Độc tính của xi măng nhựa tự dán trên nguyên bào sợi 3t3

DANH MỤC BẢNG1.1 Tóm tắt một số nghiên cứu về độc tính của vật liệu 132.2 Thông tin các loại xi măng sử dụng trong nghiên cứu 163.3 Phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết t

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

- -ĐẶNG THỊ LAN ANH

ĐỘC TÍNH CỦA XI MĂNG NHỰA TỰ DÁN

TRÊN NGUYÊN BÀO SỢI 3T3

Nghiên cứu In Vitro

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

MỤC LỤC

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Khả năng gây độc tế bào của vật liệu nha khoa 5

1.2 Một số thử nghiệm In Vitro đánh giá khả năng gây độc tế bào 5

1.2.1 Các thử nghiệm quan sát hình thái 6

1.2.2 Các thử nghiệm đánh giá sự chuyển hóa hoặc chức năng tế bào 6

1.2.3 Các thử nghiệm khác về chức năng tế bào 7

1.3 Sự tiếp xúc giữa vật liệu và tế bào trong thử nghiệm độc tính 8

1.4 Tương hợp sinh học của xi măng gắn 9

1.4.1 Xi măng GIC 9

1.4.2 Xi măng GIC lai 10

1.4.3 Xi măng resin 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 16

2.1.1 Nguồn tế bào 16

2.1.2 Vật liệu 16

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

2.2.2 Thiết kế nghiên cứu 17

2.2.3 Chuẩn bị trước khi nghiên cứu 17

2.3 THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU 20

2.3.1 Chuẩn bị tế bào 20

2.3.2 Chuẩn bị dịch chiết 23

2.4 TÓM TẮT QUI TRÌNH THỰC HIỆN 33

2.5 BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU 33

2.5.1 Biến số độc lập 33

2.5.2 Biến số phụ thuộc: biến số định lượng 33

2.6 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ 33

2.7 CÁC BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC SAI SỐ 34

Chương 3: KẾT QUẢ 36

4.1 ĐỘC TÍNH CỦA DỊCH CHIẾT TRỰC TIẾP 37

4.2 ĐỘC TÍNH CỦA DỊCH CHIẾT GIÁN TIẾP 41

4.3 SO SÁNH DỊCH CHIẾT TRỰC TIẾP VÀ DỊCH CHIẾT GIÁN TIẾP 45

Chương 4: BÀN LUẬN 48

4.1 VỀ PHƯƠNG PHÁP VÀ DÒNG TẾ BÀO NGHIÊN CỨU 48

4.1.1 Về phương pháp nghiên cứu 48

4.1.2 Về dòng tế bào nghiên cứu 50

4.2 VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51

4.3 Ý NGHĨA VÀ ỨNG DỤNG CỦA ĐỀ TÀI 58

4.4 HẠN CHẾ CỦA NGHIÊN CỨU 58

KẾT LUẬN 59

KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

4-META 4-methacryloyloxyethy trimellitate anhydride

DANH MỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT-ANH

Thử nghiệm dịch chiết Test on extract

Xi măng nhựa tự dán Self-adhesive resin cement

DANH MỤC BẢNG

1.1 Tóm tắt một số nghiên cứu về độc tính của vật liệu 132.2 Thông tin các loại xi măng sử dụng trong nghiên cứu 163.3 Phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết trực tiếp đối

với từng loại vật liệu

36

3.4 So sánh phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết trực

tiếp giữa các vật liệu

37

3.5 So sánh phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết trực

tiếp giữa Fuji I và Fuji Plus

38

3.6 So sánh phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết trực

tiếp giữa Fuji I và G Cem

39

3.7 So sánh phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết trực

tiếp giữa Fuji Plus và G Cem

39

3.8 Phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết gián tiếp đối

với từng loại vật liệu

40

3.9 So sánh phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết gián

tiếp giữa các vật liệu

41

3.10 So sánh phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết gián

tiếp giữa Fuji I và Fuji Plus

42

3.11 So sánh phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết gián

tiếp giữa Fuji I và G Cem

43

3.12 So sánh phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết gián

tiếp giữa Fuji Plus và G Cem

43

3.13 So sánh phần trăm tế bào sống của Fuji I giữa dịch chiết trực tiếp

và dịch chiết gián tiếp

44

3.14 So sánh phần trăm tế bào sống của Fuji Plus giữa dịch chiết trực

tiếp và dịch chiết gián tiếp

45

3.15 So sánh phần trăm tế bào sống của G Cem giữa dịch chiết trực tiếp

và dịch chiết gián tiếp

46

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

4.1 Phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết trực tiếp giữa

các loại vật liệu

55

4.2 Phần trăm tế bào sống ở các lần pha loãng dịch chiết gián tiếp

giữa các loại vật liệu

56

DANH MỤC HÌNH

2.4 Tế bào nguyên bào sợi 3T3 thế hệ thứ 8 ở vật kính 10X 21

2.6 Dịch chiết trực tiếp nồng độ 100% thu được sau 24 giờ 252.7 Đo pH dịch chiết trực tiếp của các loại vật liệu 252.8 Nồng độ dịch chiết trực tiếp các vật liệu sau khi pha loãng 262.9 Mô hình các bước tạo hệ thống thân răng trong nghiên cứu 26

2.11 Sử dụng sáp inlay che kín bề mặt xoang phía thân răng 282.12 Ngâm các khối vật liệu và nhóm chứng vô môi trường DMEM 292.13 Dịch chiết gián tiếp nồng độ 100% thu được sau 24 giờ 302.14 Nồng độ dịch chiết gián tiếp các vật liệu sau khi pha loãng 302.15 Cấy tế bào ra đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào/ml 313.16 Hình ảnh tế bào 3T3 tiếp xúc với dịch chiết xi măng sau 24 giờ 35

MỞ ĐẦU

Sự thành công lâm sàng của phục hình cố định phụ thuộc nhiều yếu tố, baogồm cả việc lựa chọn xi măng gắn phù hợp Từ thực tế gắn những phục hình cố địnhtrên răng tủy sống, sẽ có sự tiếp xúc trực tiếp giữa xi măng gắn với phức hợp ngà tủy,được cho là một trong những nguyên nhân gây nhạy cảm và ê buốt sau can thiệp Do

đó, ngoài các đặc điểm hóa học, cơ học, vật lý đảm bảo cho khả năng gắn dính, tươnghợp sinh học của xi măng gắn trên tế bào tủy răng là một yêu cầu quan trọng và cầnthiết

Việc gia tăng mối quan tâm của nha sĩ và bệnh nhân về phục hình thẩm mỹgiống màu răng đã làm gia tăng mức độ phổ biến của phục hình toàn sứ, từ đó cũngthúc đẩy sự sáng tạo và cải tiến hệ thống xi măng gắn cho phục hình thẩm mỹ Sosánh với các xi măng gắn truyền thống, xi măng nhựa có những ưu điểm về thẩm mỹ,cải thiện độ lưu giữ, ít vi kẽ, độ hòa tan thấp Tuy nhiên, xi măng nhựa chứa cácmonomer nhựa như: HEMA, Bis-GMA, TEGDMA, UDMA có khả năng gây độccao Hơn nữa, việc xử lí ngà răng bằng acid để loại bỏ lớp mùn ngà trước khi sử dụng

xi măng nhựa sẽ làm tăng tính thấm ngà từ đó cũng làm tăng khả năng gây độc của

xi măng nhựa

Xi măng nhựa tự dán ra đời năm 2002, hầu hết thuộc loại lưỡng trùng hợp,kết hợp các thành phần tự trùng hợp và quang trùng hợp, có thể bắt đầu một phản ứngtrùng hợp mà không cần chiếu đèn Cơ chế lưỡng trùng hợp đảm bảo chất lượngpolymer hóa của xi măng, bù đắp cho sự giảm ánh sáng trong quang trùng hợp do độdày và độ mờ đục của phục hình Từ đó làm giảm tỉ lệ các monomer tự do khôngđược trùng hợp hoàn toàn có khả năng gây độc Xi măng kết hợp tác nhân dán và ximăng trong một sản phẩm, rút gọn qui trình gắn chỉ gồm một bước đơn giản, dễ thaotác, giảm thời gian trên lâm sàng Do không cần các bước xử lí bề mặt răng trước khigắn, lớp mùn ngà không bị loại bỏ, nên được cho là không gây nhạy cảm sau gắn Sự

dán dính vào các cấu trúc mô răng không có sự hình thành của các đuôi nhựa trongống ngà [4], từ đó có thể ngăn chặn làm giảm tác động gây hại cho tủy [15], [36].

Với tính thuận tiện và đa năng, xi măng nhựa tự dán hiện được nhiều nhàlâm sàng lựa chọn Tuy nhiên, các nghiên cứu đánh giá độc tính tế bào của xi măngnày vẫn chưa được thực hiện nhiều và kết quả không thống nhất

Năm 2015, Rita Trumpaite- Vanagiene [30] nghiên cứu trên nguyên bào sợinướu răng đã kết luận xi măng nhựa tự dán và xi măng GIC lai đều gây độc tế bào.Trong khi đó, năm 2016, Fonseca [8] nghiên cứu trên tế bào nguyên bào ngà MDPC-

23 và tế bào tủy răng người kết luận xi măng nhựa tự dán và xi măng GIC lai khônggây độc cho tế bào Từ các kết luận khác nhau như vậy, cho thấy đây cũng là vấn đềcần được nghiên cứu thêm

Nhiều nghiên cứu độc tính tế bào in vitro dựa trên đánh giá mức độ sốngcủa tế bào khi tiếp xúc với dịch chiết trực tiếp của vật liệu Tuy nhiên, trên thực tế,khả năng gây độc của vật liệu nha khoa, phụ thuộc vào khả năng của vật liệu khuếchtán qua ngà răng và tích lũy trong tủy ở nồng độ đủ cao để gây ra các vấn đề trên tủy

Vì vậy, mô hình sử dụng rào cản ngà răng là phương pháp tốt để đánh giá các độctính trên tủy của vật liệu nha khoa

Vì vậy, nghiên cứu in vitro này được thực hiện nhằm đánh giá độc tính trên

tế bào nguyên bào sợi 3T3 của xi măng nhựa tự dán lưỡng trùng hợp (G-Cem) theophương pháp trực tiếp và gián tiếp qua rào cản ngà răng, so sánh với hai loại xi măngthông dụng là xi măng Glass Ionomer tăng cường nhựa ( Fuji Plus) và xi măng GlassIonomer (Fuji I)

Câu hỏi nghiên cứu

Có hay không sự khác biệt độc tính trên tế bào nguyên bào sợi 3T3 của ximăng nhựa tự dán (G-CEM) so với xi măng Glass Ionomer tăng cường nhựa (FujiPlus) và xi măng Glass Ionomer (Fuji I)?

Giả thuyết nghiên cứu

Có sự khác biệt độc tính trên tế bào nguyên bào sợi 3T3 của xi măng nhựa

tự dán (G-CEM) so với xi măng Glass Ionomer tăng cường nhựa (Fuji Plus) và ximăng Glass Ionomer (Fuji I)

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu tổng quát

Đánh giá độc tính trên tế bào nguyên bào sợi 3T3 của xi măng nhựa tự dánlưỡng trùng hợp (G-CEM) theo phương pháp trực tiếp và gián tiếp qua rào cản ngàrăng, so sánh với xi măng Glass Ionomer tăng cường nhựa (Fuji Plus) và xi măngGlass Ionomer (Fuji I)

Mục tiêu chuyên biệt

1 Xác định và so sánh tác động gây độc tế bào giữa ba loại xi măng gắn

2 Xác định và so sánh tác động gây độc tế bào giữa hai phương pháp nghiên

cứu: phương pháp trực tiếp và gián tiếp qua rào cản ngà răng

3 Xác định và so sánh tác động gây độc tế bào giữa các nồng độ dịch chiết

khác nhau

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khả năng gây độc tế bào của vật liệu nha khoa

Tương hợp sinh học trong nha khoa được định nghĩa là khả năng của mộtvật liệu thực hiện chức năng của nó trong ứng dụng điều trị với một phản ứng thíchhợp của cơ thể người nhận (ISO 1942) Đặc tính tương hợp sinh học được nghiên cứusâu rộng, để đảm bảo điều trị an toàn cho bệnh nhân và sức khỏe của nhà lâm sàng

Do hầu hết các vật liệu sinh học được sử dụng trong nha khoa có ảnh hưởng trực tiếphoặc gián tiếp vào các tế bào lân cận hoặc các mô, do đó cần phải đảm bảo đặc tínhtương hợp sinh học trước khi ứng dụng vật liệu trên lâm sàng

Đánh giá khả năng gây độc tế bào của vật liệu nha khoa là rất quan trọng từhai quan điểm Đầu tiên, kiểm tra khả năng gây độc tế bào đã trở thành một phươngtiện được chấp nhận để sàng lọc vật liệu nha khoa về tính tương hợp sinh học (ADA,1979; ANSI / ADA, 1982) Việc cải tiến thử nghiệm này sẽ cung cấp một phươngtiện chính xác hơn để sàng lọc vật liệu mới, giúp giảm yêu cầu thử nghiệm trên độngvật hoặc trên con người Thứ hai, sự tương tác của vật liệu và các thành phần của vậtliệu với các tế bào ở cấp độ phân tử có thể chịu trách nhiệm cho các phản ứng ở cấp

độ mô như viêm, hoại tử, gây đáp ứng miễn dịch và sinh ung thư Hiểu được tươngtác giữa vật liệu và tế bào là cần thiết để hiểu được cách các vật liệu gây ra các đápứng trong cơ thể

1.2 Một số thử nghiệm In Vitro đánh giá khả năng gây độc tế bào

Các thử nghiệm in vitro có một số ưu điểm như: dễ dàng kiểm soát các điềukiện thí nghiệm, được chuẩn hóa, có thể lặp lại, thực hiện nhanh, chi phí tương đốithấp, thích hợp cho việc đánh giá các đặc tính sinh học cơ bản của vật liệu Nhược

điểm của thử nghiệm in vitro là mức độ phù hợp tương đối giữa điều kiện mô phỏngtrong phòng thí nghiệm và thực tế trên cơ thể người để áp dụng các kết quả thử nghiệm

1.2.1 Các thử nghiệm quan sát hình thái

Đánh giá sự chết tế bào gây ra bởi vật liệu bằng cách đánh giá số lượng tếbào hoặc sự tăng trưởng tế bào trước và sau khi tiếp xúc với vật liệu Thử nghiệmtính thấm qua màng tế bào được sử dụng để đánh giá khả năng gây độc bởi sự thấmcủa một loại thuốc nhuộm qua màng tế bào, vì tế bào có màng thấm được thuốcnhuộm là tương đương hoặc gần như tương đương với tế bào chết

1.2.2 Các thử nghiệm đánh giá sự chuyển hóa hoặc chức năng tế bào

Một số thử nghiệm sử dụng hoạt động sinh tổng hợp hoặc hoạt động enzymcủa tế bào nhằm đánh giá phản ứng gây độc tế bào

− Thử nghiệm đo lường sự tổng hợp protein hoặc DNA (deoxyribonucleicacid)

− Thử nghiệm enzym:

 Thử nghiệm xanh Alamar định lượng sự tăng sinh tế bào bằng cách sửdụng chất chỉ thị phát huỳnh quang cho phép theo dõi tế bào liên tục theothời gian

 Thử nghiệm sắc ký dựa trên những loại muối tetrazolium: thử nghiệmMTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide],MTS [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl) - 2H - tetrazolium], thử nghiệm NBT (nitroblue tetrazolium),thử nghiệm XTT [muối 2,3-Bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) - 2H –tetrazolium-5 - carboxanilide

 Thử nghiệm MTS

Phương pháp khử muối tetrazolium là phương pháp đáng tin cậy, thườngđược sử dụng để khảo sát độc tính tế bào của các loại vật liệu

MTS (3 (4,5dimethylthiazol2yl) – 5 (3carboxymethoxyphenyl) – 2 (4-sulfophenyl) - 2H - tetrazolium) khi có mặt PMS (phenazine methosulfate) sẽ được

-tế bào chuyển hóa, tạo ra một sản phẩm formazan tan trong môi trường nuôi cấy -tếbào, hấp thụ ánh sáng tối đa ở bước sóng 490-500 nm trong PBS ( phosphate-bufferedsaline) Sự chuyển đổi này được cho là do enzyme dehydrogenase phụ thuộc NADHtrong các tế bào sống

Hình 1.1: Nguyên tắc của thử nghiệm MTSLượng formazan tạo ra sẽ được định lượng bằng lượng ánh sáng ở bướcsóng 492nm bị hấp thụ và tỷ lệ thuận với lượng tế bào sống trong môi trường nuôicấy đó Số lượng tế bào càng lớn tạo ra một lượng Formazan càng lớn, do đó làm tăngmật độ quang Đánh giá sự thay đổi mật độ quang giúp đánh giá được sự thay đổi tỉ

lệ tế bào còn sống ở thời điểm khảo sát Từ đó, xác định khả năng gây độc của nhữngcác loại thuốc và vật liệu Phương pháp MTS thường được coi là phương pháp MTT

1 bước, có tính tiện lợi cao do chỉ cần thêm thuốc thử trực tiếp vào môi trường nuôicấy tế bào mà không cần bước hòa tan tinh thể như trong thử nghiệm MTT

1.2.3 Các thử nghiệm khác về chức năng tế bào

Những thử nghiệm in vitro đo lường chức năng miễn dịch hoặc các phảnứng mô khác cũng đã được sử dụng Những thử nghiệm này đo lường sự sản xuấtcytokine từ các lympho bào và các đại thực bào, sự tăng sinh lympho bào, hoá hướng

động… Một số thử nghiệm khác lại đo lường khả năng của vật liệu làm thay đổi chutrình tế bào hoặc kích hoạt bổ thể Tầm quan trọng in vivo của những thử nghiệm nàyvẫn chưa được xác định chắc chắn, nhưng phần lớn cho thấy đầy hứa hẹn có thể làmgiảm số lượng thử nghiệm cần thiết trên động vật để đánh giá tính tương hợp sinhhọc của vật liệu.

1.3 Sự tiếp xúc giữa vật liệu và tế bào trong thử nghiệm độc tính

Các thử nghiệm in vitro, thực hiện bên ngoài cơ thể sống, trong đó, vật liệuhoặc thành phần của vật liệu tiếp xúc với tế bào Sự tiếp xúc có thể được chia thành

ba loại

 Vật liệu được đặt tiếp xúc trực tiếp với tế bào: được sử dụng trong nhữngtrường hợp vật liệu có tỷ trọng thấp Một phần vật liệu được đặt trực tiếp vôtrong môi trường nuôi cấy có những tế bào đang tăng trưởng Độc tính củavật liệu sẽ được đánh giá thông qua sự hiện diện những tế bào bị biến dạng,thoái hóa, ly giải xung quanh vùng tiếp xúc với vật liệu

 Dịch chiết của vật liệu tiếp xúc với tế bào: vật liệu được ngâm trong môitrường nuôi cấy với tỉ lệ phù hợp Sau khoảng thời gian ủ, các thành phầncủa vật liệu khuếch tán vô môi trường nuôi cấy Dịch chiết thu được sau đóđược sử dụng để nuôi cấy tế bào và đánh giá những thay đổi trên những tếbào được nuôi cấy

 Vật liệu được đặt tiếp xúc gián tiếp với tế bào qua một rào cản: Bởi vì sựtiếp xúc trực tiếp thường không xảy ra giữa tế bào và vật liệu khi sử dụngtrên cơ thể sống, nên một số thử nghiệm in vitro có rào cản (thử nghiệmgián tiếp) đã được phát triển nhằm mô phỏng tình trạng trong cơ thể sống.Các rào cản thường được sử dụng là: thạch, màng lọc vi lỗ, ngà răng

 Phương pháp khuyếch tán qua thạch: Trong phương pháp này, một lớp

mỏng thạch giàu dinh dưỡng cho tế bào được đặt bên trên lớp tế bào nuôicấy Vật liệu (hoặc dịch chiết của vật liệu dạng khô trên giấy lọc) được

đặt bên trên lớp thạch Độc tính của vật liệu sẽ khuếch tán quá lớp thạch

và gây ảnh hưởng lên tế bào nuôi cấy bên dưới

 Phương pháp sử dụng màng lọc vi lỗ: lớp đơn tế bào tăng trưởng trên

màng lọc rồi lật màng lọc lại để vật liệu thử nghiệm đặt trên màng lọc vànhững thành phần của vật liệu khuếch tán qua lỗ lọc có thể tương tác với

tế bào

 Phương pháp sử dụng rào cản ngà: Trong cơ thể sống, ngà răng đóng

vai trò là một rào cản, thông qua đó các vật liệu độc hại phải khuếch tánqua được lớp ngà để tiếp xúc tủy răng Như vậy, sự hiện diện và độ dàycủa ngà răng trực tiếp liên quan đến sự bảo vệ tủy Phương pháp này môphỏng điều kiện trên lâm sàng, trong đó vật liệu sẽ tiếp xúc với một mặtcủa lớp ngà, dung dịch môi trường nuôi cấy tế bào sẽ tiếp xúc với mặtcòn lại Các thành phần của vật liệu có thể khuyếch tán qua lớp ngà, vàdịch chiết gián tiếp thu được sau đó sẽ dùng để nuôi cấy tế bào và đánhgiá ảnh hưởng của vật liệu lên chuyển hóa tế bào Ngoài ra, tế bào cũng

có thể được nuôi cấy cùng lúc trong môi trường nuôi cấy tiếp xúc giántiếp với vật liệu qua lớp ngà Phương pháp sử dụng rào cản ngà thườngđược ưu tiên sử dụng khi đánh giá độc tính của vật liệu trên tế bào tủyrăng

1.4 Tương hợp sinh học của xi măng gắn

Mặc dù vật liệu dùng trong nha khoa phục hồi và các loại xi măng nha khoa

đã có nhiều cải tiến về tính chất hóa lý, mức độ gây độc của vật liệu, tuy nhiên mức

độ gây độc trong các thử nghiệm in vitro vẫn còn khá cao Vì vậy, việc đánh giá lạicác tính chất hóa, lý và khả năng sinh học của vật liệu là cần thiết

1.4.1 Xi măng Glass Ionomer (GIC)

Vào năm 1969, xi măng Glass Ionomer được tìm ra bởi Wilson và Kentdựa trên phản ứng axit – bazơ giữa bột aluminosilicate glass và dung dịch polymers,copolymers của axit acrylic, bao gồm axit itaconic, axit maleic và axit tricarboxylic

GIC được định nghĩa bởi McLean, Nicholson và Wilson “xi măng bao gồm bột thủytinh và dung dịch polymer của axit, mà quá trình đông là phản ứng axit – bazơ giữacác thành phần GIC có nhiều ưu điểm như: gắn hóa học vào răng, độ giãn nở vì nhiệtgiống mô răng, độ đàn hồi tương tự ngà răng, chống lại sự hòa tan của axit, có độ épmỏng cao, giữ độ nhớt ổn định một thời gian ngắn sau trộn tạo sự thuận lợi để gắnphục hình GIC được coi như một vật liệu tương hợp sinh học, với khả năng gắn hóahọc vào cấu trúc răng, khả năng phóng thích fluor, và khả năng tái khoáng hóa thươngtổn sâu răng Một vài bất lợi của GIC như có thể gây nhạy cảm, dễ bị mòn trong vùngchịu lực nhai lớn.

GIC phóng thích lượng flour cao nhất trong 24h đầu sau khi đông và lượngflour phóng thích có khả năng gây độc tủy răng Một số nghiên cứu in vitro như củaChang YC, Chou MY (2001) [5], Theiszova M và cs (2008) [35] đã cho thấy flourgây độc lên tế bào tủy răng ở người bằng việc ngăn cản sự tăng trưởng của tế bào, sựtăng sinh, hoạt động nội bào, tổng hợp protein và gây ra sự chết tế bào theo chươngtrình

Trong nghiên cứu của Tatjana Kanjevac và cs (2012) [19] đã cho thấy lượngfluor phóng thích tương quan trực tiếp với hoạt động gây độc trên tế bào gốc tủy răngcủa các xi măng GIC Những loại vật liệu phóng thích ít flour như Fuji I, Fuji Triage,Composit thì khả năng gây độc tế bào ít hơn so với những loại GIC phóng thích flourcao như Fuji Plus, Fuji VIII, Vitrebond

1.4.2 Xi măng Glass Ionomer tăng cường nhựa (RMGIC)

Sự phát triển của GIC dẫn đến sự ra đời của vật liệu lai được biết đến vớitên gọi xi măng Glass Ionomer tăng cường nhựa (resin modified glass ionomercement - RMGIC) Nó là sự kết hợp của GIC với các monomer như 2-hydroxyethylmethacrylate (HEMA), triethylene glycol dimethacrylate (TEGDMA) So sánh vớiGIC thông thường, RMGIC tăng cường độ bền uốn, độ bền kéo, mô đun đàn hồi vàkháng mòn Bất lợi chính của RMGIC là độc tính cao hơn so với GIC truyền thống[25]

GIC lai phóng thích flour gây độc tế bào [19] và ngoài ra, hầu hết các tácgiả đều cho rằng các monomer tự do không được trùng hợp như HEMA, TEGDMA,UDMA chịu trách nhiệm gây độc tế bào Thành phần này có tính ái nước và trọnglượng phân tử nhẹ, do đó dễ dàng xuyên qua các ống ngà, và đến tế bào tủy răng, ởđây, kết hợp với màng lipid của tế bào gây ra hiện tượng loạn năng màng tế bào vàdẫn đến chết tế bào [3] Mặc dù có nhiều cải tiến xi măng GIC lai, lượng monome tự

do không trùng hợp trong xi măng đã giảm, tuy nhiên vẫn không có sự chuyển đổihoàn toàn trong quá trình trùng hợp Mặc dù số lượng monome còn lại là ít hơn 1,5-5%, nhưng đủ để góp phần gây ra các tác động gây độc tế bào trong các thử nghiệm

Trong một nghiên cứu in vitro của Rita Trumpaite- Vanagiene [30] về độctính của các loại xi măng gắn thường được sử dụng, Hoffmann’s Zinc Phosphate(Hoffmann’s ZP), GC Fuji Plus (RMGIC) and 3M ESPE RelyX Unicem ResinCement (RelyX Unicem RC) trên nguyên bào sợi nướu răng người Nhà nghiên cứu

đã kết luận, Hoffmann’s ZP ít gây độc nhất, trong khi RMGIC và RelyX Unicem RCthì độc tế bào nhiều hơn (ANOVA, p<0,001)

1.4.3 Xi măng nhựa (RC)

Vật liệu nhựa được sử dụng đã lâu trong nha khoa với vai trò là xi mănggắn phục hình và vật liệu phục hồi Trong các thử nghiệm in vitro, các loại nhựa hóatrùng hợp và quang trùng hợp thường gây độc tế bào từ 24-72 giờ trong môi trườngnuôi cấy, mặc dù một vài hệ thống mới hơn dường như giảm thiểu khả năng gây độc.Khả năng gây độc tế bào giảm một cách có ý nghĩa từ 24-48 giờ sau khi đông Mộtvài nghiên cứu đã cho thấy một số loại nhựa vẫn còn khả năng gây độc tế bào in vitro

đến 4 tuần Trong các trường hợp, vật liệu gây độc tế bào là do một số monomer nhựađược phóng thích như: Triethylene Glycol Dimetharylate Bisphenol-A-glycidylMethacrylate, Urethane Dimethacrylate, Ethyleneglycol Dimethacrylate,Diethyleneglycol Dimethacrylate…Các nghiên cứu chỉ ra rằng nhựa quang trùng hợpthì ít độc tế bào hơn so với nhựa hóa trùng hợp, nhưng kết luận này phụ thuộc vàohiệu quả gây trùng hợp của ánh sáng và hệ thống nhựa.

Goldberg (2008) [15] khẳng định sau 3 ngày trám với composite quangtrùng hợp và hóa trùng hợp với ngà có độ dày còn lại 0,5mm, đáp ứng tủy viêm ởmức độ từ nhẹ đến trung bình Tuy nhiên không còn phản ứng nào sau 5-8 tuần Thêmvào đó là quá trình hình thành ngà sửa chữa

Trong một nghiên cứu [17] nuôi cấy tế bào tủy răng với dịch chiết trực tiếplấy ngày thứ 2 và ngày thứ 5 của 5 loại vật liệu gốc nhựa khác nhau, bao gồm 2RMGIC (Fuji II LC and Fuji IX), 1 compomer (Dyract), and 2 composite resin (Tetricand Superfil), tác giả Fu-Mei Huang và Yu-Chao Chang kết luận tất cả các vật liệuđều gây độc tế bào Composite có gây độc tế bào cao nhất trong các loại vật liệu vớithứ tự Superfil > Tetric > Fuji IX > Fuji II LC = Dyract

Trong nghiên cứu của Fonseca năm 2016 [8] về khả năng gây độc của cácloại xi măng gắn (RMGIC - RelyX Luting, xi măng nhựa tự dán- RelyX U200 và ximăng nhựa thông thường- RelyX ARC) đối với tế bào tủy răng qua rào cản ngà, kếtluận cả ba loại xi măng gắn có chứa nhựa không gây độc cho tế bào tủy răng

Bảng 1.1: Tóm tắt một số nghiên cứu về độc tính của vật liệuSTT Tác giả Tế bào/Vật liệu

-Dịch chiết trực tiếp.

-Đánh giá độctính sau 2ngày, 5 ngàyvới thửnghiệm MTT

-Tất cả vật liệu đều gây độc

tế bào Composite độcnhất Thứ tự gây độcSuperfil > Tetric > Fuji IX

> Fuji II LC = Dyract

2 Costa C và

cs (2003)

-Nguyên bàongà MDPC-23

-Vitremer,Vitrebond, Fuji

II LC,Fuji IX GP,Ketac-Molar

-Dịch chiết trực tiếp.

-Đánh giá độctính sau 72giờ bằng thửnghiệm MTT

-RMGIC (Vitremer,Vitrebond) gây độc tế bàocao hơn GIC (Fuji IX GP,Ketac-Molar)

3 Kanjevac T

và cs(2012)

-Tế bào gốc tủyrăng người

- Fuji I and FujiTriage,

Composite, FujiPlus, Fuji VIII,Vitrebond

-Dịch chiết trực tiếp.

-Đánh giá độctính sau 72giờ với thửnghiệm MTT

-Những loại vật liệu phóngthích ít flour như Fuji I,Fuji Triage, Composite cókhả năng gây độc tế bào íthơn so với những loại GICphóng thích flour cao hơnnhư Fuji Plus, Fuji VIII,Vitrebond

4 Malkoc

MA và cs(2014)

-Tế bào nguyênbào sợi L929

-Super-BondC&B, RelyXARC, ClearfilEsthetic

-Dịch chiết trực tiếp.

-Đánh giá độctính sau 24hbằng thửnghiệm MTT

-Cả ba loại xi măng nhựađều gây độc với tế bào

5 Rita

Vanagiene(2015)

Trumpaite Nguyên bào sợinướu răngngười

-Hoffmann’s

ZP, Fuji Plus,RelyX Unicem

-Dịch chiết trực tiếp.

-Đánh giá độctính sau 1, 6,12h bằng thửnghiệm MTT

-Cả ba loại xi măng đềugây độc với tế bào

6 Ulker HE

và Sengun

A (2009)

-Tế bào nhúrăng bò-RelyX Unicem,MaxCem,

Panavia F 2.0,BisCem, Bistite

II DC

-Tế bào tiếp xúc gián tiếp

với vật liệuqua rào cảnngà 0,5mm

-Đánh giá độctính sau 24hbằng thửnghiệm MTT

-Trừ MaxCem, các loại ximăng nhựa còn lại gây độc

tế bào

7 Fonseca

RobertiGarcia

-Tế bào nguyênbào ngà MDPC-

23 và tế bào tủyrăng người

-Dịch chiết gián tiếp qua

rào cản ngà0,4mm

-Các loại xi măng khônggây độc tế bào theo chuẩnISO 10993-5:1999

L, Pontes

EC (2016)

-RelyX Luting,RelyX U200,RelyX ARC

-Đánh giá độctính sau 24hbằng thửnghiệm MTT

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguồn tế bào

Dòng tế bào nguyên bào sợi chuột 3T3 được cung cấp từ phòng thí nghiệm

bộ môn sinh học phân tử trường Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh

G

cem

Ximăngnhựa tựdán

1511261 Lưỡng

trùnghợp

Bột: fluoro-aluminio-silicate glassLỏng: thành phần nhựa có tính axit, nước,UDMA, Dimethacrylates, 4-META,phosphoric ester monomer,

camphorquinone

Hình 2.2: Các loại xi măng sử dụng trong nghiên cứu

2.2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

 Thời gian nghiên cứu:

Tháng 10/2016 đến tháng 4/2017

 Địa điểm nghiên cứu:

Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm bộ môn sinh học phân tửtrường Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh

2.2.2 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu in vitro có nhóm chứng

2.2.3 Chuẩn bị trước khi nghiên cứu

a) Huấn luyện định chuẩn

Việc nghiên cứu được chuấn luyện định chuẩn tại phòng thí nghiệm bộ mônsinh học phân tử trường Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh

Cán bộ huấn luyện: giảng viên bộ môn

Nội dung: các tiêu chuẩn và cách thức nuôi cấy tế bào, thử nghiệm MTS

Thực hành thí nghiệm 3 lần trên mỗi nhóm, mỗi nhóm gồm 2 giếng, tiến hànhthử nghiệm và ghi nhận trong bảng thu thập dữ liệu.

− Tủ nuôi cấy tế bào

− Máy ủ ấm môi trường

2.3 THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU

2.3.1 Chuẩn bị tế bào

Nguồn tế bào nguyên bào sợi 3T3 thế hệ tế bào P7 được cấy chuyền đến thế

hệ P8 (các tế bào đạt độ đồng nhất về hình dạng) Theo dõi sự tăng sinh củacác tế bào đến khi chúng trải thành một lớp đơn phủ kín trên bể mặt đĩa petri(độ bao phủ đạt gần 85%) Lúc này tế bào đã sẵn sàng để tiến hành thử nghiệmđánh giá độc tính của vật liệu

 Cấy chuyền từ đĩa petri sang đĩa petri

− Hút bỏ môi trường DMEM/F12+10% CS cũ trong đĩa petri

− Rửa bề mặt với 10 ml PBS

− Hút bỏ hết PBS

− Thêm vào 1 ml Trypsin- EDTA 0,25%, ủ trong tủ ủ ấm 370C trong 1 phút

để tế bào tách khỏi bề mặt đĩa nuôi

− Thêm 5 ml môi trường vào đĩa, trộn đều để bất hoạt Trypsin

− Hút toàn bộ 6 ml trong đĩa ra ống falcon 15 ml, quay ly tâm 1200 vòng/phúttrong 5 phút ở 200C

− Sau ly tâm: hút bỏ bớt môi trường trong ống falcon Trộn đều lượng môitrường còn lại để được huyền phù tế bào

− Chuẩn bị 2 - 3 đĩa petri mới (tùy tỉ lệ cấy chuyền) Cho vào mỗi đĩa 10 mlmôi trường mới và lượng huyền phù tế bào chia đều cho mỗi bình

− Nuôi trong tủ ủ ấm ở 370C, 5% CO2

− Thay môi trường mỗi ngày

− Tế bào nguyên bào sợi 3T3 thế hệ thứ 8 được nuôi trong đĩa petri đạt mật

độ 80% có thể thực hiện nghiên cứu

Hình 2.4: Tế bào nguyên bào sợi 3T3 thế hệ thứ 8 ở vật kính 10X

 Phương pháp xác định số lượng tế bào trong đĩa

− Hút bỏ môi trường DMEM/F12+10% CS cũ trong đĩa petri

− Rửa bề mặt với 10 ml PBS

− Hút bỏ hết PBS

− Thêm vào 1 ml Trypsin - EDTA 0,25%, ủ trong tủ ủ ấm 370C trong khoảng

1 phút để tế bào tách khỏi bề mặt đĩa nuôi

− Thêm 5 ml môi trường vào đĩa, trộn đều để bất hoạt Trypsin

− Hút toàn bộ 6 ml trong đĩa ra ống falcon 15 ml, quay ly tâm 1200 vòng/phúttrong 5 phút ở 200C

− Sau ly tâm: hút bỏ bớt môi trường trong ống falcon Trộn đều lượng môitrường còn lại để được huyền phù tế bào

− Hút 20 µl huyền phù tế bào cho vào eppendorf, thêm vào 20 µl TrypanBlue theo tỉ lệ 1:1, trộn đều

− Phủ buồng đếm với lamelle Cho 10 µl dung dịch hỗn hợp trên vào buồngđếm bằng cách nhiễu sát chỗ tiếp xúc giữa cạnh lamelle và buồng đếm.Nhờ hệ thống mao dẫn mà giọt huyền phù sẽ tràn đầy buồng đếm

− Chỉnh kính hiển vi quang học ở vật kính 4X, định vị buồng đếm trên thịtrường Đếm tế bào ở vật kính 10X

− Đếm 4 vùng đếm ở 4 góc

− Đếm tất cả tế bào to, tròn, sáng rõ Đếm theo nguyên tắc cạnh trên - bênphải (đối với những tế bào nằm ở vạch ranh giới, đếm các tế bào nằm bêntrên và bên phải của ô đang đếm, không đếm các tế bào nằm bên dưới vàbên trái) Giả sử đếm được số tế bào là A.

(a)

(b)Hình 2.5: Buồng đếm tế bào(a): Hình minh họa; (b): Hình chụp thực tế từ nghiên cứu

− Trong mỗi buồng đếm có 9 vùng đếm, tương ứng với 9 ô vuông Chỉ cóvùng đếm ở giữa là có 25 ô lớn, mỗi ô lớn chia thành 16 ô nhỏ Vậy vùngđếm ở giữa có tổng cộng là 25х16 = 400 ô nhỏ

− Thể tích một ô nhỏ là: 1/20х1/20х1/10 = 1/4000 mm3 (chiều cao là 1/10mm)

− Thể tích vùng đếm ở giữa là: 400х1/4000 = 1/10 mm3 = 10-4 ml

− Số tế bào trong 1ml môi trường là: N= (A/4) / 10-4хĐộ pha loãng

− Do trước khi đếm, thể tích tế bào được trộn với Trypan Blue theo tỉ lệ 1:1nên mẫu được pha loãng ra 2 lần

− Vậy số tế bào trong 1ml huyền phù là: N=A/4х104х2 (tế bào / ml)

− Trước khi kích hoạt, lắc đều con nhộng

− Ấn pít tông ở đáy con nhộng lên bề mặt cứng cho pít tông lún vào thânnhộng

− Gắn con nhộng vào súng bắn xi măng, bấm 1 nấc, con nhộng đã đượckích hoạt

− Gỡ con nhộng ra khỏi súng bắn xi măng, gắn vào máy trộn xi măng.Trộn xi măng trong 10 giây (tốc độ 4000 vòng/ phút)

− Gắn con nhộng vào lại súng bắn Bắn xi măng vào ống bơm tiêm dungtích 1 ml Bơm lượng xi măng bằng 3 vạch của ống tiêm vào khuôn cao

su hình trụ tròn, đường kính đáy 4 mm đã được hấp vô trùng

Đợi xi măng đông cứng Thời gian đông của xi măng Fuji I là 4 phút 30giây, của Fuji Plus là 4 phút 15 giây Riêng G-CEM chiếu đèn trùng hợp trong 20giây Sau khi đông, gỡ các khối xi măng ra khỏi khuôn Tất cả các thao tác được thựchiện trong tủ vô trùng

b) Chuẩn bị dịch chiết

Thể tích của 1 khối xi măng sẽ là: V = 3х1/100 = 3х10-2 ml = 30 mm3

Mặt khác, do khối xi măng được đặt trong khuôn hình trụ tròn nên V = πhR2

Suy ra chiều cao khối xi măng trong khuôn cao su sẽ là:

H = V / (πR2) = 30 / (πх22) = 2,39 mmDiện tích của khối xi măng trong khuôn cao su sẽ là:

S = 2πR2 + 2πRh = 2πR(R + h) = 2πх2х(2 + 2,39) = 55,17 mm2 = 0,5517

cm2

Lượng môi trường để ngâm dịch chiết theo chuẩn ISO 10993-12:2012 đốivới khuôn có chiều dày lớn hơn 1 mm, tỉ lệ diện tích bề mặt khối vật liệu: thể tíchmôi trường là 3 cm2/ml

Vậy thể tích môi trường cần để ngâm 1 khối vật liệu tạo dịch chiết sẽ là:

Vmt = S/3 = 0,5517/3 = 0,1839 ml môi trường/ 1 khối vật liệuNgâm khối vật liệu Fuji I, Fuji Plus, G-CEM trong môi trường DMEM/F12với tỉ lệ 0,1839 ml môi trường/ 1 khối vật liệu

c) Chuẩn bị nhóm chứng âm và nhóm chứng dương

Sau 24 giờ thu được dịch chiết trực tiếp của các loại vật liệu và nhómchứng nồng độ 100% (nồng độ 1)

Hình 2.6: Dịch chiết trực tiếp nồng độ 100% thu được sau 24 giờ

Đo pH các dịch chiết trực tiếp của các vật liệu:

Fuji I = Fuji Plus = 6G-Cem = 7

Hình 2.7: Đo pH dịch chiết trực tiếp của các loại vật liệu

Từ dịch chiết 100% ban đầu (nồng độ 1), pha loãng dịch chiết thành 4 nồng

độ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 bằng cách thêm vào môi trường DMEM với tỉ lệ tương ứng

Hình 2.8: Nồng độ dịch chiết trực tiếp các vật liệu sau khi pha loãng

2.3.2.2 Dịch chiết gián tiếp

a) Chuẩn bị mẫu

Bốn mươi tám răng khôn hàm trên lành mạnh, không có sâu răng, mòn, nứt.Sau khi loại bỏ vôi răng và các mảnh vụn hữu cơ, răng được giữ trong dung dịch nướcmuối sinh lí cho đến khi thực hiện nghiên cứu

Thân răng được cắt rời khỏi chân răng tại vị trí đường nối men – xê măng.Sau đó, bề mặt phía dưới của thân răng được mài cho đến khi được bề mặt ngà phẳngngang mức trần tủy (không còn thấy được sừng tủy)

Sau đó, từ phía mặt nhai thân răng, sử dụng tay khoan high speed và mũikhoan kim cương sửa soạn xoang hình trụ tròn đường kính đáy là 4,5 mm với độ sâucủa xoang được điều chỉnh cho đến khi bề dày ngà răng phía trên buồng tủy dày 0,5mm

4

Hình 2.9: Mô hình các bước tạo hệ thống thân răng sử dụng trong nghiên cứu

Hình 2.10: Hệ thống thân răng trong nghiên cứu

4,5 mm

0,5mm

Bề mặt ngà răng phía tủy được xoi mòn với axit citric 50% trong 30 giây đểloại bỏ lớp mùn ngà do tác động mài răng Sau đó, hệ thống thân răng được hấp tiệttrùng.

Các vật liệu được chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất, giống với quitrình trộn xi măng ở phần dịch chiết trực tiếp Sau khi trộn, bơm lượng xi măng bằng

3 vạch của ống tiêm dung tích 1 ml vào xoang phía mặt nhai của thân răng Đợi ximăng đông cứng Thời gian đông của xi măng Fuji I là 4 phút 30 giây, của Fuji Plus

là 4 phút 15 giây Riêng G-CEM chiếu đèn trùng hợp trong 20 giây

Sau khi xi măng đông cứng, sử dụng sáp cứng inlay (Kerr, USA) với độnóng chảy 40-50⁰C để che kín bề mặt xoang phía mặt nhai thân răng

Tất cả các thao tác được thực hiện trong tủ vô trùng

Hình 2.11: Sử dụng sáp inlay che kín bề mặt xoang phía thân răng

S = 2πR2 + 2πRh = 2πR(R + h) = 2πх2,25х(2,25 + 1,89) = 58,53 mm2

= 0,5853 cm2