Luận văn đánh giá quần thể lai lại (backcross) phục vụ cho chọn giống lúa kháng rầy nâu tại đồng bằng sông cửu long

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

PHẠM THỊ THU HÀ

ðÁNH GIÁ QUẦN THỂ LAI LẠI (BACKCROSS) PHỤC VỤ CHO CHỌN GIỐNG LÚA KHÁNG RẦY NÂU

TẠI ðỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng

Mã số : 60.62.05

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN VĂN HOAN

HÀ NỘI – 2011

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả ñược nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa ñược sử dụng trong bảo vệ bất kì một học

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Văn Hoan – cán bộ giảng dạy bộ môn Di truyền – Chọn giống cây trồng, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn của mình Tôi xin cảm ơn tới GS.TS Nguyễn Thị Lang trưởng bộ môn Di truyền – chọn giống, và các cán bộ ñồng nghiệp ở Viện Lúa ðồng Bằng Sông Cửu Long ñã hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Di truyền – chọn giống cây trồng và Viện Sau ñại học – trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội;

ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành tốt ñề tài này

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia ñình, người thân, bạn bè ñã luôn ủng hộ, giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Tác giả luận văn

PHẠM THỊ THU HÀ

2.4 Lập bản ựồ di truyền trên lúa nhờ marker phân tử 26

2.6 Chọn giống nhờ marker phân tử (Theo Nguyễn thị Lang, 2006) 27

4.1 đánh giá sự ựa dạng của nguồn gen khang rầy nâu 50

4.2 đánh giá kiểu hình 53 4.2.1 Thanh lọc giai ựoạn mạ 13 tổ hợp BC1F1 53

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified fragment length polymorphis

ALP Amplicon length polymorphism

AP-PCR Arbitrary primer - PCR

BPH Brown planthopper

DBTD ðột biến tám dài

DBTDT ðột biến tám dài thuần

ðBSCL ðồng Bằng Sông Cửu Long

NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn

EDTA Disodium ethylen diamin tetraacetate

ETS Expressed tagged sites

FISH Fluorescent in situ hybridization

PCR Polymerase chain reaction

SDS Sodium dodecyl sulfat

SSCP Single strand conformation polymorphism

SSR Simple sequence repeat ( microsatellite)

STS Sequence - tagged sites

TRIS Trizma base

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.1 Danh sách 7 tổ hợp lai và 7 giống lúa bố mẹ ñược tiến hành thí

3.2 Thành phần dung dịch loading buffer 10X 38

3.4 Các thành phần pha dung dịch PCR cho 1 phản ứng 47

4.1 Sự phân bố tính kháng rầy nâu trên 21 giống sau khi thanh lọc 50 4.2 Cấp phản ứng và chỉ số hại của rầy nâu trên 21 giống lúa 51 4.3 Sự phân bố cấp gây hại trên 13 tổ hợp BC1F1 54 4.4 phản ứng của rầy nâu trên 8 giống bố mẹ 56 4.5 Phản ứng rầy nâu trên 13 tổ hợp BC1F1 57 4.6 Xem xét tỷ lệ phân ly của các tổ hợp lai BC1F1 bằng phép thử

3.7 Sơ ñồ phát triển quần thể con lai hồi giao 44

3.11 Φ 174 marker cắt bởi enzyme Hinf I ñược tách trên gel agarose 49

4.1 Phân nhóm di truyền 21 giống lúa theo kiểu hình 52 4.2 Tỷ lệ gây hại của rầy nâu trên 13 tổ hợp lai 53 4.3 Sự biểu hiện cấp gây hại của 13 tổ hợp 55 4.4 Tỷ lệ gây hại của rầy nâu trên 13 tổ hợp lai BC1F1 59 4.5 Kết quả kiểm tra chất lượng DNA trên gel agarose 0,9% 60 4.6 Sản phẩm khuếch ñại PCR với primer VL3,4 61

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực quan

trọng, nuôi sống hơn 1/3 nhân loại trên thế giới Riêng tại Việt Nam, cây lúa không chỉ là cây lương thực thực phẩm mà còn là cây trồng ñóng góp lớn nhất trong ngành nông nghiệp (Nguyễn Văn Hoan, 2007) Trong quá trình sinh trưởng phát triển cây lúa chịu nhiều tác ñộng của bệnh hại và côn trùng tấn công làm giảm năng suất và phẩm chất gạo Côn trùng và bệnh hại cây trồng

là vấn ñề nan giải hàng ñầu trong sản xuất lúa (Hà Minh Trung, 1985) mà rầy nâu là ñối tượng gây hại rất nguy hiểm

Trong ñiều kiện thâm canh với giống lúa mới cao sản ngắn ngày, chịu bón nhiều phân ñạm kết hợp với khí hậu gió mùa nóng ẩm quanh năm tạo ñiều kiện thuận lợi cho dịch hại phát triển, do ñó mà cây lúa chịu nhiều tác ñộng của bệnh hại và côn trùng tấn công làm giảm năng suất và phẩm

chất gạo Trong ñó, rầy nâu (Nilaparvata Lugens Stal.) là loại dịch hại

nguy hiểm tại nhiều vùng sản xuất lúa trên thế giới và các nước Châu Á trong ñó có Việt Nam Ngoài trực tiếp gây “cháy rầy”, rầy nâu còn là tác

nhân truyền bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá (Rice ragged stunt virus) là những

bệnh hại do virus gây hại nguy hiểm ðể hạn chế tối ña thiệt hại năng suất lúa do rầy nâu gây ra, ñồng thời góp phần thực hiện mục tiêu an toàn lương thực Quốc gia và khu vực trên cơ sở an toàn cho môi trường sinh thái, chương trình sử dụng giống kháng cần ñược ñặt ra và giải quyết Vì vậy, nhiều nhà chọn giống ñã cố gắng tìm nhiều vật liệu quí ñể lai tạo với mục ñích tạo ra giống mới có năng suất cao, phẩm chất gạo tốt, kháng sâu bệnh, chống chịu ñược với ảnh hưởng bất lợi của môi trường và giảm thiểu sử

dụng nông dược (Nguyễn Thị Lang et al., 2006)

Trong thực tế cho thấy, ở những quần thể cây trồng nhiễm bệnh vẫn còn nhiều cá thể sống sót và phát triển dần từ năm này ñến năm khác, hoàn toàn không bị tấn công hay bị tấn công nhẹ, mặc dù có sự phát tán nguồn bệnh rất ñồng ñều, như vậy vẫn còn một số gen kháng khác có thể bảo vệ cho các cá thể trong quần thể ñó ñược tồn tại (Bùi Chí Bửu, 2002)

Việc tổ chức nhân nhanh các giống lúa mới kháng rầy và có chất lượng gạo tốt là một yêu cầu bức thiết mà ngành nông nghiệp phải quan tâm Giải pháp cơ bản và cần thiết ñể ñối phó với dịch hại rầy nâu là xác ñịnh và phổ biến các giống lúa kháng rầy nâu trong sản xuất Về sản xuất lâu dài, công tác giống lúa cũng là quan trọng nhất và hiệu quả nhất và là công tác ñi ñầu trong việc phòng trị rầy nâu, nhất là dịch rầy nâu ñang bọc phát hiện nay Theo PGS.TS Nguyễn Thị Lang (2002) thì lai lúa là phương pháp thông dụng ñể chủ ñộng tạo ra giống mới theo mong muốn của người chọn giống

Chọn giống cây trồng theo phương pháp truyền thống dựa trên cơ sở chọn lọc kiểu hình trong quần thể con lai ñang phân ly của một tổ hợp lai nào ñó Phương pháp này thường gặp phải những khó khăn về tương tác giữa kiểu gen và môi trường (G x E) Hơn nữa, nhiều qui trình chọn lọc theo theo phương pháp cổ truyền tốn rất nhiều thời gian nhưng không tìm ra giống kháng (Nguyễn Thị Lang, 2006)

Chọn giống nhờ marker phân tử là một chiến lược ñược thế giới ủng hộ

từ năm 1995, ñang ñược phát triển trong chọn giống lúa chống chịu với các loài sâu bệnh hại chính, là phương pháp tác ñộng mạnh ñến hiệu quả chọn giống với các ñánh dấu có kết quả và kỹ thuật cao trên cơ sở PCR ñể ñánh giá kiểu gen của tính trạng mục tiêu (Bùi Chí Bửu, 2002)

Phần lớn những giống lúa kháng rầy cao lại không có dạng hình ñẹp và năng suất cao Mặt khác, ñể chọn giống kháng tốt, bền vững người ta tiến hành chiến lược quy tụ nhiều gen kháng từ nhiều nguồn khác nhau

Do ựó tắnh kháng của cây chủ là cách kiểm soát rầy nâu có hiệu quả nhất

vì thế công tác chọn tạo và ựánh giá giống lúa kháng gầy nâu là công việc liên tục và là mục tiêu quan trọng trong chương trình cải tiến giống lúa Ngoài ra tắnh kháng gầy nâu bị ảnh hưởng bởi di truyền (yếu tố bên trong) và sinh thái học(yếu tố bên ngoài) Do ựó, chúng sẽ bị chi phối bởi nguồn gen kháng, chiến lược lai tạo, quá trình chọn lọc tự nhiên của quần thể rầy nâu

Song song với việc chọn giống dựa trên kiểu hình thì việc ựánh giá kiểu gen cũng không thể thiếu Do ựó, chọn giống nhờ marker phân tử là một chiến lược quan trọng trong chọn giống lúa kháng sâu bệnh hại chắnh, là phương pháp tác ựộng mạnh ựến hiệu quả chọn giống với các ựánh dấu có kết quả kỹ thuật cao trên cơ sở PCR ựể ựánh giá kiểu gen của tắnh trạng mục tiêu Sau ựó

so sánh với kiểu hình tìm ra mức ựộ chắnh xác của phương pháp

Chắnh vì vậy, tìm nguồn gen kháng ựể tạo ra các giống có dạng hình ựẹp, năng suất cao ựóng vai trò hết sức quan trọng Chắnh vì vậy ựể giải quyết

các vấn ựề trên ựề tài: Ộđánh giá quần thể lai lại (backcross) phục vụ cho

chon giống lúa kháng rầy nâu tạiằng Sông Cửu LongỢ Nhằm ựánh giá ựược

mức ựộ gây hại của rầy nâu trên tổ hợp lai của cây lúa ựể chọn ra tổ hợp lai có mang gen kháng rầy nâu, làm cơ sở cho việc chọn lọc tìm ra các dòng mang gen kháng ựể phục vụ tốt hơn cho công tác chọn giống

1.2 Mục ựắch và yêu cầu của ựề tài

- Lai tạo tổ hợp lai lại (Backross)

- đánh giá kiểu hình và kiểu gen (Ứng dụng marker phân tử ựể ựánh giá rầy nâu trên tổ hợp lai.)

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1 Cây Lúa

2.1.1 Giới thiệu chung về cây lúa

Cây lúa trồng (Oryza sativa L.) là một loài cây thân thảo sinh sống

hàng năm Thời gian sinh trưởng của các giống dài ngắn khác nhau và nằm trong khoảng 60 – 250 ngày Cây lúa có chiều cao trung bình khoảng 50 –

100 cm Phát hoa theo kiểu ñẻ nhánh, bông rủ xuống hay thẳng ñứng, chiều dài nhánh bông khoảng dưới 20 – 50 cm Thụ phấn chủ yếu nhờ gió Qua kết quả thanh lọc rầy nâu trên các tổ hợp lai bước ñầu tìm ra sự phân ly của từng kiểu trong từng nhóm với phương thiết lập kiểu gen của các giống kháng rầy nâu ñược thực hiện với phản ứng lai và ñánh giá tìm vật liệu lai tốt nhất trong chương trình chọn giống như IK01500, Babawee, IKO1537, IR 68077, IR69726, IR68059 và OM 6602 là vật liệu khởi ñầu tốt trong thời ñiểm chống chịu với rầy nâu tại ðBSCL tại thời ñiểm năm 2007, 2008 , 2009 (Lang và ctv 2009) Với 114 tổ hợp lai ñơn, các tổ hợp lai chọn lựa như OM6468/OM4495F2-1,OM4102/VN95-20,OM6468/OM4495F2-3,

OM6468/OM6496 F2 mang gen kháng cao cấp 3 ðối với 42 tổ hợp lai dialele ñánh giá tỉ lệ kháng rất thấp chỉ có 2 tổ hợp NGD/ PTB33 và NGD/

- Giống PTB33 có nguồn gốc từ Ấn ðộ, mang 2 gen kháng Bph-2 và Bph-3

ñược chọn làm giống chuẩn kháng rầy nâu

- Giống TN1 (Taichung Native 1), ựược dùng làm giống chuẩn nhiễm, nguồn gốc đài Loan, từ cặp lai DEE GEO WOOGEN/TSAI-YIAN-CHAN, là giống nhiễm rầy nâu, rầy lưng trắng, không có gen kháng

2.1.2 Tình hình sâu bệnh hại lúa

Theo Nguyễn đức Khiêm (2006), trong hơn 10 năm qua, sản xuất lương thực nước ta nhất là sản xuất lúa, ựã ựi vào thế ổn ựịnh cung cấp cho nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu đến tháng 12/2003, theo thống kê diện tắch lúa cả năm là 7.443.600 ha, năng suất ựạt loại khá 46,6 tạ/ha, tổng sản lượng lương thực ựạt 37,5 triệu tấn, tăng hơn 1,5% so với năm 2002 và xuất khẩu ựược 3,8 triệu tấn lúa Ngoài những thành tựu về sử dụng giống mới, thâm canh cao, những thành tựu về bảo vệ cây lúa cũng ựóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao sản lượng lúa Tuy nhiên, vấn ựề sâu bệnh hại lúa nói chung, sâu hại và côn trùng hại lúa nói riêng ngày càng trở nên phức tạp, mức ựộ gây hại ngày một lớn hơn Căn cứ tắnh chất tác hại và mức ựộ phổ biến của các loài sâu hại lúa có thể chia thành hai nhóm:

Nhóm I: Là những sâu hại chủ yếu trên cây lúa và gây tác hại quan trọng ở nhiều nơi hoặc trong từng vùng Chúng bao gồm rầy nâu, sâu cuốn lá nhỏ, sâu ựục thân hai chấm, bọ xắt dài, sâu năn và sâu phao

Nhóm II: Là sâu hại thứ yếu Chúng gồm những sâu hại phổ biến ở nhiều vùng và thường gặp trên ruộng lúa nhưng ắt khi gây ra thiệt hại ựáng kể: rầy lưng trắng, rầy xám, bọ trĩ, ruồi ựục noãn, sâu keo, bọ xắt ựen, bọ xắt xanh, sâu cắn gié, sâu ựục thân 5 vạch, sâu cắn gié, sâu ựo xanh, sâu cuốn lá lớn (Nguyễn Công Thuật, 1996)

Theo Lương Minh Châu (2010), trong vụ đông Xuân 2009 Ờ 2010, diện tắch nhiễm rầy nâu là 81.234 ha (tăng 10.258 ha so với cùng kỳ năm trước) Rầy nâu xuất hiện trên trà lúa giai ựoạn ựẻ nhánh ựến trổ, mật số rầy nâu phổ biến từ 1.000 Ờ 1.500 con/m2, có 4.114 ha lúa nhiễm nặng với mật số

rầy cao 3.000 Ờ 10.000 con/m2 Rầy nâu xuất hiện phổ biến ở các tỉnh Kiên Giang, đồng Tháp, Long An, Sóc Trăng, Trà Vinh, Bạc Liêu, Bình ThuậnẦ

Tỷ lệ rầy nâu nhiễm vi rút vẫn còn cao >70% (Lương Minh Châu, 2010)

Diện tắch nhiễm bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá trên lúa ựã ựược chi cục đông Xuân 2009 Ờ 2010 ựã ựược Cục Bảo Vệ Thực Vật cập nhật liên tục trong các thông báo ựịnh kỳ của Ban chỉ ựạo phòng chống rầy nâu, bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá các tỉnh phắa Nam Diện tắch nhiễm bệnh lúc cao nhất lên ựến

223 ha, diện tắch nhiễm bệnh nặng tập trung chủ yếu ở hai tỉnh Long An, Kiên Giang (Bộ Môn Bệnh Cây Ờ Viện lúa đBSCL, 2010)

2.1.3.Phương pháp lai

● Phương pháp lai trong chọn tạo giống lúa

Lai là sự phối hợp của hai dạng cha mẹ khác nhau Khi lai cây cha cung cấp phấn hoa, cây mẹ tiếp nhận phấn hoa và tạo ra con lai

Nhà chọn giống tạo ra nguồn biến dị mới ựể cải tiến giống lúa: thông qua lai tạo Khi lai tạo ra thế hệ con lai F1 và ở thế hệ F2 trở ựi có sự biến thiên giữa các cá thể trong quần thể, người ta gọi ựó là sự phân ly Nhà chọn giống lợi dụng hiện tượng này ựể lựa chọn cây lúa mà mình mong muốn Cá thể trở nên thuần và ựồng ựều ở F7 - F8 (Nguyễn Thị Lang, 2002)

● Kỹ thuật lai giống

Kỹ thuật lai giống ở lúa bao gồm các bước tiến hành như: chuẩn bị vật liệu lai, chuẩn bị cây lai và dụng cụ, tiến hành khử ựực và thụ phấn cho hoa

Quyết ựịnh sự thành công của kỹ thuật lai lúa là khâu khử ựực đây là giai ựoạn quan trọng trong công tác lai tạo Việc chọn bông lúa ựể khử và sự khéo léo của thao tác khử bằng tay của người thực hiện là một yêu cầu khắt khe

Bông lúa nên chọn khi vừa ló ra khỏi bẹ Thời ựiểm này bảo ựảm hoa lúa (nhụy) chưa ựược thụ và thao tác gấp bao phấn thực hiện cũng dễ dàng, tỷ

lệ cao

Ở thế hệ F2, người ta có thể áp dụng hai phương pháp chọn lọc: phương pháp phả hệ và phương pháp trồng dồn Các cá thể chọn lọc trở nên thuần và ñồng ñều ở F7 -F8 Người ta chọn ra các dòng triển vọng, và xem xét chúng thông qua:

- Bộ giống quan sát (không có nghiệm thức lặp lại)

- So sánh năng suất sơ khởi

- So sánh năng suất hậu kỳ

Theo Nguyễn Thị Lang (2002) thành công của chương trình lai tạo giống tùy thuộc vào:

- Mục tiêu lai tạo rõ ràng

- Có phương pháp lai tạo giống phù hợp

- Có sự tuyển chọn hợp lý với bố mẹ trong việc lai tạo

- Có những tiêu chuẩn chọn lọc và các phương pháp kết hợp trắc nghiệm kết hợp hài hòa

Khi có mục tiêu lai tạo rõ ràng, chúng ta sẽ có một khái niệm ñầy ñủ về sự phối hợp các tính trạng, và xác ñịnh vùng thích hợp với giống ấy

● Phương pháp lai Backcross

Lai Backcross (lai lại) là phép lai trong ñó F1 ñược lai trở lại với bố mẹ với một số lần lặp lại cần thiết Lai Backcross ñược sử dụng khi muốn bổ sung một vài tính trạng khác ñể hoàn thiện giống có hàng loạt tính trạng tốt Phép lai này còn dùng phổ biến ñể truyền tính bất dục ñực tế bào chất cho một giống nhằm tạo ra các dòng CMS mới sử dụng trong chọn giống ưu thế lai hệ “3 dòng” (Nguyễn Thị Lang, 2002)

2.2 Rầy nâu và gen kháng rầy nâu

2.2.1 Rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal )

Tên khoa học Nilaparvata lugens Stal , thuộc giống Nilaparvata, thuộc

họ rầy thân Delphacidea, thuộc bộ phụ cánh nhỏ Fulgoroidea, bộ cánh ñều

Homoptera, có tới 16 loài trong ựó loài gây hại trên lúa là Nilaparvata lugens (Nguyễn Xuân Hiển et al., 1979)

Rầy nâu có mặt trên khắp các nước trồng lúa Dịch rầy bùng phát mạnh từ năm 1977 ựến nay gây thiệt hại trầm trọng tại Philippin, Thái Lan, Indonesia, Ấn độ, Mã Lai, đài Loan, Trung Quốc, Sri Lanka và Việt Nam Tại nước ta rầy nâu luôn luôn là tai hoạ nghiêm trọng và thường xuyên có mặt

từ Nam ra Bắc, ựặc biệt là tại đBSCL rầy nâu xuất hiện quanh năm (Lương Minh Châu, 2006)

Ngoài cây lúa, rầy nâu còn tác hại trên các cây trồng khác như: ngô, lúa

mì, lúa mạch, kê, cỏ gấu, cỏ lồng vực

2.2.1 1 Tình hình gây hại trong và ngoài nước

Rầy nâu xuất hiện ở tất cả các nước trồng lúa ,nhất là các nước ở ựồng bằng nhiệt ựới Á Châu Dịch rầy nâu bộc phát mạnh từ 1977 ựến nay gây thiệt hại trầm trọng ở Philippin, Ấn độ, đài Loan, Thái LanẦ

Ở nước ta, rầy nâu luôn là tai họa nghiêm trọng và thường xuyên từ Bắc vào Nam, ựặc biệt tại đồng Bằng Sông Cửu Long rầy nâu xuất hiện

quanh năm

Năm 1931 với một vài trận dịch nhỏ tại Long An và Tiền Giang đến năm 1965 các giống lúa mới ngắn ngày từ Viện lúa quốc tế (IRRI) ựã du nhập vào Việt Nam, tạo tiền ựề cho việc thâm canh, tăng vụ, mở rộng diện tắch trồng lúa giúp cho rầy nâu gia tăng mật số Diện tắch lúa nhiễm rầy nâu ựã xuất hiện trong giai ựoạn 1971 Ờ 1974 gần 100.000 ha, ựại dịch xảy ra vào năm 1977 khoảng nửa triệu ha, năm 1991 với 1 triệu ha Những năm 1992 Ờ

1998 diện tắch nhiễm rầy nâu giảm dần còn 300.000 ựến 650.000 ha (Nguyễn

Xuân Hiển et al., 1979 ) Trong năm 2006, diện tắch lúa Hè Thu bị rầy gây hại

tăng nhanh hơn vụ đông Xuân 2005 - 2006 và có tắnh phân bố rộng ở nhiều tỉnh trong vùng đBSCL Diện tắch nhiễm rầy ựạt cao nhất là tháng 6 (53.593

ha) khi toàn bộ diện tắch lúa Hè Thu ựã xuống giống xong và ựang ở giai ựoạn

và lùn xoắn lá

Cuối vụ Hè Thu và ựầu vụ Thu đông có một sự chuyển tiếp dịch hại rầy nâu giữa 2 vụ ở đồng Bằng Sông Cửu Long Từ tháng 8, diện tắch nhiễm rầy nâu trên lúa Hè Thu giảm dần từ 11.142 ha (25/8/2006) còn 1.570 ha (8/9/2006); tuy nhiên diện tắch nhiễm rầy lại tăng nhanh trên lúa Thu đông ựến 15.357 ha (15/9/2006) đặc biệt là có sự tăng nhanh diện tắch nhiễm rầy nâu trên lúa Thu đông và vụ Mùa ở vùng đông Nam bộ từ 388 ha (25/8/2006) lên 29.730 ha (15/9/2006) Giai ựoạn sinh trưởng của cây lúa ựóng vai trò quan trọng trong sự tăng giảm này Lượng rầy nâu tại vùng đông Nam Bộ sẽ tăng mật số tắch lũy và di chuyển ựến lúa đông Xuân ở đBSCL sẽ ựược gieo sạ vào tháng 11/2006 đây là nguy cơ tiềm ẩn gây bộc phát rầy lần hai tại khu vực phắa Nam Bên cạnh ựó diện tắch bị nhiễm rầy nâu cao trên trà lúa Thu đông tại đBSCL là nơi lưu tồn mầm bệnh vi rút lây truyền khi các ựợt rầy mới nở chắch hút và di chuyển sang lúa đông Xuân vừa gieo sạ

Bệnh vàng lùn - lùn xoắn lá phát hiện ựầu tiên trên trà lúa Hè Thu sớm gieo sạ trong tháng 2 - 3 trùng với cuối vụ đông Xuân chắnh vụ do rầy nâu di chuyển từ lúa đông Xuân sang gây hại, lượng rầy nâu gây hại trong vụ đông Xuân chủ yếu là nhân mật số, tắch lũy tại chổ Khi chuyển sang vụ Hè Thu sớm và Hè Thu chắnh vụ chắnh những diện tắch bị nhiễm bệnh vi rút là nguồn lan truyền bệnh thông qua sự di chuyển của rầy nâu và kết quả là diện tắch

nhiễm bệnh vàng lùn - lùn xoắn lá tăng lên không ngừng trong vụ Hè Thu và Thu đông ở cả hai vùng là đBSCL và đông Nam bộ

Theo Cục Bảo Vệ Thực Vật phắa Nam, vụ đông xuân năm 2008 ở Nam

Bộ ựã gieo 1.582.689 ha, trong ựó, diện tắch thu hoạch xong là 530.599 ha Diện tắch vụ Xuân Hè ựã gieo 69.915 ha Diện tắch nhiễm rầy nâu vụ đông Xuân là 66.225 ha với mật ựộ rầy nâu phổ biến là 750 Ờ 2.000 con/m2 (có 3.252 ha xuất hiện với mật ựộ cao nhất 5.000 Ờ 10.000 con/m2 ) Rầy nâu trên ựồng ruộng phổ biến là rầy cám tuổi 1 Ờ 3 Diện tắch nhiễm rầy nâu trong vụ Xuân Hè là 8.042 ha với mật số phổ biến là 500 Ờ 1.000 con/m2 (cao nhất 3.000 con/m2 ) Diện tắch lúa Hè Thu ựã gieo sạ ựược 547.860 ha Diện tắch lúa chắn 14.037 ha Diện tắch nhiễm rầy nâu 13.499 ha, mật ựộ rầy phổ biến là 1.000 Ờ 3.000 con/m2 (có nơi nặng nhất 6.000 Ờ 12.000 con/m2 với diện tắch là 1.311 ha) Tuổi rầy phổ biến từ 1 Ờ 5

Năm 2006 dịch rầy nâu, bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá hại lúa ựã lây lan

ra 21 tỉnh, thành, gây thiệt hại cho trên 500.000 ha và làm giảm sản lượng 825.000 tấn lúa, ước thiệt hại khoảng 2.000 tỷ ựồng

Năm 2007, ở vụ hè thu diện tắch nhiễm rầy nâu khoảng 29.300 ha Còn diện tắch lúa thu ựông và lúa mùa bị nhiễm khoảng 28.000 ha

Năm 2008 có tới 210.000 ha lúa bị nhiễm bệnh trong ựó có 26.500 ha bị nhiễm nặng với mật ựộ 1.000-1.500 con/m2 (cá biệt có nơi nhiễm 10.000 con/m2)

Hiện nay, tại các tỉnh phắa Nam dịch rầy nâu cũng diễn biến khá phức tạp diện tắch lúa nhiễm rầy nâu gần 220 ngàn ha, giảm 32 ngàn ha so với cùng kỳ năm trước Mật ựộ rầy phổ biến từ 1.000-1.500 con/m2Ầ

Bên cạnh ựó Bộ NN&PTNT cho biết, ở các tỉnh phắa Bắc, vùng bắc Trung Bộ tình hình rầy nâu gây hại trên lúa ôm ựồng, trổ bông :

Cụ thể, tại các tỉnh phắa Bắc mật ựộ rầy phổ biến từ 50-100 con/m2, có nơi ựến 1.500-3.000 con/m2, trong dó có một số ựịa phương có diện tắch

nhiễm nhiều như: Nghệ An có 5.785 ha, Huế có 643 ha, Quảng Trị có 350 ha

bị nhiễm rầy nâu và rầy lưng trắng

Ở các tỉnh Bắc Trung bộ với tổng ñộ rầy phổ biến từ 400-1.500 con/m2, ở Quảng Trị lên tới 2.000 con/m2 Vùng ðồng Bằng Bắc Bộ diện tích nhiễm gần 4.000 ha, cao hơn cùng kì năm trước

2.2.1.2 Mức ñộ gây hại

Cháy rầy

Rầy trưởng thành và rầy non dùng miệng chích vào thân cây lúa ñể chích hút dịch cây Bị hại nhẹ các lá dưới có thể bị héo Bị hại nặng chúng có thể gây ra hiện tượng “cháy rầy”, cháy rầy xảy ra khi mật ñộ rầy cao Cháy rầy sẽ làm giảm năng suất ñáng kể thậm chí có thể mất trắng hiện tượng cháy rầy ñầu tiên chỉ xuất hiện cục bộ một vài m2, nhưng nếu gặp ñiều kiện thuận lợi vết cháy rầy lan tỏa rất nhanh tới một vài ha hoặc cả cánh ñồng trong vòng một ñến hai tuần

Truyền bệnh vi rút

Rầy nâu là tác nhân gây ra bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá, do chúng có thể lấy ñược cả hai loại vi rút gây bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá và chúng sẽ truyền bệnh cho cây lúa khi chúng chích hút Tuy nhiên không phải con rầy nào cũng mang vi rút truyền bệnh

Rầy non có khả năng truyền vi rút mạnh hơn rầy trưởng thành Một con rầy tuổi ba có thể truyền bệnh cho khoảng 200 cây lúa Tỷ lệ truyền bệnh của rầy nâu không khác biệt giữa rầy cánh dài và rầy cánh ngắn Rầy vẫn tiếp tục truyền bệnh sao khi lột xác Cây lúa khi bị vàng lùn và lùn xoắn lá thì không phát triển ñược ñều ñó ñã làm giảm năng suất lúa ñáng kể

2.2.1.3 ðặc ñiểm sinh học của rầy nâu

● Nhận diện hình thái

- Thành trùng : có hai dạng cánh dài và ngắn

+ Dạng cánh dài : con cái dài 4,5 – 5 mm bụng màu nâu vàng, ñỉnh ñầu nhô ra phía trước Cánh trong suốt giữa cạnh sau của cánh trước có một ñốm ñen, khi hai cánh xếp lại, hai ñốm này chồng lên nhau tạo thành một ñốm ñen

to trên lưng Dạng cánh dài thường xuất hiện vào cuối vụ lúa ñể di chuyển tìm nguồn thức ăn mới

Hình 2.1: Rầy trưởng thành dạng cánh dài

Mắt kép màu nâu nhạt, mắt ñơn màu nâu ñỏ Gốc râu có hai ñốt phình to; con ñực dài 3,6 – 4,0 mm màu nâu ñậm bé hơn con cái, cuối bụng dạng loa kèn + Dạng cánh ngắn : con cái dài 3,5 – 4 mm cánh trước kéo dài ñến ñốt thứ sáu Con ñực dài 2 – 2,5 mm, hình nhỏ màu ñen nâu, cánh trước kéo dài tới 2/3 chiều dài của bụng

Hình 2.2: Rầy trưởng thành dạng cánh ngắn

- Ấu trùng: có 5 tuổi qua bốn lần lột xác, ấu trùng mới nở còn gọi là rầy cám, kích thước lớn dần từ 0,5 ñến 4 mm, màu sắc thay ñổi từ trắng ngà ñến vàng nâu, bụng có màu trắng sữa, mầm cánh kéo dài ñến ñốt bụng 4

Hình 2.3: Ấu trùng của rầy nâu

Hình 2.4: Trứng rầy nâu

- Trứng: hình bầu dục dài hơi cong, ñuôi hơi thon, ổ trứng có hình nải chuối,

nằm trong nhu mô của bẹ lá

8 ngày, trứng phát triển nhanh ở nhiệt ñộ 25 – 30oC, nhưng không nở ở 33oC, nhiệt ñộ tối hảo là 27oC Ấu trùng có 4 lần lột xác kéo dài 14 – 21 ngày Lượng trứng và sự phát triển của rầy non cao nhất ở 27 - 28oC Tuy nhiên rầy

non tuổi 4 - 5 có thể sống trong khoảng 12 - 31oC Như vậy, vòng ñời rầy nâu biến thiên từ 20 - 50 ngày Riêng tại ðBSCL , rầy nâu hoàn tất chu kỳ sống trong vòng 20 - 30 ngày, tùy theo mùa vụ, thời tiết và lượng thức ăn trên ñồng ruộng

Hình 2.5: Vòng ñời rầy nâu (Nguồn:

www.khuyennongvn.gov.vn/anh/vllxl.pdf)

● ðặc ñiểm sinh lý, sinh thái

Trong vùng nhiệt ñới ấm và ẩm, rầy nâu sống quanh năm và biến ñộng mật số tuỳ vào giống lúa, hệ thiên ñịch và ñiều kiện môi trường Sau khi lúa gặt xong, rầy nâu di chuyển lên cỏ dại nhưng không sống tiềm sinh ở ñó Tuy nhiên, chúng chỉ qua ñông với trứng và rầy non tuổi 5 trong vùng ôn ñới như Nhật Bản Sau khi có lúa mới sạ hay cấy, rầy nâu di chuyển từ cỏ dại sang

ruộng lúa Như vậy, sự xuất hiện theo mùa xảy ra ở vùng có giai ñoạn hưu miên và hoạt ñộng quanh năm ở nơi không có miên kỳ nhưng phát triển mạnh vào mùa khô từ tháng 9 – 10 và gối lứa liên tục

Trong ñiều kiện dẫn thủy tốt, trồng lúa liên tục, thời vụ lai rai kéo dài, gieo sạ dày với giống lúa nhiễm rầy lại bón nhiều phân ñạm, phun thuốc trừ sâu bừa bải thì rầy nâu sẽ bùng phát mạnh do có tiểu khí hậu phù hợp như ẩm

ñộ cao, nhiệt ñộ tối hảo và không khí êm mát Lũ lụt với các trận mưa lớn trong hàng tháng trời sẽ làm rầy nâu bị suy kiệt, rầy cám trôi xuống nước, ñồng thời rầy cũng dễ bị nấm bệnh tấn công Trong khi mưa nhỏ hay mưa nắng xen kẻ, trời âm u rất thích hợp ñể rầy phát triển mật số Ẩm ñộ thích hợp ñối với rầy nâu là từ 80 – 86%

Rầy nâu có khả năng di chuyển xa khi có gió mùa, rầy bốc lên theo các luồng gió và bị cuốn ñi có thể ñến những nơi rất xa, có thể ñến hàng chục cây

số từ quần ñảo Philippin ñến miền Bắc Việt Nam rồi sang Trung Quốc và ñáp xuống Nhật Bản

Yếu tố thức ăn và thời tiết có ảnh hưởng ñến sự hình thành số lượng rầy cái hoặc ñực cũng như dạng cánh ngắn hay dài

Thường có ba lứa rầy trong một vụ lúa ngắn ngày (100 – 110 ngày), vào các giai ñoạn ñẻ nhánh, làm ñòng, chín sữa Trong năm có hai ñỉnh cao của rầy nâu vào tháng 1, 2 và tháng 7, 8

cũng như cần bố trí 2 - 3 giống lúa khác nhau trên cùng cánh ñồng ñể tránh sự phát triển ñộc tính của các quần thể rầy nâu

- Nên trồng một số giống lúa kháng trung bình ñã phổ biến trên diện rộng như: OM1490, OM3536, AS996, OM4498, OM4495, OM576, OM 6162…

- Biện pháp canh tác:

+ Thời vụ: nên trồng lúa hàng loạt, tránh thời gian gieo xạ kéo dài tạo

ra nguồn thức ăn dồi dào cho rầy nâu

+ Thường xuyên thăm ñồng và vệ sinh ñồng ruộng

+ Luân canh: trồng thêm một vụ dưa, ñậu, bắp, bông vải…ñể cắt nguồn thức ăn của rầy nâu

+ ðiều chỉnh cách bón phân ñạm: nên chia ra bón nhiều lần (> 3), kết hợp bón phân cân ñối NPK, tăng cường bón phân kali ñể tăng tính chống sâu bệnh

+ Tháo nước ra trong vòng 3 – 4 ngày

- Biện pháp sinh học:

Bảo vệ các thiên ñịch và các loài ong ký sinh như: Bọ rùa, Nhện chân

dài, Chuồn chuồn kim, Bọ xít mù, Nhện ñỏ, Trichogrammatid, Myraid,

Elendid ký sinh trên trứng và ấu trùng, các loài nhện bắt ấu trùng và thành

trùng ñể ăn, nên mật số rầy không cao ñược Một số các loài thiên ñịch thường có cao ñiểm vào 30 - 40 ngày sau khi gieo sạ, do ñó không nên phun thuốc trừ sâu vào giai ñoạn này ñể bảo vệ các loài thiên ñịch Ngoài ra có thể thả vịt con một tháng tuổi với mật ñộ 150 - 200 con/ha hoặc thả cá rô, cá chép trong ruộng ñể ăn rầy nâu

- Biện pháp hoá học:

+ ðối với giống nhiễm rầy nâu như ðS20, OMCS 2000, Jasmin 85 … Chỉ phun thuốc khi ñến ngưỡng phòng trừ, không phun khi rầy ở giai ñoạn trứng, thành trùng hay rầy mới nở làm hủy diệt thiên ñịch

+ ðối với gống lúa kháng trung bình thì nên áp dụng biện pháp không phun thuốc trừ sâu trong vòng 40 ngày ñầu sau sạ nhờ vào khả năng bù trừ của cây lúa cao và tăng cường quần thể thiên ñịch trên ruộng lúa ñể chống chịu ñược rầy nâu

+ Trong trường hợp bắt buộc phải phun thuốc trừ sâu thì chỉ chọn loại thuốc ít ñộc cho thiên ñịch như Bassa, Mipcin, Trebon, Applaud Không phun các loại thuốc gây hồi phục rầy nâu như Fastac, Methyl parathion, … Tuân thủ biện pháp bốn ñúng: ñúng lúc, ñúng thuốc, ñúng liều lượng và ñúng cách (hướng vòi phun sát gốc lúa)

Thuốc hột tỏ ra kém hiệu quả hơn ñối với rầy nâu so với thuốc phun.sinh học, Côn trùng học, Công nghệ sinh học

2.2.2 Những nghiên cứu về gen kháng rầy nâu trong và ngoài nước

ðồng Bằng Sông Cửu Long ñược coi là trọng ñiểm sản xuất lúa chính của cả nước với diện tích ñất nông nghiệp chiếm khoảng 2,4 triệu ha

Các giống lúa cao sản hiện nay trong ñiều kiện thâm canh tốt ở ðồng Bằng Sông Cửu Long ñã ñạt năng suất gần ñến ngưỡng tối ña ðể nâng cao tiềm năng năng suất lúa cho vùng thâm canh ñòi hỏi sản xuất phải ña dạng hoá nguồn gen, thay thế những giống lúa có phẩm chất gạo thấp bằng những giống lúa có phẩm chất cao, giống lúa dài ngày bằng giống lúa ngắn ngày Ở ðồng Bằng Sông Cửu Long ñặc biệt là trong nhưng năm gần ñây dịch rầy nâu tấn công mạnh, nhiều giống kháng trong những năm trước lại nhiễm với dạng hình mới của rầy nâu

Trong chương trình cải thiện giống lúa của ðồng Bằng Sông Cửu Long, Viện lúa ðBSCL liên tục lai tạo ra những giống lúa mới kháng rầy nâu, ñạo ôn, có năng suất cao và phẩm chất ñạt tiêu chuẩn xuất khẩu

Ở Nhật Bản ñôi khi thấy Nilaparvata lugens sống chung với một số loài rầy khác như: N bakeri và N muiri, nhất là trong các tháng 5, 6 và 7 Ở

Ấn ðộ, số lượng rầy nâu thay ñổi tương quan với số lượng rầy ñiện quang

Inazuma dorsalis và rầy xanh Nephotettix virescens Ở Trung Quốc, 67,7%

tổng số rầy trên ruộng lúa là rầy lưng trắng Sogatella furcifera, 28% là

Empoasca subrufa, 2,2% rầy xanh Nephotettix bipunctatus cincticeps, 1,3% Cicadella viridis, 0,7% Delphacodes striatella, chỉ 0,1% là Nilaparvata lugens và có Nisia atrovenosa với tỷ lệ không ñáng kể

Trên thế giới, rầy nâu hiện diện ở khắp các nước Nhật Bản, Triều Tiên, Trung Quốc, Việt Nam, Campuchia, Thái Lan, Miến ðiện, Banglañet,

Ấn ðộ, Sri Lanka, Malaixia,…

Cho ñến nay, người ta ñã ghi nhận có 4 biotype rầy nâu ở Châu Á Vật liệu cho gen kháng rầy nâu biotype 1 là Mudgo (gen Bph-1), kháng biotype 2 là ASD7 (gen Bph-2, gen lặn), kháng biotype 3 là Rathu Heenati (gen Bph-3), kháng biotype 4 là Babawee (gen Bph-4) Biotype 4 chỉ có ở

Ấn ðộ, không ñược ghi nhận ở các vùng trồng lúa khác Những giống có gen kháng rầy nâu khác cũng ñược công bố như ARC10550 (gen Bph-5), Swarnalata (gen Bph-6), T12 (gen Bph-7), Chin Saba (gen Bph-8), giống

Pokkari (gen Bph-9), lúa hoang O australiensis (gen Bph-10, ñịnh vị trên

nhiễm sắc thể số 12), có 2 gen kháng biotype 4 cũng ñược ghi nhận trên

dòng dẫn xuất từ O officinalis, ñịnh vị trên nhiễm sắc thể số 3 và số 7,

tương tác bổ sung theo tỉ lệ phân ly kiểu hình kháng : nhiễm là 9:7 ở F2 của

tổ hợp lai 9195 (O.offcinalis)/IR50 (Bùi Chí Bửu, 1997)

Di truyền tính kháng rầy nâu ñã ñược nghiên cứu kỹ, nhiều gen ñơn kiểm soát tính kháng rầy nâu ñã ñược báo cáo cho ñến ngày nay Năm trong

số những gen này là Bph1, bph2, Bph9, Bph10, Bph18 nằm trên nhiễm sắc thể

Quần thể rầy nâu chỉ có thể gây thiệt hại ựối với những giống không mang gen kháng ựược gọi là biotype 1

Biotype 2 ựược xác ựịnh là tồn tại ở Philippine, Indonesia, và Việt Nam vào năm 1976-1977 Sau ựó biotype trội mở rộng qui mô gây hại trên các gi

giống mang gen Bph1 (Khush, 1979)

Biotype 3 ựược xác ựịnh sau khi nuôi thử nghiệm rầy nâu trên giống

ASD7, một giống mang gen kháng bph2 từ 130 thế hệ tại IRRI (Pathak và

Heinrichs, 1982)

Quần thể rầy nâu biotype 4 bắt nguồn từ đông nam Á và ựã ựược ựề cập tới như là một biotype của đông nam Á (Khush, 1984)

đối với ựặc tắnh kháng rầy, ựến nay người ta ựã tìm ựược khoảng trên

10 gen kháng chắnh (major genes) và một số gen kháng phụ khác (minor genes hay QTLs) dựa vào sự khảo sát phản ứng của các giống lúa ựối với các biotype rầy nâu cũng như các thắ nghiệm phân tắch di truyền và lập bản

ựồ phân tử (Sidhu and Khush, 1978; Ikeda, 1985; Ishii et al., 1994; Lưu Thị Ngọc Huyền và ctv, 2001) Trong công trình trước (Thiều Văn đường và ctv,

2000) ựã xác ựịnh các gen kháng rầy nâu bph4 ở dòng lúa DG5 và Bph6 ở

dòng lúa GC9 kháng khá hiệu quả ựối với quần thể rầy nâu ở ựồng bằng sông Hồng và đồng Bằng Sông Cửu Long Cho ựến nay vẫn chưa có công

trình nào xác ựịnh xem gen Bph6 nằm trên nhiễm sắc thể nào Còn việc ựịnh

vị gen bph4 trên nhiễm sắc thể thì lại không có sự thống nhất giữa các nhà khoa học: gen bph4 nằm trên nhiễm sắc thể số 4 qua phân tắch di truyền

(Sidhu and Khush, 1978), hoặc trên nhiễm sắc thể số 6 dựa theo phương pháp chỉ thị phân tử (Kawaguchi et al, 2001)

Những nghiên cứu ựược thực hiện bởi Athwal et al (1971) ựã chứng

minh rằng gen trội Bph1 chi phối tắnh kháng ở giống Mudgo, MTU15, CO22,

và MGL2 kháng với rầy nâu loại hình sinh học 1 (biotype 1), trong khi ựó một

gen lặn bph2 ựiều khiển tắnh kháng ở giống ASD7 và Ptb18 kháng ựối với rầy

nâu loại hình sinh học 2 (biotype 2) Hai gen này liên kết chặt nhau và không

có sự tái tổ hợp giữa chúng

Theo Lakshminarayana và Khush (1977), Sidhu và Khush (1978,1979),

Ikeda và Kaneda (1981) báo cáo rằng giống indica Rathu Heenati của Sri

Lankan thể hiện tính kháng ñối với tất cả biotype, ñược kiểm soát bởi một gen

trội mới khác với gen Bph1, ñã ñược xác ñịnh rõ là gen Bph3 kháng rầy nâu

loại hình sinh học 3 (biotype 3) Một giống khác ở Sri Lankan là Babawee mang một gen kháng lặn (Lakshminarayana va Khush, 1977) Gen này ñộc

lập với gen bph2 và ñược xác ñịnh là mang gen bph4 kháng rầy nâu loại hình sinh học 4 (biotype 4) Hai gen Bph3 và bph4 liên kết với nhau rất chặt chẽ Gen lặn bph4 còn liên kết với gen sd1 (ñiều khiển tính trạng nữa lùn)

Kabir và Khush (1988) qua phân tích di truyền ñã xác ñịnh gen bph5 có trong giống ARC10550, gen lặn bph5 ñiều khiển tính kháng rầy nâu loại hình sinh học 4 (biotype 4), phân ly ñộc lập với các gen Bph1, bph2, Bph3 Một gen trội Bph6 phân ly ñộc lập ñối với các gen bph5 ở giống Swarnalatha và

bph7 ở T12, kháng trung bình với những biotype rầy nâu từ Bangladesh

Akihama ñã thu thập ñược hai giống chưa ñược biết từ Thái Lan vào năm 1969, và ñã dặt tên cho chúng là Col.5 Thailan (sau ñó ñược gọi

là Col.5 T) và Col.11 Thailan (sau ñó ñược gọi là Col.11) Ikeda (1985)

ñã chứng minh rằng các gen lặn ñược tìm thấy ở Col.5 T, Col.11 T và

Chin saba không allel với gen bph4, và các gen kháng mới ñược phát hiện thể hiện phản ứng khác với gen Bph1 và gen bph2

ðối với lúa hoang ñược ghi nhận là nguồn tài nguyên di truyền rất ña

dạng cung cấp gen kháng sâu bệnh hại trong ñó có rầy nâu Oryza

australiensis (2n=24EE) kháng rất cao ñối với rầy nâu (BPH), và bệnh bạc

lá (BB) Oryza brachyantha (2n= 24FF) kháng bệnh ñạo ôn, bạc lá và rầy nâu Việc du nhập các gen mục tiêu vào lúa trồng rất khó khăn vì tính chất khác biệt giữa 2 genome (genome của lúa trồng 2n=24AA) Với kỹ thuật

cứu sống phôi mầm người ta có thể thực hiện việc chuyển gen mục tiêu vào lúa thường Sau ñó người ta sử dụng kỹ thuật FISH (fluorescent in situ hybridization) ñể xét nghiệm Tuy nhiên, cơ chế du nhập gen như vậy vẫn chưa ñược biết rõ ràng Trong chương trình chọn giống kháng sâu bệnh việc

ổn ñịnh tính kháng ñược ñặc biệt quan tâm Những marker ñược sử dụng trong kĩ thuật PCR sẽ là cơ hội tốt giúp chúng ta ñạt ñược kết quả mong

muốn trong chọn giống lúa kháng Loài lúa hoang Oryza Australiensis Domin cũng ñã ñược chứng minh là mang gen kháng trội Bph-10 (t), gen này

ñã ñược ñưa vào giống indica ñể tạo ra những tổ hợp mới mang gen kháng rầy

nâu Bph-10(t) (Ishii et al., 1994)

Hai gen kháng rầy nâu Bph1 và Bph10(t) ñược tìm thấy liên kết rất chặt

chẽ với RFLP marker, C185 và RG457 trên nhiễm sắc thể số 12 Quần thể lúa

hoang Oryza australiensis ñược phát hiện có mang gen Bph10(t)

Gần ñây, hai gen bph11 (t) và Bph12 (t) ñã ñược báo cáo Những loài

Oryza hoang dại tiềm ẩn những nguồn gen kháng mới ñối với rầy nâu Ước lượng khoảng 11000 quần thể lúa hoang dại là phương tiện ñể nghiên cứu gen kháng với biotype 1, 2 và 3, viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) ñã phát hiện ñược 19 nhóm thuộc bốn loài lúa hoang là kháng hay kháng vừa phải với cả

ba biotype

Marker RG457 ñịnh vị trên locus số 12 ñược dùng ñể thiết kế chuỗi

kí tự của STS marker, ứng dụng PCR nhằm phát hiện gen kháng Bph-10 trong quần thể con lai của PTB33/TN1 Kỹ thuật cloning ñược thực hiện thông qua vector BAC Clone IR64 BAC ñược áp dụng ñể tìm sự chồng gen kháng rầy nâu Kết quả RG457 phân lập ñược 2 clone 07I2 và 16C14, với kích thước 1200bp Dựa trên clone này chúng ta có thể ñịnh vị các locus ñiều khiển gen kháng rầy nâu (Nguyễn Thị Lang và ctv 2005)

Nguyễn Thị Lang và ctv (1999) ñã thiết kế những STS primer ñể phân lập gen kháng rầy nâu Bph-10 trên quần thể con lai F2, F3 của tổ hợp lai

IR54742/IR31917 và PTB33/TN1 ñược dùng ñể ñánh giá kiểu gen kháng rầy nâu với marker có tên là RG457FL-RB hoặc RG457FL-RL

Quần thể rầy nâu ở ðồng Bằng Sông Cửu Long có thể là sự pha trộn giữa 2 loại hình sinh học BPH2 và BPH3 Giống PTB33 ñược ghi nhận có tính kháng ổn ñịnh ñối với quần thể rầy nâu trong nhiều năm và ñược Viện Lúa ðồng Bằng Sông Cửu Long ñề xuất là vật liệu cho gen kháng Trong khi Ishii và ctv (1994) ghi nhận gen kháng rầy nâu Bph-10 có tính kháng ổn ñịnh ñối với rầy nâu BPH3

2.3 Các loại ADN marker

2.3.1 Các loại ADN marker

ADN marker là những marker phân tử ñược tạo ra nhờ kĩ thuật phân cắt ADN bằng những enzyme nội sinh, phân cắt hạn chế ADN marker ñã ñược chứng minh có tầm quan trọng hơn về lâu dài do số lượng của nó lớn

hơn rất nhiều lần isozyme marker (Tanksley et al., 1980) Việc áp dụng ADN

marker dễ dàng hơn và tương lai sẽ rẻ tiền hơn nhờ sự cải tiến không ngừng của các nhà khoa học

Về căn bản, bất cứ chuỗi mã ADN nào ñược dùng ñể phân biệt giữa 2

cá thể, 2 dòng hoặc 2 giống khác nhau, ñều có thể ñược xem là 1 ADN marker Các ADN marker có thể chia thành 2 nhóm:

- PCR - based: ALP, AFLP, SSR, SSCP

- ADN/ADN hybridization - based: RFLP, minisatellite

Các marker thuộc nhóm PCR-based có thể ñược chia nhỏ thành:

• MAAP

• Marker ngắn, có tính ngẫu nhiên: RAPD, AP-PCR, DAF, AFLP

• Và amplicon ñơn: ALP, SSR, SSCP

Những lợi ích của ADN marker so với marker hình thái và isozyme marker là:

- ðo lường trực tiếp các vật liệu di truyền

- Có nhiều marker trong quần thể

- ðo lường không chi phối ảnh hưởng môi trường và ảnh hưởng có tính chất phát triển

Do những lợi ích nêu trên, ADN marker ngày nay trở nên thông dụng trong nghiên cứu di truyền cây lúa

Bảng 2 1: Các loại ADN marker thông dụng

Marker Tên ñầy ñủ

Single strand conformation polymorphism Moderately repeated, dispersed, and highly variable DNA (minisatellite)

Single nucleotide polymorphism

2.3.2 Marker là sản phẩm của PCR (PCR-BASED MARKER)

Nguyên tắc cơ bản của PCR: Phản ứng chuỗi polymerase thường ñược viết tắt là PCR (polymerase chain reaction) ðây là phương pháp nhân nhanh một ñoạn ADN trong ống nghiệm ra ñời từ ñầu thập niên 1990 cho phép chúng ta ứng dụng marker phân tử theo hướng ñơn giản và hiệu quả hơn Phương pháp PCR tạo nên ALP (amplicon length polymorphism) phản ánh ADN có tính ña hình giữa các cá thể, các dòng lai và giữa các giống trên

cơ sở ñiện di Ngoài ra, PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hóa di

truyền ADN bằng cách phát triển primer một cách ñồng loạt trên các dây ñơn ADN Toàn bộ tiến trình ñược hoàn thiện do sự biến chất của ADN cần thiết,

sự tác ñộng của primer tại ñầu của các dây ñơn ADN này, kế ñến là sự phát triển của các primer do phản ứng ADN polymerase

Bước 1: Giai ñoạn biến tính thường là 94 - 96°C trong vòng 30 giây -1 phút (tùy thuộc vào vật liệu)

Bước 2: Giai ñoạn bắt cặp thường nhiệt ñộ dao ñộng khoảng 40-72°C thường

là 55°C và kéo dài từ 30 giây -1 phút

Bước 3: Giai ñoạn tổng hợp hay kéo dài lúc này nhiệt ñộ tăng lên ñến 72°C, ñây là nhiệt ñộ tối ưu cho nhiều ADN polymerase chịu nhiệt và kéo dài từ 1 phút ñến nhiều phút tùy vào ñộ dài ADN cần khuếch ñại

Chu kỳ gồm 3 bước này sẽ ñược lặp lại nhiều lần khoảng 25 - 40 (tùy vào ứng dụng chuyên biệt) Cuối cùng ñược kết thúc bằng một “extension” ở 72°C trong 5 phút, sau ñó cho dừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở nhiệt ñộ phòng hoặc ở 4°C (tùy thuộc vào loại máy Thermal cycler ñược sử dụng) (Bùi Chí Bửu & Nguyễn Thị Lang, 2004) Số bản sao ADN ñược tạo ra nhờ kỹ thuật PCR ñược tính như sau:

Tổng số khuếch ñại = m x 2n

Trong ñó n là số chu kỳ, m là số bản sao của chuỗi mã cần nghiên cứu (Bùi Chí Bửu & Nguyễn Thị Lang, 2004)

Một số thành phần chủ yếu trong hỗn hợp phản ứng PCR:

• ADN polymerase ñược dùng phổ biến là Taq polymerase lấy từ

Thermus aquaticus, có tính ổn ñịnh nhiệt rất cao Taq polymerase nhạy cảm

với ion magnesium Nồng ñộ tối hảo của Mg++ là 0,5-2,5 mM Vì dNTP có thể gắn với ion Mg++, cho nên nồng ñộ chính xác của Mg tùy thuộc vào nồng

ñộ của dNTP

• Các thành phần khác ít mẫn cảm với Taq polymerase là KCl và Tris Ngoài ra, các chất tẩy không có ion, gelatine, NP40 và Tween 20 ñược thêm vào với số lượng nhỏ nhằm thúc ñẩy hoạt ñộng của Taq polymerase với nồng

ñộ hiện ñược dùng là 0,01% và còn tiếp tục thử nghiệm Trong hầu hết các quy trình, người ta khuyến cáo nồng ñộ Taq sử dụng là 0,5U/25µl Nếu nồng

ñộ Taq quá cao (> 1,25U/25µl) những sản phẩm không chuyên tính có thể nhảy vào làm sai lệch kết quả Nếu nồng ñộ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không

có ñủ số lượng men xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn (Bùi Chí Bửu

& Nguyễn Thị Lang, 2004)

• Primer và dNTP: Dung dịch dNTP làm stock phải ñược trung tính ở pH=7.0 Stock ban ñầu ñược pha thêm ñể có 10 mM, và tồn trữ ở -200°C Stock ñược dùng nên có nồng ñộ dNTP là 1mM Sự ổn ñịnh của dNTP trong suốt các chu kỳ lặp lại ước còn khoảng 50% sau 50 chu kỳ Hàm lượng dNTP trong khoảng 20-200µM cho kết quả ổn ñịnh, trung thực và chuyên tính Bốn dNTP ñược xử lý sao cho nồng ñộ chúng tương ñương nhau, ñể giảm thiểu tối

ña hiện tượng sai biệt do kết hợp sai mã di truyền nào ñó

Sự khuếch ñại chuyên biệt ñối với ADN cần nghiên cứu ñều phải tùy thuộc các primer tương xứng Do vậy, chiều dài primer và thành phần G + C ñều có ảnh hưởng quan trọng ñối với nhiệt ñộ trong quá trình tác ñộng ở ñầu dây ñơn Nếu có 50% G+C, thì chiều dài của primer phải có kích thước tương ứng là 18 – 20 nucleotide và có tính ñặc hiệu hơn, còn ñối với primer chứa một ñoạn lớn hơn 4 nucleotide liên tục thì nó sẽ làm mất tính ñặc hiệu

• ADN mục tiêu: Người ta cần phải có những ñoạn ADN mang mật mã biết trước, ñược gọi với thuật ngữ ADN mục tiêu Trong kỹ thuật PCR, kết quả thu nhận sẽ tốt nhất nếu ADN thật sự thuần khiết Số lượng ADN cần cho một phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần 5-10 ng DNA thuần khiết

2.4 Lập bản ñồ di truyền trên lúa nhờ marker phân tử

Kỹ thuật tái tổ hợp ADN ñược ứng dụng rất rộng rãi trong chọn giống cây trồng với sự trợ giúp ñắc lực của marker phân tử ðể xác ñịnh marker thích hợp ñối với gen mục tiêu, người ta cần phải có trước bản ñồ di truyền hay bản ñồ liên kết gen với marker

Bộ gen cây lúa ñược xem là nhỏ nhất trong lớp thực vật một lá mầm

Mc Couch et al (1988) lần ñầu tiên ñã thiết lập bản ñồ di truyền nhờ

marker phân tử (RFLP) trên cây lúa bao gồm 135 loci Bản ñồ phủ trên 12 nhiễm sắc thể với tổng cộng 1.389 cM trên genome cây lúa từ cặp lai

IR34583 (indica) và Bulu Dalam (javanica)

Tiếp theo ba năm sau, bản ñồ thứ hai từ quần thể IRAT117

(japonica) và Apura (indica) ñược công bố (Mc Couch, 1991; Tanksley et al., 1991); Saito et al (1991) thiết lập một bản ñồ khác dựa trên cặp lai Kasalath (indica) và F1134 (japonica) với 347 RFLP

markers, phủ trên 12 nhiễm sắc thể, ñạt chiều dài tổng cộng là 1.836

cM, với 347 loci

Causse et al (1994) thiết lập một bản ñồ khác, dùng 800 RFLP và sử dụng quần thể hồi giao (backcross) giữa Oryza sativa và Oryza

longistaminata

Tại Nhật Bản, Kurata et al (1994) dùng quần thể F2 của cặp lai

Nipponbare (japonica) và Kasalath (indica) ñể lập bản ñồ di truyền Bản ñồ

ñược bao phủ trên 12 nhiễm sắc thể với tổng cộng chiều dài 1.575 cM Vị trí thiết lập bản ñồ tâm ñộng cũng ñược xây dựng với 170 RFLP markers

(Singh et al., 1996)

2.5 Lập bản ñồ cho gen kháng rầy nâu

ðối với rầy nâu, việc dùng marker ñể lập bản ñồ gen rất phức tạp và khó khăn Tuy nhiên, năm 1994 nhóm khoa học gia người Nhật ñã thiết lập bản ñồ gen rầy nâu nhờ RFLP marker và xác ñịnh gen này trên nhiễm sắc

thể số 12 (Ishii et al., 1994) Lang et al (1999) tiếp tục phát triển gen này và

dùng kĩ thuật STS marker ñể phát hiện gen kháng rầy nâu với khoảng cách

di truyền 1,7 cM trên quần thể lúa hoang Gen rầy nâu ñược nghiên cứu bằng STS marker với RG 457 LF-LR tách các gen trên quần thể lúa hoang Cũng

trên gen này, Lang et al (2005) ñã xây dựng bản ñồ vật lý và bản ñồ di

truyền dùng SSR marker tách cả gen rầy nâu trên nhiễm sắc thể số 12 với hai marker RM227 và RM260

Bảng 2.2: Danh sách gen kháng rầy nâu ñược biết

Gen Giống cho gen kháng Nhiễm sắc thể Liên kết với

2.6 Chọn giống nhờ marker phân tử (Theo Nguyễn thị Lang, 2006)

Chọn giống cây trồng theo phương pháp truyền thống dựa trên cơ sở chọn lọc kiểu hình trong quần thể con lai ñang phân ly của một tổ hợp lai nào ñó Phương pháp này thường gặp phải những khó khăn về tương tác

giữa kiểu gen và môi trường (G x E) Hơn nữa, nhiều qui trình chọn lọc theo kiểu hình rất ñắc tiền, tốn nhiều thời gian, tiền của và sức lao ñộng,

Chọn giống nhờ marker phân tử ñược biết với thuật ngữ quốc tế MAS (viết tắt từ chữ marker-assisted selection) là một phương pháp có khả năng khắc phục ñược nhược ñiểm nói trên

• Nó có tính chất bổ sung, không có tính chất thay thế hoàn toàn phương pháp ñánh giá kiểu hình trong lai tạo giống truyền thống

• Nó có thể làm thay ñổi tiêu chuẩn chọn lọc từ sự kiện chọn theo kiểu hình bằng chọn theo kiểu gen một cách trực tiếp hoặc gián tiếp

• Những marker phân tử không bị ảnh hưởng bởi môi trường và nó

có khả năng tìm kiếm gen mục tiêu ở bất cứ giai ñoạn nào (tăng trưởng hoặc phát triển) của cây trồng

• Với sự phát triển của “array” tập hợp nhiều marker phân tử và sự trợ giúp của bản ñồ di truyền, phương pháp MAS có thể áp dụng trong trường hợp ña gen ñiều khiển tính trạng số lượng (QTL: quantitative trait loci)

Phương pháp chọn giống nhờ dấu chuẩn phân tử thành công sẽ hỗ trợ cho qui trình chọn giống tin cậy hơn trên cơ sở:

• Bản ñồ di truyền bao gồm các marker phân tử liên kết với gen chủ lực hoặc QTL của tính trạng có liên quan

• Sự liên kết chặt chẽ giữa marker và gen mục tiêu, giữa marker và QTL mục tiêu

• Sự tái tổ hợp giữa các marker liên kết với tính trạng mục tiêu

• Khả năng phân tích một số lượng lớn các cá thể trong cùng một thời gian một cách hiệu quả về mặt chi phí

Thành công của MAS còn tùy thuộc vào sự ñịnh vị của marker tương ứng với gen mục tiêu

∗ Trường hợp thứ nhất: marker phân tử có thể ñịnh vị trực tiếp trên gen mục tiêu Mối liên kết này là thuận lợi nhất, tạo ñiều kiện ñể ta dòng hóa gen mục tiêu (tạo nên DNA clone) Tình trạng này thường xảy ra ñối với gen kháng bệnh, gen ñiều khiển tính trạng phẩm chất (trong genome cà chua)

∗ Trường hợp thứ hai: marker liên kết với gen ñiều khiển tính trạng với khoảng cách di truyền nhất ñịnh Khoảng cách di truyền càng gần, mức

ñộ tin cậy càng cao, bởi vì rất hiếm alen của marker sẽ bị tách ra khỏi tính trạng mục tiêu do sự kiện tái tổ hợp Hầu hết ứng dụng MAS thành công ñều thuộc trường hợp thứ hai

∗ Trường hợp thứ ba: gen mục tiêu có thể ñược ñại diện bởi một hoặc nhiều QTL Vùng mục tiêu trên genome thường là những ñoạn nhiễm sắc thể, do ñó, nó có hai marker ña hình, kế cận tại QTL mục tiêu; cộng với một hoặc nhiều marker có trong vùng chứa QTL như vậy

ðối với nhà chọn giống cây trồng, việc ứng dụng hữu hiệu nhất của MAS là

sử dụng marker phân tử ADN nhằm 3 mụch ñích sau:

∗ Phát hiện các alen có lợi (trội hoặc lặn) trong các thế hệ ñể tích tụ các alen mong muốn

∗ Xác ñịnh cá thể phù hợp nhất trong quần thể con lai ñang phân ly, trên cơ sở thành phần alen của genome

∗ Phá vỡ liên kết giữa alen mong muốn với loci không mong muốn

2.7 Ứng dụng SSR Và STS marker

2.7.1 Ứng dụng SSR marker

Microsatellite là chuỗi mã di truyền lặp lại rất ñơn giản, thường xảy

ra một cách ngẫu nhiên trong hầu hết genomic trên thực vật, là một công cụ rất có giá trị ñể phân tích di truyền, trong ñánh dấu gen kháng rầy nâu ở cây

lúa (Bửu et al., 1997)

Microsatellite ñã ñược ứng dụng khá thành công từ 1995 ñến nay Nó ñược dùng ñể phát hiện các bệnh ung thư thường gặp trên người, sự liên hệ về huyết thống, các gen có ích trong thực vật

Microsatellite là một PCR- based marker khám phá sự khác biệt các

mà marker ñó ñịnh vị (Jacob et al., 1991; Litt & Luty, 1989; Weber & May, 1989; Zheng K et al., 1995) và nó cung cấp một nguồn ñánh dấu sự khác

biệt ngay trên vật chất di truyền

Microsatellite marker (marker vi vệ tinh) bao gồm một chuỗi mã gốc ñược lập lại nhiều lần và phân tán rộng khắp trong genome, trên nhiều loci, mỗi locus chứa alen thích ứng với mỗi dạng khác nhau về lần lặp lại của nó

và nó rất nhạy cảm (Ramakrishna et al., 1995) Do ñó, nó ñược gọi với thuật

ngữ chuỗi mã giản ñơn lập lại nhiều lần (simple sequence repeats = SSR) Motif có 15 bp repeat trong gen ñiều khiển protein III của thực khuẩn thể M13 ñã ñược áp dụng rất có hiệu quả ñể khám phá ña hình và ñiều tra

marker trong ADN fingerprinting (Vassart et al., 1987; Ryskov et al., 1988)

SSR rất phong phú và phân bố rộng trong genome cây lúa vì thế chúng ñược sử dụng ñể phân tích ña dạng di truyền giữa các giống lúa (Mc

Couch et al., 1997) Bản ñồ di truyền SSR trên genome cây lúa ñược thiết kế

với các SSR marker ñược viết tắt là RM (Rice Microsatellite) ở Mỹ và OSR

ở Nhật Sự phong phú về số lượng các marker SSR với các motif lặp lại phát

triển trên những phần mã hoá và không mã hoá của genome cây lúa (Wu &

Tanksley, 1993; Panaud et al., 1995, 1996; Akagi et al., 1996; Chen et al., 1997; Temnykh et al., 2000) giúp cho việc khảo sát sự hiện diện và khác biệt

các chuỗi mã ñơn giản lặp lại trên toàn bộ genome ngày càng hoàn hảo SSR là marker có giá trị cao bởi chúng thường là dạng di truyền codominant và dễ phân tích bằng PCR Trên lúa có khoảng 5700 – 10.000 SSR có trình tự khác nhau 2, 3 hoặc 4 ñơn vị lặp lại Với số lượng lớn SSR

sẽ rất thuận lợi cho việc ứng dụng lặp bản ñồ gen Một bản ñồ gen của cây

lúa ñược Chen et al (1997) thiết lập trên 121 SSR marker Một bản ñồ có

mật ñộ phân tử cao cũng ñã ñược công bố năm 1998 Bản ñồ này ñược thiết lập với 2275 marker bao phủ 1521,6 cM dựa trên quần thể gồm 186 cá thể con lai F2 từ tổ hợp lai giữa Nipponbare (Japonica) và Kasalath (Indica) (Harushima et al., 1998) Một bản ñồ khác ñã ñược thực hiện bằng 312 SSR

marker phủ ñầy genome với mức ñộ bao phủ trung bình của một marker là 6

cM (Temnykh et al., 2000) Ngoài ra, Mc Couch et al (2002) cũng ñã phát

triển và thiết lập bản ñồ trên cây lúa với 2240 SSR marker mới

Bửu et al (1997) ñã áp dụng microsatellite marker ñể phát hiện gen kháng rầy nâu từ lúa hoang Oryza officinalis, kiểm soát tính kháng