Hiện nay, việc chế tạo ra vật liệu thủy tinh hoạt tính sinh học và đưavào sử dụng như vật liệu tổng hợp dùng trong ghép xương, trám răng đòi hỏi sự kết hợp của nhiều nhà khoa học trong l
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Trang 31 LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từngđược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác
NGUYỄN KẾ ĐỨC
Trang 4MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt i
Danh mục đối chiếu thuật ngữ Việt - Anh iii
Danh mục bảng iv
Danh mục biểu đồ iv
Danh mục hình vi
Danh mục sơ đồ vii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1 VẬT LIỆU SINH HỌC 4
1.1.1 Khái niệm 4
1.1.2 Phân loại vật liệu 4
1.1.2.1 Vật liệu sinh học ghép xương 4
1.1.2.2 Vật liệu hoạt tính sinh học 5
1.2 VẬT LIỆU THỦY TINH HOẠT TÍNH SINH HỌC 6
1.2.1 Cấu trúc thủy tinh hoạt tính sinh học 6
1.2.2.Thành phần và quá trình hình thành thủy tinh hoạt tính sinh học 9
1.2.2.1 Thành phần 9
1.2.2.2 Quá trình hình thành 11
1.2.3.Một số tác dụng của thủy tinh hoạt tính sinh học 11
1.2.3.1 Hình thành apatite 11
Trang 51.2.4 Ứng dụng của thủy tinh hoạt tính sinh học 14
1.3 TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VẬT LIỆU THEO ĐỘC TÍNH TẾ BÀO 16
1.3.1 Phương pháp thử nghiệm 16
1.3.2 Hình thức đánh giá độc tính tế bào 18
1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI 22
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 26
2.1.1.Thủy tinh hoạt tính sinh học (Việt Nam) 26
2.1.2 Straumann® Bone Ceramic (Thụy Sĩ) 26
2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 26
2.2.1 Đánh giá định tính 27
2.2.2 Đánh giá định lượng 27
2.2.3 Qui trình nghiên cứu 28
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
2.3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29
2.3.2 Thiết kế nghiên cứu 29
2.3.3 Phương pháp nghiên cứu 29
Chương 3.KẾT QUẢ 40
3.1 Đặc điểm mẫu nghiên cứu 40
3.2 Mức độ độc tính tế bào của thủy tinh hoạt tính sinh học 40
3.2.1 Thử nghiệm MTS 40
3.2.2 Thử nghiệm ELISA 49
Trang 63.3 So sánh vật liệu thủy tinh hoạt tính sinh học và Straumann® Bone
Ceramic 52
Chương 4 BÀN LUẬN 56
4.1 Đặc điểm mẫu nghiên cứu 56
4.2 Vật liệu, kỹ thuật và phương tiện nghiên cứu 56
4.2.1 Vật liệu nghiên cứu 56
4.2.2 Kỹ thuật và phương tiện nghiên cứu 60
4.3 Mức độ độc tính tế bào của thủy tinh hoạt tính sinh học 60
4.3.1 Xác định mức độ độc tính tế bào của thủy tinh hoạt tính sinh học 61
4.3.2 Đánh giá tế bào hoạt hoá apoptosis 65
4.4 So sánh mức độ độc tính tế bào của thủy tinh hoạt tính sinh học và Straumann® Bone Ceramic 66
KẾT LUẬN 70
ĐỀ XUẤT 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Phụ lục 1 Phiếu đăng ký đề tài, dự án khoa học và công nghệ
Phụ lục 2 Bảng thu thập số liệu qua thử nghiệm MTS
Phụ lục 3 Bảng xử lí số liệu qua thử nghiệm MTS
Phụ lục 4 Hình thái tế bào của mẫu trống và 15 nồng độ của
Thủy tinh hoạt tính sinh học (Việt Nam) và Straumann® Bone Ceramic
Phụ lục 5 Bảng định lượng Cleavage caspase - 3 và β - actin
Trang 72 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Trang 8OB Osteoblasts
Trang 9DANH MỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH
Cục quản lý Thực phẩm và Dược
phẩm Mỹ
U.S Food and Drug Administration(FDA)
Protein phát sinh hình thái xương Bone Morphogenetic Protein (BMP)
Ức chế số tế bào tăng sinh khoảng
Trang 103 DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Các tham số cấu trúc của một vài loại thuỷ tinh 8
Bảng 1.2 Mối liên quan giữa thành phần, chỉ số cấu trúc và hoạt tính sinh học của thủy tinh hoạt tính sinh học 9
Bảng 1.3 Thành phần thủy tinh hoạt tính sinh học và sứ - thủy tinh 10
Bảng 1.4 Sản phẩm thủy tinh hoạt tính sinh học trong chỉnh hình 15
Bảng 1.5 Sản phẩm thủy tinh hoạt tính sinh học trong sọ - mặt 15
Bảng 1.6 Sản phẩm thủy tinh hoạt tính sinh học trong răng hàm mặt 16
Bảng 1.7 So sánh hai phương pháp thử nghiệm đánh giá độc tính tế bào bằng thử nghiệm in vitro 18
Bảng 2.1 Các bước thực hiện đánh giá độc tính bằng thử nghiệm MTS 34
Bảng 2.2 Bảng thang đo đánh giá định tính độc tính tế bào của 37
Bảng 3.1 Mức độ độc tính tế bào của thủy tinh hoạt tính sinh học sau 24 giờ 42
Bảng 3.2 Mức độ độc tính tế bào của thủy tinh hoạt tính sinh học sau 48 giờ 43
Bảng 3.3 So sánh mức độ độc tính tế bào của thủy tinh hoạt tính sinh học sau 24 giờ và 48 giờ 45
Bảng 3.4 So sánh mức độ độc tính tế bào của thủy tinh hoạt tính sinh học và Straumann® Bone Ceramic sau 24 giờ 52
Bảng 3.5 So sánh mức độ độc tính tế bào của thủy tinh hoạt tính sinh học và Straumann® Bone Ceramic sau 48 giờ 54
Bảng 4.1 Kết quả phân tích huỳnh quang tia X thủy tinh tổng hợp 57
Bảng 4.2 So sánh HA/TCP và thủy tinh hoạt tính sinh học 58
Bảng 4.3.Thành phần thuỷ tinh hoạt tính sinh học 58S, 63S và 72S 63
Trang 11DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1 Mức độ độc tính tế bào của thủy tinh hoạt tính sinh học sau 24giờ 43Biểu đồ 3.2 Mức độ độc tính tế bào của thủy tinh hoạt tính sinh học sau 48giờ 44Biểu đồ 3.3 So sánh mức độ độc tính tế bào của thủy tinh hoạt tính sinh họcsau 24 giờ và 48 giờ 46Biểu đồ 3.4 Tương quan tuyến tính giữa nồng độ và tỉ lệ phần trăm tế bàosống sót của thủy tinh hoạt tính sinh học sau 24 giờ 47Biểu đồ 3.5 Tương quan tuyến tính giữa nồng độ và tỉ lệ phần trăm tế bàosống sót của thủy tinh hoạt tính sinh học sau 48 giờ 48
Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng nồng độ lên lượng Cleavage caspase - 3 và β - Actin1
Biểu đồ 3.7 So sánh mức độ độc tính tế bào của thủy tinh hoạt tính sinh học
và Straumann® Bone Ceramic sau 24 giờ 53Biểu đồ 3.8 So sánh mức độ độc tính tế bào của thủy tinh hoạt tính sinh học
và Straumann® Bone Ceramic sau 48 giờ 55
Trang 12DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Hình ảnh vật liệu sinh học và một số sản phẩm vật liệu nhập ngoại 5Hình 1.2 Cấu trúc tinh thể và vô định hình của thủy tinh silic 6Hình 1.3.Tứ diện SiO4 liên kết qua đỉnh O trong mạng lưới thủy tinh silic 6Hình 1.4 Quá trình bẻ gãy liên kết Si - O - Si nhờ oxit CaO 7Hình 1.5 Mạng lưới thủy tinh silic có chứa ion dương Na+ 7
Hình 1.6 Hai phương pháp thử nghiệm in vitro đánh giá độc tính tế bào… 17
Hình 3.1 Hình thái tế bào quan sát dưới kính hiển vi soi ngược ở các mẫutrống, Bone Ceramic 100 mg/ml, Thủy tinh hoạt tính sinh học (Việt Nam) 1mg/ml, 50 mg/ml và 100 mg/ml trong thử nghiệm MTS 41Hình 3.2 Hình thái tế bào quan sát dưới kính hiển vi soi ngược ở các mẫutrống, Bone Ceramic 100 mg/ml, Thủy tinh hoạt tính sinh học (Việt Nam) 0,5mg/ml, 50 mg/ml và 100 mg/ml trong thử nghiệm ELISA 49
Trang 134 DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1 Chu kỳ tế bào 14
Sơ đồ 1.2 Sự chuyển hóa MTS thành formazan 20
Sơ đồ 2.1 Qui trình nghiên cứu 28
Sơ đồ 2.2 Mô hình đặt mẫu thử nghiệm vào giếng 33
Trang 145 ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ thập niên năm 1890, trong phẫu thuật ghép xương và thay thế xươngngười ta thường dùng xương tự thân hay xương đồng loại Tuy nhiên trongghép xương tự thân, số lượng và khối lượng mô ghép hạn chế, người bệnhthêm một số phẫu thuật Trong ghép xương đồng loại lại có nguy cơ thải trừmảnh ghép với cơ thể nhận, lây nhiễm, vấn đề tâm lý và tôn giáo [32]
Với những bất lợi kể trên, vật liệu tổng hợp như calcium phosphate vàthủy tinh hoạt tính sinh học phát triển Trong đó thủy tinh hoạt tính sinh học
có nhiều sản phẩm thương mại hóa như Novabone, Perioglas, Novamin [1].Vật liệu này hiện đang được nhập ngoại từ các nước như Đức, Bazil, Pháp,
Mỹ, Ấn Độ về các bệnh viện và phòng nha ở Việt Nam Vì vậy chi phí muanhững vật liệu còn cao và chưa có thủy tinh hoạt tính sinh học được sản xuấttrong nước
Hiện nay, việc chế tạo ra vật liệu thủy tinh hoạt tính sinh học và đưavào sử dụng như vật liệu tổng hợp dùng trong ghép xương, trám răng đòi hỏi
sự kết hợp của nhiều nhà khoa học trong lĩnh vực khác nhau như Vật liệu,Công nghệ sinh học, Y học… và trải qua nhiều giai đoạn thử nghiệm KhoaCông Nghệ Vật Liệu, Đại học Bách Khoa Tp.HCM bước đầu tìm ra quy trìnhcông nghệ để tổng hợp thành công vật liệu thủy tinh hoạt tính sinh học vớithành phần là 45SiO2 - 24,5CaO - 24,5Na2O - 6P2O5 theo % khối lượng nhưngkhác biệt ở chỗ là thành phần nền SiO2 lấy từ cát trắng Cam Ranh, BìnhThuận, Việt Nam Theo Hiệp hội Nha khoa Quốc tế [38], để đánh giá các đặctính sinh học của một vật liệu sinh học [37], qua ba loại thử nghiệm nối tiếp:
thử nghiệm cấp 1 – in vitro, thử nghiệm cấp 2 – in vivo và thử nghiệm sử
dụng Thử nghiệm cấp 1 nhằm đánh giá thành phần, cấu trúc, tính chất vật lý
và hóa học, độc tính của vật liệu trong điều kiện phòng thí nghiệm Thử
Trang 15nghiệm này là cơ sở cho thử nghiệm cấp 2 về tương hợp mô sống của vật liệu.Sau khi đã có kết quả thỏa mãn yêu cầu về các đặc tính sinh học ở thử nghiệmcấp 1, thử nghiệm cấp 2 và thử nghiệm sử dụng Sau đó vật liệu được tiếnhành trước khi vật liệu có thể sử dụng các thử nghiệm lâm sàng [9].
Để vật liệu này được ứng dụng trên lâm sàng nha khoa phải qua nhiềuđánh giá, trong đó đánh giá độc tính trên tế bào động vật là một trong những
đánh giá bắt buộc Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Độc tính tế
bào của thủy tinh hoạt tính sinh học được tổng hợp ở Việt Nam trên tế bào động vật”.
Trang 166 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU+ Mục tiêu tổng quát: Đánh giá được độc tính tế bào của thủy tinh hoạt
tính sinh học được tổng hợp ở Việt Nam với thành phần SiO2 có nguồn gốc từcát trắng Cam Ranh ở Việt Nam trên tế bào động vật
+ Mục tiêu chuyên biệt:
1 Xác định mức độ độc tính tế bào của thủy tinh hoạt tính sinh học(Việt Nam)
2 So sánh mức độ độc tính tế bào của thủy tinh hoạt tính sinh học(Việt Nam) và Straumann® Bone Ceramic
Trang 17Chương 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 VẬT LIỆU SINH HỌC
1.1.1 Khái niệm
Vật liệu sinh học là loại vật liệu có nguồn gốc tự nhiên hay nhân tạo,
sử dụng để thay thế hoặc thực hiện một chức năng sống của cơ thể con người.
(Williams D.F., 1987) [39].
1.1.2 Phân loại vật liệu
1.1.2.1 Vật liệu sinh học ghép xương
Theo bản chất của chủ thể cho và nhận, vật liệu sinh học có 4 loại [32]:
- Ghép cùng gen (Isograft): trao đổi miếng ghép xương giữa hai cơ thểgiống nhau hoàn toàn về di truyền
- Ghép xương tự thân (Autograft): xương tự thân được lấy ra từ mộtphần cơ thể bệnh nhân (xương ở hông, xương hàm, xương sọ ) ghép vào nơithiếu xương Thuận lợi là vật liệu ghép xương tốt nhất Bất lợi là bệnh nhânthêm một lần phẫu thuật
- Ghép xương đồng loại (Allograft): xương từ cơ quan người hiến tặng
và được xử lý an toàn Thuận lợi là vật liệu ghép xương tốt sau vật liệu ghép
tự thân, có sẵn, dồi dào về số lượng, không phẫu thuật lần hai và an toàn Bấtlợi là chi phí cao
- Ghép xương dị loại (Xenograft): xương tổng hợp từ động vật, thực vậthoặc sợi tổng hợp Thuận lợi là chi phí cao Bất lợi là số lượng và hiệu quả
Trang 181.1.2.2 Vật liệu hoạt tính sinh học
Vật liệu sinh học thành 2 loại chính là vật liệu hoạt tính sinh học và vật
liệu trơ sinh học (Hench L.L.) [15].
Nhiều loại vật liệu sinh học tổng hợp khác nhau như các vật liệu calciumphosphate (tricalcium phosphate (TCP) Ca3(PO4)2, hydroxyapatite (HA)
Ca10(PO4)6(OH)2 hay biphasic calcium phosphate (HA/TCP), thủy tinh hoạttính sinh học (CaO - SiO2 - Na2O - P2O5 ), các xi măng sinh học GlassInomer Cement (GIC), ConsilDental và các kim loại trơ như Ti, Ni…và đượcthương mại hóa
Hình 1.1 Hình ảnh vật liệu sinh học và một số sản phẩm vật liệu
nhập ngoại
Trang 191.2 VẬT LIỆU THỦY TINH HOẠT TÍNH SINH HỌC
1.2.1 Cấu trúc thủy tinh hoạt tính sinh học
Thủy tinh có cấu trúc vô định hình, mạng lưới tinh thể không gian bachiều Mạng lưới tinh thể bao gồm những tứ diện SiO4, mỗi một nguyên tử Siđều liên kết với 4 nguyên tử O, như một ‘‘viên gạch cơ bản’’ xây dựng mạnglưới tinh thể Thủy tinh hoạt tính sinh học có thêm liên kết cộng hóa trị như Si
- O, P - O và liên kết ion Ca2+, Na+ với O2- (Hình 1.2)
Hình 1.2 Cấu trúc tinh thể và vô định hình của thủy tinh silic [7]
Các oxit này cấu tạo dưới dạng tứ diện hoặc tam diện cơ bản là SiO4,
BO4, BO3, [PO4]3- Những tứ diện hay tam diện cơ bản này liên kết với nhauqua đỉnh O của chúng tạo nên mạng lưới không gian của thủy tinh (Hình 1.3).Nguyên tử oxy đó gọi là oxy bắc cầu (BO)
Trang 20Khi thêm các oxit CaO, Na2O.v.v tạo lực hút tĩnh điện với các nguyên
tử oxy bắc cầu và làm gãy các mối liên kết giữa các tứ diện hay tam diện vớinhau như trong hình 1.4 và những nguyên tử oxy không còn liên kết vớinguyên tử silic Những nguyên tử oxy đó gọi là oxy không bắc cầu (NBO):
Si - O (BO) - Si + CaO -> 2 Si - O(NBO) – Ca2+
Hình 1.4 Quá trình bẻ gãy liên kết Si - O - Si nhờ oxit CaO [42]
Zachariasen vào năm 1932 đưa ra mạng lưới thủy tinh silic có chứa iondương Na+ (Hình 1.5) [42]
Hình 1.5 Mạng lưới thủy tinh silic có chứa ion dương Na + [43]
Trang 21Tham số Y là số lượng trung bình BO mỗi cầu tứ diện SiO4, Y là phầntrăm khối lượng của SiO2 trong thủy tinh (p):
Y = 6 - 200 / pChỉ số chiều dài chuỗi trung bình (n):
n = 2 / (2 - Y)Tất cả các chỉ số có thể dễ dàng tính toán bắt đầu từ p (Bảng 1.1)
Bảng 1.1 Các tham số cấu trúc của một vài loại thuỷ tinh [43]
Theo mô hình của Zachariasen, thủy tinh có Y ≥ 3, thủy tinh tứ diệnSiO4 có 3 nguyên tử O liên kết với tứ diện khác, thủy tinh có Y < 3 có liênkết ion giữa NBO và ion dương, thủy tinh có Y < 2 có liên kết ion chủ yếu[43]
Hill cho thấy thủy tinh có Y < 2 là thủy tinh có hoạt tính sinh học,ngoại trừ S38P8 có Y < 2 nhưng không có hoạt tính sinh học (Bảng 1.2)
Trang 22Bảng 1.2 Mối liên quan giữa thành phần, chỉ số cấu trúc và hoạt tính sinh
học của thủy tinh hoạt tính sinh học [22]
1.2.2 Thành phần và quá trình hình thành thủy tinh hoạt tính sinh học 1.2.2.1 Thành phần
Thành phần thủy tinh cơ bản SiO2 - Na2O - CaO - P2O5 Tùy thuộcthành phần vật liệu có mức độ liên kết với mô xương và mô mềm [18]
Dựa theo thủy tinh hoạt tính sinh học với tỉ lệ phần trăm khối lượngSiO2, CaO, Na2O và P2O5 (với 6% khối lượng P2O5 không đổi) [15]:
Thủy tinh SiO2 CaO Na2O P2O5 B2O3 Al2O3 Y Hoạt tính
Trang 23 SiO2 (45 - 52% theo % khối lượng) : liên kết với mô xương và mô mềm.
SiO2 (55 - 60% theo % khối lượng): liên kết với mô xương và không liênkết với mô mềm
SiO2 (> 60% theo % khối lượng): không liên kết với mô xương và mômềm
Thủy tinh hoạt tính sinh học với thành phần 45SiO2 24,5CaO.24,5Na2O 6P2O5 theo % khối lượng có mức độ hoạt tính sinh học cao nên táitạo xương nhanh chóng với tính chất sinh cơ học giống với xương nguồn gốc
ở vùng cấy ghép Vì vậy thủy tinh hoạt tính sinh học loại này được phân vàonhóm A Sự tái tạo xương nhanh chóng do kết hợp quá trình kích tạo xương
S53P4(AbminDent1®)
Glass - ceramic A -W(Cerabone®)
Trang 241.2.2.2 Quá trình hình thành
Hai phương pháp chính [16], [21]:
a Phương pháp thứ nhất (phương pháp sol - gel): Phương pháp tổng
hợp qua một chuỗi các phản ứng hóa học trong dung dịch để thủy phân cáctiền chất thành các hạt sol sau đó để ngưng tụ sang trạng thái gel Gel được xử
lý nhiệt để tạo thành thủy tinh ở dạng bột
Ưu điểm tổng hợp thủy tinh ở nhiệt độ thấp, độ tinh khiết cao, dễ tạohình dáng khác nhau phù hợp với chi tiết ghép
b Phương pháp thứ hai (phương pháp nóng chảy): Nấu nóng chảy các
tiền chất vô cơ ở nhiệt độ cao khoảng 14000C, sau đó làm nguội thủy tinhtrong không khí hay trong nước Thủy tinh dạng khối được nghiền theo cáckích thước hạt khác nhau tùy theo mục đích sử dụng
Ưu điểm tổng hợp chính xác thành phần thủy tinh, độ tinh khiết cao, thờigian nhanh và kiểm soát tham số kỹ thuật
1.2.3.1 Hình thành apatite
Cơ chế tương tác giữa vật liệu thủy tinh hoạt tính sinh học và dịch môphỏng dịch cơ thể người (SBF) để hình thành một lớp hydroxyapatite (HA) cóthể được giải thích qua sự phân tích các kết quả đạt được trên và qua nghiêncứu các tài liệu tham khảo [15], [20]
Cơ chế này có thể tóm tắt gồm các giai đoạn như sau:
Giai đoạn 1: Các proton H3O+ trong dung dịch SBF trao đổi nhanh vớicác cation Ca2+ trong mạng cấu trúc thủy tinh để tạo nên các nhómsilanol Si - OH trên bề mặt
Trang 25 Giai đoạn 2: Sự giải phóng các axit silicic Si(OH)4 ra môi trường bởi sự
bẻ gãy các liên kết Si - O - Si
Giai đoạn 3: Khi các axit silicic Si(OH)4 giải phóng ra môi trường đạttới trạng thái bão hòa, chúng bị polyme hóa để hình thành một lớp gelsilica SiO2 trên bề mặt thủy tinh
Trang 26 Giai đoạn 4: Sự di chuyển các ion Ca2+ và [PO4]3- trong mạng lưới cấutrúc thủy tinh cũng như sự di chuyển của chúng từ trong môi trườngdung dịch SBF về bề mặt lớp gel SiO2 tạo nên một lớp giàu Ca - P.
Giai đoạn 5: Các ion Ca2+ và [PO4]3- kết hợp với các ion OH- phản ứngtheo thời gian để tạo nên lớp hydroxyapatite giống với thành phần vô
cơ của xương người Nhờ lớp khoáng này mà xương hỏng, xươngkhuyếm khuyết được sửa chữa và lấp đầy
1.2.3.3 Sự tăng sinh và biệt hóa tế bào và kích hoạt biểu hiện gen
Giai đoạn 6: Phóng thích phân tử hoạt tính sinh học Giai đoạn 7: Hoạthóa đại thực bào Giai đoạn 8: Sự bám dính tế bào gốc Giai đoạn 9: Tăngsinh và biệt hóa tạo cốt bào Giai đoạn 10: Xuất hiện yếu tố tăng trưởng, tổnghợp khung ngoại bào Giai đoạn 11: Tế bào xương người trưởng thành, phânbào và hình thành xương mới [17]
Tế bào trạng thái nghỉ ở giai đoạn G0 và khi tế bào kích thích đi vàochu kỳ tế bào Một chu kỳ tế bào mới bắt đầu sau khi một tế bào hoàn tất mộtchu kỳ phân bào Yếu tố chìa khóa tái tạo xương là kiểm soát tế bào vào chu
kỳ phân bào, hoàn tất sự phân bào với sự sao chép gen chính xác và tế bàobiệt hóa có thụ thể chuyên biệt tổng hợp protein ngoại bào và tạo thành xươngtrưởng thành
Nghiên cứu của Xynos và cộng sự năm 2001 cho thấy kiểm soát chu kỳ
tế bào xương bằng cách kiểm soát sự phóng thích ion từ sự phân giải thủy tinhhoạt tính sinh học [43] Dòng tế bào gốc trên bề mặt thủy tinh hoạt tính sinhhọc Tuy nhiên, nồng độ các ion Si4+ và Ca2+ tại giao diện vật liệu và dungdịch phải đủ kiểm soát chu kỳ tế bào và kích hoạt bảy nhóm gen chịu tráchnhiệm tạo xương, làm tăng sinh và biệt hóa tạo cốt bào (sơ đồ 1.1)
Trang 27Sơ đồ 1.1 Chu kỳ tế bào [11]
Kiểm soát sự hòa tan thủy tinh hoạt tính sinh học giúp tạo ra nồng độ
đủ các ion hoạt tính sinh học tác động lên tế bào khi dịch tiếp xúc bề mặt vậtliệu Nhóm gen không được điều hòa và/hoặc hoạt động đều liên quan đếnmột phần đến chu kỳ tế bào, tăng sinh và biệt hóa tế bào
1.2.4 Ứng dụng của thủy tinh hoạt tính sinh học
Bảng 1.4, bảng 1.5 và bảng 1.6 tóm tắt các sản phẩm dùng thủy tinh hoạttính sinh học dùng trong lâm sàng, kể từ ngày tổng hợp đầu tiên thủy tinhhoạt tính sinh học năm 1969
Trang 28Bảng 1.4 Sản phẩm thủy tinh hoạt tính sinh học trong chỉnh hình [17]
Bảng 1.5 Sản phẩm thủy tinh hoạt tính sinh học trong sọ - mặt [17]
Phẫu thuật tạo hình Tái tạo cấu trúc mặt
Khuyếm khuyết răng
miệng
Ghép xương vùng mất răngDuy trì mào xương ổ răngNâng xoang hàm
Thủ thuật mở xươngKhuyếm khuyết nha chu
Chấn thương
Gãy xương dài (cấp tính và/hoặc gãy vụn); Cốđịnh đơn thuần hay với cố định bên trongSửa chữa phức hợp xương đùi
Gãy xương chày trên caoPhẩu thuật khớp Lấp đầy quanh vùng cấy ghép (tái tạo ổ khớp)
Trang 29Bảng 1.6 Sản phẩm thủy tinh hoạt tính sinh học trong răng hàm mặt [17]
Kem đánh răng và điều trị nhạy cảm ngà
Che tủy
Che xoang
Nứt gãy sàn ổ mắt
Duy trì mào xương ổ răng đã mất răng
Thay thế xương con ở tai giữa
1.3 TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VẬT LIỆU THEO ĐỘC TÍNH TẾ BÀO 1.3.1 Phương pháp thử nghiệm
Trong các phương pháp thử nghiệm đánh giá độc tính tế bào tiêu chuẩn,
có hai phương pháp [24]:
Phương pháp gián tiếp
Trong phương pháp gián tiếp, mẫu thử và mẫu chứng được ngâm vàodung dịch Sau đó dịch chiết cho vào tế bào đơn dòng, thay thế môi trườngnuôi dưỡng các tế bào ở thời gian trước đó Bằng cách này, các tế bào thửnghiệm được cung cấp với một môi trường chất dinh dưỡng mới có chứa dịchchiết, có nguồn gốc từ các vật liệu thử nghiệm, chứng Các mẫu này sau đóđược đặt ở 370C trong tủ nuôi tế bào Đánh giá từng giai đoạn thời gian bằngkính hiển vi soi ngược và phân tích với thời gian kéo dài thường là hai ngày
Phương pháp trực tiếp
Trong phương pháp trực tiếp, mẫu thử và mẫu chứng tiếp xúc trực tiếpcho lớp tế bào đơn dòng đặt vào môi trường nuôi cấy Trong thời gian ủ,
Trang 30thành phần từ vật liệu thử nghiệm di chuyển vào môi trường nuôi cấy hoặcthông qua các lớp thạch dinh dưỡng phủ bên trên với các tế bào phủ bên dưới.Sau khi ủ, đánh giá dựa trên sự hiện diện hay vắng mặt của tế bào đơn dòngbên dưới hoặc xung quanh mẫu thử Điều kiện chiết xuất trong phương pháptrực tiếp ít chặt chẽ hơn trong phương pháp gián tiếp Tuy nhiên, phươngpháp này đặc biệt hữu ích nếu chỉ một lượng rất nhỏ vật liệu có sẵn hoặc khichỉ có một bề mặt vật liệu cần đánh giá.
Phương pháp gián tiếp Phương pháp trực tiếp
Hình 1.6 Hai phương pháp thử nghiệm in vitro đánh giá độc tính tế bào [42]
Trang 31Bảng 1.7 So sánh hai phương pháp thử nghiệm đánh giá độc tính tế bào
bằng thử nghiệm in vitro [42]
Thuận lợi
Vật liệu hòa tan được
Chọn lựa môi trường chiếtxuất
Tách dịch chiết để thửnghiệm
Với một lượng tác độngthích hợp
Mở rộng thời gian tiếp xúc
Vật liệu không hòa tanđược
Kiểm soát giai đoạn chiếtxuất
Tiếp xúc giữa tế bào đích
và vật liệuTạo môi trường sinh lý môphỏng
Mở rộng thời gian tiếp xúc(thêm môi trường sạch)
Giảm số lượng tế bào nếu
có độc tính hòa tan cao
1.3.2 Hình thức đánh giá độc tính tế bào [24]
Có 2 hình thức đánh giá:
Trang 32 Đánh giá về mặt số lượng
Thử nghiệm MTS là phương pháp đo màu, định lượng số tế bào sống và
chết MTS là muối hữu cơ màu vàng, carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium khi có mặt PMS(phenazine methosulfate) sẽ được tế bào chuyển hóa, tạo ra một sản phẩmformazan tan trong môi trường nuôi cấy tế bào Lượng formazan tạo ra sẽđược định lượng bằng lượng ánh sáng ở bước sóng 490 nm bị hấp thụ và tỷ lệthuận với lượng tế bào sống trong môi trường nuôi cấy đó
Nguyên tắc
Trang 33Sơ đồ 1.2 Sự chuyển hóa MTS thành formazan
Đánh giá khả năng sống sót tế bào trên đĩa 96 giếng Thử nghiệm MTS
đã được áp dụng rộng rãi và phổ biến trong các phòng thí nghiệm và xuất hiệnnhiều trong nhiều bài báo khoa học Chất MTS cùng với dung dịch sinh lý tạomôi trường sống cho tế bào nuôi cấy, với nồng độ cuối cùng MTS là 0,2 - 0,5mg/ml, ủ trong 1 - 4 giờ Số lượng formazan tỷ lệ thuận với số lượng tế bàosống, đo bằng quang phổ hấp thụ ở bước sóng 490 nm bằng trắc quang Mộtbước sóng tham chiếu 630 nm được sử dụng, nhưng không cần thiết cho hầuhết các thử nghiệm
Tế bào sống trong trao đổi chất có sử dụng enzyme succinatdehydrogenase (SDH) chuyển đổi MTS, màu vàng thành formazan, màu tímvới bước sóng cao nhất 490 - 500 nm Khi các tế bào chết, tế bào mất khảnăng chuyển đổi MTS thành formazan, do đó màu không hình thành và mức
độ màu tím đậm nhạt như là một dấu hiệu hữu ích và tiện lợi chỉ ra có tế bàosống sót hay không và nhiều hay ít Cơ chế tế bào chuyển MTS thànhformazan, liên quan đến phản ứng NADH thành NAD+, quá trình phân tửchuyển electron khi có MTS Nhiều nghiên cứu cho thấy enzyme ti thể đóngvai trò cơ chất tham gia phản ứng chuyển đổi MTS thành formazan, đo lườnghoạt động của ty thể
Đánh giá về mặt hình thái
Các tế bào được quan sát bằng kính hiển điện tử quét (SEM) hay kínhhiển vi soi ngược với đặc điểm hình thái thay đổi (như thay đổi kích thướchoặc xuất hiện của các thành phần tế bào hoặc một sự gián đoạn trong hìnhdáng của tế bào) do ảnh hưởng độc tính của vật liệu thử nghiệm và chứng
Trang 34Yếu tố làm thay đổi hình thái tế bào: Do mắc phải (hoại tử tế bào), di truyền(chết tế bào theo lập trình - apoptosis) [46].
Hoại tử tế bào: Một phản ứng do bệnh lý làm tổn thương tế bào Baogồm tổng hợp các thay đổi hình thái theo sau chết tế bào trong mô hoặc cơquan sống Bao gồm thay đổi hồi phục và không hồi phục
+ Thay đổi hồi phục: Ly giải polysome (Disaggregatedpolysomes), Sự bám rìa nhiễm sắc thể tiêu (Focal chromatin margination), Phìđại nhẹ ti thể (Mild mitochondria swelling)
+ Thay đổi không hồi phục: Phì đại quá mức ti thể (High amplitudemitochondria swelling), Dày khung ti thể (Mitochondria matrix densities),Dày quá mức lưới nội chất (Progressive dilatation of endoplasmic reticulum),Phân giải lysosome (Lysosomal rupture), Phân giải màng bào tương (Plasmamembrane rupture), Phân giải nhân (Nuclear dissolution), Mất cơ quan nhận(Loss of recognisable organelles)
Chết tế bào theo lập trình: một quá trình sinh lý mà bao gồm các tínhiệu cụ thể dẫn đến tế bào chết theo lập trình Quá trình này có thay đổi hìnhthái tế bào
+ Tế bào teo tóp lại và vê tròn được thấy rõ vì caspase đã phân giảiphần khung tế bào bằng protein
+ Tế bào chất trở nên đậm đặc hơn và các bào quan bị ép chặt lại.+ Nhiễm sắc chất xoắn chặt lại trở thành một khối đính vào lớpmàng bao quanh nhân trong quá trình cô đặc nhiễm sắc thể (pyknosis), mộtdấu hiệu nhận biết sự chết rụng tế bào
+ Lớp màng nhân trở nên không liên tục và ADN trong nhân bịphân rã trong quá trình phân rã tế bào (karyorrhexis) Thế là nhân tế bào phân
rã thành nhiều tiểu thể nhiễm sắc hay đơn vị thể nhân
Trang 35+ Màng tế bào hình thành những chỗ phồng không theo một quytắc nào.
+ Tế bào tan vỡ thành những túi tiết mang tiểu thể chết rụng, cáctiểu thể này sẽ bị các đại thực bào tiêu thụ
1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI
1 Hench L.L và cộng sự (1969) cho thấy có liên kết giữa xương vớithủy tinh hoạt tính sinh học, thực hiện nghiên cứu ở Đại học Florida (Báo cáocho nghiên cứu phát triển trong Quân Y lục quân Mỹ)
2 Hench L.L và cộng sự (1971) cho thấy có liên kết giữa xương vớithủy tinh hoạt tính sinh học Thành phần thủy tinh hoạt tính sinh học chứa45% SiO2, với tỉ lệ thành phần Ca/P là 5 thì trở nên cố định vững chắc khi đặttrong khiếm khuyết đầu xương đùi chuột với thành phần ion Ca2+ và [PO4]3-
nhưng không có ion F- tại giao diện vật liệu cấy ghép trong vật liệu cấy ghép.Việc bổ sung các ion F- vào vật liệu ngăn cố định vật liệu này Rõ ràng sựxuất hiện ion Ca2+ và [PO4]3- tại giao diện vật liệu góp phần hình thành liênkết giữa xương và vật liệu [20]
3 Wilson J và cộng sự (1981) cho thấy có hình thành liên kết ổn địnhgiữa thủy tinh hoạt tính sinh học với mô liên kết và sau 8 tuần thử nghiệm
(qua 20 thử nghiệm in vitro và in vivo) đánh giá độc tính tế bào và tương hợp
sinh học của thủy tinh hoạt tính sinh học và FDA đã chấp nhận tính an toàncủa vật liệu này và được sử dụng trên lâm sàng [40]
4 Merwin G.E và cộng sự (1985) cho thấy bộ phận giả tai giữa bằngthủy tinh hoạt tính sinh học đáp ứng tốt với mô qua thử nghiệm lâm sàng trênbệnh nhân trong việc tái cấu trúc chuỗi xương con và được FDA chấp nhậnsản phẩm y khoa đầu tiên (MEP) sử dụng trên lâm sàng [28], [29], [30]
Trang 365 Hench L.L và cộng sự (1991) đề ra phương pháp sot - gel tạo thủytinh hoạt tính sinh học làm thủy tinh gia tăng hoạt tính sinh học Phương phápnày thực hiện ở nhiệt độ thấp đáng kể so với phương pháp nóng chảy Liênkết là hình thành lớp bề mặt hydroxyapatite Điều này có thể mở rộng đáng kểhoạt tính sinh học thông qua kiểm soát vi cấu trúc bằng phương pháp sol-gel[21].
6 Oonishi H và cộng sự (2000): cho thấy tốc độ hình thành xương củavật liệu cấy ghép của thủy tinh hoạt tính sinh học hơn hydroxyapatite tổng
hợp và thủy tinh A - W Nghiên cứu này thực hiện trên thử nghiệm in vivo
trên lồi cầu xương đùi thỏ trưởng thành Qua đó cho thấy tốc độ tăng trưởngcủa xương tương quan với tốc độ phân giải thủy tinh [33]
7 Xynos I.D và cộng sự (2000): cho thấy số lượng tế bào ở giai đoạn
S, G2 và M tăng lên khi tạo cốt bào được nuôi cấy với thủy tinh hoạt tính sinhhọc sau 2 ngày Hình thành cầu xương ở một số vị trí sau 6 ngày và nhiều vịtrí khác sau 12 ngày, cho thấy có hình thành tạo cốt bào trưởng thành Kếtluận thủy tinh hoạt tính sinh học có sự tăng sinh và biệt hóa tạo cốt bào [42]
8 Xynos I.D và cộng sự (2001) cho thấy ion phân giải từ thủy tinhhoạt tính sinh học trong DMEM qua 4 ngày làm tăng sinh tạo cốt bào lên155% Sau 2 ngày thử nghiệm, tăng yếu tố tăng trưởng II tương tự insulin(IGF - II), protein IGF - II chưa kết hợp, IGFBP - 3 (một protein vận chuyểnIGF - II), metalloproteinase - 2 and cathepsin - D lần lượt là 290%, 168%,200%, 340% và 310% Sự tác động của ion phân giải từ thủy tinh hoạt tínhsinh học 45S5 lên sự tăng sinh tạo cốt bào chịu sự điều hòa của IGF - II [41]
9 Paman M và cộng sự (2010) cho thấy thủy tinh hoạt tính sinh học
và calcium hydroxide có tác dụng kháng khuẩn Enterococcus Faecalis nhưng
Trang 37không diệt hoàn toàn vi khuẩn Tuy nhiên, canxi hydroxide có tác dụng khángkhuẩn cao hơn [34].
10 Bakry A.S và cộng sự (2011) cho thấy thủy tinh hoạt tính sinh học
có tính tương hợp sinh học cao đối với tế bào tủy răng so với ba vật liệu nhakhoa thường dùng (Caviton, Fuji I, SuperSeal), có tính an toàn trong điều trịnhạy cảm ngà [6]
11 Bakry A.S và cộng sự (2014) nghiên cứu chất dán của hợp chấtthủy tinh hoạt tính sinh học và axit photphoric được dùng trong điều trị sâumen răng mới chớm Sang thương sâu men răng mới chớm được tự tạo rabằng chất khử khoáng [5] Tất cả mẫu thử chịu sự mòn răng do chải răng đểthử nghiệm sự duy trì theo thời gian của lớp mới hình thành do kết qua củađặt chất dán thủy tinh hoạt tính sinh học Sau đó các mẫu được che phủ bằngnhững tinh thể hydroxyapatite Việc mòn răng do chải răng không ảnh hưởngđáng kể phần trăm độ phủ men răng của tinh thể khoáng hóa do đặt chất dánthủy tinh hoạt tính sinh học (p < 0,05) Những tinh thể sau đó chuyển thànhtinh thể hydroxyapatite khi trong môi trường nước bọt nhân tạo 14 ngày.Những kỹ thuật gần đây gợi ý khả năng trám những sang thương sâu răngmới chớm do mòn cơ học theo thời gian với sự hình thành lớp tinh thểhydroxyapatite
Tóm lại, thủy tinh hoạt tính sinh học đã được phát hiện vào năm 1969
và qua các thử nghiệm in vitro, thử nghiệm in vivo và thử nghiệm sử dụng
trên động vật Sau đó vật liệu được tiến hành trước khi vật liệu có thể sử dụngcác thử nghiệm lâm sàng vào năm 1985 Cuối cùng thủy tinh hoạt tính sinhhọc trở thành sản phẩm đầu tiên được thương mại hóa Những phát hiện gầnđây cho thấy rằng sự phóng thích ion có kiểm soát từ sự phân giải thủy tinh
Trang 38quan đến việc điều hòa bảy nhóm gen kiểm soát chu kỳ tế bào tạo cốt bào,tăng sinh tế bào và biệt hóa tế bào Với sự hiện diện của ion Ca2+, Si4+ trongvòng 48 giờ, kích thích nguyên bào xương tăng sinh và biệt hóa và có khảnăng tái tạo xương mới Đặc biệt thủy tinh hoạt tính sinh học Bioglass® 45S5
đã có những nghiên cứu bước đầu trong điều trị nhạy cảm ngà
Trang 397 Chương 2.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1 Thủy tinh hoạt tính sinh học (Việt Nam)
Thủy tinh hoạt tính sinh học có thành phần % khối lượng là 45% SiO2,24,5% CaO, 24,5% Na2O và 6% P2O5
Vật liệu thủy tinh hoạt tính sinh học (Việt Nam) đạt chuẩn là thủy tinhhoạt tính sinh học và được đăng ký đề tài, dự án khoa học và công nghệ (Phụlục 1) Qua các phương tiện kiểm định XRF, XRD, FTIR đã thể hiện được vậtliệu tổng hợp này là vật liệu cấu trúc vô định hình, nồng độ các tạp chất oxitkim loại và kim loại như chì, sắt, mangan trong giới hạn cho phép, có hoạttính cao thể hiện qua tốc độ hình thành nhanh lớp khoáng apatite mới làm cầunối liên kết giữa thủy tinh và mô chủ
Thành phần 60 % hydroxylapatite và 40 % tricalcium phosphate
2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Theo tiêu chuẩn ISO 7405 [23], khi đánh giá độc tính tế bào của thủytinh hoạt tính sinh học được tổng hợp ở Việt Nam trên tế bào chuột thì phảiđánh giá trên hai nội dung: đánh giá định tính và đánh giá định lượng
Từ vật liệu thủy tinh hoạt tính sinh học (Việt Nam), Straumann® BoneCeramic và được ngâm trong dung dịch DMEM Sau đó mẫu thử/so sánh thuđược của 2 vật liệu được pha thành 15 nồng độ pha loãng là 0,5 mg/ml, 1mg/ml, 1,5 mg/ml, 2 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml và 100 mg/ml
Trang 40Dòng tế bào nguyên bào sợi chuột 3T3 được nuôi cấy trong môi trườngDMEM Sau 24 giờ, một mật độ tế bào nhất định được đặt trong từng giếng.
Sau đó, mẫu thử/so sánh có 15 nồng độ khác nhau và mẫu trống lầnlượt được đặt vào giếng chứa tế bào 3T3
2.2.1 Đánh giá định tính
Sau 24 giờ và 48 giờ, mẫu thử/so sánh và mẫu trống được lấy ra đánhgiá định tính qua quan sát dưới kính hiển vi soi ngược: đánh giá tế bào vêtròn, tế bào mất hạt bào chất và tế bào ly giải Dựa trên bảng đánh giá mức độđộc tính tế bào theo tiêu chuẩn ISO 7405 [23] mà xác định mức độ độc tính tếbào của vật liệu
Thử nghiệm lặp lại 4 lần
2.2.2 Đánh giá định lượng
Sau 24 giờ và 48 giờ, hai đĩa giếng: thủy tinh hoạt tính sinh học (ViệtNam) và Straumann® Bone Ceramic, lần lượt được thêm dung dịchMTS/PMS vào từng giếng Sau 2 giờ nuôi cấy, đặt đĩa giếng lên máy rung.Hai đĩa giếng lần lượt được đưa vào máy quang phổ kế với bước sóng 490 nm
và cho kết quả Dựa vào tiêu chuẩn ISO 7405 [23] mà đánh giá mức độ độctính tế bào Nếu tỉ lệ phần trăm tế bào sống sót của mẫu thử < 70% so vớimẫu trống, mẫu thử có độc tính tế bào 3T3
Thử nghiệm lặp lại 4 lần