng bộ kiturease N.S do Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á cung cấp

- Nguyên lý hoạt động của kit urease N.S: urea bị thủy phân bởi enzyme

urease của H pylori tạo ra NH3 làm kiềm hóa thuốc thử Chất chỉ thị màucho thấy sự đổi màu thuốc thử nếu có phản ứng xảy ra

- Các thông số về kit urease N.S:

Bảng 2.1 Các thông số của kit urease N.S (nguồn: do nhà sản xuất cung cấp)

Giá trị tiên đoán dương tính 100%

Giá trị tiên đoán âm tính 86%

GIẢI TRÌNH TỰ TÌM CÁC ĐỘT BIẾN GIEN KHÁNG THUỐC LEVOFLOXACIN THỰC HIỆN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR

MẪU SINH THIẾT DẠ DÀY

UREASE (+)

GHI NHẬN KẾT QUẢ

XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU

Hình 2.1 Sự đổi màu của thuốc thử urease N.S

(nguồn: hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất)

Bảng 2.2 Tiêu chuẩn đọc kết quả của kit urease N.S

(nguồn: hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất)

Chuyển từ màu vàng cam sang

màu đỏ tím trong vòng 5 phút

Dương tính

Mẫu chứa H pylori có hoạt tính

mạnh Chuyển từ màu vàng cam sang

màu đỏ cam sậm trong vòng 30

phút

Mẫu chứa ít H pylori hoặc bệnh

nhân đã có đợt điều trị nên

H pylori đang ở dạng thoái triển

Chuyển từ màu vàng cam sang

màu đỏ hồng sau 30 phút

Âm tính

Màu chuyển do tạp nhiễm các loài

Proteus, Morganella hoặc do ảnh

hưởng tạm thời bởi pH của dạ dày Môi trường không thay đổi màu

vàng cam sau 60 phút

2.2.5.2 Xác định các týp gen cagA và vacA

Tiến hành ly trích ADN của H pylori và multiplex PCR để xác định các týp gen cagA và vacA với bộ kit AccuLite H pylori Genotyping Kit do công ty

TNHH công nghệ sinh học Khoa Thương cung cấp

- Nguyên lý hoạt động của AccuLite H pylori Genotyping Kit

AccuLite H pylori Genotyping Kit hoạt động dựa trên bốn bước chính:

xử lý mẫu sinh thiết dạ dày, tách chiết DNA của H pylori từ mẫu sinh thiết đã

xử lý, nhân bản ADN của H pylori bằng các cặp mồi đặc hiệu và cuối cùng là

phân tích kết quả trên gel agarose Toàn bộ qui trình có thể hoàn tất trong 8 giờ

- Các thông số về AccuLite H pylori Genotyping Kit (theo nhà sản xuất)

Độ nhạy của AccuLite H pylori Genotyping Kit là 50 bản sao ADN vi khuẩn trong một phản ứng, được xác lập trên mẫu vi khuẩn H pylori chuẩn J99

(ATCC 700824) và Tx30a (ATCC 51932)

Độ tin cậy của kết quả phụ thuộc rất nhiều quá trình thu mẫu, vận chuyển vàbảo quản mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm

- Quy trình thực hiện:

giải protein Lực cơ học hỗ trợ quá trình phân tách khối mô thành các tế bàođơn, hỗ trợ cho hỗn hợp thủy giải phá hủy sự ổn định trong cấu trúc củaprotein, đặc biệt với protein màng tế bào và màng nhân, giúp giải phóngADN Quá trình xử lý mẫu được tiến hành như sau:

+ Đánh số trên eppendorf 1,5 ml có chứa mẫu và dung dịch KTL2.

+ Spin down các eppendorf.

+ Cho thêm vào mỗi eppendorf 200μl KTL2+ 50μl KTL3 + 10μl KTL4 + Cắt nhuyễn mẫu bằng kéo vô trùng.

C trong 3 giờ Mỗi giờ lắc đảo nhẹ nhàngkhoảng 5 giây

+ Hỗn hợp sau khi xử lý phải đồng nhất.

Hình 2.2 Xử lý mẫu tại YSHPT - BV ĐHYD Tp.HCM

sinh thiết dạ dày sau xử lý được thu nhận bằng phương pháp tách chiết dựatrên các hạt từ phủ silica Các thành phần như guanidine isothiocyanate, chấttẩy, tris, EDTA có trong dung dịch ly giải có vai trò chính trong việc phá vỡ

cấu trúc protein của màng tế bào người và vi khuẩn H pylori Ngoài ra, hoạt

động biến tính protein của các chất này cũng làm bất hoạt các enzyme phânhủy ADN có trong hỗn hợp Đồng thời, trong dung dịch ly giải chứa nồng độmuối cao và pH thích hợp cho phép ADN gắn với silica trên hạt từ Phức hợpADN - hạt từ sau đó được chuyển lần lượt sang các giếng chứa dung dịchđệm có ethanol để rửa sạch các chất bẩn và chất ức chế Dung dịch này đảmbảo việc làm sạch ADN, sau đó làm khô để loại hết ethanol Cuối cùng,ADN được dung giải trong dung dịch đệm nồng độ muối thấp trước khi sửdụng cho phản ứng multiplex PCR Trong đề tài này, quá trình chiết tách

(Smart LabAssist - 24) Trước khi thực hiện, bật hệ thống tách chiết

TANBead trước khoảng 10 phút để làm nóng hệ thống đến khi nhiệt độ của

hệ thống tách chiết đạt khoảng 500C

+ Chuẩn bị một số lượng đĩa chứa sẵn hóa chất tách chiết (16 test/đĩa, tối đa

2 đĩa trên mỗi lần chạy) hoặc các dãy tube (1 test / dãy, thực hiện được từ

1 đến tối đa 16 dãy trên mỗi lần chạy) tương ứng với số lượng mẫu cầnthực hiện và thêm 1 test cho chứng âm tách chiết Chuẩn bị số các strip

(tip comb) tương ứng với số lượng plate hoặc tube.

+ Cẩn thận tháo bỏ lớp phôi nhôm để tránh bắn dung dịch hóa chất Lưu ý:

không phơi plate hoặc tube chứa hóa chất phản ứng trong không khí quálâu để tránh bay hơi và thay đổi pH ảnh hưởng đến hiệu suất tinh sạch

+ Đánh dấu số mẫu tương ứng với vị trí trên đĩa hoặc dãy tube.

+ Hút 300μl dịch mẫu đã qua xử lý vào trong mỗi cột số 1 và số 7 trên đĩa

hoặc cột số 1 trên dãy tube đã đánh dấu tương ứng Đối với chứng âm táchchiết, hút 300μl dung dịch Elution Buffer

+ Đặt các plate tách chiết hoặc tube vào khay plate của hệ thống tách chiết.

Lưu ý: chắc chắn rằng góc khuyết của plate tách chiết hướng về phía trướccửa của thiết bị

+ Gắn đủ các strip tương ứng vào các khe trên khay stip Đóng cửa thiết bị.

Bảng 2.3 Chương trình cài đặt máy TANBead.

(nguồn: YSHPT - BV ĐHYD Tp.HCM)

Hình 2.3 Máy TANBead (Smart LabAssist - 24).

(nguồn: YSHPT - BV ĐHYD Tp.HCM)

+ Chuẩn bị sẵn các eppendorf sạch, đánh dấu tương ứng với các mẫu theo

thứ tự cho mẫu vào plate hoặc tube Khi chương trình được thực hiệnxong, chuông sẽ báo Cẩn thận lấy plate khỏi thiết bị

+ Sử dụng micropipet để chuyển ADN đã tinh sạch từ cột số 6/12 sang các

eppendorf sạch được chuẩn bị sẵn Nếu không tiến hành phản ứngmultiplex PCR ngay trong ngày, có thể bảo quản ADN tách chiết ở 2 - 80Ctrong vòng 2 - 3 ngày, hoặc ở -200C trong vòng 6 tháng

+ Cẩn thận loại bỏ các plate/tube và các strip đã sử dụng Vệ sinh thiết bị và

bật đèn UV thiết bị trong 15 phút

Vùng gene nhân bản: các vùng gene nhân bản được chọn có tính bảo

tồn cao, đảm bảo sự nhân bản diễn ra đồng đều giữa các chủng H pylori và

giữa các vùng gene khác nhau trong cùng một chủng Ngoài ra, các vùng genemục tiêu này cũng phải có độ tương đồng thấp khi so sánh với các vùng gene

của người hay các tác nhân khác có thể xuất hiện trong mẫu AccuLiteH pylori Genotyping Kit sử dụng 4 cặp mồi bắt cặp trên 4 vùng gene có chiều dài lần

lượt là 401/476, 259/286, 349 và 200 bp của các gene vacAm1/m2

, vacAs1/s2, cagA

và Smad4 trong bộ gene của H pylori và của người.

Thành phần phản ứng multiplex PCR: ADN sau khi được tách chiết sẽđược bổ sung vào eppendorf chứa hỗn hợp các thành phần của phản ứngmultiplex PCR Tại đây, phản ứng multiplex PCR sẽ diễn ra Đầu tiên, nhiệt độphản ứng được nâng cao làm các phân tử ADN bị biến tính thành dạng mạchđơn, enzyme Taq ADN polymerase lúc này cũng được hoạt hóa Khi ống phảnứng được làm mát, các đoạn mồi và mẫu dò đến bắt cặp với vùng gene mụctiêu Nhờ có sự hiện diện của ion Mg2+ và các deoxynucleotide triphosphate(dNTP) ở nồng độ cao, Taq ADN polymerase sẽ kéo dài mồi để tạo nên cácphân tử ADN mạch đôi Việc tăng và giảm nhiệt độ của phản ứng được máyluân nhiệt lặp lại theo số chu kỳ đã định trước Hiện tượng nhân bản chỉ xảy ra

ở vùng gene mục tiêu chứ không xảy ra trên toàn bộ bộ gene

Trong đề tài này, quá trình multiplex PCR được thực hiện với máy

Rotor-Gene®Q của hãng QIAGEN® Qui trình tiến hành như sau:

+ Rã đông hoàn toàn các ống MasterMix, PrimobeMix và chứng dương

(bằng cách đặt ở nhiệt độ phòng trong tối đa 30 phút), ly tâm nhẹ (3.000 4.000 rpm) và đặt vào rack lạnh Lưu ý: thao tác chứng dương tách biệtvới 2 ống MasterMix và PrimobeMix để hạn chế nguy cơ nhiễm

-+ Vortex mạnh ống PrimobeMix, hút ra 200µl chuyển vào ống MasterMix.

Lưu ý: tránh làm văng dung dịch lên nắp ống PrimobeMix trong quá trìnhvortex dẫn đến việc không đủ thể tích hút

+ Trộn đều hỗn hợp có trong ống MasterMix bằng micropipette Hút ra lần

lượt 20µl hỗn hợp cho vào từng eppendorf 0,2ml đã được ghi sẵn tên mẫu.Lưu ý: không được trộn ống MasterMix bằng máy vortex, mỗi hỗn hợpchuẩn bị đủ cho 19 phản ứng

+ Vortex nhẹ từng dung dịch ADN xét nghiệm, dung dịch chứng âm tách

chiết, các dung dịch chứng dương

+ Cho 5µl dung dịch ADN xét nghiệm, dung dịch Chứng âm tách chiết, các

dung dịch Chứng dương hoặc nước cất 2 lần, lần lượt vào các ốngeppendorf 0,2 ml riêng lẻ đã chuẩn bị ở Bước 3 Lưu ý: phản ứngmultiplex PCR phải được đặt vào máy chạy trong vòng 3 giờ sau khi bổsung dịch ADN, mỗi lần chạy máy Real-time PCR cần tối thiểu 1 phảnứng cho chứng âm tách chiết, 2 phản ứng cho 2 ống chứng dương và 1phản ứng với nước cất 2 lần (hoặc dung dịch KTS5) làm chứng âm PCR.Thứ tự chuẩn bị các phản ứng phải là: Chứng âm PCR  Chứng âmtách chiết  Mẫu xét nghiệm  2 chứng dương

+ Đậy nắp thật kỹ các eppendorf 0,2 ml, ly tâm nhẹ (3.000 - 4.000 rpm) và

đặt vào máy PCR (máy Rotor-Gene®

Q của hãng QIAGEN®) Cài đặtchương trình như sau:

1 chu kì 950C – 15 phút

40 chu kì 950C – 20 giây; 600C – 40 giây; 720C – 40 giây

1 chu kì 720C – 5 phút

Hình 2.4 Máy Rotor-Gene®Q (QIAGEN®)

(nguồn: YSHPT - BV ĐHYD Tp.HCM)

có gốc phosphate mang điện tích âm, dưới tác dụng của lực điện trường sẽ dichuyển về cực dương của nguồn điện Môi trường bán rắn của gel agarosekhiến cho các phân tử ADN có kích thước lớn di chuyển chậm hơn các phân

tử ADN kích thước nhỏ, dẫn đến sự phân tách của các sản phẩm multiplexPCR khác nhau Trong quá trình di chuyển, các phân tử ADN bị chất nhuộmhuỳnh quang gắn chèn vào và sẽ phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại Tínhiệu huỳnh quang và vị trí của nó trên bản gel điện di cho biết sự có mặt củasản phẩm multiplex PCR Quá trình điện di trên gel agarose 5% được tiếnhành như sau:

+ Pha dung dịch TAE 1X: 20ml dung dịch TAE 50X bỏ vào ống đong

1000ml, thêm nước cất đến vạch 1000ml

+ Phản ứng multiplex PCR sau khi kết thúc, đem các mix PCR tới khu vực

điện di, chuẩn bị gel agarose 5% với số lượng giếng nhiều hơn số mix là 1giếng

+ Cho bảng gel vào bồn, đổ dung dịch TAE 1X vào bồn, mực dung dịch

phải ngập qua bảng gel

+ Cho 5µl dung dịch nạp mẫu cho mỗi mix.

+ Nạp 20µl hỗn hợp phản ứng đã trộn với dung dịch nạp mẫu vào giếng + Cuối cùng nạp trực tiếp 5 μl thang 100 bp vào giếng trống trên gel.

+ Chạy điện di 120V, 50 - 60 phút và quan sát kết quả điện di dưới đèn UV.

Hình 2.5 Chạy điện di các sản phẩm multiplex PCR và đọc kết quả

dưới đèn UV tại YSHPT - BV ĐHYD Tp.HCM

*Kiểm tra vạch tín hiệu của sản phẩm PCR, của chứng dương và chứng âm

+ Các mẫu chứng âm phải không có bất kỳ vạch ký sinh nào

+ Mẫu chứng dương:

J99: vạch 259 bp (vacAs1), 349 bp (cagA+) và 401 bp (vacAm1) hiện sáng rõ

Tx30a: vạch 286 bp (vacAs2) và 476 bp (vacAm2) hiện sáng rõ

*Kiểm tra từng mẫu xét nghiệm:

+ Mẫu âm tính là mẫu chỉ xuất hiện (rõ hoặc mờ) vạch chứng nội 200 bp.

Lưu ý: mẫu âm tính được hiểu là mẫu không phát hiện týp gene cagA và vacA.

+ Mẫu dương tính là mẫu xuất hiện một trong các vạch 259/286, 349 và

401/476 bp (đặc trưng cho H pylori) Lưu ý: độ sáng các vạch (rõ hoặc

mờ) thể hiện tương đối nồng độ của vi khuẩn trong mẫu ban đầu Vạchchứng nội 200 bp có thể có hoặc không thấy ở mẫu dương tính

Hình 2.6 Kết quả điện di một số týp gene cagA và vacA của H pylori.

(nguồn: hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất)

2.2.5.3 Giải trình tự vùng QRDR trên gen gyrA của H pylori

- Nhân bản vùng QRDR trên gen gyrA: thực hiện PCR để nhân bản vùng

QRDR trên gen gyrA của 30 chủng H pylori có tổ hợp gen cagA+vacAs1m1

với cặp mồi đặc hiệu do công ty TNHH Công nghệ Sinh học Khoa Thươngcung cấp

Hình 2.7 Kết quả nhân bản vùng QRDR của gen gyrA 3 (-); 4 (+).

(nguồn: YSHPT - BV ĐHYD Tp.HCM)

- Giải trình tự vùng QRDR trên gen gyrA

+ Giải trình tự vùng QRDR trên gen gyrA của 30 chủng H pylori có tổ hợp

gen cagA(+)vacAs1m1 (đã được nhân bản) bằng máy Genetic Analyzer 3500của hãng Hitachi để xác định gen đột biến kháng levofloxacin (nếu có) của

các chủng vi khuẩn H pylori (do công ty Macrogen - Hàn Quốc thực hiện).

+ Đọc và phân tích kết quả giải trình tự bằng phần mềm chuyên dụng

(BioEdit)

Hình 2.8 Máy Genetic Analyzer 3500 (Hitachi)

(nguồn: công ty Macrogen - Hàn Quốc)