Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 gen hệ identifiler từ quần thể người hoa ở các tỉnh phía nam

Một phòng giám định ADN đạt chuẩn phải có một điều kiện mang tính bắt buộc là khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất alen của các gen đang được ứng dụng phù hợp với các quần thể ngư

MỞ ĐẦU

Trong khoa học hình sự, giám định gen (ADN) mở ra một phương pháp truy nguyên cá biệt chính xác và hiệu quả, giúp các nhà điều tra tìm ra thủ phạm trong các vụ án thông qua việc phân tích các dấu vết, mẫu vật Giám định gen là ứng dụng kỹ thuật, công nghệ hiện đại của sinh học phân tử nhằm phân tích các đặc điểm của dấu vết mẫu vật hay cá thể người dựa trên nền tảng của giám định sinh học

Để bảo đảm tính khoa học và tính pháp lý, các phòng giám định ADN đều phải tuân thủ nghiêm ngặt các quy định của Hiệp hội ADN hình sự quốc tế về trang bị phương tiện, thiết bị, con người, hóa chất…, đặc biệt là trình độ công nghệ [9] Một phòng giám định ADN đạt chuẩn phải có một điều kiện mang tính bắt

buộc là khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất alen của các gen đang được ứng dụng phù hợp với các quần thể người [10]

Việt Nam có 54 dân tộc, trong đó dân tộc Kinh chiếm tỉ lệ lớn nhất (gần 90%) [1] và đã có đề tài khoa học cấp Bộ khảo sát tần suất các alen của 15 gen người Việt (Kinh), người dân tộc H'mông, dân tộc Khmer theo hệ Identifiler [9,12] Còn lại là các dân tộc khác chưa được tiến hành khảo sát tần suất alen và xây dựng cơ

sở dữ liệu ứng dụng vào công tác giám định

Đề tài nghiên cứu: “Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 gen hệ Identifiler từ

quần thể người Hoa ở các tỉnh phía Nam”, là một yêu cầu rất cần thiết trong thực tế giám định

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 gen (ADN) hệ Identifiler trong quần thể người Hoa

ở các tỉnh phía Nam

- Đánh giá tính đa hình của 15 gen (ADN) hệ Identifiler trong quần thể người Hoa, phát hiện các alen hiếm, các alen đặc trưng và đề xuất khả năng ứng dụng trong công tác giám định ADN đối với những vụ việc liên quan đến người Hoa ở Việt Nam

Giả thuyết nghiên cứu

- Quần thể người Hoa có thể có những alen đặc trưng của 15 gen hệ Identifiler, mang giá trị truy

nguyên cao

- Có sự khác nhau về tần suất các alen của 15 gen hệ Identifiler ở các quần thể người khác nhau và

sự khác nhau này là có ý nghĩa trong cơ sở dữ liệu tần suất khi kết luận giám định

Những điểm mới và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Xây dựng bảng tần suất các alen của 15 gen hệ Identifiler trong quần thể người Hoa ở các tỉnh phía Nam, đây là cơ sở pháp lý để xác định độ tin cậy và tính chính xác trong các kết luận giám định ADN liên quan tới người Hoa của lực lượng kỹ thuật hình sự trên cả nước

- Đưa ra số liệu so sánh tần suất các alen của quần thể người Hoa với các quần thể người Việt (Kinh), Thái Lan và Malaixia Đánh giá sự khác biệt về số loại alen, tần suất của từng alen ở các quần thể

Bổ sung vào cơ sở dữ liệu tần suất chung các quần thể người ở Việt nam và trên thế giới

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cơ sở khoa học và sự ra đời của giám định gen

Bản chất di truyền nằm trên cấu trúc nhiễm sắc thể.Nhiễm sắc thể nằm trong nhân tế bào.Nhiễm sắc thể được cấu trúc từ phân tử ADN kết hợp với các protein kiềm (histon) Phân tử ADN là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗi nucleotide Hướng của hai mạch đơn trong chuỗi xoắn kép ngược nhau và là hai mạch đối song song [28] Những đặc điểm quan trọng nhất trong mô hình cấu trúc ADN là tính đặc thù trong việc kết cặp base và sự phân cực ngược chiều của hai sợi đơn 5'  3', 3'  5') bởi

vì chúng có tầm quan trọng đặc biệt với nhiều hoạt động chức năng của ADN như tự sao chép, phiên mã và dịch mã

Hình 1.1: Cấu tạo ADN trong nhân tế bào

Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định cá thể người: nhận biết qua vân tay, tiếng nói, nhận biết các yếu tố di truyền [13]…nhưng khả năng phân biệt thấp Phải đến thập kỷ 80, 90 các nhà khoa học hình sự mới ứng dụng công nghệ gen (DNA-Technology) vào việc xác định tội phạm Năm 1984, Alec Jeffreys và các cộng sự ở trường đại học Leicester (Anh) khi nghiên cứu các đoạn ADN mã hoá cho myoglobin trong máu người đã phát hiện ra trình tự của các base nitơ được lặp lại một số lần với chiều dài đoạn lặp từ 10-15 bp (base pair), các đoạn lặp này được gọi là các tiểu vệ tinh [28] Các tiểu vệ tinh được phát hiện thấy trong mọi tế bào và ở những vị trí khác nhau trong hệ gen người Điều đáng chú ý là số lần lặp lại các đoạn lặp này ở các cá thể khác nhau thì khác nhau Đây chính là đặc điểm rất quan trọng để phân biệt

sự khác nhau giữa các cá thể (truy nguyên cá thể) Giám định gen cho mục đích tư pháp ra đời từ đây Giám định gen là truy nguyên được cá thể người, xác định quan hệ huyết thống, xác định hài cốt [14]

Tháng 10 năm 1990, tại Mỹ, Dự án hệ gen người (Human Genome Project-HGP) chính thức được bắt đầu Đến ngày 12 tháng 02 năm 2001, HGP và Celera đã công bố trình tự đầy đủ của hệ gen người Theo

đó, bộ gen người có khoảng 35.000 gen, trong đó có hàng chục gen được nghiên cứu ứng dụng để xác định huyết thống và truy nguyên cá thể [18]

Phân tử ADN sợi đôi

Các nucleotit

1.2.1 Định luật Hardy - Weinberg [42]

Năm 1908, Geoffrey Hardy (Anh) và Wilhelm Weinberg (Đức) đã đồng thời nghiên cứu ra định luật Hardy-Weinberg, nội dung như sau: “Trong một quần thể có số lượng lớn, giao phối tự do và ngẫu nhiên ở vào thế cân bằng, không có chọn lọc và cũng không có đột biến, thì tần số tương đối của các alen ở mỗi gen

có khuynh hướng duy trì không đổi từ thế hệ này sang thế hệ khác” [12, 47] Định luật Hardy-Weinberg gồm

Với n alen (p1, p2 ,p3 pn) thì công thức sẽ là:(p1 + p2 + p3 + pn)2 = 1

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trạng thái cân bằng của định luật Hardy - Weiberg

Các yếu tố làm thay đổi ngẫu nhiên tần số của các alen trong một quần thểlà: Tình trạng kết hôn đồng huyết gây đột biến gen; Sự di dân; Sự phiêu bạt di truyền và dòng chảy của gen (phát tán chậm chạp của gen)

1.3 Giám định ADN

1.3.1 Các gen được sử dụng trong giám định

- Các gen được lựa chọn sử dụng trong giám định là các STR có chiều dài dưới 400 base để dễ dàng phân tích Các đoạn STR này có đặc tính: đa hình và mức độ dị hợp tử cao (>70%); Dễ dàng phối hợp thành

bộ phức khi thực hiện PCR; Sản phẩm PCR ổn định

1.3.2 Vai trò của cơ sở dữ liệu tần suất các alen

Mỗi cá thể người có cấu trúc di truyền riêng trừ những trường hợp sinh ra cùng một trứng [8] Mỗi một quần thể người (tộc người) khác nhau cũng có những đặc điểm di truyền đặc trưng thể hiện bằng sự phân bố tần suất alen trong mỗi quần thể [47] Do vậy, trong giám định ADN các nhà khoa học hình sự ngoài lựa chọn, nghiên cứu những locus (vị trí trên nhiễm sắc thể) có tính đa alen (đa hình) cao thì cần khảo sát tần suất phân bố các alen trong quần thể của từng locus gen để sử dụng Quần thể được nghiên cứu khảo sát phải đạt được các yêu cầu trong thống kê, di truyền như: các mẫu đảm bảo tính ngẫu nhiên, không có quan

hệ huyết thống [8, 9]

Để có được tần suất của mỗi alen, phải tìm được số lần xuất hiện của mỗi alen trong quần thể nghiên cứu sau đó tính tần suất lý thuyết của alen đó theo luật di truyền quần thể [27] Kiểm định xem tần suất alen

có được chấp nhận với mức xác suất đã chọn

Giám định gen (ADN) đòi hỏi cơ sở khoa học vững chắc để tính toán xác suất một người ngẫu nhiên trong quần thể là người có cấu trúc di truyền đặc trưng trùng lặp với ADN trong các mẫu vật (thu thập trong quá trình điều tra, phá án) Nếu không có tần suất alen thì không tính toán được tần suất xuất hiện của một kiểu gen nào đó trong một quần thể nhất định [8, 10, 47]

Trong trường hợp cần xác định huyết thống, để kết luận một người có phải là cha đẻ hoặc mẹ đẻ của người con không, phải dựa vào khả năng cho nhận của các alen và phải căn cứ vào tần suất alen để tính ra chỉ số quan hệ huyết thống (Paternity Index - PI), từ đó tính độ tin cậy đạt được Mặt khác, đó cũng là cơ sở khoa học để so sánh độ tin cậy trong trường hợp phân tích được nhiều gen hoặc ít gen hơn

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về khảo sát tần suất các alen của các sử dụng trong giám định ADN

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Từ những năm 1990, các nhà Khoa học hình sự trên thế giới sử dụng các kỹ thuật phân tích các gen

có trình tự lặp ngắn (Short Tandem Repeat-STR hay Microsatellite) cho mục đích giám định ADN [34] Các tập đoàn nghiên cứu khoa học trên thế giới đã sản xuất các bộ KIT phân tích tổ hợp các locus có trình tự lặp lại ngắn: KIT 9 locus (hệ Profiler Plus của hãng Perkin-Elmer, Mỹ), KIT 15 locus (hệ Identifiler của hãng AB, hệ Power Plex 16 của hãng Promega) [14]

Mỗi phòng thí nghiệm giám định gen (ADN) đều phải đạt những chỉ tiêu chất lượng trang thiết bị máy móc cũng như con người và đều phải có các nghiên cứu, khảo sát và công bố kết quả của mình về tần

suất các alen trong hệ locus gen của từng quần thể người để ứng dụng trong giám định truy nguyên cá thể hay xác định quan hệ huyết thống

Tại Mỹ, cảnh sát liên bang Mỹ đã khảo sát và sử dụng tần suất dữ liệu ADN theo hệ Identifiler của nhiều chủng tộc người khác nhau: 191 người gốc Mỹ, 290 người Mỹ gốc Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha, 349 người Mỹ da trắng và 357 người Mỹ gốc Phi [20, 21].Với chủng tộc người lai Âu - Á (Eurasia), tại mỗi quốc gia khác nhau lại có những khảo sát khác nhau về tần suất các alen theo hệ Identifiler của cộng đồng người Eurasia tại quốc gia đó: 384 người tại Nga, 300 người tại Hy Lạp, 139 người tại Rumani [47, 52]

Năm 2006, 2008 Thái lan, Malaixia đã công bố kết quả khảo sát của 15 gen của người Malaixia [44, 46] Nhật Bản cũng đã công bố kết quả khảo sát của 15 gen hệ Identifiler của người Nhật năm 2013 [43]

Từ năm 2012 đến 2015, Trung Quốc công bố bảng tần suất các alen của 9 gen STR các dân tộc phía nam Trung Quốc [22], tần suất các alen của 15 gentừ các cá thể người dân tộc Hán ở các vùng miền ở Trung Quốc [45, 50], tần suất, các alen của 15 gen từ các cá thể người phía Bắc Trung Quốc [25, 34, 35] Năm

2016, Indonesia đã công bố tần suất các alen của 15 gen hệ Identifiler được khảo sát từ 8 dân tộc của Indonesia [53] Năm 2016, Malaixia đã công bố các thông tin mới nhất về các alen của 15 gen hệ Identifiler khảo sát từ 341 cá thể người Malaixia [54]

Kit Identifiler là bộ Kit phức hợp nhân đồng thời 16 gen STR, trong đó một gen qui định giới tính,

15 gen qui định tính trạng nằm trên NST thường Các khảo sát về tần suất alen được tiến hành nghiên cứu trên 15 gen này

Tên locus Vị trí trên NST Trình tự đoạn lặp Các alen

Y: p11.2

Bảng 1.2 Các locus gen hệ Identifiler [37]

Đặc điểm của một số locus gen STR hệ Identifiler: Gen D8S1179 (D8) định vị trên nhiễm sắc thể (NST) số 8; Gen D21S11 (D21) định vị trên NST số 21; Gen D7S820 (D7) định vị trên NST số 7; Gen CSF1PO (CSF) định vị trên NST số 5; Gen D3S1358 (D3) định vị trên NST số 3; Gen HUMTH01 (THO1) định vị trên NST số 11; Gen D13S317 (D13) định vị trên NST số 13; Gen D16S539 (D16) định vị trên NST

số 16; Gen D2S1338 (D2) định vị trên NST số 2; Gen D19S433 (D19) định vị trên NST số 19; Gen vWA định vị trên NST số 12; Gen TPOX ở NST số 2; Gen D18S51 (D18) NST số 18; Gen D5S818(D5) định vị trên NST số 5; Gen FGA: Định vị trên NST số 4

Hình 1.2: Sơ đồ các gen hệ Identifiler

1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, giám định gen được triển khai từ tháng 4 năm 1999, tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an Toàn bộ máy móc trang thiết bị và con người đều được đào tạo trang bị theo chương trình chuyển giao công nghệ tại Cộng hòa liên bang Úc

Từ năm 2002 đến 2016, đã có các nghiên cứu, khảo sát và xây dựng tần suất các alen của các gen trong hệ NinePlex II (9 gen), hệ Identifiler (ID) trên các quần thể người dân tộc Kinh, dân tộc H’mông, dân tộc Khmer được nghiệm thu và ứng dụng trong các kết luận giám định, giúp cơ quan tố tụng giải quyết có hiệu quả rất nhiều vụ việc [8, 9]

Việt Nam cũng đã thông báo bảng tần suất các alen của các locus gen hệ Nineplex II trên đối tượng người Kinh cho Interpol

Các nghiên cứu này là căn cứ khoa học để xây dựng cơ sở pháp lý vững chắc trong các kết luận giám định

về truy nguyên cá thể và xác định huyết thống phục vụ tố tụng hình sự và dân sự đối với những vụ án, vụ việc có liên quan đến các quần thể người tại Việt Nam [9,14]

Hình 1.3: Bộ KIT Identifiler thương mại của hãng Applied Biosystems

đang được sử dụng phân tích ADN tại Việt Nam

có 47 vụ, năm 2014 có 56 vụ, năm 2015 có 69 vụ và năm 2016 có 73 vụ

Ở Việt Nam cho đến nay chưa có một nghiên cứu nào khảo sát sự phân bố các alen của 15 locus gen

hệ Identifiler đối với quần thể người Hoa

1.6.1 Cơ sở xác định số lượng mẫu nghiên cứu

Theo Hội đồng nghiên cứu quốc gia Hoa Kỳ năm 1996 [21, 38] khuyến cáo rằng mỗi alen nên được tính ít nhất là năm lần để tần suất tính được đáng tin cậy Do đó tần số thấp nhất của một alen là 5/2N, trong

đó N là số lượng mẫu khảo sát từ quần thể và 2N là số lượng NST Với quy ước như thế, số lượng mẫu khảo sát sẽ ảnh hưởng tới tần suất của alen tối thiểu như sau:

Số lượng mẫu khảo sát

Theo John M Butler [20],số lượng mẫu càng lớn thì xác suất lý thuyết và thực tế càng tiệm cận tới nhau hơn với độ tin cậy cao hơn

Theo tác giả Chakraborty vàonăm 1992 [21], số lượng mẫu khảo sát thông thường là 100-150 mẫu ADN từ các cá thể không có quan hệ huyết thống là đủ cho các locus STR có từ 5 đến 15 alen

Theo tác giả John Buckleton (2005), chọn 200 mẫu khảo sát cho mỗi quần thể là số lượng tiêu chuẩn chính xác được lựa chọn phổ biến [32]

Với những cơ sở trên, để kết quả nghiên cứu đảm bảo tính khoa học, bảng tần suất các alen có thể được Interpol và Hiệp hội ADN hình sự Châu Á áp dụng trong việc giám định ADN thì chúng tôi chọn số lượng mẫu khảo sát đối với quần thể người Hoa tại các tỉnh phía Nam là 200 người

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp điều tra khảo sát thực tế:

Tiến hành thu mẫu đúng cá thể người Hoa và không có quan hệ huyết thống với nhau, đảm bảo đại diện ngẫu nhiên, tuân theo các điều kiện của định luật Hardy - Weinberg

Kết hợp cùng sở Tư Pháp, chính quyền địa phương để xác minh nhân thân, kiểm tra giấy tờ tùy thân (căn cước, chứng minh thư nhân dân, hộ chiếu, giấy khai sinh) và hỏi trực tiếp những người được thu mẫu

- Phương pháp thực nghiệm khoa học: Phân tích kiểu gen 200 cá thể theo Quy trình giám định ADN(TCVN - AN 2013) được ban hành kèm theo Thông tư số 46/2013/TT-BCA ngày 05/11/2013 của Bộ trưởng Bộ Công an

- Phương pháp thống kê số liệu sinh học để tính tần suất các alen trong hệ Identifiler của người Hoa

- Phương pháp so sánh: tiến hành so sánh tần suất các alen của người Hoa với một số quần thể người khác để đánh giá các alen hiếm, alen đặc trưng, tính đa hình và khả năng ứng dụng trong thực tế giám định

- Phương pháp xin ý kiến chuyên gia: các chuyên gia đầu ngành về những ý kiến quý báu liên quan đến lý luận và thực tiễn giám định

2.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Tiến hành thu 200 mẫu máu của 200 cá thể người Hoa ở thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh phía Nam chia thành 2 đợt:

+ Đợt 1: Thu 100 mẫu máu từ ngày từ ngày 29 tháng 12 năm 2015 đến ngày 28 tháng 02 năm 2016 + Đợt 2: Thu 100 mẫu máu từ ngày từ ngày 01 tháng 6 năm 2016 đến ngày 15 tháng 8 năm 2016

- Phân tích mẫu bao gồm các bước tách chiết ADN, định lượng ADN, nhân bội ADN, điện di trên máy điện di mao quản, kết quả lập được bảng 200 kiểu gen của các mẫu nghiên cứu

- Xử lý số liệu thống kê, kiểm định tần suất kiểu gen giữa kết quả thực tế và tính toán lý thuyết với

độ tin cậy p = 0,05 Tính toán và đưa ra bảng tần suất các alen của các locus gen hệ Identifiler cho 200 cá thể người Hoa

2.3 Nội dung nghiên cứu:

2.3.1 Thu mẫu

Thu các mẫu máu mang tính ngẫu nhiên, không có quan hệ huyết thống, phiếu thông tin của mẫu được thiết kế như hình 2.1

Hình 2.1: Phiếu thu mẫu (danh bản ADN)

DANH BẢN ADN

Số thứ tự:

Ký hiệu:

Ngày thu mẫu:

Họ và tên: Nam/Nữ:

Tên gọi khác:

Sinh ngày: Quê quán:

HKTT:

Quốc tịch: Dân tộc:

Ghi chú:

- Phạm vi thu mẫu ở thành phố Hồ Chí Minh và 7 tỉnh phía Nam gồm: Bình Dương, Đồng Nai, Tây Ninh, An Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng và Bạc Liêu, nơi có nhiều người Hoa đang sinh sống - Kết hợp cùng sở Tư pháp, chính quyền địa phương để xác định nhân thân, kiểm tra giấy tờ tùy thân (chứng minh thư nhân dân, giấy khai sinh )

- Hỏi trực tiếp người được thu mẫu

- Dùng kim chích đầu ngón tay và thấm trực tiếp vào giấy FTA

- Đảm bảo chất lượng mẫu không bị lẫn, nhiễm, khô tự nhiên, đóng gói riêng rẽ, ghi ký hiệu cho mẫu

Hình 2.2: Thẻ FTA chuyên dụng để thu mẫu máu

Kết quả đã thu thập đủ 200 mẫu cá thể người Hoa đạt tiêu chuẩn nghiên cứu (Phụ lục 01)

2.3.2 Phân tích mẫu

Tiến hành phân tích theo Quy trình giám định ADN được chuẩn hoá trong tài liệu TCVN - AN 2013: Qui trình giám định ADN của Viện Khoa học hình sự ban hành theo Thông tư 46/2013/TT-BCA ngày 05/11/2013-Bộ trưởng Bộ Công an) Gồm có các bước như sau:

Hình 2.3: Sơ đồ qui trình giám định ADN

1 Dung dịch Chelex 100, tỷ lệ 5%

2 Block nhiệt khô cho ống1,5ml (1000C) kèm nhiệt kế

3 Máy li tâm ống 1,5ml 14.000v/p

4 Tủ an toàn sinh học

5 Ống nghiệm loại 1,5ml (eppendorf)

6 Giá đỡ cho ống eppendorf 1,5ml

7 Các đầu típ 10µl, 200µl và 1000µl cùng pipetman tương ứng

Bảng 2.1: Hóa chất và thiết bị cho tách chiết AND

200 mẫu máu người Hoa được tách chiết ADN bằng chelex 5% theo quy trình:- Rửa bằng dH2O (nước cất 2 lần đó khử ion) trong ống 1,5 ml

- Cho 200 ml chelex 5%, ủ ở 560C trong 30 phút

- Votex 10 giây, chuyển sang ủ ở 100C trong 8 phút

- Votex, ly tâm 13000 vòng/phút, hút dịch nổi chứa ADN (50 ul/ống) sang ống mới để tiến hành các bước phân tích tiếp theo

Hình 2.4 : Sơ đồ minh họa phương pháp tách chiết ADN

2.3.2.2.Định lượng ADN

Phương pháp Real-time PCR là phương pháp định lượng chính xác hàm lượng ADN của người được

sử dụng trong giám định ADN Thông thường sau tách chiết, dung dịch tách chiết bao gồm cả ADN của vi sinh vật có trong mẫu vật Với mồi thiết kế đặc hiệu của bộ kit, sau khi thu nhận được kết quả, tín hiệu luôn

là của ADN đặc hiệu của người

1 Quantifiler Human DNA quantification Kit (hãng AB)

2 Optical plate 96 well

3 Optical seal

4 Máy Realtime PCR 7500 (hãng Applied Biosystems)

5 Các loại đầu típ 10 µl, 200 µl và 1000 µl cùng pipet tương ứng

6 Giá đỡ cho ống dung tích tương ứng

Bảng 2.2: Hóa chất và thiết bị cho định lượng ADN Thiết lập phản ứng:

- Chuẩn bị ống PCR chuyên dụng cho Real-time PCR;

- Cho 5,25 ul Primer và 6,25 ul Master mix;

- Lấy 1 ul dung dịch ADN đã tách chiết cho vào ống PCR đã có thành phần hóa chất;

- Chuẩn bị các mẫu chuẩn tương tự ;

- Chạy trên máy Realtime PCR 7500 với phần mềm của hãng Applied Biosystems - Mỹ

Hình 2.5: Hình ảnh chu kỳ ngưỡng và tín hiệu huỳnh quang trên máy Real Time PCR

định lượng ADN

2.3.2.3 Nhân bội ADN (phản ứng PCR)

PNhân bội gen hay PCR (polymerase Chain Reaction) là một phương pháp căn bản trong việc nghiên cứu và phân tích các gen, nó có thể tạo ra hàng triệu phiên bản của một trình tự ADN khuôn ban đầu trong vòng vài giờ nhờ hai đoạn mồi với sự tham gia của ADN-polymerase, deoxynucleotide triphosphate (dNTP), đệm PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ gồm 3 bước:

Bước 1: Giai đoạn biến tính (denaturation) ADN ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử (940C-950C) trong 30 giây đến 1 phút

Bước 2: Giai đoạn lai (anealing): Nhiệt độ hạ thấp để các mồi bắt cặp với AND khuôn, nhiệt độ dao động trong khoảng 40-700C tuỳ thuộc Tm của mồi Thời gian khoảng từ 30 giây đến 1 phút

Bước 3: Giai đoạn tổng hợp (extension): Nhiệt độ tăng lên đến 720C giúp cho ADN- polymerase hoạt động tốt nhất, thời gian tuỳ thuộc vào độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại Từ 30 giây đến nhiều phút

Một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần sẽ làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước theo cấp số nhân, theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với lượng bản mẫu của ban đầu

1 Máy PCR 9700 96 well Applied biosystems

2 Kit Identifiler của hãng Applied biosystems

3 Tube loại 0,25ml và 0,5ml

4 Các loại đầu típ 10 µl, 200 µl và 1000 µl cùng pipet tương ứng

6 Giá đỡ cho ống có dung tích tương ứng

Bảng 2.3: Hóa chất và thiết bị cho nhân bội ADN

28 chu kỳ nhân gen trên máy PCR 9700 của hãng Applied Biosystems - Mỹ

Hình 2.6 Sơ đồ phản ứng PCR

2.3.2.4 Điện di sản phẩm PCR và phân tích kết quả

Sản phẩm PCR được điện di trên máy giải trình tự Applied Biosystems 3130 sử dụng phần mềm Data Collection của hãng Applied Biosystems - Mỹ

Phân tích kết quả kiểu gen của từng mẫu bằng phần mềm Gene Mapper ID v3.2 của hãng Applied Biosystems - Mỹ

1 Máy giải trình tự Applied Biosystems 3130

2 POP 4 (ABI)

3 Liz 500 Gene scan

4 HIDI formamide và Buffer 10X for AB - 3130

5 Capilary 3130 (36cm x 50ul)

6 Optical plate 96 well và Septa

7 Tube loại 0,25ml và 0,5ml

8 Các loại đầu típ 10 µl, 200 µl và 1000 µl cùng pipet tương ứng

9 Giá đỡ ống nghiệm với dung tích tương ứng

Bảng 2.5: Hóa chất và thiết bị điện di

Nguyên lý: điện di mao quản là dùng tia lase kích hoạt các đoạn ADN mồi đã được gắn huỳnh quang

để thu được các phổ quang học

Hình 2.7: Máy điện di ABI Prism 3130 Genetic Analyzer 4 mao quản

2.3.3 Xử lý số liệu thống kê

2.3.3.1 Cơ sở lý thuyết

Đánh giá xem mẫu nghiên cứu với các gen được phân tích có có tuân theo định luật Hardy - Weinberg hay không? Kiểm tra sự phù hợp giữa mẫu nghiên cứu với quần thể lý thuyết thông qua đánh giá chênh lệch các tần số quan sát kiểu gen

2.3.3.2 Phương pháp xử lý thống kê

Kiểm định sự phù hợp phân bố tần số kiểu gen giữa mẫu khảo sát và quần thể lý thuyết dựa vào tiêu chuẩn Chi bình phương 2 (phần 1.2.1) Việc tính toán tần suất và các chỉ số được thực hiện bằng phần mềm Microsoft Excel và SPSS, gồm: HWE (kiểm tra sự phù hợp với định luật Hardy - Veinberg), Hobs (dị hợp tử quan sát), Hexp (dị hợp tử mong đợi), chỉ số MP (khả năng trùng lặp), chỉ số PD (khả năng phân biệt), chỉ số

PE (khả năng loại trừ), và FEB (không bao gồm quan hệ dòng Y)

2.3.3.3 Các bước tính toán thống kê và kiểm định

- Thống kê 200 kiểu gen, số lượng alencủa 200 cá thể người Hoa; Tính tần suất các alen của mỗi gen theo số liệu thu được; Xác định số kiểu gen thực tế của mẫu khảo sát (số lượng kiểu gen AiAj cho từng gen )

- Xác định số kiểu gen lý thuyết Eij (giả thiết tuân theo định luật Hardy - Weinberg) và tính chỉ số kiểm định 2 theo công thức di truyền quần thể