Luận văn nghiên cứu bệnh đốm vàng lụi lúa (rice yellow stunt virus) ở miền bắc việt nam

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

LƯU THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU BỆNH VÀNG LỤI LÚA (Rice yellow stunt virus)

Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan!

Bản luận văn tốt nghiệp này ñược hoàn thành bằng sự nhận thức chính xác của bản thân

Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực, chưa ñược sử dụng và công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng cám ơn sự hướng dẫn tận tình, với tinh thần trách nhiệm cao của Tiến sĩ Hà Viết Cường, Giáo viên bộ môn Bệnh cây- Khoa Nông học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội Trân trọng cám ơn các Giảng viên bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học; các cán bộ công nhân viên của Trung tâm Bệnh cây nhiệt ñới trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ về mặt kỹ thuật, dụng cụ, trang thiết bị phục vụ cho quá trình ñiều tra, tiến hành các thí nghiệm và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này

Trân trọng cám ơn cán bộ Lãnh ñạo UBND và Trưởng ban khuyến nông, Trạm trưởng Trạm Bảo vệ thực vật huyện Ba Vì – Hà Nội, huyện Hiệp Hòa – Bắc Giang ñã hỗ trợ theo dõi, phối hợp ñánh giá tình hình diễn biến của bệnh vàng lụi trong quá trình thực hiện ñề tài

Hà Nội, ngày 20 tháng 3 năm 2011

Tác giả

Lưu Thị Thảo

2.3 Phân loại, hình thái và đặc điểm bộ gen virus RYSV 7

2.5.1 Nguyên lý của phương pháp huyết thanh học và ứng dụng 11 2.5.2 Chế tạo kháng huyết thanh đa dịngđối với virus thực vật 12

3.3.2 Vật liệu thử nghiệm tạo kháng huyết thanh và chẩn đốn ELISA 15

3.3.5 Các enzyme và kit thương mại 16

4.1.1 Triệu chứng bệnh vàng lụi tại các ựiểm ựiều tra 25

4.1.4 Phát hiện virus RYSV bằng RT-PCR trên các mẫu thu thập ngoài

4.2 Thử nghiệm tạo kháng huyết thanh ựặc hiệu virus RYSV 33

4.2.6 đánh giá chất lượng của 2 nguồn kháng huyết thanh (huyết tương và

4.2.7 Kiểm tra nồng ựộ virus trong quá trình tinh chiết 40

4.2.8 đánh giá ựộ hòa loãng của kháng huyết thanh 42

4.2.10 Kiểm tra nồng ựộ virus ở mẫu lá vàng và lá xanh trên cùng một cây bệnh 44 4.2.11 đánh giá về mẫu khô, mẫu tươi và mẫu nghiền, mẫu không nghiền 46 4.2.12 Kiểm tra nồng ựộ virus ở các bộ phận khác nhau của cây bệnh 47 4.2.13 Kiểm tra virus trong mẫu rầy xanh ựuôi ựen và một số loại cỏ tại Bắc

4.2.14.Ứng dụng ELISA kiểm tra virus RYYSV thu tại ở Hà Nội, Bắc Giang

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Bộ NN&PTNT : Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn

DAS - ELISA : Double antibody sandwich - ELISA

NCBI

: National Center for Biotechnology Information

PTA-ELISA

: Plate Trapped Entigen – ELISA

RT-PCR : Reverse Transcriptional – Polymerase Chain

Reaction

DANH MỤC BẢNG BIỂU

4.1 Bệnh vàng lá lúa vụ xuân năm 2011 tại một số tỉnh phắa Bắc 27 4.2 Bệnh vàng lá lúa vụ mùa năm 2011 tại một số tỉnh phắa Bắc 29 4.3 RT-PCR phát hiện virus RYSV trên lúa vụ xuân 2011 tại Hà- Nội 31 4.4 RT-PCR phát hiện virus RYSV trên lúa vụ xuân năm 2011 tại Bắc

4.5 Tóm tắt các bước tinh chiết phân tử virus RYSV từ mô lá lúa bệnh 35 4.6 ELISA kiểm tra sự có mặt kháng thể virus RYSV trong kháng huyết

4.7 ELISA so sánh chất lượng 2 nguồn kháng huyết thanh virus RYYSV

(huyết tương và dịch trên tủa sau ly tâm máu ựông) 38 4.8 Kiểm tra ELISA hàm lượng virus RYSV trong các sản phẩm thu

4.11 Thử nghiệm ELISA về nồng ựộ virus trên mẫu lá xanh và lá vàng trên

4.12 đánh giá về mẫu nghiền và mẫu không nghiền; mẫu khô và mẫu tươi 46 4.13 Kiểm tra nồng ựộ virus ở các bộ phận khác nhau ở cây bệnh 48

4.15 Kiểm tra ELISA một số loại cỏ thu thập ựược trong quá trình ựiều tra

4.16 Kết quả kiểm tra RYSV trên mẫu lúa vụ mùa 2011 51

4.19 Kiểm tra sản phẩm miniprep bằng enzyme cắt giới hạn 57

4.21 Kết quả tìm kiếm trên ngân hang gen bằng phần mềm Blast 59

DANH MỤC HÌNH

2.2 Cấu trúc phân tử của các rhabdovirus (Viralzone, 2009) 8

2.3 Phân tử virus RYSV (hình trái, Shikata và Chen, 1969) và vị trí

hình thành của các phân tử virus RYSV trong phần ngoại vi của

2.4 Sơ ñồ tổ chức bộ gen của RYSV ñược xây dựng dựa trên mẫu

2.5 Hìn thái 3 loài rầy xanh truyền RYSV Từ trái sang phải lần lượt

là là N nigropictus, N cincticeps và N virescens. 10

4.1 Một số triệu chứng ñiển hình của cây lúa bị bệnh vàng lá do

4.2 ðiều tra bệnh và thu thập rầy xanh ñuôi ñen tại xã Hòa Sơn –

4.3 ðiều tra bệnh vàng lá và thu thập rầy xanh ñuôi ñen tại xã Phú

4.4 ðiều tra bệnh vàng lá và thu thập rầy xanh ñuôi ñen tại xã Hòa

4.5 Kiểm tra RT-PCR phát hiện virus RYSV trên lúa Hà Nội vụ xuân

4.8 ELISA kiểm tra sự có mặt kháng thể virus RYSV trong kháng

4.9 ELISA so sánh chất lượng 2 nguồn kháng huyết thanh virus

RYYSV (huyết tương và dịch trên tủa sau ly tâm máu ñông) 39

4.10 Kiểm tra ELISA ñánh giá hàm lượng virus ở các sản phẩm của

4.11 ELISA ñánh giá ñộ hòa loãng của kháng huyết thanh 42

4.12 Elisa ñánh giá ñộ hòa loãng của mẫu cây bệnh và nồng ñộ virus

4.13 Kiểm tra ELISA ñánh giá mẫu tươi, mẫu khô; mẫu nghiền,

4.14 Kiểm tra ELISA ñánh giá nồng ñộ virus ở các bộ phận của cây bệnh 48

4.16 Sơ ñồ bộ gen virus RYSV, vị trí các mồi và sản phẩm RT-PCR 53

4.17 RT-PCR dùng 2 tổ hợp mồi ñể nhân gen L và N của RYSV từ 2

mẫu lúa bệnh 1075 và 2011 M là thang DNA 1 kb (Fermentas)

4.18 Nuôi cấy các dòng vi khuẩn tái tổ hợp trong môi trường LB lỏng

4.19 Kiểm tra PCR các dòng vi khuẩn biến nạp bằng cặp mồi Vector

SeqFor và Vector SeqRev M là thang DNA 100 bp (Fermentas)

4.20 Kiểm tra sản phẩm miniprep bằng cắt kép với BamHI và ECoRI M

là thang DNA 100 bp ( Fermentas) với 2 băng tham khảo ñược chỉ

4.21 Trình tự sản phẩm RT-PCR và minh họa một phần ñồ thị trình tự 58

1 ðẶT VẤN ðỀ

1.1 Tính cấp thiết của nghiên cứu

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng nhất ở các nước Châu Á nói

chung và Việt Nam nói riêng Khoảng 92% lúa gạo ñược sản xuất từ Châu Á Việt Nam, trong nhưng năm gần ñây là một trong các quốc gia xuất khẩu gạo hàng ñầu của thế giới Hiên nay, Việt Nam chỉ ñứng sau Thái Lan về xuất khẩu gạo, với lượng xuất khẩu khoảng 5 triệu tấn, chiếm 1/5 tổng lượng gạo xuất khẩu trên thế giới

Sản xuất lúa hiện ñang phải ñương ñầu với nhiều nguy cơ, ñặc biệt là sự tấn công của dịch hại, trong ñó có bệnh virus Cho tới nay có hơn 15 virus gây bệnh cho lúa ñã ñược xác ñịnh, trong ñó có 12 virus ở Châu Á, 2 virus ở Châu phi, 1 virus ở Châu Âu và 1 virus ở Châu Mỹ (Hibino, 1996) Tại các nước Châu Á, bệnh virus hại lúa xảy ra ở nhiều vùng, từ năm này qua năm khác và gây thiệt hại hàng nghìn

ha luá (Bos, 1992)

Tại Việt Nam, bệnh vàng lùn do Rice grassy stunt virus (RGSV) và lùn xoắn lá

do Rice ragged stunt virus (RRSV) ñã gây ra nhiều vụ dịch nghiêm trọng trên lúa tại miền Nam từ năm 2006 Gần ñây hơn, bệnh lùn sọc ñen so Southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV) ñã và ñang gây bệnh nghiêm trọng, ñặc biệt trên lúa mùa ở miền Bắc và miền Trung từ năm 2009 (Hà Viết Cường et al., 2009, Ngô Vĩnh Viễn et al., 2009)

Tại Việt Nam, bệnh vàng lụi (còn gọi là bệnh vàng lá) xuất hiện ở Việt Nam từ những năm 60 của thế kỷ trước và ñược coi là dịch hại nguy hiểm nhất, ñược xác ñịnh do rầy xanh ñuôi ñen truyền, gây hại thành dịch tại nhiều tỉnh phía Bắc, ñặc biệt là các tỉnh miền núi (Ngô Vĩnh Viễn và Hà Minh Trung, 2006) ðến năm 1980-

1981 bệnh xuất hiện trở lại và gây hại cục bộ trên các cánh ñồng Mường Thanh (ðiện Biên) và Phù Yên (Sơn La) Mặc dù vector truyền bệnh ñược biết là do rầy xanh ñuôi ñen nhưng virus gây bệnh vẫn chưa ñược nghiên cứu

Trong năm 2010, tại Bắc Giang, một bệnh trên lúa với triệu chứng vàng lá ñã xuất hiện và gây hại trên diện rộng Các cây lúa bị bệnh sinh trưởng phát triển kém, lùn lụi Theo thông báo của Chi cục BVTV Bắc Giang, bệnh ñã xuất hiện từ năm

2004 và diện tắch nhiễm bệnh tới ~ 1000 ha năm 2009 Vụ mùa 2010 ở Bắc Giang, bệnh ựã xuất hiện ở 24/26 xã của huyện, trong ựó hai xã bị nặng nhất là Hòa Sơn và Thanh Sơn Tới ngày 6/8/2010, tổng diện tắch bị bệnh của huyện là 108 ha, nhiều ruộng có tỷ lệ bệnh tới ~ 90 % Ngoài ra, triệu chứng bệnh tương tự còn thấy xuất hiện ở một số tỉnh như Hà Nam, Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ AnẦ

Lúc ựầu bệnh ựã ựược cho là do các nguyên nhân sinh lý như ựất ựai, phân bón hoặc ngẹt rễ gây ra Tuy nhiên, dựa vào ựánh giá triệu chứng, phân tắch phân tử (PCR và giải trình tự), hiển vi ựiện tử, nguyên nhân gây bệnh vàng lá tại Bắc Giang

ựã ựược xác ựịnh chắnh xác là do virus Rice yellow stunt virus (RYSV) (Hà Viết Cường et al., 2010) Virus gây bệnh còn ựược biết với tên gọi là Rice yellow transitory virus (RYTV) ựã từng gây thành dịch nghiêm trọng tại tại nhiều tỉnh phắa nam Nam Trung Quốc kể cả đài Loan trong những năm 60 và 70 (Ou, 1985; Hibino, 1996)

Do ựặc ựiểm giống nhau về triệu chứng, vector truyền bệnh nên tên bệnh vàng

lá Bắc Giang ựược ựề xuất là bệnh vàng lụi (Hà Viết Cường et al., 2010)

Mặc dù tác nhân gây bệnh vàng lụi lúa tại Việt Nam ựã ựược xác ựịnh là do RYSV nhưng nhiều vấn ựề liên quan ựến virus ựều phải ựược nghiên cứu bao gồm: (i) bản thân virus (ựặc ựiểm hình thái, phân tử/di truyền, phân loại, chẩn ựoánẦ), (ii) các ựặc trưng sinh học (phạm vi ký chủ, quan hệ vector, tắnh chất gây bệnh, tắnh hướng mô, chức năng genẦ), (iii) dịch tễ bệnh (ảnh hưởng tương tác của 3 yếu tố bệnh học là ký chủ - ựiều kiện ngoại cảnh - virus ựến sự phát triển bệnh trên qui mô quần thể) và (iv) phòng chống (các chiến lược và chiến thuật phòng trừ bệnh) Trong các nội dung nghiên cứu trên thì nghiên cứu chẩn ựoán chắnh xác bệnh

là yêu cầu bức thiết vì triệu chứng ựiển hình của bệnh là bộ lá bị biến vàng, cây lùn nhưng lại có khả năng mất triệu chứng trong một số trường hợp dẫn tới bệnh rất dễ

bị nhầm do các nguyên nhân khác

Xuất phát từ thực tế trên, dưới sự hướng dẫn của TS Hà Viết Cường, chúng

tôi tiến hành ựề tài: ỘNghiên cứu bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus) ở miền Bắc Việt NamỢ

• ðiều tra bệnh vàng lụi, kiểm tra virus bằng RT- PCR và ELISA

• Thử nghiệm tạo kháng huyết thanh ñặc hiệu phân tử virus RYSV và ñánh giá các ñiều kiện ñể tối ưu hóa phản ứng ELISA

• Dòng hóa và giải trình tự một phần gen virus RYSV

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Bệnh vàng lụi trên thế giới và Việt Nam

Bệnh vàng lùn lúa (rice yellow stunt disease) ựược phát hiện ựầu tiên ở tỉnh Quảng Tây (Trung Quốc) năm 1957 và ựược công bố chắnh thức năm 1965 (Fang et

al 1994) Cũng trong năm này, một bệnh trên lúa gọi là bệnh vàng tạm thời (rice transitory yellowing disease) ựã gây thành dịch ở đài Loan (Chiu et al., 1965) và virus gây bệnh ựược gọi là RTSV (Rice transitory yellowing virus) Tại Việt Nam, bệnh Ộvàng tạm thờiỢ tại đài Loan ựã ựược dịch là bệnh Ộvàng lá di ựộngỢ

Tên bệnh Ộvàng tạm thờiỢ và tên virus RTSV ựã xuất hiện trên nhiều tài liệu, chủ yếu do các tác giả Nhật Bản và đài Loan, thậm chắ ựể chỉ cả bệnh Ộvàng lùnỢ ở

lục ựịa Trung Quốc (Shikita, 1972; Ou, 1985) Triệu chứng bệnh của 2 loại bệnh

này trên cây lúa ựược mô tả giống nhau: lá lúa bị vàng, nhiều nhất là lá phắa dưới, cây lúa còi cọc và giảm số nhánh ở các cây bị bệnh và làm giảm năng suất lúa Bệnh Ộvàng lùnỢ hay bệnh Ộvàng tạm thờiỢ ựã từng gây thành dịch tại nhiều tỉnh phắa nam trong những năm 60 và 70 như đài Loan (1960 Ờ 1962, 1973 Ờ 1980), các tỉnh phắa nam sông Dương Tử như Quảng đông (1964-1966, 1979), Phúc Kiến (1966, 1969, 1973), Chiết Giang (1970 Ờ 1973) (Ou, 1985; Hibino, 1996) Tại Việt Nam, trong cùng thời gian, một bệnh biến vàng trên lúa gọi là bệnh Ộvàng lụiỢ do rầy xanh ựuôi ựen truyền ựã gây thành dịch ở miền Bắc, ựặc biệt tại các tỉnh miền núi (Ngô Vĩnh Viễn và Hà Minh Trung, 2006) Mặc dù mẫu bệnh vàng lụi của Việt Nam không ựược lưu giữ nhưng ựối chiếu bệnh Ộvàng lùnỢ hay Ộvàng tạm thờiỢ của Trung Quốc và bệnh Ộvàng lụiỢ của Việt Nam thấy có nhiểu ựiểm giống nhau về (i) triệu chứng, (ii) vector và (iii) ựặc biệt là sự xuất hiện các vụ dịch trong cùng thời gian, tại các khu vực gần gũi về mặt ựịa lý Rất có thể, bệnh Ộvàng lụiỢ tại Việt Nam chắnh là bệnh Ộvàng lùnỢ hay Ộvàng tạm thờiỢ tại Trung Quốc (Hà Viết Cường et al., 2010) (Hình 2.1)

Hình 2.1 Phân bố dịch bệnh Ộvàng lụiỢ tại Việt Nam, bệnh Ộvàng lùnỢ tại phắa Nam Trung Quốc và Ộvàng tạm thờiỢ tại đài Loan (các hình tam giác ựỏ) trong những năm 60, 70 (Hà Viết Cường, Báo cáo hội thảo quốc gia Bệnh cây

năm 2011 tổ chức tại đH Nông nghiệp Hà Nội)

Tại Việt Nam, Viện Bảo vệ thực vật ựã có nhiều nghiên cứu về bệnh vàng lụi trong những năm 1980-1981, mẫu bệnh ựược chụp trên kắnh hiển vi ựiện tử tại Viện

vệ sinh dịch tễ Hà Nội và ựã kết luận bệnh vàng lụi xuất hiện ở các tỉnh miền núi phắa Bắc giống như bệnh vàng lá di ựộng gây hại ở đài Loan (Ngô Vĩnh Viễn và Hà Minh Trung, 2006)

Gần ựây, tại Bắc Giang, một bệnh với triệu chứng vàng lá ựã xuất hiện

và gây hại trên diện rộng Các cây lúa bị bệnh sinh trưởng phát triển kém, lùn lụi Theo thông báo của Chi cục BVTV Bắc Giang, bệnh ựã xuất hiện từ năm

2004 nhưng vì là bệnh mới, không xác ựịnh ựược nguyên nhân gây bệnh nên không thống kê diện tắch nhiễm Các năm tiếp theo, Chi cục ựã thống kê mức

ựộ gây hại của bệnh như sau:

Ớ Năm 2005:diện tắch nhiễm (DTN) 60 ha ở Hiệp Hòa

Ớ Năm 2006: Bệnh phát sinh rộng, chủ yếu ở Hiệp Hòa, DTN 200 ha với tỷ lệ bệnh trung bình 10-20%, diện tắch nhiễm nặng 30 ha với tỷ lệ bênh 50-60% Huyện tổ chức phòng trừ trên diện tắch 100 ha, áp dụng các biện pháp như ựối với bệnh sinh lý nhưng không có kết quả

Ớ Năm 2007: DTN 13 ha ở Hiệp Hòa, Lạng Giang

• Năm 2008: DTN > 1 ha ở Hiệp Hòa

• Năm 2009: DTN lên tới 914,5 ha, mất trắng > 4,5 ha, xuất hiện ở hầu hết các huyện, riêng Hiệp Hòa 600 ha Các biện pháp phòng chống bệnh như ñối với bệnh sinh lý ñã ñược áp dụng trên diện tích 605 ha nhưng không có kết quả

• Vù mùa 2010, bệnh cũng xuất hiện trên diện rộng, ñặc biệt tại huyện Hiệp Hòa Tại Hiệp Hòa, bệnh ñã xuất hiện ở 24/26 xã của huyện, trong ñó hai xã

bị nặng nhất là Hòa Sơn và Thanh Sơn Tới ngày 6/8/2010, tổng diện tích bị bệnh của huyện là 108 ha, nhiều ruộng có tỷ lệ bệnh tới ~ 90 %

Ngoài ra, triệu chứng bệnh tương tự còn thấy xuất hiện ở một số tỉnh như Hà Nam, Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An

Lúc ñầu bệnh ñã ñược cho là do các nguyên nhân sinh lý như ñất ñai, phân bón hoặc ngẹt rễ gây ra Tuy nhiên, dựa vào ñánh giá triệu chứng, phân tích phân tử (PCR và giải trình tự), hiển vi ñiện tử, nguyên nhân gây bệnh vàng lá tại Bắc Giang

ñã ñược xác ñịnh chính xác là do virus RYSV (Rice yellow stunt virus) Do ñặc ñiểm giống nhau về triệu chứng và vector truyền bệnh nên tên bệnh vàng lá Bắc Giang ñược ñề xuất là bệnh vàng lụi (Hà Viết Cường et al., 2010)

2.2 Triệu chứng gây hại

Về triệu chứng, bệnh biến vàng tạm thời ở luá ñã ñược Ou (1985) mô tả như sau:

(i) Triệu chứng ñiển hình là bộ lá biến vàng, cây lùn, ñẻ nhánh giảm Hai ñến ba

tuần sau cấy, một cây bệnh ñiển hình có 1-2 lá phía dưới bị biến vàng, sau chuyển thành vàng sáng hoặc vàng cam tối, cuối cùng các lá vàng này trở nên nhăn héo Lá biến vàng thường bắt ñầu từ ñỉnh lá và trên cây thì các lá phía dưới biến vàng trước sau ñó mới lan lên các lá phía trên Trên các lá biến vàng, có thể xuất hiện các chấm

nhỏ màu nâu ñỏ (màu gỉ sắt) (ii) Trên giống mẫn cảm, cây bị lùn, giảm mạnh khả

năng ñẻ nhánh, trỗ kém hoặc không trỗ Cây nhiễm sớm có thể biểu hiện triệu chứng rõ rệt nhưng cây nhiễm muộn có thể không biểu hiện triệu chứng Trường

hợp nặng, cây có thể chết trước khi trỗ (iii) Bệnh ñược gọi là “vàng tạm thời” vì

cây bệnh, ñặc biệt trong ñiều kiện nhà kính, sau khi biểu hiện triệu chứng vàng lá ñiển hình, có thể phục hồi, thậm chí không biểu hiện triệu chứng Nhiều khi, các dảnh trông bình thường hình thành từ một cây bệnh

2.3 Phân loại, hình thái và ñặc ñiểm bộ gen virus RYSV

Phân loại

RYSV hay RTYV là thành viên của chi Nucleorhabdovirus, họ

Rhabdoviridae, bộ Mononegavirales (Walker et al., 2000)

Tổng số loài virus thuộc họ Rhabdovirus ñược công nhận bởi ICTV cho tới

năm 2009 là 51 Các rhabdovirus ñược phân loại chính thức vào 6 chi và một số chưa phân loại ñến chi “Rhabdo” có nguồn gốc từ từ Hy Lạp “rhabdos” có nghĩa là

“hình gậy” ám chỉ phân tử virus có hình nhộng (gậy ngắn) Các rhabdovirus gây hại

thực vật chỉ thuộc 2 chi Nucleorhabdovirus và Cytorhabdovirus, còn lại là các virus

ñộng vật Trong số các rhabdovirus hại ñộng vật, Rabies virus (gây bệnh dại) là nguy hiểm nhất Trong số các rhabdovirus hại thực vật, RYSV gây bệnh vàng lụi lúa là virus quan trọng nhất (Hà Viết Cường, 2010 b)

Hình thái phân tử virus (virion) và tổ chức bộ gen

Các rhabdovirus là các virus có bộ gen RNA, sợi ñơn, không phân mảnh, cực

âm, kích thước 11-15 kb, chiếm khoảng 1-2% khối lượng phân tử virus Bộ gen virus chứa ít nhất 5 khung ñọc mở (open reading frame, ORF) không liên tục theo chiều từ ñầu 3' - 5' (chú ý RNA của virus là cực âm) theo thứ tự sau: 3'- N- P- M-G-L-5' Các ORF ñược phiên mã thành mRNA và dich mã ñộc lập thành các protein cấu trúc sau:

• N: protein nucleoprotein Bên trong tế bào, N ñóng vai trò cân bằng giữa quá trình phiên mã các gen virus và tái sinh bộ gen virus do tác ñộng ñến sự nhận biết các dấu hiệu phiên mã

• L: protein lớn (large protein) L là một RdRp

• M : protein tạo protein nền (matrix protein) M còn ñược kí hiệu là M1, M ñóng vai trò ñiều khiển quá trình phiên mã của virus, ức chế phiên mã của kí chủ, ảnh hưởng tới sự gây bệnh

• P : protein ñược phosphryl hóa (phosphorylated protein) P còn ñược ký hiệu là M2 P là một cofactor của protein L và do ñó cần thiết cho quá trình tái sinh của virus

• G : protien ñược glycosyl hóa (glycosylated protein).G lắp ráp thành trimer ñể tạo thành gai vỏ Có chức năng quan trọng trong xâm nhập tế bào, tương tắc với vector

Ngoài ra, ở ñầu 3' và 5' của bộ gen virus có lần lượt 2 chuỗi leader và trailer Các rhabdovirus nhìn chung có cấu trúc phân tử phức tạp, thuộc nhóm có vỏ bọc Phần lớn các rhabdovirus có hình con nhộng nhưng một số có hình viên ñạn (hình nhộng nhưng với một ñầu phẳng hơn) Các rhabdovirus có kích thước khá lớn, dài 100 – 430 nm và ñường kính 40-100nm

Về cấu trúc chi tiết, các phân tử protein N liên kết chắt với phân tử RNA genome theo kiểu ñối xứng xoắn ñể tạo thành phân tử ribonucleoprotein (RNP) Phân tử RNP lại liên kết với protein L và P ñể tạo thành phức hợp nucleocapsid Phức hợp này ngập trong một lớp protein nền ñược cấu tạo bởi protein M Toàn bộ cấu trúc trên lại ñược bao bọc bởi một lớp màng kép lypid chứa các gai vỏ nhô lên

bề mặt và ñược cấu tạo bởi các protein G (glycoprotein) Mỗi một gai vỏ là một trimer gồm 3 phân tử protein G lắp ráp thành (Hình 2.2)

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử của các rhabdovirus (Viralzone, 2009)

ðặc ñiểm hình thái của RYSV ñã ñược Shikata và Chen công bố lần ñầu tiên vào năm 1969 Các quan sát dưới kính hiển vi ñiện tử dung lát cắt siêu mỏng mô lá lúa cho thấy RYSV có hình ñầu ñạn ñặc, có vỏ bọc, kích thước 94 nm x 180 - 210

nm Trong tế bào, các phân tử RYSV hình thành nhiều tại phần ngoại vi của nhân tế bào (Shikata & Chen, 1969; Fang et al., 1994; Ou, 1985) (Hình 2.3)

Hình 2.3 Phân tử virus RYSV (hình trái, Shikata và Chen, 1969) và vị trí hình thành của các phân tử virus RYSV trong phần ngoại vi của nhân tế bào lúa

(hình phải, Ou, 1985)

Bộ gen ñầy ñủ của RYSV ñược công bố ñầu tiên vào năm 2003 từ nguồn virus phân lập tại Trung Quốc (Huang et al., 2003) Tiếp theo, năm 2010, trình tự toàn bộ

bộ gen của một mẫu RTYV từ Nhật Bản cũng ñược công bố (Hiraguri et al., 2010)

So sánh trình tự của mẫu RTSV này với mẫu RYSV thấy chúng ñồng nhất tới 98,5

% trên toàn bộ gen và trình tự amino acid của 7 protein của virus RYSV và RTYV giống nhau trong phạm vi từ 82,3 ñến 99,7% (Hiraguri et al., 2010) Dựa trên kết quả so sánh này, Hiraguri et al (2009) ñã kết luận RTYV và RYSV là thành viên của cùng một loài và các tác giả ñã gửi mẫu RTSV lên Ngân hàng gen với tên RYSV Theo luật ưu tiên, Ủy ban phân loại và danh pháp virus quốc tế (ICTV) ñã phê chuẩn tên virus ñại diện cho loài này là RYSV

RYSV có tổ chức bộ gen giống như của các rhabdovirus khác Tổ chức bộ gen ñầy ñủ của mẫu RYSV (mã truy cập AB011257, Huang et al., 2003) cho thấy virus có có bộ gen RNA mạch thẳng, sợi ñơn, cực âm, kích thước khoảng 14 kb Virus có một chuỗi nucleotide khoảng 203 nucleotide gọi là leader ở ñầu 3’, một chuỗi 181 nucleotide gọi là trailer ở ñầu 5’ Virus mã hóa 7 protein, theo thứ tự từ trái sang phải là N-P-3-M- G-6-L Tuy nhiên chỉ có 5 protein cấu trúc có mặt ở phân

tử virus là N, P, M, G, L (Fang et al., 1994; Luo và Fang, 1998; Huang et al., 2003)

Hình 2.4 Sơ ñồ tổ chức bộ gen của RYSV ñược xây dựng dựa trên mẫu

AB011257 bằng phần mềm NTI (hãng Invitrogen) 2.4 Lan truyền của RYSV

Virus RYSV thuộc nhóm gây hại ở bó mạch phloem như các loại virus khác của chi nucleorhabdovirus (Nault và Ammar, 1989) Các nghiên cứu lan truyền cho thấy RYSV (hay RTYV) ñược truyền theo kiểu bền vững tái sinh (virus nhân lên trong vector) nhưng không truyền qua trứng (Chiu et al., 1965; 1968; Shieh et al., 1970; Chen và Shikata, 1971)

Ba loài rầy xanh ñã ñược ghi nhận truyền RYSV (hay RTYV) là N

nigropictus, N cincticeps và N virescens (Hình 2.5), trong ñó hiệu quả truyền

bệnh cao nhất là của N Nigropictus, tiếp theo là N cincticeps và thấp nhất là

N virescens ; nhìn chung ñối với rầy N nigropictus, hiệu quả truyền của rầy

ñực cao hơn rầy cái, còn ñối với 2 loại rầy còn lại thì không có sự khác biệt ñáng kể (Inoue, 1978)

Hình 2.5 Hìn thái 3 loài rầy xanh truyền RYSV Từ trái sang phải lần lượt là

là N nigropictus, N cincticeps và N virescens

Chiu et al (1965), Chiu & Jane (1967) khi nghiên cứu 3 loài rầy này ñã cho biết khoảng 41- 62% cá thể rầy có khả năng truyền virus Thời gian chích nạp của

RYSV -AB011257, kích thước 14042 nucleotides

Leader

đa số (>50%) rầy là 1-2 giờ, nếu tăng thời gian chích nạp lên 1 ngày thì 90% rầy cĩ khả năng lan truyền ; thời kỳ ẩn trong vector từ 3-34 ngày nhưng thường 9-16 ngày ; Thời gian chích nạp thay đổi từ 5-10 phút, 5-10 giờ, 24 giờ sẽ làm tăng hiệu quả truyền tương ứng từ 28%, 45%, 88% ; thời kỳ ủ bệnh trong cây từ 2-4 tuần

Hseih (1969) khi nghiên cứu rầy N Nigropictus đã cho biết khi nhiệt độ

<160C hoặc >380C, rầy khơng cĩ khả năng lan truyền ; trong khoảng nhiệt độ

20-360C, nhiệt độ càng cao thì thời gian ẩn càng rút ngắn

Theo Chen (1979), Chen & Chiu (1980) khi cho rầy chích nạp trên lá biến vàng hay trên giống mẫn cảm thì hiệu quả truyền tương ứng là 28,8% và 34,4%, cịn khi cho rầy chích nạp trên lá đã phục hồi hoặc trên giống kháng thì hiệu quả truyền tương ứng chỉ là 3,3% và 9% ; rầy đực và rầy cám cĩ khả năng truyền virus hiệu quả hơn rầy cái ; mỗi rầy mang virus cĩ thể truyền bệnh cho «3 cây lúa/ngày Khi nhiễm virus rầy cĩ khả nãng truyền bệnh cả đời Virus cĩ thể làm rầy cám chết sớm trước khi trưởng thành và rầy bị giảm số trứng đẻ hay rút ngắn vịng đời

2.5 Phương pháp chẩn đốn virus bằng ELISA

2.5.1 Nguyên lý của phương pháp huyết thanh học và ứng dụng

Theo Gibbs & Harrison (1980), phương pháp dựa trên hiện tượng kháng nguyên gặp kháng thể đặc hiệu với nĩ thì xảy ra phản ứng kết tủa vẩn hoặc phản ứng ngưng kết Khi virus (kháng nguyên) được tiêm vào cơ thể máu nĩng (thỏ, chuột ) thì hệ miễn dịch hình thành kháng thể (Ig) đặc hiệu virus Kháng thể thường hình thành trong máu trong vịng một tuần và chủ yếu là IgM Hiệu quả kháng huyết thanh tăng dần trong vài ngày, sau đĩ giảm cho đên khi chỉ con rất ít kháng thể Nếu thỏ được tiêm tiếp với cùng một kháng nguyên đĩ thì kháng thể sẽ được hình thành nhanh, nhiều hơn, trong đĩ chủ yếu là IgG IgG tồn tại trong máu thỏ lâu hơn IgM

Cả hai kháng thể này đều cĩ đáp ứng miễn dịch, nhưng trong chẩn đốn virus thực vật thường sử dụng IgG Hầu hết các virus thực vật đều cĩ hoạt tính gây miễn dịch tốt hơn cho protein thực vật (Gibbs & Harrison)

Thực tế hiện nay, chẩn đốn bằng kĩ thuật huyết thanh học được ứng dụng đối với nhiều loại virus và một số bệnh vi khuẩn Phương pháp này khá đơn giản và chính xác với các kỹ thuật như khuyếch tán miễn dịch, điện di miễn dịch, latex và ELISA (phương pháp miễn dich và liên kết men)

2.5.2 Chế tạo kháng huyết thanh ña dòngñối với virus thực vật

Theo Gibbs & Harrison (1980), một mẫu virus ở bất kỳ ñộ sạch nào cũng ñều

có thể sử dụng ñể tạo kháng huyết thanh Nhưng vì cơ thể ñộng vật sẽ tạo kháng thể của các loại kháng nguyên có trong mẫu virus nên mẫu virus càng sạch thì càng tốt

ñể tạo ra kháng huyết thanh Tất cả các loài ñộng vật có xương sống ñều có thể tạo kháng thể nhưng ña số kháng huyết thanh virus thực vật ñều tạo ra trên thỏ vì dễ thao tác

2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến nồng ñộ kháng thể

Tuyến tiêm

Virus có thể ñược tiêm vào máu thỏ qua tĩnh mạch ở mép tai (ven), vào cơ bắp, thường là vào bắp ñùi chân sau thỏ, vào mô liên kết ở dưới da hoặc hiếm hơn ở bàn chân (tiêm dưới da) hoặc thậm chí ñược tiêm vào hạch bạch huyết Kháng thể thường ñạt nồng ñộ tối ña khoảng 2 tuần sau khi tiêm ven, 4 ñến 8 tuần sau khi tiêm bắp hoặc dưới da (Gibbs & Harrison, 1980)

Số lần tiêm và số lượng virus ñem tiêm

Cùng một lượng virus nếu ñược tiêm làm nhiều lần sẽ ñược nhiều kháng thể hơn tiêm chỉ một lần Matthew (1957) phát hiện thấy 4 lần tiêm mỗi lần 10µg virus TYMV (Turnip yellow mosaic virus), cách nhau 21 ngày ñã tạo ra hiệu giá của kháng huyết thanh không tỷ lệ trực tiếp với số lượng virus tiêm vào

Theo Webster (1968), ở các thời ñiểm khác nhau sau khi tiêm, kháng thể tạo

ra sẽ khác nhau không chỉ về loại mà còn tính ñặc hiệu Ông cho biết: Sau khi tiêm, kháng thể hình thành ñầu tiên là IgM có tính ñặc hiệu rất thấp IgM nhanh chóng biến mất và thay vào ñó là IgG Những kháng thể IgG ñầu tiên hình thành có tính ñặc hiệu rất cao, nếu tiếp tục tiêm, IgG sẽ tăng lên nhanh chóng nhưng tính ñặc hiệu lại giảm ñi Do vậy, kháng huyết thanh lấy sớm sẽ có hiệu giá thấp nhưng rất ñặc hiệu và ngược lại

Các chất tiêm cùng kháng nguyên

Nếu tiêm ven, dich virus thường hòa trong dịch nước muối sinh lý 0.85% NaCl và chúa lượng tối thiểu các chất gây ñộc cho thỏ như các muối phosphate, borate và các ion khác

Nếu tiêm bắp, tiêm dưới da, dịch virus được trộ với các chất cĩ tác dụng tăng cường hoạt tính miễn dịch Chất phổ biến là Freurds adjuvant

Thời gian giữa các lần tiêm

Cách hiệu quả nhất để tạo kháng huyết thanh cao khi tiêm thỏ la tiêm với số lượng virus trung bình (tối đa 1µg virus/ml) ở các khoảng thời gian cách nhau xa và

cĩ sử dụng adjuvant Govier (1958), thấy tiêm PVX 2 lần bằng cách tiêm ven, mỗi lần cách nhau 1 tháng sẽ cĩ hiệu giá kháng thể cao hơn 8 lần so với tiêm bắp 1 lần hoặc tiêm ven nhiều lần, mỗi lần cách nhau 2 tuần

2.5.4 Các kỹ thuật ELISA

Theo Hull (2000), dựa vào quan hệ của kháng thể liên kết enzyme với kháng nguyên, ELISA cĩ thể được chia làm 2 nhĩm (Hình 2.6) là:

• Nhĩm trực tiếp (direct ELISA): Kháng thể liên kết enzyme là kháng thể

phát hiện kháng nguyên (ví dụ các kỹ thuật I, VIII và IX trong hình 2.6)

• Nhĩm gián tiếp (indirect ELISA): Kháng thể liên kết enzyme khơng phải

là kháng thể phát hiện kháng nguyên (ví dụ các kỹ thuật II, III, IV, V, VI, VI trong hình 2.6)

ELISA cũng gồm rất nhiều kỹ thuật khác nhau Hai kiểu phổ biến nhất thường áp dụng cho chẩn đốn virus thực vật là:

• Kẹp kép kháng thể (double antibody sandwich = DAS) ðây là kỹ thuật

được phát triển đầu tiên bởi Clark & Adams (1977) Trong kỹ thuật này, kháng thể IgG đặc hiệu virus được cố định vào bản ELISA cĩ vai trị để bẫy virus Tiếp theo, kháng thể đặc hiệu virus liên kết với enzyme alkaline phosphatase (AP) sẽ liên kết với virus bị bẫy và enzyme sẽ thủy phân một cơ chất là nitrophenyl phosphate (NPP) vốn khơng màu thành nitrophenol phosphate cĩ màu vàng Trong hình 2.6, ngoại trừ kỹ thuật II thì tất cả các kỹ thuật cịn lại đều là DAS-ELISA

• Bẫy kháng nguyên trước (plate-trapped antigen = PTA) ðây là một dạng

đơn giản của ELISA (Mowat & Dawson, 1987) Trong kỹ thuật này, dịch cây chứa virus sẽ được cố định trước vào giếng ELISA Tiếp theo, kháng thể đặc hiệu virus tinh chiết hoặc phổ biến là kháng huyết thanh thơ được cố định vào bản ðể phát hiện liên kết này, một kháng thể thứ hai liên kết với AP đặc hiệu với kháng thể của virus sẽ được cho vào giếng Trong hình 2.6 Kỹ thuật II là PTA-ELISA

Hình 2.6 Các kỹ thuật ELISA khác nhau (Hull, 2000)

2.6 Chẩn đốn virus RYSV bằng ELISA

Các nghiên cứu về ứng dụng ELISA trong chẩn đốn rất ít Takahashi et al (1988) đã thí nghiệm đánh giá 2 kỹ thuật ELISA dùng kháng thể đặc hiệu RYSV là

kỹ thuật ELISA và kỹ thuật ELISA đơn giản hĩa Trong kỹ thuật ELISA, tác giả đã thử nghiệm 1 loạt các đệm chiết mẫu khác nhau bao gồm đệm phosphate, đệm phosphate chứa NaCl và Tween20 (đệm PBS-T), đệm citrate và đệm Tris-Cl Các tác giả kết luận rằng đệm PBS-T là đệm tốt nhất để chiết mẫu Trong kỹ thuật ELISA đơn giản hĩa, các tác giả đã ủ đồng thời dịch virus và kháng thể liên kết AP Các tác giả đã chứng minh rằng bước kết hợp này khơng ảnh hưởng đến độ nhạy và tính đặc hiệu

DAS-3 ðỊA ðIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Nội dung nghiên cứu

1 ðiều tra bệnh vàng lụi, kiểm tra virus bằng RT- PCR và ELISA

2 Thử nghiệm tạo kháng huyết thanh đặc hiệu phân tử virus RYSV và đánh giá các điều kiện để tối ưu hĩa phản ứng ELISA

3 Dịng hĩa và giải trình tự một phần gen virus RYSV

3.2 ðịa điểm nghiên cứu chính

Trung tâm bệnh cây nhiệt đới, Trường đại học Nơng nghiệp Hà Nội

3.3 Vật liệu liệu nghiên cứu chính

3.3.1 Vật liệu thu thập mẫu cây và rầy

3.3.2 Vật liệu thử nghiệm tạo kháng huyết thanh và chẩn đốn ELISA

• ðộng vật dùng để sản xuất kháng huyết thanh là thỏ đã trưởng thành, cĩ sức khỏe tốt, trọng lượng ≥ 2kg, được nuơi tại Trung tâm Bệnh cây Nhiệt đới

• Bản ELISA

3.3.3 Hĩa chất, dung dịch đệm, mơi trường

• ðệm điện di agarose (1X TAE): 10 mM Tris-acetate, 0.5 mM EDTA (pH 7.8)

• ðệm CTAB: 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinylpyrrolidone), 100 mM Tris-HCl pH 8.0 và 25 mM EDTA

• ðệm TE, pH8: 10 mM Tris-Cl and 1 mM EDTA

• ðệm chiết phân tử virus: 0.1 M citrate natri, pH 6.5 chứa 10 % đường

sucrose, 0.2 % Na2SO3 và 4 % bột than hoạt tính

• ðệm hòa virus: ñệm phosphate 0.01 M, pH 7.2 chứa 0.85 % NaCl

• Dung dịch ñường sucrose 12 %

• Dung dịch ñường sucrose 50 %

• ðệm carbonate (pH 9.6) (1L):1.59 g Na2CO3, 2.93 g NaHCO3, 0.02 g NaN3 Hòa các chất trong 900 ml H2O, chỉnh pH = 9.6 với HCl và lên thể tịch 1 L

• ðệm PBS (pH 7.4): 8.0 g NaCl, 0.2 g KH2PO4, 1.15 g Na2HPO4.12H2O, 0.2 g KCl, 0.02 g NaN3 Hòa các chất trong 900 ml H2O, chỉnh pH = 4.4 và lên thể tịch 1 L

• Môi trường LB agar chứa kháng sinh ampicillin: Thành phần giống môi trường

LB lỏng nhưng chứa 15 g agar/L và có bổ sung ampiciline (100 mg/L) Kháng sinh cho vào môi trường ñang ấm khoảng 55 oC trước khi rót ra ñĩa petri

• Chất nền NPP: nitrovinyl phosphate, dạng viên nen 5 mg/viên (Sigma)

3.3.5 Các enzyme và kit thương mại

• RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (hãng Fermentas): kít tổng hợp sợi cDNA

• ReverseDreamTaq (Fermentas): DNA polymerase chịu nhiệt

• Expand Long Template PCR System (Roche): hỗn hợp enzyme chịu nhiệt tổng hợp sợi DNA dài

• AccuPrep Plasmid Extraction Kit (Bioneer): kít tinh chiết plasmid

• AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer): kit thôi gel

• Tripure (Roche): kít tinh chiết RNA tổng số

• InsTAclone PCR Cloning Kit (Fermentas) dùng vector pTZ57R/T

• BamHI và ECoRI (Fermentas): enzyme cắt giới hạn

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1.Phương pháp ñiều tra bệnh ñồng ruộng

ðiều tra bệnh vàng lụi tại một số tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam (ñặc biệt vụ mùa) Chỉ tiêu ñánh giá: Cường ñộ bệnh:

• Tần suất bắt gặp (số ñiểm có bệnh/ số ñiểm quan sát)

• Tỷ lệ bệnh (Số cây có triệu chứng /số cây quan sát)

• Triệu chứng biểu hiện

3.4.2 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu

Mẫu cây:

1 Lúa

2 Cỏ hòa thảo (xung quanh bờ ruộng lúa hoặc ngô bị bệnh nặng)

ðối với mỗi loại triệu chứng: thu thập 3- 5 mẫu Các mẫu phải ñược số liệu hóa

• Hình ảnh

• ðịa ñiểm

• Thời gian thu thập

• Giai ñoạn sinh trưởng

• Giống (ñối với lúa và ngô), loài ñối với cỏ

• Mô tả chi tiết triệu chứng

• Các nghi vấn (thuốc trừ cỏ, tuyến trùng…) nếu có

Xử lý: Mẫu phải ñược xử lý khô bằng silicagel ngay lập tức sau khi thu thập

3.4.3 Phương pháp bảo quản mẫu

Có hai phương pháp bảo quản mẫu: bảo quản khô và bảo quản tươi

• Bảo quản khô: Mẫu thu về ñược ñể trong túi chứa hạt Silicagel Thay hạt Silicagel ñến khi mẫu khô

• Bảo quản tươi: Mẫu thu về ngày hôm trước ñể nguyên trong túi giữ lạnh ở tủ -20 OC hay bảo quản trong túi nilon và giữ ẩm ở Trung tâm Bệnh cây nhiệt ñới

3.4.4 Phương pháp chiết RNA tổng số từ mô lá

Quy trình chiết tách RNA tổng số hoặc bằng kít Tripure theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc bằng phương pháp CTAB/LiCl của Chang et al (1993)

Qui trình chiết theo phương pháp CTAB/LiCl như sau:

• Trước khi chiết: ủ ñệm CTAB + βME (10 µl/ ml ñệm) ở 60 oC trong 30 phút bằng bể nhiệt

• Lấy 0,2 g mô lá bệnh, nghiền trong 1ml ñệm CTAB bằng chày cối sứ Cho dịch nghiền vào tube 1,5ml, ủ 60 oC 30 phút (ñể ở nhiệt ñộ phòng 10 phút cũng cho kết quả tốt ñối với một số loại mô dễ như cà chua)

• Li tâm 13000g 5 phút ñể loại bỏ tàn dư, thu dịch trên tủa

• Cho Chloroform/Isoamyl (24:1) vào tube với thể tích tương ñương, trộn ñều

• Li tâm 13000g 5 phút Hút dịch trên tủa chuyển sang tube mới

• Chiết lại lần 2 bằng Chloroform/Isoamyl

• Bổ sung vào tube dịch trên tủa vừa thu ñược một lượng LiCl 10M (= 1 /4 thể tích dịch trên tủa) ðể lạnh 15 phút

• Li tâm 13000g 10-15 phút, thu cặn RNA

• Rửa cặn 2 lần bằng Ethanol 70%

• ðể khô tự nhiên trong không khí tối thiểu là 30 phút

• Hoà tan cặn RNA trong 50 µl nước cất vô trùng (hoặc nước DEPC) và bảo quản -80 oC

3.4.5 Phản ứng RT – PCR

Hai cặp mồi ñặc hiệu gen N và L của RYSV (Rice yellow stunt virus) ñã ñược thiết kế từ bộ gen ñầy ñủ của RYSV sẵn có trên Ngân hàng gen (mã số truy cập AB011257) Cặp mồi thứ nhất ñặc hiệu gen N (RY-N-F1 và RY-N-R1) tạo sản phẩm có kích thước 444 bp còn cặp mồi thứ 2 ñặc hiệu gen L (RY-L-F2/RY-L-R2) tạo sản phẩm 422 bp Trình tự các mồi này là:

RY-N-F1 GCCAGTGCAGATGCCTTATTAGTC

RY-N-R1 GGTCTCTGCCTCTGTCATTCGTTC

RY-L-F2 AGGTACCAAGACGGCTCAACTATG

RY-L-R2 AAGGTGGGGAAGGTCGGAATC

Phản ứng RT-PCR ñược thực hiện theo 2 cách

• RT-PCR 1 bước: Kết hợp cả bước tổng hợp cDNA và PCR, dùng kít

• RT-PCR 2 bước: ñầu tiên, RNA của virus ñược chuyển thành cDNA Tiếp theo, cDNA ñược dùng làm khuôn ñể chạy PCR

RT-PCR 1 bước: Phản ứng RT-PCR ñược thực hiện với 2 enzyme Reverse Aid

và Dreamtaq của hãng Fermentas Phản ứng ñược thực hiện trong tube Effpendorf 0.5 ml chứa các thành phần sau:

Phản ứng RT – PCR 1 bước ñược thực hiện theo các ñiều kiện sau:

- Tổng hợp sợi cDNA trong 30 giây ở 45 OC

- Khởi ñầu biến tính 4 phút ở 94 OC

- Tiến hành 35 chu kỳ phản ứng ở 94 OC trong 35 giây; 54 OC trong 35 giây;

Bước 2 (phản ứng PCR) ñược thực hiện với khuôn cDNA ở bước 1 với kit Expand Long Template PCR System (hãng Roche) dùng 3 tổ hợp mồi: (i) RY-N-F1/RY-L-R2, (ii) RY-N-F1/RY-N-R1, và (iii) RY-L-F2/RY-L-R2 Phản ứng PCR ñược thực hiện với enzyme Dreamtaq hoặc hoặc dùng kit Expand Long Template PCR System Phản ứng ñược thực hiện trong tube Effpendorf 0.5 ml chứa các thành phần sau:

Phản ứng PCR ở bước 2 ñược thực hiện theo các ñiều kiện sau:

- Khởi ñầu biến tính 4 phút ở 94 OC

- Tiến hành 35 chu kỳ phản ứng ở 94 OC trong 35 giây; 54 OC trong 35 giây;

72 OC trong 1 (hoặc 10) phút tùy tổ hợp mồi

- Cuối cùng là bước kết thúc ở 72 OC trong 5 phút

3.4.6 ðiện di agarose

- Chuẩn bị gel 1%: Cân 1g agarose hòa tan trong 100 ml ñệm TAE, ñem ñun trong lò vi sóng ñể agarose tan hoàn toàn, sau ñó bổ sung thêm 1µl dung dịch Ethidium bromide

- Chuẩn bị khay ñựng gel và chọn lược với lượng giếng thích hợp số mẫu cần chạy ñiện di Tiếp theo ñổ gel khi nhiệt ñộ khoảng 50 OC Khi gel ñông ñem ñặt vào bể ñiện di, ñổ ngập bản gel bằng ñệm TAE

- Cài mẫu: Lấy 10 µl sản phẩm PCR + 2µl Loading Dye cho vào các giếng của bản gel

- ðiện di với hiệu ñiện thế 100V trong khoảng 30 phút

- Kiểm tra kết quả PCR dưới ánh sáng cực tím

3.4.7 Dòng hóa và giải trình tự

• Sản phẩm RT-PCR ñược tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Hàm lượng DNA ñược ước lượng nồng ñộ bằng ñiện di agarose

• Sản phẩm PCR tinh chiết ñược nối vào vector pTZ57R/T của kít dòng hóa InsTAclone PCR Cloning Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất và ñược biến nạp

vào tế bào vi khuẩn Escherichia coli dòng XL1-Blue bằng phương pháp sốc nhiệt

• Plasmid ñược tinh chiết dùng kít tinh chiết plasmid AccuPrep Plasmid Extraction Kit (Bioneer) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

• Các dòng vi khuẩn tái tổng hợp ñược kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp ñúng bằng 2 cách:

• Kiểm tra PCR (dùng mồi Vector SeqFor và Vector SeqRev ñược thiết kế sẵn tương ứng với trình tự của vector)

• Cắt kép bằng 2 enzyme cắt giới hạn là BamHI và EcoR1 Tổng phản ứng cắt là 10 µl chứa 2 µl plasmid và 0.5 µl mỗi loại enzyme cắt giới hạn Hỗn hợp ñược ủ 37 oC trong 1 giờ và ñược phân tích bằng ñiện di agarose 1%

• Plasmid tái tổ hợp ñược giải trình tự dùng kít BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) trên máy PCR Sản phẩm giải trình tự ñược tinh chiết, làm khô và gửi ñọc tại Viện Công nghệ sinh học tại Hà Nội

• Trình tự nucleotide ñược biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene)

3.4.8 Phân tích trình tự

Danh tính trình tự các mẫu ñược xác ñịnh khi so sánh với các chuỗi GenBank bằng phần mềm tìm kiếm BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) Các phân tích trình tự và phả hệ ñược thực hiện với phần mềm NTI, BioEdit và MEGA

3.4.9 Tinh chiết phân tử virus RYSV

Qui trình chiết phân tử RYSV từ lúa ñược thực hiện theo qui trình chiết virus Cynodon chlorotic streak virus (CCSV) trên cỏ Bermuda (Lockhart et al.,1985) Các bước cụ thể như sau:

• Nghiền mẫu bệnh: Khoảng 100 g mô lá lúa nhiễm RYSV (ñã ñược kiểm tra RT-PCR) ñược nghiền với 400 mL ñệm citrate (sodium citrate) 0.1 M, pH 6.5 chứa 10 % ñường sucrose, 0.2 % Na2SO3 và 4 % bột than hoạt tính Mô lá ñược nghiền trong ñệm lạnh bằng máy nghiền sinh tố Lọc dịch nghiền bằng vải lọc

• Acid hóa dịch nghiền: Sau khi lọc dịch nghiền qua vải lọc, dịch ñược acid hóa tới pH 0.5 bằng nhỏ từ giọt acid acetic ñậm ñặc (acid acetic băng) Dịch ñược giữ ở 4 OC trong 2 – 4 giờ

• Làm trong: Dịch ñược làm trong bằng ly tâm ở 17400 g trong 20 phút bằng máy ly tâm Beckman Algera 64G Lấy dịch trong và loại bỏ cặn

• Sa lắng virus: Sa lắng virus trong dịch trong ở trên bằng siêu ly tâm ở

91500 g trong 30 phút (máy siêu ly tâm Beckman Optima L-90K) Hòa cặn virus trong ñệm phosphate 0.01 M, pH 7.2 chứa 10 % ñường sucrose và 0.85 % NaCl

• Tách virus bằng ly tâm gradient tỷ trọng Dịch virus ở trên ñược tách bằng

ly tâm trên nệm gradient tỷ trọng ñường sucrore (12-50%) Nệm tỷ trọng ñược chuẩn bị với ñệm phosphate 0.01 M, pH 7.2 chứa 0.85 % NaCl Nệm tỷ trọng ñược

ly tâm ở 107000 g trong 45 phút

• Thu thập vùng chứa virus bằng xi ranh y tế

• Kết tủa lại virus bằng ly tâm vùng chứa virus ở 139000 g trong 30 phút

Hòa cặn virus tinh chiết trong 1 mL ñệm phosphate 0.01 M, pH 7.2 chứa 0.85 % NaCl ðây là dịch virus ñã tinh chiết Kiểm tra dịch virus tinh chiết bằng RT-PCR

và bảo quản ở - 20 O C

3.4.10 Tạo kháng huyết thanh virus trên thỏ

• Tiêm hỗn hợp gồm 0.5 mL dịch virus + 0.5 ml chất tăng cường miễn dịch (complet adjuvant) vào bắp ñùi sau của thỏ Tiêm 4 lần, mỗi lần cách nhau 1 tuần

• Huyết thanh thỏ ñược thu thập sau lần tiêm thứ 2 từ ñộng mạch tai của thỏ (khoảng 0.5 mL) Máu thỏ ñược ly tâm 13000g 5 phút và lấy dịch kháng huyết thanh trên tủ Sự có mặt của kháng thể ñược ñánh giá bằng phương pháp PTA-ELISA

• Khi kháng thể virus hình thành ñủ nhiều thì giết thỏ và thu thập toàn bộ kháng huyết thanh Khi thử, thấy hiệu giá kháng huyết thanh cao, tiến hành giết thỏ

ñể thu toàn bộ máu

• Máu thu từ thỏ, ñược làm ñông trong vòng 24 giờ ở nhiệt ñộ 4oC Sau ñó dùng lấy phần huyết tương ở trên ñể riêng Phần máu thỏ ñông ñược ly tâm 10000g/

15 phút ñể lấy dịch kháng huyết thanh sau li tâm Phần này cũng ñược ñể riêng

• Huyết tương và kháng huyết thanh sau ly tâm ñược bổ sung NaN3 0,2%

và bảo quản ở tủ lạnh sâu (-20oC)

3.4.11 Phương pháp ELISA

Phương pháp ELISA ñược sử dụng dùng ñể ñánh giá chất lượng kháng huyết thanh là phương pháp bẫy kháng nguyên trước (PTA-ELISA = Plate Trapped Antigen – ELISA

) (Mowat & Dawson, 1987 Các bước của một kỹ thuật PTA-ELISA chuẩn như sau:

Bước 1: Cố ñịnh dịch cây cần kiểm tra

- Nghiền 0,1 g mẫu lá cây cần kiểm tra trong ñêm carbonate với tỉ lệ lá/dung dịch ñệm từ 1/5 – 1/30 (khối lượng/thể tích)

- Ly tâm 13000 vòng/phút, thu lấy dịch trên tủa

- Nhỏ dịch mẫu vào bản ELISA: 100 µl /giếng ðể bản ELISA vào hộp ẩm và ủ qua ñêm trong tủ lạnh

- Rửa bản ELISA: Tiến hành 3 lần bằng ñệm PBS-T rồi rửa lại 3 lần bằng nước

cất Mỗi lần rửa cách nhau 1 phút

Bước 2: Cố ựịnh kháng thể thỏ ựặc hiệu virus

- Nghiền mẫu lá cây khoẻ trong dung dịch ựệm kháng huyết thanh (PBS-T +2% Ovalbumin) Li tâm 10000g trong 15 phút và thu dịch trên tủa

- Cho kháng huyết thanh vào dịch cây khoẻ theo tỷ lệ 1/100 Ờ 1/1000, trộn ựều

và ủ ở 37oC trong 45 phút ựể hấp thụ chéo các kháng thể không ựặc hiệu có trong kháng huyết thanh (kháng thể không ựặc hiệu là kháng thể phản ứng với protein của cây)

- Nhỏ vào mỗi giếng 100 ộl dịch cây khoẻ chứa kháng huyết thanh ở trên Sau

ựó ựể bản ELISA trong hộp ẩm và ựể trong ựiều kiện nhiệt ựộ 37oC trong thời gian

2 Ờ 4 giờ

- Rửa bản ELISA (như ở bước 1)

Bước 3: Cố ựịnh kháng thể chuột liên kết AP (Alkaline phosphatase) ựặc hiệu kháng thể thỏ

- Pha kháng thể chuột liên kết AP ựặc hiệu kháng thể thỏ trong ựệm kháng huyết thanh theo tỉ lệ 1/5000

- Nhỏ vào mỗi giếng 100 ộl dịch kháng thể chuột ở trên

- để bản ELISA trong hộp ẩm và ủ ở 37oC trong 2-4 giờ

- Rửa bản ELISA (như ở bước 1)

Bước 4: Cố ựịnh chất nền (nitrophenyl photphat)

- Pha chất nền trong ựệm cơ chất với lượng 1 mg/mL

- Nhỏ 100 ộl dịch chất nền vào mỗi giếng

- để bản ELISA ở nhiệt ựộ phòng, trong tối, trong 30-60 phút

- đánh giá kết quả bằng mắt và ựo mật ựộ quang OD (optical density) bằng máy ựọc ELISA ở bước sóng 405 nm

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1 ðiều tra bệnh vàng lụi năm 2011

4.1.1 Triệu chứng bệnh vàng lụi tại các ñiểm ñiều tra

Bệnh virus hại lúa gây bệnh vàng lụi (còn gọi là bệnh vàng lá) xuất hiện ở Việt Nam từ những năm 60 của thế kỷ trước ở nước ta

Gần ñây bệnh ñã xuất hiện tại một số tỉnh miền Bắc như Bắc Giang, Hà Nội,

Hà Nam Hiện nay, nhiều cơ quan liên quan ñến Bảo vệ Thực vật, bao gồm ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện Bảo vệ thực vật, các Chi cục Bảo vệ Thực vật tại một số

tỉnh miền Bắc vẫn ñang ñiều tra, ñánh giá, phát hiện sự có mặt của bệnh

ðể ñóng góp vào việc kiểm soát bệnh, chúng tôi tiến hành ñiều tra nguồn bệnh trên lúa vụ xuân và vụ mùa năm 2011 tại một số tỉnh miền Bắc Việc phát hiện triệu chứng bệnh dựa theo triệu chứng ñặc trưng của bệnh Kết quả ñiều tra cho thấy: Tại một số tỉnh miền Bắc, triệu chứng “vàng lụi” trên lúa khá phổ biến Bệnh

có thể xuất hiện ở cả ở vụ lúa xuân và vụ lúa mùa, biểu hiện từ khi lúa ñẻ nhánh ñến khi thu hoạch, ñặc biệt xuất hiện nhiều ở giai ñoạn ñẻ nhánh, ñứng cái, trỗ bông Kết quả ñiều tra cho thấy: Các khu ñồng bị bệnh thường nằm ở khu vực ven chân núi, chân ñồi Những ruộng bị nặng thường ở trị trí trũng, ñất sình lầy của cánh ñồng ðất và nước ruộng lúa bị bệnh không có biểu hiện sặc chua

Khi bệnh mới phát sinh, ñầu mút lá bánh tẻ biến màu vàng nhạt, lan dần xuống phía dưới Ban ñầu chỉ phiến lá biến vàng, các gân chính, gân phụ vẫn còn xanh, khi bệnh nặng toàn bộ lá biến màu vàng – vàng cam, gân chính chuyển màu vàng sau cùng Hầu hết các lá vàng ñều từ ñầu mút lá xuống nhưng có một số lá chỉ vàng một nửa phiến lá còn nửa kia vẫn xanh

Lá bị bệnh thường là các lá bánh tẻ bị trước, lá già bị sau; khi bệnh nặng lá non cũng bị biến màu vàng

Ban ñầu chỉ một số lá, dảnh/khóm bị biến vàng, bệnh nặng thì cả khóm biến

màu vàng, nhiều dảnh chết

Những ruộng mới bị bệnh, các dảnh lúa bệnh thường rải rác khắp ruộng, khi bệnh phát triển rõ hơn thì ven bờ ruộng cĩ tỷ lệ vàng lá nhiều hơn, sau đĩ bệnh nặng thì lan khắp ruộng

Bộ rễ cây bệnh nặng kém phát triển, ít rễ con hơn cây khỏe

Trong nhiều trường hợp, cây lúa cĩ chiều cao bình thường, đẻ nhánh trung bình, gân chính màu xanh, phiến lá biến vàng, lá biến vàng thường bắt đầu từ đỉnh

lá và trên cây thì các lá phía dưới biến vàng trước sau đĩ mới lan lên các lá phía trên Cây lúa vẫn trỗ bơng song cho năng suất khơng cao

Triệu chứng cĩ thể rất nặng nếu nhiễm bệnh trong giai đoạn cịn non Cây thường bị rất lùn, các lá bệnh thường ngắn, chiều cao cây chỉ đạt 60-70% so với trung bình, phiến lá vàng, đơi khi cây bị nặng cĩ nhánh bị chết khơ, khả năng phục hồi và cho năng suất rất thấp Cây lúa bị bệnh cĩ thể khơng cĩ bơng hoặc rất ít bơng nhưng hạt bị lép

Cĩ thể tĩm tắt các triệu chứng bệnh dưới một số triệu chứng điển hình sau

(Hình 4.1):

• Vàng lá dạng khảm sọc Cả lá biến vàng, thường từ ngọn lá trước sau lan

xuống phần phía dưới, nhưng gân vẫn cịn xanh Cây cĩ thể lùn hoặc khơng bị lùn ðây là triệu chứng khá điển hình và cĩ giá trị chẩn đốn

• Vàng lá da cam Lá cĩ màu vàng sáng, khơng thê phân biệt được với các

Hình 4.1 Một số triệu chứng ñiển hình của cây lúa bị bệnh vàng lá do RYSV tại miền Bắc vụ xuân 2011 Từ trái sang phải: biến vàng dạng khảm sọc, vàng

lá da cam và vàng lùn

4.1.2 ðiều tra tình hình bệnh vụ xuân năm 2011

ðể xác ñịnh ñược mức ñộ nhiễm bệnh vàng lụi ở vụ xuân năm 2011, chúng tôi tiến hành ñiều tra bệnh vàng lụi ở một số tỉnh phía Bắc: Bắc Giang, Nam ðịnh, Gia Lâm – Hà Nội, Hà Tây, Hòa Bình Kết quả ñiều tra ñược thể hiện dưới bảng:

Bảng 4.1 Bệnh vàng lá lúa vụ xuân năm 2011 tại một số tỉnh phía Bắc

ðịa ñiểm Giai ñoạn sinh trưởng Ngày ñiều tra Mức ñộ

phổ biến

TLB (%)