Nghiên cứu quy trình sản xuất mẫu huyết thanh để ứng dụng trong chương trình ngoại kiểm hóa sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ---NGUYỄN THỊ QUỲNH NGA NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU HUYẾT THANH ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH NGOẠI KIỂM HÓA SI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-NGUYỄN THỊ QUỲNH NGA

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU HUYẾT THANH ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH NGOẠI KIỂM HÓA SINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-NGUYỄN THỊ QUỲNH NGA

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU HUYẾT THANH ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH NGOẠI KIỂM HÓA SINH

Chuyên Ngành: Xét nghiệm Y học

Mã số: 60720333LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.BS VŨ QUANG HUY

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu

là hoàn toàn trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trìnhnào khác

Tác giả

NGUYỄN THỊ QUỲNH NGA

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 VAI TRÕ CỦA XÉT NGHIỆM HÓA SINH TRONG LÂM SÀNG 4 1.2 CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM 14

1.3 NGOẠI KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG (EQA – External Quality Assessment) 19

1.4 MẪU NGOẠI KIỂM 21

1.5 KỸ THUẬT ĐÔNG KHÔ 25

1.6 PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH 28

1.7 TÌNH HÌNH NGOẠI KIỂM HÓA SINH TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 29

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31

2.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 31

2.3 CỠ MẪU 31

2.4 TIÊU CHUẨN CHỌN MẪU 32

2.5 PHƯƠNG PHÁP THU THẬP SỐ LIỆU 32

2.6 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 33

2.7 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.8 KIỂM SOÁT SAI LỆCH 43

2.9 Y ĐỨC VÀ TÍNH ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 46

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 47

3.1 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG MẪU SẢN XUẤT 47

3.2 ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA 2 YẾU TỐ NHIỆT ĐỘ, THỜI GIAN LÊN QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN MẪU NGOẠI KIỂM 54

3.3 QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU HUYẾT THANH NGOẠI KIỂM HÓA SINH 64

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 67

4.1 QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM HÓA SINH 67

4.2 SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT MẪU HUYẾT THANH BẰNG ĐÔNG KHÔ VÀ ĐÔNG LẠNH 69

4.3 ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA MẪU THEO THỜI GIAN VÀ NHIỆT ĐỘ 70

KẾT LUẬN 76

KIẾN NGHỊ 77

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC A I PHỤ LỤC B III PHỤ LỤC C IV PHỤ LỤC D VI PHỤ LỤC E VIII

TCQG : Tiêu chuẩn quốc gia

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

BUN : Blood Urea nitrogen

CDC : Centers for Disease Control and Prevention, USACLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute

Cho : Cholesterol

CM : Chylomicron

Cre : Creatinin

CRM : Certified Reference Material

CV : Coefficient of Variation

DNA :Deoxynucleic acid

EQA : External Quality Assessment

GOD : Glucose Oxidase

GOT : Glutamat Oxaloacetac Transaminase

GPO : Glycerol 3 Phosphate Oxidase

GPT : Glutamat Pyruvat Transaminase

HBsAg :Hepatitis B surface antigen

HCV : Hepatitis C virus

HIV :Human immunodeficiency virus

HDL : High density lipoprotein

IDL : Intermediate density lipoprotein

IEC : International Electrotechnical CommissionIFCC : International Fedaration of clinical Chemistry

IQC : Internal Quality Control

ISO : International Organization for StandardizationLDL : Low density lipoprotein

PAP : Peroxidase Antiperoxidase

PT : Proficiency testing

QA : Quality Assurance

QC : Quality Control

QM : Quality Management

QMS : Quality Management System

RNA : Ribonucleic acid

RM : Reference Material

SD : Standard Deviation

SSG : Sum of Squares between - Groups

SST : Total Sum of Squares

SSW : Sum of Squares Within-groups

TG : Triglycerid

Tri :Triglycerid

Ure : Ure

VLDL : Very low density lipoprotein

WHO :World Health Organization

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cơ chế điều hòa nồng độ Glucose máu 5

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa BUN trong cơ thể 7

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa Creatinin trong cơ thể 9

Hình 1.4 Sơ đồ vận chuyển Cholesterol trong cơ thể 11

Hình 1.5 Quá trình hình thành Acid Uric 12

Hình 1.6 Các yếu tố của hệ thống quản lý chất lượng 19

Hình 1.7 Quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm [3] 19

Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp tiến hành 386

Hình 2.2 Quá trình đông khô mẫu huyết thanh 4038

Hình 2.3 Mẫu huyết thanh trộn và kết quả sàng lọc anti-HIV 40

Hình 2.4 Biểu đồ nội kiểm tra Levey Jennings 45

Hình 3.1 Nồng độ glucose 54

Hình 3.2 Nồng độ ure 55

Hình 3.3 Nồng độ creatinin 55

Hình 3.4 Nồng độ triglycerid 56

Hình 3.5 Nồng độ cholesterol 56

Hình 3.6 Nồng độ acid uric 57

Hình 3.7 Hoạt động enzym GOT 57

Hình 3.8 Hoạt động enzym GPT 58

Hình 3.9 Hoạt động enzym GGT 58

Hình 3.10 Nồng độ glucose theo thời gian 59

Hình 3.11 Nồng độ ure theo thời gian 59

Hình 3.12 Nồng độ creatinin theo thời gian 60

Hình 3.13 Nồng độ triglycerid theo thời gian 60

Hình 3.14 Nồng độ cholesterol theo thời gian 61

Hình 3.15 Nồng độ acid uric theo thời gian 61

Hình 3.16 Hoạt độ enzym GOT theo thời gian 62

Hình 3.17 Hoạt độ enzym GPT theo thời gian 62

Hình 3.18 Hoạt độ enzym GGT theo thời gian 63

Hình 3.19 Hình ảnh mẫu ngoại kiểm sản xuất 66

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Mối quan hệ giữa nhiệt độ và áp suất hơi 27

Bảng 2.1 Máy móc và thiết bị sử dụng 33

Bảng 2.2 Dụng cụ và vật tư tiêu hao 34

Bảng 2.3 Hóa chất và thuốc thử 35

Bảng 2.4 Bảng điều chỉnh nồng độ mẫu ngoại kiểm 32

Bảng 2.5 Phương pháp định lượng các chỉ số Hóa sinh 39

Bảng 3.1 Đánh giá độ đồng nhất của mẫu sản xuất bằng phương pháp đông lạnh 48

Bảng 3.2 Đánh giá độ đồng nhất của mẫu sản xuất bằng phương pháp đông khô 49

Bảng 3.3 So sánh phương pháp đông khô và đông lạnh 49

Bảng 3.4 Độ ổn định của mẫu đông khô bảo quản ở nhiệt độ - 200 C sau 5 tháng 50

Bảng 3.5 Độ ổn định của mẫu đông khô bảo quản ở nhiệt độ 2- 80 C sau 5 tháng 51

Bảng 3.6 Độ ổn định của mẫu đông lạnh bảo quản ở nhiệt độ -200 C sau 5 tháng 51

Bảng 3.7 Độ ổn định của mẫu đông lạnh bảo quản ở nhiệt độ 2 - 80 C sau 5 tháng 52

Bảng 3.8 Độ ổn định mẫu đông khô và đông lạnh bảo quản ở - 200 C sau 5 tháng 53

Bảng 3.9 Độ ổn định của mẫu đông khô bảo quản ở 2 – 80 C sau 3 tháng 53

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật, việc chẩnđoán và điều trị bệnh đã dễ dàng hơn rất nhiều nhờ sử dụng máy móc hiện đạivào xét nghiệm cận lâm sàng Việc sử dụng máy móc thay thế con người sẽgiúp cho công tác khám chữa bệnh nhanh chóng, có thể cho ra hàng loạt kếtquả trong một thời gian ngắn [58], nhưng trong quá trình máy phân tích tựđộng có thể xảy ra lỗi và dẫn đến sai kết quả Dù sai số đó chỉ chiếm 1%nhưng cũng dẫn đến sai lầm trong chẩn đoán và điều trị [20] Vì vậy, đảm bảochất lượng kết quả là vấn đề đáng quan tâm nhất tại mỗi phòng xét nghiệm

Để có được kết quả đảm bảo độ tin cậy thì mỗi phòng xét nghiệm cần tiếnhành nội kiểm tra và đặc biệt là ngoại kiểm tra chất lượng theo khuyến cáocủa CLSI, CDC kết hợp với WHO Ngoài ra theo như hướng dẫn Thông tư số01/2013/TT-BYT của Bộ Y tế thì cần có hệ thống quản lý chất lượng để đảmbảo chất lượng [1] nhằm tiến tới lộ trình liên thông kết quả xét nghiệm trênphạm vi toàn quốc theo quyết định số 316/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính Phủ

về phê duyệt Đề án tăng cường năng lực hệ thống quản lý chất lượng xétnghiệm y học giai đoạn 2016 – 2025 [11]

Tuy nhiên, để có thể kiểm tra chất lượng xét nghiệm cần có một mẫuchuẩn đạt tiêu chuẩn Các mẫu chuẩn thường dùng hiện nay đa số được nhậpkhẩu từ thị trường nước ngoài với giá thành rất cao Các cơ sở trong nướcchưa sản xuất được sinh phẩm dùng để kiểm tra chất lượng các chỉ số xétnghiệm đặc biệt là các chỉ số hóa sinh Vì vậy, các phòng xét nghiệm trên cảnước vẫn chưa thể thực hiện đồng nhất và có quy mô chương trình ngoại kiểmtra chất lượng xét nghiệm các chỉ số hóa sinh, đặc biệt là các phòng xétnghiệm nhỏ và các phòng xét nghiệm tuyến huyện… [36]

Trong tình hình hiện tại như vậy, việc sản xuất một mẫu kiểm chuẩn đảmbảo tính đồng nhất và ổn định theo thời gian để có thể tiến hành ngoại kiểm

tra chất lượng phòng xét nghiệm là điều cần thiết Các mẫu kiểm chuẩnthường được sản xuất với rất nhiều phương pháp, trong đó có phương phápđông khô, đông lạnh [32], [34], [36], [40], [41] Do đó, tiến hành hai phươngpháp để sản xuất mẫu kiểm chuẩn nhằm so sánh và lựa chọn được mẫu kiểmchuẩn tối ưu nhất, giúp ích cho việc nâng cao chất lượng kết quả xét nghiệmtrên cả nước Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài “Quy trình sản xuất mẫuhuyết thanh, ứng dụng trong chương trình ngoại kiểm hóa sinh” nhằm sảnxuất ra được mẫu kiểm chuẩn đảm bảo tính đồng nhất, ổn định và ít bị tácđộng bởi điều kiện môi trường trong quá trình bảo quản mẫu Kết quả củanghiên cứu không chỉ nâng cao chất lượng kết quả của phòng xét nghiệm hóasinh mà còn giúp cho các phòng xét nghiệm trong nước có thể tiến hành thựchiện chương trình ngoại kiểm tra chất lượng với giá cả hợp lý mà vẫn đảmbảo tính tin cậy trong quá trình thực hiện xét nghiệm.

C U HỎI NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được quy trình sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh dùng

để ngoại kiểm hóa sinh ở quy mô phòng thí nghiệm đảm bảo tính ổn định vàđồng nhất trong quá trình sản xuất hay không?

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu tổng qu t

Nghiên cứu quy trình thử nghiệm sản xuất mẫu huyết thanh để ứng dụngtrong chương trình ngoại kiểm Hóa sinh ở quy mô phòng thí nghiệm

Mục tiêu cụ thể

1 Nghiên cứu quy trình thử nghiệm sản xuất mẫu huyết thanh để ứngdụng trong chương trình ngoại kiểm Hóa sinh ở quy mô phòng thínghiệm

2 So sánh sự ổn định và đồng nhất của mẫu huyết thanh được sản xuấttheo hai phương pháp đông khô và đông lạnh

3 Khảo sát độ ổn định của mẫu huyết thanh theo thời gian và nhiệt độ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 VAI TRÕ CỦA XÉT NGHIỆM HÓA SINH TRONG L M SÀNG

Cơ thể chúng ta gồm các mô, các cơ quan và các dịch thể Qua quá trìnhtiêu hóa thức ăn nhờ hệ thống tiêu hóa của cơ thể đã phân giải thức ăn thànhcác chất dinh dưỡng hay các dưỡng chất (glucose, acid amin…) Dưỡng chất

sẽ được hấp thu vào máu, rồi được đến các mô, tại đây chúng được dùng đểtổng hợp các đại phân tử hay thoái hóa thành các sản phẩm trung gian và cuốicùng Các sản phẩm này được đưa vào máu tới các mô để sử dụng hay các cơquan bài tiết để thải ra ngoài (qua nước tiểu, thức ăn hay mồ hôi, phân…).Ngoài những quá trình chuyển hóa chung, mỗi mô có các đặc điểm chuyểnhóa riêng và có sự tham gia của các enzym và isoenzym đặc trưng để tạo racác sản phẩm chuyển hóa riêng Việc đo lường những enzym và các sản phẩmchuyển hóa đặc trưng của cơ thể có ý nghĩa nhất định trong việc xác định tìnhtrạng bệnh lý của các mô tương ứng [5]

Cùng với các xét nghiệm chẩn đoán khác, xét nghiệm hóa sinh thườngquy góp phần quan trọng trong việc chẩn đoán, đánh giá chức năng, tiênlượng bệnh và theo dõi kết quả điều trị Ngoài ra xét nghiệm hóa sinh còn cóthể tầm soát bệnh và nguy cơ bị bệnh Do đó, các xét nghiệm hóa sinh đượcchỉ định thường quy trong quá trình khám và chữa bệnh Một trong số xétnghiệm hóa sinh thường được chỉ định để chẩn đoán, theo dõi và điều trị bệnh

đó là: Glucose, Ure, Creatinin, GOT, GPT, GGT, Triglycerid, Acid Uric,Cholesterol…

1.1.1 Xét nghiệm định lượng Glucose máu

Glucose là nguồn năng lượng chủ yếu và trực tiếp của cơ thể, được dựtrữ ở gan dưới dạng glycogen Glucose tham gia vào cấu trúc tế bào (RNA vàDNA) và một chất đặc biệt khác (Mucopolysaccharid, heparin, acid

hyaluronic, chondroitin…) Bình thường nồng độ glucose máu tương đối hằngđịnh Khi cơ thể đói, sự giảm nồng độ glucose có thể tránh được nhờ phânhủy glycogen, khi glucose máu tăng thì glucose sẽ sinh tổng hợp thànhglycogen Việc điều hòa nồng độ glucose máu chịu tác động của 2 hệ thốnghormone đối lập nhau:

- Insulin có tác dụng làm hạ glucose máu

- Glucagon, adrenalin, cortisol và GH có tác dụng làm tăng nồng độglucose máu (hình 1.1)

Hình 1.1 Cơ chế điều hòa nồng độ glucose máu

Đánh giá nồng độ glucose máu cho phép phát hiện các rối loạn chuyểnhóa glucose Nguyên nhân thường gặp ở rối loạn trong chuyển hóa glucose đó

là đái tháo đường Xác định nồng độ glucose huyết tương lúc đói và làm

nghiệm pháp gây tăng glucose máu đường uống là một biện pháp sàng lọcbệnh ĐTĐ cực kì có giá trị Ngoài ra đánh giá nồng độ glucose máu lúc đói

và sau khi ăn 2 giờ, xét nghiệm tìm glucose trong nước tiểu, diễn biến củanồng độ glucose máu mao mạch hay định lượng hemoglobin A1C và C peptidcũng cung cấp thông tin hữu ích cho chúng ta để chẩn đoán và điều trị ĐTĐ[2], [5], [13], [14]

Giá trị bình thường của Glucose [2]:

- Huyết tương: 60 - 110 mg/dl hay 3,36 – 6,16 mmol/L

- Máu toàn phần: 60 – 105 mg/dL hay 3,36 – 5,58 mmol/L

- Trẻ sơ sinh: 20 – 80 mg/dL hay 1,12 – 4,48 mmol/L

Sự thay đổi giá trị của glucose máu không những giúp chẩn đoán vàkiểm soát bệnh đái tháo đường mà còn để chẩn đoán tình trạng hạ đườnghuyết Bên cạnh đó xét nghiệm định lượng nồng độ glucose máu còn giúpchẩn đoán và theo dõi các rối loạn chuyển hóa cacbohydrat khác bao gồmĐTĐ thai kỳ, hạ đường huyết ở trẻ sơ sinh, hạ đường huyết vô căn và ung thưbiểu mô tế bào tụy đảo [2], [5], [13], [14]

1.1.2 Xét nghiệm định lượng Ure máu

Ure là sản phẩm thoái hóa chính của các protein và acid amin trong cơthể và là sản phẩm quan trọng nhất của chuyển hoá nitơ Ure được tạo thành ở

phần nitrogen của ure trong máu Ure có nguồn gốc xuất xứ chủ yếu từ quátrình thoái hóa các protein (hình 1.2) Các protein có thể có nguồn gốc từthức ăn (1) hay nội sinh (2):

Nồng độ ure máu phụ thuộc vào chức năng thận, chế độ ăn, quá trình dịhóa protein nội sinh và tình trạng thăng bằng điện giải trong cơ thể Tất cả rối

giảm nhiều hay ít Ure được đào thải qua hai con đường tiêu hóa nhờ enzymurease của ruột và đường thận Ure được lọc qua cầu thận và tái hấp thu thụđộng qua ống thận Tất cả các rối loạn chức năng thận đều dẫn tới tăng nồng

độ ure huyết thanh và khi nồng độ ure tăng tới > 33mmol/L (>200 mg/dL) thì

có thể thấy biểu hiện lâm sàng ở tim, phổi, tiêu hóa và hệ thần kinh… [2], [5],[13], [14]

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa BUN trong cơ thể

Giá trị bình thường [2]:

- Huyết thanh: Ure: 13 – 40 mg/dL hay 2,1 – 6,6 mmol/L

BUN: 5 - 17 mg/dL.

- Tỷ lệ nồng độ ure huyết thanh/ creatinin huyết thanh: 10 – 40

Xét nghiệm định lượng ure cho phép đánh giá mức độ tăng đơn độcnồng độ ure không kèm tăng creatinin giúp hướng tới chẩn đoán dị hóaprotein hay tăng song song với creatinin gợi ý tình trạng suy thận Đây là xétnghiệm giúp quyết định dùng loại thuốc gì không gây độc cho thận Xétnghiệm này còn giúp ích trong việc đánh giá mức độ nặng nhẹ của suy thận[2], [5], [13], [14]

1.1.3 Xét nghiệm định lượng Creatinin máu

Creatinin là một chất chuyển hóa nitơ, là sản phẩm của sự thoái hóacreatinin cơ và được đào thải duy nhất qua thận Phản ứng giữa arginin vàglycin xảy ra ở mô thận, tạo ra ornithin và acid guanidon-acetic(glycocyamin) Sau đó glycocyamin được đưa vào máu rồi chuyển đến gan,

và được chuyển hóa thành creatinin (hình 1.3) Creatinin vào mạch máu vàđược tế bào cơ hấp thụ Tại đây creatinin được chuyển hóa thành creatininphosphat, chất này được chuyển hóa thành creatinin Sự tạo thành creatininphụ thuộc vào khối lượng cơ (đàn ông nhiều hơn phụ nữ) Creatinin ổn địnhtrong máu, không phụ thuộc vào chế độ ăn và những thay đổi sinh lý khác màchỉ phụ thuộc vào khả năng đào thải của thận Creatinin được lọc qua cầu thận

và không được tái hấp thụ tại ống thận Vì vậy nồng độ creatinin máu có tácdụng đánh giá chức năng lọc của cầu thận và theo dõi diễn tiến của chức năngthận [2], [5], [13], [14]

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa creatinin trong cơ thể

Giá trị bình thường [2]:

- Creatinin huyết thanh: Nam: 0,7 – 1,3 mg/dL hay 62 – 115 µmol/L

Nữ: 0,5 – 1,0 mg/dL hay 44 – 88 µmol/L

Trẻ em: 0,3 – 1,0 mg/dL hay 26 – 88 µmol/L

Creatinin máu có thể tăng trong các trường hợp suy thận do nguyên nhântrước thận (suy tim mất bù, hẹp động mạch thận, xuất huyết… ) hay nguyênnhân tại thận do tổn thương ống thận (sỏi thận, đa u tủy xương, viêm thận –

bể thận cấp hay mạn tính…) hoặc do tổn thương cầu thận (tăng huyết áp, đáitháo đường, viêm cầu thận…) và nguyên nhân sau thận (sỏi thận, khối u bàngquang…)

Creatinin máu giảm thường do hòa loãng máu, suy dinh dưỡng nặng,một số bệnh gây teo mô cơ hoặc do có thai [2], [5], [13], [14]

1.1.4 Xét nghiệm định lượng Triglycerid

Triglycerid (TG) là ester của glycerol và 3 acid béo cấu tạo thành TG làmột dạng mỡ và là nguồn cung cấp năng lượng chính cho cơ thể TG có hainguồn gốc ngoại sinh (thức ăn) và nội sinh (do gan tổng hợp) TG ngoại sinhđược vận chuyển bởi chylomicron và TG nội sinh được vận chuyển trong máunhờ VLDL

Xét nghiệm TG thường được chỉ định để đánh giá tình trạng cân bằnggiữa lượng lipid đưa vào và chuyển hóa lipid trong cơ thể Tăng nồng độ TGmáu thường làm tăng nguy cơ xơ vữa động mạch và bệnh tim mạch.

Giá trị bình thường [2]:

- Bình thường: < 1,7 mmol/L hay < 150 mg/dL

- Giới hạn bình thường cao: 1,7 – 2,24 mmol/L hay 150 – 199 mg/dL

- Giới hạn cao: 2,25 – 5,63 mmol/L hay 200 – 499 mg/dL

- Rất cao: ≥ 5,64 mmol/L hay ≥ 500 mg/dL

TG tăng nguyên phát trong bệnh tăng lipid huyết gia đình và thứ pháttrong ĐTĐ, xơ gan do rượu, viêm tụy, viêm gan, tắc mật, hội chứng thận hư

và xơ vữa động mạch [2], [5], [13], [14]

1.1.5 Xét nghiệm định lượng Cholesterol

Cholesterol huyết tương có 2 nguồn gốc ngoại sinh (thức ăn) và nội sinh(do cơ thể tổng hợp) Cholesterol được tích hợp chủ yếu trong các lipoproteinloại LDL, HDL, VLDL và một số ít dưỡng chấp (chylomicron)

Cholesterol là steroid chính trong cơ thể người Cholesterol được cáclipoprotein LDL và HDL vận chuyển trong máu để tham gia vào hai quá trìnhchuyên biệt Cholesterol tích hợp vào LDL được vận chuyển trong máu từ ganđến mô ngoại biên với nguy cơ tạo nên xơ vữa động mạch Cholesterol tíchhợp vào HDL sẽ được vận chuyển từ các mô ngoại biên đến gan để thực hiệnquá trình dị hóa cholesterol Khoảng 25 – 40% cholesterol huyết tương ở dạng

tự do, 60 -70% dưới dạng ester hóa Trong xét nghiệm hai dạng này thườngđược đo chung gọi là cholesterol toàn phần (hình 1.4)

Cholesterol là một chất cần thiết cho hoạt động chức năng màng tế bào

và như một tiền chất của acid mật, progesterone, vitamin D, estrogen,glucocorticoid và các corticosteroid điều hòa chuyển hóa khoáng chất Xét

nghiệm định lượng cholesterol để nghiên cứu các tình trạng rối loạnlipoprotein máu và giúp đánh giá nguy cơ hình thành màng xơ vữa độngmạch Ngoài ra xét nghiệm định lượng cholesterol còn dùng để nghiên cứuchức năng gan và hỗ trợ cho chẩn đoán các tình trạng rối loạn chức năngtuyến giáp [2], [5], [13], [14].

Giá trị bình thường [2]:

- Cholesterol toàn phần:

+ < 10 tuổi: 100 – 180 mg/dL hay 2,6 – 4,7 mmol/L

+ 10 – 20 tuổi: 120 – 180 mg/dL hay 3,1 – 4,7 mmol/L

+ > 20 tuổi: 120 – 200 mg/dL hay 3,1 – 5,2 mmol/L

Hình 1.4 Sơ đồ vận chuyển cholesterol trong cơ thể

1.1.6 Xét nghiệm định lượng Acid uric

Acid uric là sản phẩm thoái hóa của các base purin, một thành phần củaacid nucleic Acid nucleic khi bị thủy phân thì cho ra các đơn vị cấu tạo AMP,GMP… Các chất này tiếp tục thoái hóa cho acid uric (hình 1.5)

Xét nghiệm định lượng acid uric là một thông số để đánh giá chức năngthận và xơ vữa động mạch Đặc biệt acid uric dùng để chẩn đoán các bệnh lýgây biến đổi nồng độ acid uric, để theo dõi điều trị bệnh Gout và điều trị hóachất chống ung thư nhằm hạn chế tình trạng lắng đọng cấp urat tại thận vớinguy cơ gây suy thận cấp [2], [5], [13], [14].

Giá trị bình thường Acid uric trong máu [2], [5]:

- Nam: 3,6 – 8,5 mg/dL hay 214 – 506 µmol/L

- Nữ: 2,3 – 6,6 mg/dL hay 137 – 393 µmol/L

Hình 1.5 Quá trình hình thành acid uric

1.1.7 Xét nghiệm định lượng GOT (Glutamat Oxaloacetat Transaminase).

Đây là một aminotransferase, còn có tên gọi khác là AST (AspartateAminotransferase) có tác dụng xúc tác sự chuyển hóa các acid amin thànhacid α-cetonic và ngược lại bằng cách vận chuyển nhóm amin GOT khu trúrộng rãi trong cơ thể, được tìm thấy ở tim, gan, thận và cơ xương GOT đượctìm thấy ở bào tương và cả ty thể

Aspartate + α-ceto glutarat AST/GOT

Glutamat + Oxalo acetat [13]Hoạt độ enzym GOT trong huyết thanh thường tăng do các yếu tố: hủy

tế bào, tổn thương hoặc rối loạn trong tế bào và tăng sinh tổng hợp enzymthường gặp trong các bệnh lý về gan đặc biệt tăng cao trong viêm gan dorượu, xơ gan và u gan [13] Ngay khi xảy ra tình trạng tổn thương hoặc chết

tế bào chứa enzym GOT thì chất này sẽ được giải phóng vào tuần hoàn Vìvậy enzym GOT còn dùng để chẩn đoán viêm gan cấp Hoạt độ enzym GOTtrong máu cũng tăng cao trong nhồi máu cơ tim, tăng từ giờ thứ 6 – 12 giờ saucơn đau thắt ngực, đạt đỉnh điểm khoảng 36 – 42 giờ [5] Thời gian bán hủytrong máu là 17 giờ

cơ quan khác [2], [5], [13], [14]

1.1.8 Xét nghiệm định lượng GPT (Glutamat Pyruvat Transaminase)

Đây là một aminotransferase, còn có tên gọi khác là ALT (AlaninAminotransferase) có tác dụng xúc tác sự chuyển hóa các acid amin thànhacid α-cetonic và ngược lại bằng cách vận chuyển nhóm amin GPT khu trúrộng rãi trong cơ thể, được tìm thấy ở gan, thận và nhiều ở tim, cơ xương.GPT được tìm thấy ở bào tương

Glutamat + Pyruvat [13]

Trong hầu hết các bệnh gan, hoạt độ GPT luôn tăng cao hơn so với GOTngoại trừ viêm gan do rượu, xơ gan và u gan Hoạt độ của enzym này tăngkhi có sự hoại tử của tế bào gan, có thể tăng cao gấp 100 lần so với giá trịbình thường GPT là enzym đặc hiệu hơn để chẩn đoán bệnh về gan Ngoài raGPT tăng còn có giá trị để chẩn đoán các bệnh về tim, thận, cơ xương nhưnhồi máu cơ tim, suy tim mất bù, suy giáp hay viêm tụy… [2], [5].

Giá trị bình thường [2]:

- Nam: < 22 UI/L

- Nữ: < 17 UI/L

1.1.9 Xét nghiệm định lượng GGT (Gamma Glutamyl Transferase)

GGT là enzym giữ vai trò xúc tác sự vận chuyển nhóm δ-glutamyl từpeptid và hợp chất chứa nó đến chất nhận GGT được tìm thấy ở ống lượngần của thận, gan, tụy và ruột GGT có mặt ở bào tương và màng tế bào GGT

là chất chỉ điểm nhạy đối với các bệnh lý về gan mật [15]

1.2 CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM

1.2.1 Một số khái niệm liên quan đến chất lượng xét nghiệm

- Chất lượng (Quality) là tập hợp các đặc tính vốn có của sản phẩm đápứng các yêu cầu của khách hàng [4], [8], [9]

- Quản lý chất lượng (Quality Management – QM) là một loạt các hoạtđộng có phối hợp để định hướng và kiểm soát một tổ chức về chất lượng baogồm: chính sách chất lượng, mục tiêu chất lượng, hoạch định chất lượng,kiểm soát chất lượng, đảm bảo chất lượng và cải tiến chất lượng [4], [9], [10],[15].

- Hệ thống quản lý chất lượng (Quality Management System – QMS) làcác hoạt động phối hợp để chỉ đạo và kiểm soát một tổ chức về phương diệnchất lượng Hệ thống quản lý chất lượng bao gồm 12 yếu tố thiết yếu, mỗi yếu

tố là một mắt xích quan trọng của hệ thống [9], [15], [25], [27], [28], [29],(hình 1.6)

2

12 yếu tố thiết yếu của hệ thống chất lượng

Cải tiến liên tục

Tài liệu và

hồ sơ

Mua hàng – kiểm kê

Nhân sự Trang Thiết

Bị

Quản lý thông tin Quản lý qui

trình

QL sự kiện không mong muốn.

Đánh giá

Lấy khách hàng làm trung tâm

Cơ sở vật chất và an toàn

Tổ chức

Hình 1.6 C c thành tố của hệ thống quản lý chất lượng

- Đảm bảo chất lượng xét nghiệm hay còn gọi là QA (QualityAssurance) là toàn bộ các hoạt động có kế hoạch, có hệ thống đảm bảo cho

các yêu cầu cung cấp chất lượng đảm bảo đủ độ tin cậy QA là một vấn đềkhá rộng liên quan đến sự ảnh hưởng chất lượng của một sản phẩm hay dịch

vụ Đảm bảo chất lượng xét nghiệm liên quan đến nhiều yếu tố của phòng xétnghiệm như: chính sách, kế hoạch tổ chức, các quy trình thao tác chuẩn, nhân

sự, cơ sở hạ tầng, trang thiết bị, quản lý hồ sơ… [9], [10], [15], [20]

- Kiểm tra chất lượng (QC - Quality Control) là một quá trình thiết lậpcác yêu cầu về kỹ thuật, về quy trình tiến hành… đảm bảo việc tiến hành kỹthuật xét nghiệm tuân thủ theo đúng tiêu chuẩn đã được đề ra Trong kiểm trachất lượng xét nghiệm thì nội kiểm tra và ngoại kiểm tra chất lượng là haicông cụ quan trọng nhất [9], [10], [15]

- Nội kiểm tra chất lượng IQC (Internal Quality Control) là một quytrình kiểm tra chất lượng trong nội bộ được chính các nhân viên xét nghiệmthực hiện để theo dõi và giám sát liên tục mọi khía cạnh trong quá trình xétnghiệm, giúp kiểm tra độ tin cậy của xét nghiệm và báo kết quả cho bác sĩlâm sàng sử dụng IQC là một công cụ đặc biệt để phát hiện và giám sát lỗingẫu nhiên hoặc hệ thống bằng cách sử dụng các biểu đồ và các quy tắc kiểmsoát chất lượng [16], [27], [28], [29]

- Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm EQA (External QualityAssessment) là một công cụ cơ bản để đánh giá và cải tiến chất lượng phòngxét nghiệm bao gồm việc đánh giá thông qua một cơ quan bên ngoài haythông qua so sánh liên phòng các phòng xét nghiệm [16], [27], [28], [29]

- So sánh liên phòng là việc tổ chức, thực hiện và đánh giá các thửnghiệm trên cùng một mẫu thử nghiệm hoặc mẫu thử nghiệm tương tự đượcthực hiện bởi hai hay nhiều phòng thí nghiệm theo các điều kiện xác địnhtrước [16], [27], [28], [29]

1.2.2 Quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm

Quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm được chia thành 3 giai đoạn:trước, trong và sau xét nghiệm Việc quản lý quy trình hoạt động của phòngxét nghiệm giúp kiểm soát chất lượng của phòng xét nghiệm, phát hiện điểmkhông phù hợp và phân tích nguyên nhân gốc rễ, tìm cách khắc phục lỗi vàcải tiến liên tục chất lượng [4], [16], (hình 1.7) Mỗi giai đoạn đều có khảnăng ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm

1.2.2.1 Giai đoạn trước xét nghiệm

Đây là giai đoạn thường xảy ra lỗi nhất trong quy trình xét nghiệm,chiếm đến 41% [20] Giai đoạn này bao gồm các giai đoạn chuẩn bị cho quátrình xét nghiệm từ khâu thông tin bệnh nhân, điền phiếu biểu mẫu yêu cầu,các giai đoạn thu thập và xử lý mẫu, vận chuyển và tiếp nhận mẫu cho đếnkhâu quản lý mẫu trước xét nghiệm, chuẩn bị và bảo quản bệnh phẩm Tất cảcác quá trình trên đều có thể sai sót gây ảnh hưởng đến tính chính xác của kếtquả xét nghiệm (Ví dụ như điền sai tên bệnh nhân dẫn đến trả kết quả saingười, thu thập mẫu không đúng thể tích, lấy mẫu không đúng cách, vậnchuyển và bảo quản không đúng có thể làm thay đổi nồng độ các chất trongmáu gây ra sai lệch kết quả xét nghiệm cho bệnh nhân…) Vì vậy, việc xâydựng hệ thống quản lý quy trình sẽ kiểm soát được các sai sót trong quá trìnhnhập thông tin bệnh nhân hay xây dựng được quy trình lấy mẫu, vận chuyển

và bảo quản mẫu bệnh phẩm giúp giảm thiểu sai số trong kết quả xét nghiệm

1.2.2.2 Giai đoạn trong xét nghiệm

Đây là giai đoạn quan trọng nhất và cần lưu ý nhất, mặc dù gây ra lỗi chỉchiếm 4% quá trình xét nghiệm [20] Trong giai đoạn này sai sót thường xảy

ra do kỹ thuật phân tích và xử lý kết quả, phương pháp đo của máy móc thiết

bị hay do trình độ tay nghề, chuyên môn của nhân viên xét nghiệm Những sai

sót trong quá trình này thường gặp ở các đơn vị không thực hiện kiểm soátchất lượng, không có quy trình chuẩn và không tuân thủ các quy trình kiểmtra, bảo trì, bảo dưỡng và hiệu chuẩn máy móc hàng năm Để đảm bảo chấtlượng kết quả xét nghiệm thì phòng xét nghiệm cần xây dựng các quy trìnhchuẩn và hướng dẫn tất cả các nhân viên thực hiện xét nghiệm tuân thủ theoquy trình Quy trình này phải chuẩn thức, được xác nhận và cập nhật thườngxuyên Bên cạnh đó, việc thực hiện nội kiểm tra chất lượng và tham gia ngoạikiểm tra chất lượng, định kỳ hiệu chuẩn trang thiết bị giúp nâng cao tínhchính xác, độ tin cậy của kết quả xét nghiệm.

1.2.2.3 Giai đoạn sau xét nghiệm

Giai đoạn này thường gây ra sai sót chiếm 55% trong quá trình xétnghiệm [20] Sau khi hoàn thành xét nghiệm, việc đánh giá, ghi nhận kết quả,lưu và trả kết quả, bảo quản hồ sơ và bảo quản mẫu bệnh phẩm là việc rấtquan trọng Việc bảo quản hồ sơ và trả kết quả cần nhanh chóng, chính xác,tránh sai sót và nhầm lẫn gây ảnh hưởng đến chất lượng phòng xét nghiệm.Tất cả kết quả đều được lưu giữ vào hồ sơ và được kiểm soát chặt chẽ, thuậntiện cho việc tìm kiếm hoặc tra cứu khi có yêu cầu

Hình 1.7 Quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm [3]

1.3 NGOẠI KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG (EQA – External Quality Assessment)

Ngoại kiểm tra là một công cụ quan trọng để giám sát chất lượng trongquá trình xét nghiệm EQA giúp đánh giá và giám sát liên tục việc tiến hànhxét nghiệm của các phòng xét nghiệm tham gia Xác định những yếu tố nguy

cơ có thể ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm nhằm đưa ra những giải phápphòng ngừa EQA giúp so sánh kết quả phân tích giữa các phòng xét nghiệmtham gia và các nhóm phương pháp EQA giúp chứng minh độ tin cậy, độ xácthực của kết quả xét nghiệm đối với lâm sàng Bên cạnh đó EQA còn giúpthẩm định độ không đảm bảo đo của kết quả xét nghiệm [4], [28], [29].Chương trình ngoại kiểm tra chất lượng thường được tổ chức bởi một đơn vịđược giao chức trách ngoại kiểm tra chất lượng, tổ chức này sẽ sản xuất, phânphối mẫu xét nghiệm cho các phòng xét nghiệm thành viên cùng tham gia vàohoạt động ngoại kiểm tra, sau đó thu thập kết quả và tiến hành so sánh, đánhgiá kết quả của các thành viên tham gia Kết quả của phòng xét nghiệm nào bị

sai hoặc nằm ở ngưỡng nguy cơ sẽ được đơn vị tổ chức thông báo, tham giatìm hiểu đánh giá sự không phù hợp, phân tích nguyên nhân gốc rễ để khắcphục và cải tiến lỗi nhằm nâng cao chất lượng [15], [36], [41].

1.3.1 Các phương thức ngoại kiểm tra

Có 3 phương thức được sử dụng trong ngoại kiểm tra chất lượng: Thửnghiệm thành thạo (Proficiency testing – PT), kiểm tra lại/ phân tích lại(Rechecking/Retesting) và đánh giá tại chỗ (On – site evaluation)

Thử nghiệm thành thạo là đơn vị triển khai ngoại kiểm sẽ phân phối mẫungoại kiểm cho các phòng xét nghiệm tham gia Các phòng xét nghiệm phântích mẫu ngoại kiểm và gửi kết quả về đơn vị triển khai để phân tích thống kê,đánh giá kết quả thực hiện Sau đó phòng xét nghiệm nhận bản phân tích kếtquả ngoại kiểm tra từ đơn vị triển khai để xem xét và khắc phục sai số

Kiểm tra lại, phân tích lại là phòng xét nghiệm lựa chọn mẫu ngẫu nhiêngửi đến phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc đơn vị kiểm chuẩn để phân tích vàđánh giá lại các kết quả phân tích mà phòng xét nghiệm đã thực hiện

Đánh giá tại chỗ là đoàn đánh giá được thành lập bởi các cơ quan cóthẩm quyền (Bộ Y tế, Sở Y tế…) hoặc tổ chức được công nhận của quốc gia(Văn phòng công nhận chất lượng, Trung tâm kiểm chuẩn Xét nghiệm…) sẽđến đánh giá phòng xét nghiệm định kỳ hoặc đột xuất Việc đánh giá này căn

cứ vào bảng kiểm, những tiêu chí đã được duyệt Bảng kiểm sẽ khác nhau tùythuộc vào từng lĩnh vực xét nghiệm [4], [36], [41]

1.3.2 Tầm quan trọng của việc thực hiện ngoại kiểm tra

Ngoại kiểm tra chất lượng là một công cụ quan trọng giúp giám sát chấtlượng xét nghiệm, đánh giá được độ tin cậy về kết quả của phòng xét nghiệmtại thời điểm cụ thể Ngoại kiểm tra giúp phòng xét nghiệm biết được nănglực thực hiện kết quả xét nghiệm có đạt chuẩn và đảm bảo độ chính xác và

xác thực hay không để có thể đưa ra phương án khắc phục xử lý nếu có vàtiếp tục nâng cao cải thiện chất lượng chuyên môn cũng như chất lượng hóachất, phương tiện, trang thiết bị…

Ngoại kiểm tra cung cấp bằng chứng khách quan về năng lực phòng xétnghiệm là cơ sở khoa học để công nhận đạt chuẩn quốc tế của phòng xétnghiệm Chương trình ngoại kiểm tra giúp phòng xét nghiệm, bác sĩ lâm sàng,nhà quản lý… tin tưởng vào kết quả xét nghiệm, giúp bệnh nhân giảm đượcthời gian và chi phí khám chữa bệnh Ngoại kiểm tra chất lượng giúp đơn vịkiểm chuẩn nắm được thực trạng, tình hình thực hiện xét nghiệm của cácphòng xét nghiệm để đưa ra những chính sách, tham vấn hỗ trợ phương án cảithiện nâng cao chất lượng xét nghiệm Để đảm bảo tốt nhất cho chất lượng xétnghiệm thì lãnh đạo phòng xét nghiệm cần xây dựng cơ cấu, thiết lập tổ chức,lập kế hoạch và theo dõi cải tiến quy trình tại phòng xét nghiệm và kết hợpvới đơn vị triển khai ngoại kiểm để nâng cao chất lượng chuyên môn cũngnhư chất lượng thực hành tại phòng xét nghiệm

Ngoại kiểm tra giúp duy trì và nâng cao chất lượng phân tích của các xétnghiệm trong phòng thí nghiệm Ngoại kiểm tra là một chương trình giúpnâng cao thỏa thuận liên phòng và tiêu chuẩn chất lượng

1.4 MẪU NGOẠI KIỂM

Mẫu ngoại kiểm là mẫu được sử dụng trong các chương trình ngoại kiểmtra chất lượng xét nghiệm, thường là mẫu mù với giá trị ấn định được xácđịnh dựa vào sự đồng thuận của các phòng xét nghiệm tham gia

Có 2 loại mẫu là mẫu chuẩn RM (Reference Material) và mẫu chuẩnđược chứng nhận CRM (Certified Reference Material) [7], [8], [44], [45].Mẫu chuẩn là vật liệu đủ độ đồng nhất và ổn định về một hoặc nhiều tính chất

quy định, được thiết lập phù hợp với việc sử dụng đã định trong một quá trình

đo [7], [8], [44], [45]

Mẫu chuẩn được chứng nhận là mẫu chuẩn được đặc trưng với một giấychứng nhận cung cấp giá trị của tính chất quy định, độ không đảm bảo kèmtheo và công bố về liên kết chuẩn đo lường [7], [8], [44], [45]

Theo định nghĩa của Cơ quan đo lường hợp pháp quốc tế (OIML): Mẫuchuẩn là một vật liệu hay một chất mà một hay nhiều tính chất của chúng đủđồng nhất và được tạo nên để chuẩn hóa một dụng cụ, đánh giá một phươngpháp đo hoặc để xác định giá trị đối với các vật liệu [10], [44], [45]

1.4.1 Các vật liệu mẫu kiểm chuẩn dùng trong xét nghiệm hóa sinh

Có 3 loại vật liệu có thể được sản xuất làm vật liệu ngoại kiểm dùngtrong xét nghiệm hóa sinh bao gồm: huyết thanh tươi, huyết thanh thêm chất

ổn định và huyết thanh đông khô

1.4.1.1 Vật liệu kiểm chuẩn huyết thanh tươi (Frozen QC material)

Huyết thanh tươi là huyết thanh đươc thu thập và xử lý bằng huyết thanhtrộn từ nhiều mẫu bệnh nhân hoặc huyết tương được tách ra túi máu hết hạncủa ngân hàng máu Huyết thanh chưa thay đổi là huyết thanh đông tự nhiên

C

không cần các giai đoạn hoàn nguyên [36], [39], [59]

1.4.1.2 Vật liệu kiểm chuẩn huyết thanh thêm chất ổn định (Stabilized liquid control material)

Chuẩn bị vật liệu kiểm chuẩn huyết thanh thêm chất ổn định bằng cáchthêm hóa chất hoặc khử trùng Vật liệu kiểm soát được ổn định bằng chất hóahọc có giá cả rẻ, dễ sử dụng và phù hợp trong chương trình nội kiểm tra và

ngoại kiểm tra chất lượng Huyết thanh duy trì độ ổn định tối thiểu 24 ngày ở

bằng cách lọc huyết thanh qua bộ lọc thích hợp Huyết thanh sẽ được ổn định

sẽ có giá thị trường cao hơn [37], [48], [49], [50], [59]

1.4.1.3 Vật liệu kiểm chuẩn đông khô (Lyophilized QC material)

Vật liệu kiểm chuẩn đông khô là huyết thanh được đông khô, thường sửdụng rộng rãi trong quá trình thực hiện nội và đặc biệt là ngoại kiểm tra chấtlượng ở các phòng xét nghiệm lâm sàng Huyết thanh đông khô duy trì độ ổn

C Kỹ thuật này đòi hỏi có sự hoànnguyên chính xác và cẩn thận Đây là loại vật liệu hữu ích nhất dùng để làmmẫu ngoại kiểm và là lựa chọn hàng đầu đối với các nhà sản xuất mẫu ngoạikiểm [37], [48], [49], [50], [59]

1.4.2 Các yêu cầu kỹ thuật sản xuất mẫu ngoại kiểm theo ISO 17043

Dựa theo tiêu chuẩn ISO 17043 về chuẩn bị mẫu thử thành thạo, tiếnhành sản xuất mẫu ngoại kiểm với các yêu cầu kỹ thuật và tiêu chí để đánhgiá chất lượng mẫu ngoại kiểm [9], [46] Các yêu cầu về mẫu thử thành thạo

đó là:

- Các mẫu thử thành thạo cần đồng nhất về mặt chất nền, đại lượng đo,

nồng độ với loại mẫu hoặc vật liệu gặp trong thử nghiệm hay hiệu chuẩnthông thường

- Đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định theo các thiết kế thống kê thích

hợp Lựa chọn ngẫu nhiên theo thống kê số lượng đại diện các mẫu thử thànhthạo từ toàn bộ lô vật liệu thử để đánh giá tính đồng nhất của vật liệu

- Mẫu thử thành thạo phải được chứng tỏ là đủ ổn định để đảm bảo rằng

sẽ không có thay đổi đáng kể nào trong suốt quá trình tiến hành thử nghiệmthành thạo, bao gồm cả điều kiện bảo quản và vận chuyển

Việc đánh giá chất lượng mẫu ngoại kiểm luôn cần thiết để thiết lập rằng

độ đồng nhất và ổn định là phù hợp với mục đích

Việc sản xuất mẫu chuẩn là một quá trình công phu và phức tạp, đòi hỏiphải tuân thủ nghiêm ngặt các quy trình và quy định của ISO Guide 31 [44],ISO Guide 34 [43], ISO Guide 35 [45]

1.4.3 Phương pháp đánh giá chất lượng mẫu ngoại kiểm

Tùy vào các yêu cầu của mẫu sẽ có các phương pháp đánh giá chấtlượng mẫu khác nhau Đối với chương trình sản xuất mẫu ngoại kiểm hóasinh thì hai tiêu chí quan trọng để đánh giá chất lượng mẫu đó là tính đồngnhất và tính ổn định Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN ISO/IEC 17043:2011[9] và theo hướng dẫn TCVN 7366 [8] và TCVN 9596 [10], đơn vị sản xuấtcần kiểm tra đánh giá độ đồng nhất thông qua việc lấy ngẫu nhiên 10% sốlượng mẫu sản xuất trước mỗi lô mẫu chuẩn gửi đến các đơn vị tham gia Bêncạnh đó việc đánh giá độ ổn định cũng là tiêu chí quan trọng cho các bộ mẫuchuẩn Đánh giá tính đồng nhất và tính ổn định theo TCVN 9596 [10] đã đínhkèm theo phụ lục F

1.4.3.1 Đánh giá tính đồng nhất

Mỗi chương trình ngoại kiểm khi triển khai việc gửi mẫu cùng lúc đếncác phòng xét nghiệm thành viên và thu thập lại kết quả, sau đó so sánh kếtquả nên yêu cầu mẫu chuẩn phải đảm bảo tính đồng nhất [9], [42]

Việc đánh giá tính đồng nhất là tiêu chí cần thiết khi tiến hành sản xuấtmẫu ngoại kiểm Nhà sản xuất mẫu chuẩn cần tiến hành đánh giá tính đồngnhất của mẫu chuẩn bằng cách phân tích ngẫu nhiên, có hệ thống hoặc phân

lớp ngẫu nhiên một số đại diện của mẫu chuẩn Việc thử nghiệm, hiệu chuẩndụng cụ, máy móc trang thiết bị, đo lường, lấy mẫu hoặc các hoạt động khácđược thực hiện để đánh giá tính đồng nhất phải phù hợp với TCVN ISO/ IEC

17043 [9] Các thủ tục đo được lựa chọn để đo độ lặp lại của mẫu chuẩn Sốlượng mẫu cần lấy thêm phụ thuộc chủ yếu vào việc nghiên cứu tính đồngnhất giữa các đơn vị bao gói Số lượng tối thiểu các đơn vị bao gói được lựachọn ngẫu nhiên là 10 đến 30, nhưng thường không ít hơn 10 Các nghiên cứu

về tính đồng nhất phải được thiết kế và thực hiện theo TCVN 8245 [7], ISO

13528 [42], ISO 17043 [46]

1.4.3.2 Đánh giá tính ổn định

Để đánh giá tính ổn định của mẫu chuẩn thì việc thử nghiệm, hiệu chuẩn,

đo lường, lấy mẫu đều được tiến hành theo TCVN ISO/IEC 17025 và việcđánh giá dữ liệu đo theo TCVN 8245 [8] và TCVN 9596 [10] Độ ổn địnhphải được đánh giá ngay cả trong điều kiện vận chuyển mẫu từ đơn vị sảnxuất đến các phòng thí nghiệm tham gia ngoại kiểm Phải định kỳ đánh giátính ổn định của mẫu chuẩn sau khi mô tả đặc trưng để xác nhận rằng tất cảcác giá trị được duy trì từ khi sản xuất đến khi hết hạn sử dụng

Do vậy để sản xuất được một mẫu ngoại kiểm chuẩn là một quá trìnhphức tạp và đòi hỏi sự nghiêm ngặt, khắt khe trong từng khâu và phải tuân thủtheo các quy trình, quy định của ISO 31 [44], ISO 35 [45] về sản xuất mẫungoại kiểm

1.5 KỸ THUẬT ĐÔNG KHÔ

1.5.1 Nguyên tắc đông khô

Đông khô là kỹ thuật được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như

y học, nông nghiệp và bảo quản thực phẩm… dùng để bảo quản và lưu giữmẫu Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang

ở trạng thái lạnh sâu Ở đây mẫu bệnh phẩm sẽ được làm lạnh trong môitrường chân không Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu đượclàm khô đến mức nhất định Mẫu được đóng kín để cho môi trường chứa mẫu

là chân không

Nguyên lý của quá trình đông khô là nguyên liệu được đông lạnh độtngột tại điểm chuyển pha, khiến nước từ thể lỏng sang thể rắn, tiếp tục xử lýchân không thăng hoa thành thể hơi Sau đó ngưng tụ thành nước rồi thải rangoài Theo nguyên lý này, sản phẩm được làm đông khô vẫn giữ nguyênhình thái, khi hoàn nguyên bằng nước cất hoặc dung dịch thích hợp thì sảnphẩm sẽ trở lại trạng thái ban đầu

Quá trình đông khô trải qua 03 giai đoạn:

Giai đoạn làm lạnh: trong giai đoạn này mẫu bệnh phẩm được làm lạnh

áp suất hơi nước trong bình giảm làm so với trong lòng vật liệu dẫn tới hiệntượng thoát ẩm trong lòng vật liệu Kết thúc giai đoạn này khoảng 10% – 15%nước thoát ra khỏi bệnh phẩm

Giai đoạn thăng hoa: trong giai đoạn này nhờ dòng nhiệt chủ yếu là cácbức xạ từ các tấm bức xạ, nước trong vật liệu sấy bắt đầu thăng hoa Độ ẩmcủa vật liệu sấy giảm rất nhanh, giai đoạn này có tốc độ và nhiệt độ sấy không

C Đến đây quá trình thăng hoa kết thúc

Giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại: trong giai đoạn này áp suất trong bìnhthăng hoa vẫn duy trì bé hơn áp suất bên ngoài nhờ bơm chân không và mẫuvẫn tiếp tục được gia nhiệt, nước vẫn tiếp tục từ thể rắn sang thể hơi và đi vào

bình thăng hoa, giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại chính là quá trình sấy chânkhông bình thường, kết thúc quá trình đông khô mẫu [12], [54].

1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và áp suất hơi đến quá trình đông khô

Yếu tố quan trọng trong hệ thống sấy thăng hoa là năng lượng Nănglượng được cung cấp dưới dạng nhiệt để thăng hoa một gam nước từ thể đônglạnh sang thể khí gấp 10 lần năng lượng cần để đóng băng một gam nước Vìvậy, khi tất cả các điều kiện khác đã phù hợp, nhiệt lượng phải được cung cấpđầy đủ cho sản phẩm để thúc đẩy quá trình loại bỏ hơi nước ra khỏi sản phẩmlạnh đông Cần kiểm soát nhiệt lượng một cách cẩn thận tránh sự thoát nhiềunhiệt hơn so với quá trình làm lạnh bay hơi trong hệ thống có thể làm tăngnhiệt sản phẩm đến mức vượt quá nhiệt độ phá vỡ cấu trúc hoặc nhiệt độeutecti của sản phẩm Có nhiều cách cung cấp nhiệt đó là cấp nhiệt trực tiếpqua kệ dẫn nhiệt khi sấy khay hay sử dụng nhiệt môi trường bức xạ nhiệt khisấy với giá chia mẫu [12], [54]

Bảng 1.1 Mối quan hệ giữa p suất hơi và nhiệt độ

1.5.3 Ưu và nhược điểm của phương pháp đông khô so với các phương pháp khác

Phương pháp đông khô là một phương pháp hiện nay được ứng dụng khárộng rãi trong việc bảo quản sinh phẩm trong lĩnh vực y học Phương phápđông khô thường được sử dụng để sản xuất thuốc hay vắc xin và các hóa chấtsinh phẩm dùng trong các trường hợp nội kiểm tra và ngoại kiểm tra chấtlượng xét nghiệm

Ưu điểm của phương pháp đông khô đó là dễ dàng trong việc xử lý chấtlỏng và vô trùng, tăng độ ổn định ở dạng bột khô,loại bỏ nước mà không làmquá nóng sản phẩm, vì thế ít bị ảnh hưởng đến các thành phần trong sảnphẩm Ngoài ra phương pháp đông khô còn dễ hòa tan và hoàn nguyên lạigiống sản phẩm ban đầu khi bù lại lượng nước đã mất và vận chuyển dễ dàngkhông sợ làm đổ dung dịch ra ngoài như các phương pháp khác

Nhược điểm của phương pháp đông khô đó là tốn thời gian xử lý mẫu vàchi phí đông khô, máy móc đông khô đắt tiền Ngoài ra việc đông khô mẫubắt buộc hoàn nguyên phải cẩn thận, tỉ mỉ và chính xác

1.6 PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH

Đông lạnh là kỹ thuật được áp dụng rộng rãi để bảo quản và lưu giữ mẫulâu dài trong nhiều lĩnh vực khác nhau như y học, nông nghiệp và bảo quảnthực phẩm… Đông lạnh là quá trình bảo quản mẫu bệnh phẩm ở trạng thái

C Ở đây mẫu bệnh phẩm sẽ được làmlạnh nhanh và bất hoạt các hoạt động của các enzym, protein, lipid… làm chocác tế bào ngừng hoạt động ở trạng thái đóng băng Trong quá trình này, nướcđược chuyển đổi trực tiếp từ trạng thái lỏng sang trạng thái tinh thể sau khitiếp xúc trực tiếp với nitơ lỏng

Ưu điểm của phương pháp này là đảm bảo về chất nền tối thiểu của mẫu,không cần hoàn nguyên mẫu Dễ thực hiện và bảo quản mẫu trong thời giandài.

Nhược điểm của phương pháp này đó chính là giá thành cao, đòi hỏiphải có trang thiết bị là tủ đông sâu Ngoài ra, các mẫu được bảo quản bằngphương pháp đông lạnh thường có khó khăn trong vấn đề vận chuyển mẫuđến các vùng sâu vùng xa

1.7 TÌNH HÌNH NGOẠI KIỂM HÓA SINH TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.7.1 Tình hình ngoại kiểm hóa sinh trên thế giới

Các chương trình ngoại kiểm đã bắt đầu từ nhiều thập kỉ trước ở trên thếgiới Chúng là công cụ cơ bản để đánh giá chất lượng của phòng xét nghiệm.Chương trình ngoại kiểm tra chất lượng được triển khai rộng rãi trên các lĩnhvực: Sinh hóa, huyết học, vi sinh, ký sinh trùng… Đến cả lĩnh vực khó triểnkhai ngoại kiểm như giải phẫu bệnh cũng đã bắt đầu triển khai vào năm 2017.Chương trình ngoại kiểm hóa sinh là một trong các lĩnh vực bắt đầu triển khaikhá sớm vào năm 1969 tại Anh [23] với 650 phòng xét nghiệm tham gia vàtriển khai 20 – 35 chỉ tiêu Năm 1988 [19], các nước Trung đông đã tiến hànhngoại kiểm tra chất lượng hóa sinh được 7 năm, mẫu ngoại kiểm được phânphối từ nước Anh và có 88 đơn vị tham gia ngoại kiểm Và đến nay thìchương trình ngoại kiểm hóa sinh đã phổ biến khắp các nước trên thế giới vàtriển khai rộng rãi các chỉ số hóa sinh Các mẫu ngoại kiểm hóa sinh ban đầuchỉ đánh giá chất lượng của 20 – 24 chỉ số hóa sinh [19] đến nay đã lên đến

100 chỉ số Một số đơn vị triển khai ngoại kiểm hóa sinh trên thế giới đượcbiết đến như là Randox (Anh), CLIA (Mỹ), RCPA (Öc) và CMPT (Canada)…