Luận văn đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn công tác giống bông phục vụ chọn tạo giống bông ưu thế lai

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-*** -

NGUYỄN VĂN SƠN

ðÁNH GIÁ ðA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ðOÀN CÔNG TÁC CÁC GIỐNG BÔNG PHỤC VỤ CHỌN

TẠO GIỐNG BÔNG ƯU THẾ LAI

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-*** -

NGUYỄN VĂN SƠN

ðÁNH GIÁ ðA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ðOÀN CÔNG TÁC CÁC GIỐNG BÔNG PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG BÔNG

ƯU THẾ LAI

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng

Mã số: 60.62.05

Người hướng dẫn khoa học: TS VŨ THỊ THU HIỀN

HÀ NỘI - 2011

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan tất cả các số liệu trong luận văn này là khách quan, trung thực và chưa ñược công bố ở bất kỳ một công trình nghiên cứu nào khác Nếu sai tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn

Tôi xin cam ñoan tất cả các tài liệu trích dẫn trong luận văn này ñúng nguồn gốc và các tập thể, cá nhân giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn

Tác giả

Nguyễn Văn Sơn

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện ñề tài, tác giả luôn ñược sự quan tâm, giúp ñỡ tận tình của Ban lãnh ñạo Viện Nghiên cứu bông và Phát triển Nông Nghiệp Nha Hố, Phòng Nghiên cứu Di truyền và Chọn tạo giống và các Phòng chức năng cùng toàn thể bạn bè ñồng nghiệp Với lòng chân thành tác giả bày tỏ sự cảm ơn sâu sắc ñến tất cả các tập thể, cá nhân ñó

ðặc biệt tác giả xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Thu Hiền, Khoa Nông Học, Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội ñã trực tiếp hướng dẫn và giúp

ñỡ tác giả về mọi mặt trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp ñã tạo ñiều kiện về vật chất và ñộng viên tinh thần ñể tác giả hoàn thành tốt luận văn nghiên cứu

MỤC LỤC

Trang

Phần 1 MỞ ðẦU i

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài 1

1.2 Mục ñích và yêu cầu 3

1.2.1 Mục ñích 3

1.2.2 Yêu cầu 3

1.3 Ý nghĩa của ñề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tình hình sản xuất và nghiên cứu bông vải 4

2.1.1 Tình hình sản xuất và nghiên cứu bông vải trên thế giới 4

2.1.2 Tình hình sản xuất và nghiên cứu bông vải trong nước 6

2.2 Nghiên cứu khả năng kết hợp, ưu thế lai và ứng dụng trong chọn tạo giống bông lai 9

2.2.1 Khả năng kết hợp và ưu thế lai 9

2.2.3 Một số ñặc ñiểm chính của giống bông lai F1 11

2.3 ða dạng di truyền và ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng .12

2.3.1 ða dạng di truyền 12

2.3.2 Chỉ thị phân tử 12

3.3.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng 13

2.3.4 Một số chỉ thị phân tử ứng dụng ñể nghiên cứu ña dạng di truyền thực vật 15

2.3.4.1 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphims) - ða hình ñộ dài các ñoạn cắt hạn chế 15

2.3.4.2 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphims)- ða hình ñộ dài các ñoạn nhân chọn lọc 15

2.3.4.3 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphims) - ða hình các ñoạn ADN nhân ngẫu nhiên 16

2.3.4.4 SSR (Simple Sequence Repeats) - đa hình các lặp lại ựơn giản 16

2.3.5 Ứng dụng chỉ thị SSR trong chọn tạo giống bông 17

2.3.5.1 Cơ sở khoa học ứng dụng chỉ thị SSR ựánh giá ựa hình bông vải 17

2.3.5.2 Một số thành tựu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng 17

2.3.5.3 Một số thành tựu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống bông vải 21

Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Vật liệu nghiên cứu 25

3.1.1 Giống bông: 25

3.1.2 Mồi (primers) và các vật tư khác 25

3.2 Thời gian nghiên cứu 26

3.3 địa ựiểm nghiên cứu 26

3.4 Nội dung nghiên cứu 26

3.5 Phương pháp nghiên cứu 26

3.5.1 đánh giá các ựặc ựiểm hình thái của các giống bố mẹ 26

3.5.2 đánh giá ựa dạng di truyền của các giống bố mẹ theo các chỉ thị phân tử SSR 27

3.5.2.1 Chuẩn bị mẫu, tách chiết ADN 27

3.5.2.2 Phương pháp PCR-SSR 27

3.5.3 Tạo các tổ hợp lai cho ựánh giá khả năng kết hợp và ưu thế lai theo kiểu lai ựỉnh (top cross) 27

3.5.4 đánh giá khả năng kết hợp và ưu thế lai của các tổ hợp lai với các khoảng cách di truyền khác nhau 27

3.6 Kỹ thuật canh tác và BVTV 28

3.7 Chỉ tiêu theo dõi 28

3.7.1 Theo dõi chỉ tiêu trong phòng 28

3.7.2 Theo dõi chỉ tiêu ngoài ựồng 28

3.7.2.1 Thời gian sinh trưởng 28

3.7.2.2 đặc ựiểm hình thái 28

3.7.2.3 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 29

3.7.2.4 Chất lượng xơ bông 29

3.7.2.5 Tình hình sâu bệnh hại 29

3.8 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 29

Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Kết quả ñánh giá ña dạng di truyền các chỉ thị hình thái và nông sinh học của các giống bố mẹ 32

4.1.1 Một số ñặc ñiểm hình thái chính của các giống bố mẹ 32

4.1.2 Thời gian sinh trưởng và một số ñặc ñiểm thực vật học chính 34

4.1.3 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các giống bố mẹ 37

4.1.4 Chất lượng xơ của các giống bố mẹ 39

4.1.5 Phân nhóm di truyền giữa các giống bố mẹ 42

4.2 Kết quả ñánh giá ña dạng di truyền các giống bố mẹ bằng chỉ thị SSR 51

4.2.1 Tách chiết ADN và chọn lọc mồi ñánh giá ña hình 51

4.2.2 Phân tích ña dạng di truyền dựa vào hệ số di truyền và cây phát sinh chủng loại 53

4.3 Phân tích khả năng kết hợp và ưu thế lai của một số tổ hợp lai trên các tính trạng nghiên cứu chính 57

4.3.1 Khả năng kết hợp chung (GCA) của các giống bố mẹ 57

4.3.2 Khả năng kết hợp riêng (SCA) của các tổ hợp lai tham gia thí nghiệm 59

4.3.3 Phương sai các thành phần biến ñộng 61

4.3.4 Ưu thế lai trên một số tính trạng nghiên cứu chính của các tổ hợp lai 62

4.3.4.1 Ưu thế lai tính trạng số quả/m2 và khối lượng quả 62

4.3.4.2 Ưu thế lai trên tính trạng năng suất và tỷ lệ xơ 64

4.3.4.3 Ưu thế lai trên các tính trạng ñộ dài xơ và ñộ bền xơ 67

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 70

5.1 Kết luận 70

5.2 ðề nghị 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

PHẦN PHỤ LỤC 82

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Tình hình sản xuất bông của thế giới trong những năm gần ñây……… 4 Bảng 2.2 Tình hình sản xuất bông của Việt Nam giai ñoạn 2001-2010 6 Bảng 4.1 Một số ñặc ñiểm hình thái của các giống bố mẹ, Ninh Thuận năm

Bảng 4.8 Trình tự, tổng số phân ñoạn nhân ñược và số ñoạn ña hình của các cặp mồi nghiên cứu……… 52 Bảng 4.9 Khả năng kết hợp chung của các giống bố mẹ trên các tính trạng nghiên

cứu chính, Ninh Thuận năm 2010 (Kiểm ñịnh 4 x 6, Kempthorn, 1957)

………58

Bảng 4.10 Khả năng kết hợp riêng của các tổ hợp lai F1 trên các tính trạng nghiên cứu

chính, Ninh Thuận năm 2010 (Kiểm ñịnh 4 x 6, Kempthorn, 1957) ……….60

Bảng 4.11 Bảng phân tích phương sai các thành phần biến ñộng trên các tính trạng

nghiên cứu chính, Ninh Thuận năm 2010 (Kiểm ñịnh 4 x 6 Kempthorm, 1957)….61

Bảng 4.12 Ưu thế lai trên tính trạng số quả/m2 và khối lượng quả, Ninh Thuận năm 2010………63

Bảng 4.13 Ưu thế lai trên tính trạng năng suất và tỷ lệ xơ, Ninh Thuận năm

2010……… 65

Bảng 4.14 Ưu thế lai trên các tính trạng ñộ dài xơ và ñộ bền xơ, Ninh Thuận năm 2010……… 66 Bảng 4.15 Thời gian sinh trưởng và ñặc ñiểm thực vật học của các tổ hợp lai có triển vọng, Ninh Thuận năm 2010……… 67

Bảng 4.16 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các tổ hợp lai có triển vọng, Ninh Thuận năm 2010……… 68

Bảng 4.17 Chất lượng xơ của các tổ hợp lai có triển vong, Ninh Thuận năm 2010

……… 68 Bảng 4.18 Một số chỉ tiêu sâu bệnh hại của các tổ hợp lai có triển vọng, Ninh Thuận năm 2010……….68

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 4.1 Phân nhóm di truyền của các giống bố mẹ theo chỉ thị hình thái………44

Hình 4.2a Một số hình ảnh về vườn ñánh giá ña dạng di truyền theo chỉ thị hình

Hình 4.3 Kết quả ñiện di ADN tổng số……….51

Hình 4.4 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR-SSR với cặp mồi CIR165 trên agarose 3% 51 Hình 4.5 Phân nhóm di truyền của các giống bố mẹ theo chỉ thị phân tử………55

Phần 1 MỞ ðẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây bơng (Gossypium malvacearum L.) là cây lấy sợi quan trọng nhất được

xếp vào vị trí hàng đầu trên thế giới bởi những đặc tính tự nhiên của nĩ như mềm, xoăn tự nhiên, giữ nhiệt tốt…Bởi thế bơng vải là loại cây trồng khơng thể thay thế mặc dù cĩ sự cạnh tranh cao của sợi tổng hợp nhân tạo Hiện nay, trên tồn thế giới

cĩ khoảng hơn 80 quốc gia trồng bơng với diện tích từ 30 - 35 triệu ha/năm; trong

đĩ cây bơng được trồng nhiều nhất ở Ấn ðộ, Trung Quốc, Mỹ, Pakistan, Uzbekistan, Brazin, Thổ Nhĩ Kỳ… (ICAC, 2011) [45]

Ở Việt Nam, cây bơng là cây trồng cĩ lịch sử lâu đời và là cây lấy sợi quan trọng phục vụ cho nhu cầu may mặc nội địa và xuất khẩu nên được ðảng và Nhà nước quan tâm đầu tư phát triển Từ năm 1995, nhờ cĩ các tiến bộ kỹ thuật và đổi mới về phương thức quản lý sản xuất nên sản xuất bơng tăng mạnh, cao nhất là niên vụ 2002 - 2003 đạt 32.267 ha, niên vụ 2003 - 2004, diện tích bắt đầu giảm sút ðến niên vụ 2006 - 2007, diện tích giảm mạnh cịn 17.300 ha (chỉ bằng 50% diện tích năm 2002 - 2003) và hiện nay vụ 2009 - 2010 chỉ cịn 10.470 ha [22] ðứng trước tình hình đĩ, lãnh đạo nhà nước và Tập đồn Dệt may Việt Nam coi việc khơi phục và phát triển sản xuất cây bơng nhằm tự chủ một phần nguyên liệu xơ bơng là một trong các nhiệm vụ quan trọng hàng đầu Ngành bơng cần tập trung đẩy mạnh xây dựng các vùng bơng chuyên canh cĩ tưới nhằm tăng năng suất và chất lượng bơng xơ; đồng thời tăng cường cơng tác nghiên cứu khoa học phục vụ phát triển sản xuất bơng

Hiện nay, phần lớn diện tích sản xuất bơng trong nước chủ yếu sử dụng các giống bơng lai (chiếm khoảng 90%) Cơng tác nghiên cứu sử dụng ưu thế lai trên cây bơng trong nước bắt đầu từ những năm 1980 và phĩng thích giống lai đầu tiên L18 năm 1995 Từ đĩ đến nay, 3 thế hệ giống lai đã được đưa vào sản xuất; lần lượt từ thế hệ 1 gồm L18, VN20 và VN35 (cĩ ưu thế lai cao về sinh trưởng và năng

suất, phẩm chất xơ ựạt yêu cầu); ựến thế hệ 2 gồm VN15 và VN01-2 (cải tiến tắnh kháng sâu xanh, rầy xanh và phẩm chất xơ); và sang thế hệ 3 gồm VN04-3, VN04-

4 và VN04-5 (cải tiến tỷ lệ xơ và phẩm chất xơ) Các giống lai này ựã góp phần tăng năng suất lên 1,5 ựến 2,0 lần (0,6 - 0,7 tấn/ha lên 1,0 - 1,2 tấn/ha) Tuy nhiên, trong công tác chọn tạo giống bông hiện nay chủ yếu sử dụng các phương pháp chọn lọc bố mẹ dựa trên di truyền số lượng và chỉ thị hình thái để tạo ra ựược các giống ựáp ứng ựược các yêu cầu sản xuất dựa vào các phương pháp trên ựòi hỏi phải tiến hành trên quy mô lớn, tốn nhiều thời gian và chi phắ Hơn nữa, sử dụng các chỉ thị hình thái trong công tác ựánh giá nguồn vật liệu cho công tác lai tạo còn mang tắnh chủ quan và các tắnh trạng số lượng thường bị biến ựộng lớn do tác ựộng của các ựiều kiện ngoại cảnh nên hiệu quả chọn lọc chưa cao Trong khi ựó, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng ựã mang lại nhiều thành quả cao cho sản xuất nông nghiệp Nhiều giống cây trồng ựược tạo ra bằng việc ứng dụng công nghệ sinh học như lúa, ngô, ựậu tương, cà chuaẦTrong ựó, sử dụng các chỉ thị phân tử khác nhau như AFLP, SSR, STS, RADP, RFLPẦựể ựánh giá mức ựộ ựa dạng di truyền và xác ựịnh mối quan hệ giữa các giống cây trồng là một trong những phương pháp phổ biến làm cơ sở cho việc chẩn ựoán các cặp lai cho ưu thế lai Trong ựó, chỉ thị SSR là chỉ thị ựược sử dụng khá phổ biến, có mức ựa hình cao và kết quả ựáng tin cậy trong nghiên cứu ựa dạng di truyền

Tuy nhiên, việc ứng dụng các chỉ thị này phục vụ cho công tác nghiên cứu lai tạo giống cây trồng ở Việt Nam còn chưa ựược quan tâm nhiều ựặc biệt là trên cây bông Do ựó, ựể nâng cao hiệu quả cho công tác chọn tạo giống bông nói chung

và giống bông ưu thế lai nói riêng, việc ứng dụng chỉ thị phân tử như một công cụ

hỗ trợ ựể nâng cao hiệu quả chọn lọc là một yêu cầu cấp thiết Xuất phát từ ựó,

chúng tôi thực hiện ựề tài Ộđánh giá ựa dạng di truyền tập ựoàn công tác các

giống bông phục vụ chọn tạo giống bông ưu thế laiỢ

- đánh giá nguồn vật liệu bố mẹ bằng chỉ thị hình thái

- Tiến hành PCR-SSR, xác ựịnh khoảng cách di truyền và lựa chọn các tổ hợp lai với các khoảng di truyền khác nhau

- đánh giá khả năng kết hợp và ưu thế lai của các tổ hợp lai với các khoảng cách di truyền khác nhau

1.3 Ý nghĩa của ựề tài

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình sản xuất và nghiên cứu bông vải

2.1.1 Tình hình sản xuất và nghiên cứu bông vải trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới có khoảng hơn 80 quốc gia sản xuất bông vải với diện tích hằng năm khoảng 30 - 35 triệu ha, tập trung chủ yếu ở các nước có ñiều kiện khí hậu nhiệt ñới và á nhiệt ñới Trong gần 10 năm trở lại ñây, diện tích trồng bông toàn cầu biến ñộng trong khoảng 30 - 35 triệu ha với sản lượng bông xơ khoảng 20

- 25 triệu tấn/năm Tổng giá trị sản xuất bông ñạt 21 tỷ USD/năm, trong ñó các nước ñang phát triển chiếm khoảng 70% giá trị Sản xuất bông ở khu vực Châu Á chiếm khoảng 65% sản lượng toàn cầu, Châu Mỹ Latinh khoảng khoảng 19%, Châu Phi chiếm <5% (ICAC, 2011) [45]

Bảng 2.1 Tình hình sản xuất bông của thế giới trong những năm gần ñây

Ghi chú: (*): Số liệu niên vụ 2010/2011 ước tính (Nguồn: ICAC 3/2011)

Hiện tại, diện tích trồng bông trên thế giới có xu hướng chững lại, ổn ñịnh trong khoảng 33 triệu ha Tuy nhiên, năng suất bông xơ có xu hướng tăng từ 6,4 tạ/ha vào năm 2001 lên 7,26 tạ/ha vào năm 2010; theo ñó, sản lượng bông xơ không giảm mà có xu hướng tăng lên Theo tính toán của ICAC (2011) [45], tuy sản lượng bông ước tính trong niên vụ 2010/2011 ñạt 25,1 triệu tấn nhưng vẫn còn thấp hơn so với nhu cầu của thế giới (ước tính 27,4 triệu tấn) - còn thiếu hụt khoảng 5% Chính vì vậy, giá bông tăng liên tục từ 2004 ñến nay, hiện ñạt mức 1,68

USD/kg bông xơ

Tính ñến niên vụ 2009/2010, Trung Quốc là nước ñứng ñầu thế giới về sản lượng bông xơ (6,85 triệu tấn), ñứng thứ hai là Ấn ðộ (trên 5 triệu tấn), Mỹ (2,6 triệu tấn), Pakistan (trên 2 triệu tấn), Brazil (khoảng 1,2 triệu tấn), (ICAC, 2011) [45]

Theo thống kê của Bộ nông nghiệp Mỹ, trong số các nước sản xuất bông ñứng ñầu thế giới thì Trung Quốc và Ấn ðộ là các nước có năng suất bông ñạt mức khá cao Năng suất bông hạt bình quân chung của các quốc gia này ñạt mức từ 22 -

23 tạ/ha Các nước khác như Uzbekistan và Thổ Nhĩ Kỳ có năng suất bông cũng ở mức cao [77]

Trên thế giới, Ấn ðộ là quốc gia ñi tiên phong khai thác và sử dụng các giống bông ưu thế lai với mục ñích thương mại Ngay từ năm 1970, giống bông lai H4 ñã ñược ñưa vào sản xuất tại Ấn ðộ; kể từ ñó, nhiều giống bông lai mới lần lượt

ra ñời và việc sử dụng các giống bông lai trong sản xuất gia tăng rất nhanh chóng Nghiên cứu khai thác ưu thế lai trên cây bông rất thành công ở Ấn ðộ, nhiều giống bông lai cùng loài hoặc khác loài ñã chứng tỏ ưu thế lai về khả năng cho năng suất, tính thích nghi, ñặc biệt là ưu thế lai về chất lượng xơ bông Hiện tại, Ấn ðộ là một trong những nước ñứng ñầu thế giới về sản xuất bông vải, hơn 40% diện tích sản xuất bông của Ấn ðộ ñược trồng bằng các giống lai kinh tế Diện tích sản xuất hằng năm chiếm khoảng 21% diện tích sản xuất của thế giới, sản lượng chiếm khoảng 12% Mặc dù giá thành hạt giống bông lai còn cao hơn hạt giống bông thuần, nhưng các giống bông lai cho năng suất cao hơn (năng suất bông xơ bình quân khoảng 0,8 tấn/ha) nên vẫn ñược sử dụng rộng rãi trong sản xuất (Bhagirath Choudhary và Gaurav Laroia, 2001) [32]

Theo Hsu và Gale (2001) [41], ICAC (2011) [45], Trung Quốc cũng là một

trong các quốc gia ñứng ñầu thế giới về sản xuất và tiêu thụ bông vải với ña phần diện tích sản xuất sử dụng chủ yếu là các giống bông lai (khoảng 50% diện tích) Việc sản xuất hạt giống bông lai ở Trung Quốc ñược tiến hành chủ yếu bằng phương pháp lai thủ công với chi phí sản xuất và chế biến cho 1 ha giống lai F1 khoảng từ 11.000 -

12.000 USD (tương ñương 180 - 200 triệu VND); với giá bán 1 kg hạt giống bông lai thương mại trong nước của Trung Quốc khoảng 9,8 USD (tương ñương 155.575VND), (Hezhong Dong và cộng sự, 2005) [39]

2.1.2 Tình hình sản xuất và nghiên cứu bông vải trong nước

Về năng suất, do phụ thuộc quá lớn về thời tiết nên năng suất bông trồng nhờ nước trời không ổn ñịnh Có thể nói trong 7 năm qua năng suất bông không tăng, dao ñộng khoảng 10 - 11 tạ/ha Riêng ở vụ 2004 và 2005, năng suất có giảm (8,3 - 8,8 tạ/ha) do thời tiết quá khắc nghiệt Trong khi ñó, năng suất ngô (cây trồng cạnh tranh chính với bông) tăng ñều ñặn mỗi năm 140kg/ha ðể cạnh tranh ñược, với cây ngô (giá ngô và bông trên thị trường tương ứng là 4.700 ñồng/kg và 11.000 ñồng/kg), năng suất là 4 tấn/ha thì năng suất bông bình quân phải ñạt trên 2 tấn/ha, con số này khó ñạt ñược cho bông vụ mưa Riêng ñối với bông có tưới, năng suất trong 7 năm qua tăng liên tục, từ 9,9 tạ/ha niên vụ 2001-2002 lên 15,01 tạ/ha niên

vụ 2003-2004 và hiện nay ñạt bình quân 20 tạ/ha, nhiều hộ ñạt 30 - 35 tạ/ha [22]

Bảng 2.2 Tình hình sản xuất bông của Việt Nam giai ñoạn 2001-2010

Niên vụ Diện

tích (ha)

Năng suất (kg/ha)

Diện tích (ha)

Năng suất (kg/ha)

Diện tích (ha)

Năng suất (kg/ha)

Sản lượng bông hạt (tấn)

2001-02 24.112 1.101 2.654 994 26.766 1.091 29.190 2002-03 28.931 981 3.334 1.278 32.265 1.011 32.627 2003-04 19.316 1.148 4.317 1.501 23.633 1.212 28.650 2004-05 18.647 875 1.613 1.891 20.260 955 19.358 2005-06 21.390 832 1.708 2.024 23.098 920 21.254 2006-07 14.145 1.039 1.300 2.000 15.445 1.120 17.300 2007-08 6.830 900 616 1.951 7.446 983 7.324 2008-09 8.171 1.170 500 1.980 8.671 1.216 10.550

Nguồn: Công ty Bông Việt Nam

Về diện tích, từ năm 1995, nhờ có các tiến bộ kỹ thuật và ñổi mới về phương thức quản lý sản xuất nên sản xuất bông tăng mạnh, cao nhất là niên vụ 2002-2003 ñạt 32.267 ha, vụ 2003-2004, diện tích bắt ñầu giảm sút ðến vụ 2006-2007, diện

tích giảm mạnh còn 17.300 ha (chỉ bằng >50% diện tích năm 2002-2003) và hiện

nay vụ 2009/2010 chỉ còn 8.000 ha [23] Theo Công ty Bông Việt Nam [22], thực

trạng trên là do nhiều nguyên nhân, chủ yếu là: i)- Năng suất thấp nhưng giá mua bông hạt lại thấp; ii)- Khí hậu, thời tiết thay ñổi thất thường ñối với vụ bông trồng nhờ nước trời (khoảng 90% diện tích); iii)- Những hạn chế về kỹ thuật và lao ñộng; iv)- Một số hạn chế trong thực hiện các dự án quy hoạch phát triển bông và v)- Chính sách chưa khuyến khích sản xuất bông phát triển

Ở Việt Nam, nghiên cứu sử dụng ưu thế lai trên cây bông bắt ñầu vào những năm 1980 ðến năm 1986, một số con lai khác loài (Luồi x Hải ñảo) ñã ñược lai tạo

và thử nghiệm, trong ñó nổi bật nhất là tổ hợp lai MCU9 x Menoufi Giống này có

ưu thế lai cao về năng suất và phẩm chất xơ nhưng không thích nghi với ñiều kiện

ẩm ñộ cao của Việt Nam nên tỷ lệ hạt lép cao và nhiễm bệnh giác ban nặng, do ñó giống này không phổ biến cho sản xuất

Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả trong nước ñã khẳng ñịnh các giống lai khác loài cho ưu thế lai cao về năng suất và chất lượng xơ Phan Thanh Kiếm (1990) [11] cho rằng các con lai khác loài (bông Luồi x bông Hải ñảo) thường có ưu thế lai cao về mặt năng suất, di truyền tính trạng chiều dài xơ rất cao

và trội hoàn toàn hoặc siêu trội

Từ những năm 1990 trở ñi, Việt Nam kết hợp nhập nội và thử nghiệm một số giống bông lai từ Ấn ðộ, Trung Quốc, Úc, Mỹ ñồng thời ñẩy mạnh nghiên cứu

sử dụng ưu thế lai, chủ yếu tập trung vào các giống lai cùng loài bông Luồi hirsutum) Kết quả sử dụng giống bông lai nhập nội như Bioseed 7 và các giống lai

(intra-nội ñịa ñầu tiên như L18, VN20 và VN35 thành công trong sản xuất ñã góp phần

mở rộng diện tích ñáng kể và tăng năng suất từ 1,5 - 2,0 lần (0,6 - 0,7 tấn/ha lên 1,0

- 1,2 tấn/ha) Mặt khác, sử dụng hệ thống sản xuất hạt giống lai theo phương pháp thủ công hiện tại ñã cơ bản ñáp ứng ñược nhu cầu hạt giống với chất lượng ñảm bảo cho sản xuất trong nước, giảm ñáng kể chi phí khi phải nhập khẩu hạt giống bông lai từ nước ngoài

Trong những năm gần ñây, việc nhập nội nhiều vật liệu có nguồn gen quý như kháng sâu, kháng rầy, chất lượng xơ tốt ñã giúp cho công tác nghiên cứu chọn tạo giống bông ở trong nước có nhiều bước ñột phá mới Nhiều giống bông lai mới (cùng loài bông Luồi) lần lượt ra ñời và ñược ứng dụng vào sản xuất, ñáp ứng cơ bản

và kịp thời nhu cầu ña dạng hoá bộ giống sản xuất trên nhiều vùng sinh thái trồng bông của Việt Nam Trong những giống tạo ñược nổi bật nhất là 3 giống bông lai VN15, VN01-2 và VN02-2 Các giống bông lai này bên cạnh có khả năng cho năng suất với ưu thế lai khá cao (20 - 30%) chúng còn có khả năng kháng sâu xanh tốt Trong ñó, giống VN01-2 bên cạnh có khả năng kháng sâu xanh tốt còn kết hợp ñược khả năng kháng rầy xanh chích hút; giống VN02-2 kết hợp ñược khả năng kháng sâu xanh và kháng thuốc trừ cỏ Chính nhờ việc áp dụng nhanh những tiến bộ về giống,

kỹ thuật canh tác, bảo vệ thực vật ñã góp phần rất quan trọng giúp cho sản xuất bông hàng hoá trong nước có những bước ñột phá Hiện tại, diện tích sản xuất bông của Việt Nam hàng năm dao ñộng từ 25 - 30 nghìn ha, tăng gần 2 lần so với thời ñiểm 1997 Các giống mới ñã có vai trò quan trọng trong việc ổn ñịnh sản xuất, tăng năng suất và sản lượng bông ñồng thời cải thiện ñáng kể về mặt chất lượng xơ sợi (Viện nghiên cứu và Phát triển cây bông năm 2004, 2005) [27] [28]

Kết quả nghiên cứu và chọn tạo giống bông trong những năm gần ñây ñã xác ñịnh ñược nhiều giống bông lai có triển vọng, kết hợp ñược nhiều ñặc tính quan trọng như có khả năng cho năng suất cao, kháng ñược một số loài sâu bệnh ñồng thời cho chất lượng xơ bông tốt Trong ñó nổi bật nhất là các giống bông lai mới VN04-3, VN04-4 và VN04-5 Kết quả khảo nghiệm và sản xuất thử trong năm

2003 ñã ñược ñánh giá cao tại Hội ñồng Khoa học Công ty bông Việt Nam (tại thành phố Hồ Chí Minh, 8/2004) (Viện nghiên cứu và Phát triển cây bông năm

2004) [27], do ñó các giống bông lai mới này nhanh chóng ñược công nhận ñưa vào phục vụ sản xuất

Hiện nay, việc sản xuất hạt giống bông lai ở nước ta cũng giống như Trung Quốc nhưng giá thành thấp hơn, giá 1kg hạt giống bông lai thương mại trong nước

hiện nay khoảng 8,2 USD rẻ hơn Trung Quốc 1,6 USD Mặt khác, chi phí hạt giống cho sản xuất bông ở Việt Nam hiện nay khoảng 40,9 USD/ha (thấp hơn Trung Quốc từ 10 - 20 USD/ha) Bên cạnh ñó, việc sử dụng các giống bông lai trong sản xuất ở Việt Nam trong những năm qua ñã chứng tỏ những ñặc ñiểm ưu việt của nó

so với các giống bông thuần như ưu thế lai về năng suất cao hơn 20 - 30%; khả năng kháng sâu bệnh cải thiện ñáng kể, qua ñó giảm chi phí phòng trừ sâu bệnh 1/3 lần; các ñặc tính về chất lượng xơ ñược cải thiện rất nhiều ñáp ứng yêu cầu về phẩm chất xơ sợi cho công nghiệp Dệt trong nước Do ñó, việc sản xuất và sử dụng hạt giống bông lai trong nước là một yêu cầu không thể thiếu, hợp lý và có cơ sở

Tuy nhiên, chọn tạo giống bông lai ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sử dụng phương pháp lai truyền thống mất nhiều thời gian, công lao ñộng và hiệu quả chưa cao Ngày nay, việc ứng dụng công nghệ sinh học nói chung và việc chọn giống bằng marker phân tử nói riêng ñã mang lại hiệu quả lớn trong công tác chọn giống cây trồng Chính vì thế, với ñiều kiện hiện nay việc nghiên cứu sử dụng kết hợp phương pháp chọn giống theo phương pháp truyền thống và chỉ thị phân tử là yêu cầu cấp thiết của các nhà chọn giống

2.2 Nghiên cứu khả năng kết hợp, ưu thế lai và ứng dụng trong chọn tạo giống bông lai

2.2.1 Khả năng kết hợp và ưu thế lai

Các giống cây trồng ñều có khả năng truyền lại cho ñời sau những ñặc tính của mình thông qua sự phối hợp các ñặc tính ñó ở trong các tổ hợp lai Vì thế, trong công tác lai tạo giống, nếu xác ñịnh ñược bố mẹ có khả năng kết hợp cao sẽ mang lại hiệu quả cao hơn bố mẹ có khả năng kết hợp thấp

Sparaque G.F và Tatum L.A (1942) [72] lần ñầu tiên ñưa ra khái niệm về khả năng kết hợp chung (genaral combining ability - GCA) và khả năng kết hợp riêng (specific combining ability - SCA) GCA biểu thị khả năng di truyền tính trạng của giống trong các tổ hợp lai, ñược xác ñịnh bằng ñộ lệch trung bình của giống ñó ở trong tất cả các tổ hợp lai so với trung bình chung của toàn bộ bố mẹ

SCA biểu thị khả năng thể hiện tính trạng của từng cặp lai cụ thể, ñược xác ñịnh bằng ñộ lệch tính trạng của từng cặp lai ñó so với GCA của hai bố mẹ

Xét về bản chất di truyền, Sparaque G.F và Tatum L.A (1942) [72] cho rằng GCA ñặc trưng cho hiệu quả cộng tính của các gen (additive effect), SCA ñặc trưng cho hiệu quả trội (dominance effect) và các dạng tương tác gen khác locus (epistasis)

Griffing (1956) [37], Kemptorn (1957) [51] và nhiều tác giả cho rằng phương sai khả năng phối hợp chung bao gồm cả phương sai do hiệu quả cộng tính

và phương sai do dạng tương tác giữa cộng với cộng (additive x additive); còn phương sai khả năng phối hợp riêng bao gồm hiệu quả tính trội và hai dạng tương tác giữa cộng với trội (additive x dominance) và trội với trội (dominance x dominance) khi có sự tương tác allele khác locus

Nhiều công trình nghiên cứu về khả năng kết hợp trên các giống cây trồng ñều thừa nhận sự biến ñộng của GCA và SCA phụ thuộc vào nguồn thực liệu nghiên cứu và môi trường thí nghiệm Thường ít gặp mối quan hệ chặt chẽ giữa GCA với giá trị tính trạng của giống, vì hiệu quả của GCA bao gồm cả hiệu quả của gen trội; ngược lại GCA chỉ tương tác chặt với giá trị trung bình của các tổ hợp lai mà giống ñó tham gia (Jagtap, 1985 [49]) Thông thường SCA ñạt hiệu quả cao nhất ở dạng kết hợp giữa bố mẹ có GCA cao với GCA cao (Jagtap, 1985 [49]); Trần Thanh Hùng, 1995 [9])

Các kết quả nghiên cứu về sự di truyền các tính trạng ở cây bông cho thấy, các tính trạng hình thái như màu sắc, ñộ lông trên lá phụ thuộc nhóm di truyền chất lượng, do một số ít gen quy ñịnh, ít chịu ảnh hưởng bởi ñiều kiện ngoại cảnh tức là có hệ số di truyền cao Các tính trạng như thời gian sinh trưởng, năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất, trọng lượng hạt, tỷ lệ xơ, chất lượng xơ thuộc nhóm di truyền số lượng, do kết quả tác ñộng của nhiều gen hợp thành, cho nên chịu ảnh hưởng rất lớn của ñiều kiện môi trường và có hệ số di truyền không cao (Ximogulian, 1987 [20]; Nguyễn Hữu Bình (1990) [1])

Theo nguyên tắc chung, từ kết quả phân tích phương sai, người ta cĩ thể dự đốn tính chất ưu thế lai của con lai F1 Matzinger và Kempthone (1957) [51] đã kết luận rằng :

“Ước đốn phương sai của GCA cĩ quan hệ đến phương sai do hoạt động của gen cộng tính và các ảnh hưởng của tương tác khơng alen kiểu [i] Phương sai của SCA cĩ quan hệ đến phương sai do hoạt động của gen khơng cộng tính và các ảnh huởng của tương tác khơng alen kiểu [j] và [i] ðây là điều kiện tạo ra giá trị ưu thế lai F1”

Ưu thế lai là hiện tượng phổ biến ở nhiều loại cây trồng Trên cây bơng, ưu thế lai về sinh trưởng và năng suất lần đầu tiên được cơng bố bởi Mell (1984, dẫn theo McGregor, 1967) [59]; sau đĩ, Shull (1908), dẫn theo Basu và Paroda, 1994) [30] là người đặt nền tảng cho khái niệm hiện đại về ưu thế lai Theo Moffett (1983) [60], xác nhận cĩ thể khai thác ưu thế lai về mặt thương mại đối với các con lai bơng Luồi x bơng Hải đảo

Ưu thế lai là hiện tượng con lai cĩ sức sống mạnh hơn bố mẹ, hoặc cả cơ thể cây lai, hoặc từng cơ quan bộ phận của cây lai sinh trưởng, phát triển nhanh, mạnh hơn, cĩ tính chống chịu cao hơn, phẩm chất tốt hơn bố mẹ

2.2.3 Một số đặc điểm chính của giống bơng lai F1

Giống lai F1 là giống được tạo ra do giao phối giữa hai giống bố mẹ, mang được nhiều đặc tính tốt của bố mẹ Ở đời thứ nhất, con lai được tạo ra cĩ ưu thế về sinh trưởng, phát dục, tính chống chịu và kết quả giống F1 cĩ năng suất cao hơn bố (mẹ) cho năng suất cao nhất, phẩm chất tương đương hoặc cao hơn bố mẹ

Thơng thường các con lai cùng lồi H x H cĩ thể cho năng suất tăng từ 30 - 60%, thậm chí tăng gấp 2 - 3 lần bơng thường Ở Ấn ðộ, bình quân năng suất bơng lai trên tồn quốc gấp 1,5 - 1,6 lần bơng thường

Nhìn chung các giống ưu thế lai F1 cĩ xu hướng làm tăng chiều dài xơ (khoảng 9%), tăng độ bền xơ (6 - 7%), chống chịu tốt, sinh trưởng mạnh, các tính trạng khác giữ nguyên hoặc cĩ phần cải tiến

Trong giai ựoạn ựầu cây mọc nhanh, ựều, khỏe Giai ựoạn trước khi nở hoa cây to khỏe, nhiều cành la, lá dày Với mật ựộ thưa 20 - 25 ngàn cây/ha cây phát triển cân ựối, bón nhiều phân nhưng không bị lốp, duy trì bộ lá lâu Ưu ựiểm này ựã làm cho giống F1 có năng suất rất cao, có cơ hội ựể thâm canh tăng hiệu quả trồng

trọt (Phan Thanh Kiếm, 1998) [11]

2.3 đa dạng di truyền và ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng

2.3.1 đa dạng di truyền

đa dạng di truyền là sự thể hiện phong phú ở mức ựộ gen Các gen ựa hình là nguyên nhân dẫn ựến sự tồn tại các kiểu gen dị hợp trong quần thể Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể cho phép các quần thể này thắch nghi hơn quần thể khác khi chịu những thay ựổi của môi trường

đa dạng di truyền là cơ sở ựể tạo nên ưu thế lai Trong một chừng mực nhất ựịnh, nếu tắnh ựa dạng di truyền giữa các bố mẹ càng lớn thì ưu thế lai càng cao

Nghiên cứu ựa dạng di truyền có ý nghĩa rất lớn trong chọn giống đó là nhân

tố giúp cho sinh vật di truyền ựược nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thắch nghi với những thay ựổi của ựiều kiện ngoại cảnh (La Tuấn Nghĩa, 2004) [13]

2.3.2 Chỉ thị phân tử

Chỉ thị di truyền là một thuộc tắnh hay một ựặc ựiểm có thể ựo ựếm ựược và có khả năng di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Theo Paterson và cs, 1991 [64] một ựặc ựiểm ựược coi là chỉ thị di truyền nhất thiết phải ựảm bảo hai tiêu chuẩn: (i) phải khác biệt giữa bố và mẹ; (ii) phải ựược truyền lại chắnh xác cho thế hệ sau

Các nhà nghiên cứu di truyền và chọn giống luôn quan tâm ựến chỉ thị di truyền vì tắnh ưu việt của nó trong việc nghiên cứu sự kế thừa dấu hiệu di truyền và những biến ựổi của chúng trong quần thể, ựặc biệt là các tắnh trạng nông sinh học

có lợi cho con người Chỉ thị di truyền cho phép phát hiện sự sai khác về mặt thông tin di truyền giữa hai hay nhiều cá thể Sự sai khác này có thể ựược phát hiện bằng

các chỉ thị như: chỉ thị sinh hóa, chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử… Những chỉ thị này từ lâu ñã là những công cụ hữu hiệu trong chương trình chọn giống

Chỉ thị sinh hóa là loại chỉ thị có bản chất là ña hình protein gồm isozyme và các loại protein dự trữ Những chỉ thị phân hóa chỉ thể hiện ở những giai ñoạn nhất ñịnh của quá trình phát triển cá thể tùy vào cơ chế phức tạp của sự ñóng mở gen

Cơ chế này ñược ñiều chỉnh bởi vật chất di truyền là ADN Một protein có mặt trong cơ thể sinh vật dù ở giai ñoạn nào của phát triển cá thể thì cũng chỉ là sản phẩm của gen thông qua dòng thông tin di truyền từ ADN - ARN - Protein Tuy nhiên, do có số lượng không nhiều và phụ thuộc vào các giai ñoạn phát triển của cá thể nên chỉ thị sinh hóa hạn chế về mặt ứng dụng

Chỉ thị hình thái là loại chỉ thị có thể nhìn thấy và ño ñếm ñược; chúng ñược

sử dụng như là một chỉ thị di truyền và dễ dàng nhận biết ñược ở dạng trội lặn Tuy nhiên, chỉ thị hình thái chịu ảnh hưởng của quá trình tương tác gen, ñiều kiện ngoại cảnh và chỉ thể hiện ở những giai ñoạn nhất ñịnh của quá trình phát triển cá thể (Bùi Chí Bửu và cs, 1995) [6] Vì thế, cần kết hợp chỉ thị hình thái và các chỉ thị khác nhằm mang lại hiệu quả cao trong quá trình chọn giống

Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị có bản chất ña hình ADN, nó có thể là một ñoạn gen hoặc một ñoạn ADN có vị trí xác ñịnh trên nhiễm sắc thể (NST) di truyền theo quy luật Menden

Trong những năm gần ñây, các chỉ thị phân tử ñã ñược ứng dụng rất lớn trong nghiên cứu hệ gen của nhiều loại cây trồng Các nhà khoa học ñã thiết lập ñược bản

ñồ chi tiết về các chỉ thị phân tử liên kết với các tính trạng Trên cơ sở ñó tiến hành chọn lọc gián tiếp trên các chỉ thị này, ñây ñược gọi là phương pháp chọn lọc dựa

vào chỉ thị ADN – Marker Assisted Selection (MAS) (Phan Hữu Tôn, 2004) [17]

3.3.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng

Trước ñây, việc ứng dụng các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng ñã ñược nhiều nhà chọn giống quan tâm và sử dụng, nó ñược xem như một phương tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới Tuy nhiên,

việc ứng dụng còn gặp nhiều hạn chế Vì thế chỉ thị phân tử ra ñời ñã trở thành công

cụ ñắc lực hổ trợ phương pháp truyền thống, giải phóng cho các nhà chọn giống một lượng lớn công việc khi phải tiến hành chọn lọc Các nhà khoa học ñã nghiên cứu và ñưa ra những ưu thế của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái như sau:

1 Chỉ thị phân tử có thể xác ñịnh kiểu gen của các locus tại bất kỳ giai ñoạn nào và bất cứ mức ñộ nào (tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể)

2 Số lượng các chỉ thị ADN là rất lớn, trong khi ñó số lượng các chỉ thị hình thái rất hạn chế

3 Các alen khác nhau thường không liên kết với các hiệu ứng có hại, trong khi việc ñánh giá các chỉ thị hình thái thường hay ñi kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn

4 Các alen của các chỉ thị phần lớn là ñồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào Các alen của các chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội - lặn, do ñó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai

5 ðối với chỉ thị hình thái các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc ñánh giá các cá thể trong quần thể phân ly Trong khi ñó, chỉ thị phân tử hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất ít gặp

Ngày nay, phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử là một phương pháp hữu hiệu trợ giúp ñắc lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở ngại mà chọn giống truyền thống không hoặc rất khó giải quyết Ngoài ra, phương pháp này còn giúp ta chọn lọc những cá thể mang những tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ các nhiễu do các tương tác trong cùng alen hay giữa các alen gây ra

Gần ñây, các nhà khoa học ñã phân tích cặn kẽ một số mô hình MAS Theo

ñó, chỉ cần trải qua 3 - 4 thế hệ chứ không phải 6 - 8 thế hệ (ngay cả khi quần thể chọn giống có kích thước nhỏ và các dữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế) là có thể ñạt ñược mục tiêu của mình (Frey và cs, 2004) [35]

2.3.4 Một số chỉ thị phân tử ứng dụng ñể nghiên cứu ña dạng di truyền thực vật

2.3.4.1 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphims) - ða hình ñộ dài các ñoạn cắt hạn chế

RFLP là kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai acid nucleic dựa trên sự

phân cắt ADN bằng các enzyme giới hạn (Restriction enzymes) và kỹ thuật lai

ADN với mẫu dò Kỹ thuật này tạo nên các ñoạn cắt khác nhau ñược phân biệt bằng ñiện di ñồ, các ñoạn cắt ñược gọi là “dấu vân tay” ñặc trưng cho từng phân tử ADN Ở thực vật, chỉ thị này lần ñầu tiên ñược áp dụng trong nghiên cứu gen tổng hơp ARN ribosome trong vùng cấu trúc nhân của lúa mỳ Từ ñó chỉ thị này ñược ứng dụng ñể lập bản ñồ di truyền trên một số ñối tượng khác như cà chua, ngô, lúa (Leister và cs, 1999) [52]

Chỉ thị RFLP là chỉ thị ñồng trội, có khả năng biểu hiện trong tất cả các alen của cùng một locus gen Vì thế, có thể phân biệt các cá thể ñồng hợp tử (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa), ñây là ñặc ñiểm ưu việt của chỉ thị RFLP Tuy nhiên, kỹ thuật RFLP vẫn còn nhiều hạn chế do lượng mẫu lớn, kỹ thuật phức tạp, thời gian kéo dài và ñầu tư trang thiết bị kỹ thuật lớn

2.3.4.2 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphims)- ða hình ñộ dài các ñoạn nhân chọn lọc

Chỉ thị AFLP là sự khuếch ñại có chọn lọc các ñoạn ADN ñược cắt bởi enzyme giới hạn AFLP phát hiện ña hình qua sự khác nhau về ñộ dài của các ñoạn ADN ñược nhân lên Kỹ thuật này linh hoạt, có thể phát hiện ñược sự có mặt của những mảnh cắt giới hạn trong bất kỳ loại ADN nào

Kỹ thuật này có nhiều ưu ñiểm như cho ñộ ña hình cao, lượng ADN tổng số tiêu tốn rất ít, dễ dàng lặp lại và có thể phân tích ADN ở bất kỳ nguồn gốc hay mức

ñộ phức tạp nào Tuy nhiên chỉ thị này không có khả năng phân biệt giữa thể ñồng hợp tử và dị hợp tử, kỹ thuật phức tạp và ñòi hỏi ñầu tư trang thiết bị lớn

2.3.4.3 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphims) - ða hình các ñoạn ADN nhân ngẫu nhiên

Chỉ thị RAPD là kỹ thuật ñược dựa trên cơ sở PCR với các ñoạn mồi ñơn có trình tự ngẫu nhiên (10 nucleotid) Sự nhân ADN chỉ xảy ra khi vị trí mồi ở hai ñiểm có sự ñịnh hướng ngược nhau trong khoảng tối ña 2000 base dọc theo nhiễm sắc thể Do mồi ngắn nên phản ứng RAPD sẽ tạo ra nhiều ñoạn ADN có kích thước

và trình tự khác nhau

Kỹ thuật RAPD có nhiều ưu ñiểm như phát hiện ña hình ñáng tin cậy, phương pháp tiến hành ñơn giản, dễ sử dụng, thời gian ngắn, giá thành thấp, sử dụng lượng ADN khuôn ít, không cần trang thiết bị phức tạp Nhưng chỉ thị này không phân biệt ñược thể dị hợp tử, ñộ nhạy của RAPD phụ thuộc nhiều vào ñiều kiện của phản ứng (thành phần phản ứng, nhiệt ñộ gắn mồi ), không chắc chắn các ñoạn có cùng kích thước từ 2 mẫu ADN khác nhau thực sự tạo ra từ cùng một

vị trí trên hệ gen và ñôi khi không lặp lại ñược, ñặc biệt là những cơ thể có bộ gen lớn như lúa mỳ (Devos K M và cs, 1992) [34]

2.3.4.4 SSR (Simple Sequence Repeats) - ða hình các lặp lại ñơn giản

Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) là kỹ thụât khuếch ñại các ñoạn lặp lại ñơn giản còn ñược gọi là phương pháp vi vệ tinh (microsattellite) Các ñoạn lặp lại gồm từ 2 ñến 6 cặp nucleotit ñược lặp ñi lặp lại nhiều lần trong hệ gen ðoạn SSR ñiển hình là ñoạn trình tự gồm 2 - 3 cặp nucleotit, lặp lại từ 9 - 30 lần Các ñoạn trình tự bảo thủ thường dùng trong kỹ thuật SSR là ATT, AT, CTT, CT Các ñoạn lặp lại có kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ theo từng loài, từng giống cây trồng và vật nuôi

Ngay trong một genome cũng có mức ñộ lặp lại ở các nhiễm sắc thể khác nhau Ở các ñộng vật có vú, một ñoạn trình tự lặp lại một vài lần chiếm >50%, còn ñoạn lặp lại hàng trăm nghìn lần chỉ chiếm khoảng 20 - 25% Các ñoạn SSR thường ở vùng gần tâm ñộng hoặc ñầu mút của NST và có vai trò ñiều hoà hoạt ñộng của gen

Kỹ thuật SSR là một loại marker chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại các giống cây trồng, vật nuơi khác nhau trong cùng một lồi động vật hay thực vật Ngày nay sử dụng kỹ thuật SSR để xây dựng bản đồ liên kết, phân lập (gen), xác định quan hệ di truyền giữa các dịng, giống cây trồng, vật nuơi và chẩn đốn cặp lai cho ưu thế lai (C J Bell, 1994 và D Tautz, 1984) [31], [74]

2.3.5 Ứng dụng chỉ thị SSR trong chọn tạo giống bơng

2.3.5.1 Cơ sở khoa học ứng dụng chỉ thị SSR đánh giá đa hình bơng vải

Hệ gen sinh vật Eukaryote cĩ mặt các trình tự nucleotid lặp lại, cĩ kích thước khác nhau đặc trưng cho lồi SSR (Simple Sequence Repeats) gồm 2 - 5 nucleotid lặp lại nhiều lần (TG)n hoặc (AAT) Ở lúa, đã phát hiện các nhĩm GA, GT, CAT, CTT (Z Li, 1999) [53] Các đoạn này được gọi là SSR, STRs (Short Tandom Repeats), SSLPs (Single Sequence Length Polymorphims) và gọi chung là microsatelite (vi vệ tinh) Các đoạn ADN nhắc lại này cĩ trình tự hai đầu rất đặc trưng nên được sử dụng để thiết kế mồi cho PCR Do cĩ sự sai khác về kích thước của các đoạn lặp lại nên kỹ thuật SSR rất thích hợp cho nghiên cứu đa hình, lập bản

đồ và phân lập gen

Cây bơng thuộc chi Gossypium, họ Malvaceae Chi bơng gồm nhiều lồi khác

nhau trong đĩ cĩ 4 lồi bơng trồng phổ biến và rộng rãi khắp nơi trên thế giới

(Gossypium arborium L., Gossypium herbaceum L., Gossypium hirsutum L., Gossypium barbadense L.) Lịch sử phát triển của chi bơng các lồi cĩ sự biến đổi rất

lớn về di truyền, từ nguồn gốc cây lâu năm qua quá trình tiến hố đã hình thành nhiều nhĩm khác nhau (dạng lâu năm, thường niên) Các dạng thường niên cũng phân thành nhiều nhĩm khác nhau từ chín cực sớm đến chín rất muộn và mang nhiều dạng hình khác nhau (dạng lá, độ lơng, màu sắc ) là cơ sở cho chọn giống ưu thế lai

2.3.5.2 Một số thành tựu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng

Trên thế giới

Trong những năm gần đây, với sự phát triển nhanh chĩng của khoa học cơng nghệ nĩi chung và cơng nghệ sinh học nĩi riêng Ứng dụng chỉ thị phân tử đã được

nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong việc ñánh giá mối quan hệ di truyền và lập bản ñồ liên kết gen Qua ñó, ñã tạo ra nhiều giống mới thuộc nhiều loài cây trồng khác nhau, mang các ñặc tính mong muốn phù hợp với nhu cầu của sản xuất

Những nghiên cứu gần ñây sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu ña dạng di truyền của nhiều loại cây trồng khác nhau như lúa, lúa mỳ, cà chua, khoai tây, ñậu tương ñã mang lại nhiều thành công lớn cho các nhà chọn giống Dao Li Cheng

và cs, 2001 [33] ñã sử dụng 28 cặp mồi SSR phân tích 90 giống ñậu ñũa nhân ñược

128 allen với mức tương ñồng di truyền trung bình là 44%

Zhao yong, 2002 [81] phân tích ña dạng di truyền của 23 giống lúa từ 5 quốc gia khác nhau trên thế giới với 16 cặp mồi SSR Kết quả thu ñược số alen trên locus dao ñộng từ 2 ñến 10 (trung bình 5,2) Tương ñồng di truyền của 23 giống lúa dao ñộng từ 0,13 ñến 0,64 Phân tích sơ ñồ hình cây cho thấy 23 giống nghiên cứu ñược phân thành 2 nhóm chính Qua ñó một lần nữa khẳng ñịnh rằng

có thể sử dụng chỉ thị SSR ñể ñánh giá ña dạng di truyền của các giống lúa ở các ñiều kiện sinh thái, ñịa lý khác nhau và mối quan hệ trong phả hệ

Theo Li Z C và cs, 2004 [54] nghiên cứu ña hình của 113 dòng/giống lúa vùng Yunnan ñã ñưa ra kết luận rằng sự ña dạng của loài phụ Japonica cao hơn Indica Trước ñó, Song Z P và cs, 2003 [71] ñã sử dụng 23 cặp mồi SSR phân tích

ña hình của 232 cá thể thuộc 6 quần thể lúa (03 quần thể từ Jiangxi và 03 quần thể

từ Hunan - Trung Quốc) Kết quả thu ñược tổng số 115 alen và các nhà nghiên cứu cho rằng quần thể lúa ở Jiangxi có mức ñộ ña hình cao hơn ở Hunan

Yang Xiaquan và cs, 2005 [78] sử dụng 2 chỉ thị genomic-SSR và EST-SSR

phân tích 3 loài lúa mỳ lục bội gồm 28 common wheat (Triticum aestivum L.), 13 spelt (Triticum spelta L.) và 11 compactum (Triticum compactum Host.) Kết quả

cho thấy ña hình di truyền của các giống common wheat cao nhất tiếp ñến là spelt

và compactum Khoảng cách di truyền giữa các quần thể cao hơn trong cùng quần thể và xu thế tương tự ñược khám phá cho các genome A, B và D Chính vì thế,

spelt và compactum cĩ thể sử dụng làm tập đồn giống cho chọn giống lúa mỳ đặc biệt là tăng cường gen D Qua kết quả này một lần nữa nhĩm tác giả khẳng định rằng chỉ thị EST-SSR là chỉ thị lý tưởng để đánh giá đa dạng di truyền cũng như nghiên cứu nguồn gốc và sự tiến hố cây lúa mỳ

ðối với cây ăn quả, sử dụng kết hợp kỹ thuật SSR và AFLP phân tích đa dạng di truyền của tập đồn giống bưởi chùm cho thấy gần 99,1% của 335 SSR loci, 72% của 343 AFLP loci là đa hình và 9,85 alen/SSR locus được phát hiện Giá trị đa dạng di truyền thay đổi từ 0,1939 đến 0,9073 Tỷ lệ dị hợp tử dao động từ 0,12863 đến 0,28445 Phân tích sơ đồ hình cây cho thấy tập đồn giống bưởi chùm phân thành 8 nhĩm, gồm một số nhĩm chính như nhĩm bưởi Shatain, Wendan và các giống lai Kết quả phân loại cho phép mở rộng các giống bưởi này làm genotyp nền để sử dụng cho mục tiêu chọn giống (Liu Yong và cs, 2005) [57]

Trong nghiên cứu đa dạng di truyền của 19 dịng/giống lúa bố mẹ và con lai

F1 trong sản xuất lúa lai hai dịng bằng chỉ thị phân tử, Nguyễn Văn ðồng và cs,

1999 [7] đã dùng 15 cặp mồi SSR nghiên cứu đa hình Kết quả thu được cho thấy, mức độ đa hình giữa chúng rất lớn, dao động từ 0,06 - 1 Trên cơ sở đĩ tác giả đã lựa chọn và đưa ra tổ hợp lai và TGMS-VN1 x D24 dự đốn cho ưu thế lai cao với khoảng cách di truyền 0,67 - 0,90

Bùi Mạnh Cường và cs, 2003 [21] đã sử dụng chỉ thị RAPD đánh giá 29 dịng ngơ thuần với 60 mồi ngẫu nhiên Kết quả cho thấy khoảng cách di truyền biến động từ 0,47 - 0,77 chứng tỏ giữa các vật liệu nghiên cứu cĩ sự đa hình rất lớn Phân nhĩm ưu thế lai (ƯTL) theo phương pháp PCO (Principal coodinate analysis - Gower, 1966) xác định hai nhĩm chính, tồn tại tương quan tuyến tính dương với r = 0,61 - 0,67 giữa năng suất và khoảng cách di truyền bố mẹ, xác định được 03 tổ hợp lai cĩ năng suất cao hơn bố mẹ từ 9 - 14% Tương tự, Bùi Văn Thắng và cs, 2003 [21] sử dụng kỹ thuật RAPD với 11 mồi ngẫu nhiên đánh giá đa dạng di truyền của tập đồn 33 giống lạc chống chịu bệnh gỉ sắt, thu được 109 phân đoạn ADN, trong đĩ cĩ 66 phân đoạn đa hình (chiếm 60,6%) cho thấy cĩ sự khác biệt di truyền từ 4 - 18% Phân nhĩm theo khoảng cách di truyền cho thấy các giống cĩ cùng vùng địa lý, sinh thái ở cùng nhĩm; cĩ thể chọn làm các bố mẹ phụ

vụ cho cơng tác lai tạo giống

Sử dụng chỉ thị SSR đánh giá đa dạng di truyền của tập đồn 35 giống lạc cĩ phản ứng khác nhau với bệnh héo xanh vi khuẩn Lê Thị Muội và cs, 2005 [12] đã

sử dụng 20 cặp mồi SSR để đánh giá Kết quả cho thấy, cĩ 19 cặp mồi cho đa hình,

hệ số sai khác di truyền giữa các giống khá lớn, dao động từ 12 - 49% Kết quả đã ghi nhận các giống lạc cĩ cùng nguồn gốc hoặc cùng mức độ kháng bệnh đều được xếp vào một nhĩm nhỏ

Ngồi ra, sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu 10 dịng/giống lúa cĩ nguồn gốc khác nhau đã xác định được tương đồng di truyền dao động từ 0,49 - 0,96 Qua kết quả nghiên cứu đã phân loại các giống lúa thành các nhĩm cĩ khoảng cách di truyền khác nhau, đĩ là cơ sở để chọn bố mẹ cho chọn giống lúa lai (Võ Thị Minh Tuyền, 2007) [19]

Trong những năm gần đây, việc sử dụng chỉ thị phân tử ở nước ta tập trung chủ yếu vào các tính trạng kháng sâu bệnh, chống chịu điều kiện bất lợi của mơi trường, các tính trạng chất lượng…

Lưu Ngọc Huyền, 2005 [8] sử dụng 50 cặp mồi SSR xác ñịnh tính kháng rầy nâu ở một số dòng/giống lúa Kết quả ñã xác ñịnh ñược 15 chỉ thị SSR nằm ở NST

số 4 của hệ gen lúa và sử dụng làm chỉ thị trợ giúp ñể chọn lọc các cá thể mang gen kháng rầy nâu Trong khi ñó, Trương Bá Thảo và cs, 2005 [16] phân tích ña dạng

di truyền về tính trạng protein của 50 giống lúa mùa tại 31 loci khác nhau Các SSR

marker có mức ñộ ña hình tốt là RM335, RM272, RM180, RM183 Marker RM234

liên kết với gen ñiều khiển tính trạng hàm lượng protein (GPC) trong gạo ñược xác

ñịnh trên NST số 7 Sự liên kết marker RM234 với gen ñiều khiển GPC cao biểu

hiện ñộ chính xác 93,33% QTL ñiều khiển tính trạng này

2.3.5.3 Một số thành tựu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống bông vải

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, việc ứng dụng các chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống bông ñã ñược nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

Theo Liu và cs, 2000 [55] sử dụng 65 cặp mồi ñể khuếch ñại 70 locus trong genome (nhiễm sắc thể) của các loài bông Kết quả nghiên cứu chỉ thị SSR ñược xác ñịnh trong nghiên cứu này ñã cung cấp những số liệu có mức ñộ tin cậy cao là

cơ sở cho các nghiên cứu khác Hơn nữa, có thể sử dụng kết hợp chỉ thị SSR với các chỉ thị khác ñể lập bản ñồ liên kết của genome bông Thật vậy, gần ñây bản ñồ liên kết ñã ñược tạo ra với sự kết hợp sản phẩm của 199 RAPD và SSR trong chọn lọc giống bông (Ulloa và cs, 2000) [76]

Một số nghiên cứu gần ñây khi sử dụng các chỉ thị như RAPD (random amplified polymorphic DNA), AFLP (amplified fragment length polymorphism) và SSR cho thấy mức ñộ ña hình của các loài bông trồng tương ñối thấp, có thể từ 1 - 3% (Wendel và cs, 1992; Tatineni và cs, 1996; Pilley và Myers, 1999; Lu và Myers, 2002) [80], [73], [66], [58] và 1 - 8% (Multani và Lyon, 1995) [62] Một số kết quả ở Úc, Trung Quốc và Pakistan cũng có kết quả tương tự (Zuo và cs, 2000; Rahman và cs, 2002) [82] [67] Tuy nhiên, một số kết quả khác cho thấy mức ñộ ña hình của các giống bông khá cao M K Rana và K V Bhat, 2005 [69] nghiên cứu

59 giống bông thuộc 4 loài bông trồng cho thấy, ña hình giữa 59 giống bông ñạt 36% Trong ñó, mức ñộ tương ñồng di truyền trung bình của 41 giống bông luồi

(Gossypium hirsutum) ñạt 74%, ñồng thời qua nghiên cứu các tác giả ñã khẳng

ñịnh rằng ña hình giữa các loài nhị bội cao hơn các loài bông tứ bội

Trước ñó, Rahman và cs, 2002 [68] nghiên cứu ña hình của 27 giống bông cho tương ñồng là 66,2% Sử dụng ñồng thời chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử Tatineni và cs, 1996 [73] ñã ñánh giá quan hệ di truyền của 16 giống bông nhập

nội, khẳng ñịnh tương quan tuyến tính dương (r=0,63) giữa khoảng cách di truyền

theo chỉ thị RAPD và khoảng cách phân loại theo chỉ thị hình thái Trong khi ñó, Ivan Schuster và cs, 2006 [47] sử dụng microsatellites nghiên cứu quan hệ di truyền của 53 giống bông, cho kết quả tương quan tuyến tính trung bình ñạt 0,40 ± 0,01 Một số nghiên cứu khác, Iqbal và cs, 1997 [46] xác ñịnh tỷ lệ ña hình 89,1% trong 22 giống bông Luồi; trong ñó, 17 giống phân vào cùng nhóm có tỷ lệ ñồng dạng di truyền 81,5 - 93,4%; chỉ có riêng giống nhị bội mức tương ñồng thấp

(55,7%) so với các giống tứ bội ðối với hai loài bông cỏ châu Phi (G herbaceum)

và bông cỏ châu Á (G arboreum), mức ñộ tương ñồng ñạt 72% ghi nhận trong một

nghiên cứu khác (Rana và cs., 2002) [68]

Trong những năm gần ñây, chỉ thị SSR ñược sử dụng khá phổ biến ñể ñánh giá ña hình và lập bản ñồ gen Jinfa Zhang và cs, 2005 [50] ñã sử dụng 88 cặp mồi SSR nghiên cứu ña hình của 24 giống có nguồn gốc khác nhau ñã thu ñược 177 allen với tương ñồng di truyền dao ñộng từ 0,694 ñến 0,936 (trung bình 0,772)

Ngày nay, nhiều nhà khoa học trên thế giới ñã ứng dụng kết hợp nhiều chỉ thị phân tử ñể ñánh giá ña hình bông Sử dụng chỉ thị RAPD, SSR, EST, AFLP và kết hợp các chỉ thị ñể ñánh giá 11 giống bông (Luồi và Hải ñảo) cho mức ñộ tương ñồng di truyền dao ñộng tương ứng là 63,8 - 95,9%, 13,8 - 98,1%, 70,4 - 98,5%, 13,7 - 99,3% và 78,2 - 98,0%; 11 giống bông ñược phân thành 2 nhóm chính (1 nhóm có 8 giống gồm cả bông Luồi và Hải ñảo, nhóm còn lại gồm 3 nhóm bông Luồi) (Ebtissam H A Hussein và cs, 2007) [44] Tương tự, Hussein và cs, 2002

[42] sử dụng kết hợp các chỉ thị RAPD, SSR, ISSR, AFLP phân tích 13 giống bông

và ñã chứng minh rằng giống bông Luồi (Hindi) ñược tách ra từ các giống bông Hải ñảo ở Ai Cập Trong khi ñó, Samina N Qureshi và cs, 2004 [70] sử dụng chỉ thị EST-SSR nghiên cứu ña hình giữa các loài bông cho thấy ña hình giữa các

giống cùng loài bông Luồi (Gossypium hirsutum L.) là 26%, giữa loài bông Luồi và bông Hải ñảo (Gossypium barbadense L.) là 52%

Tương tự, Wang và cộng sự, 2004 [79] ñánh giá ña hình của 50 giống bông trồng dựa vào chỉ thị EST-SSR, tương quan tuyến tính giữa các giống từ 0,11 ñến 0,83 (trung bình 0,47); các giống phân thành hai nhóm chính và hầu hết ñều phù hợp với phả hệ của các giống bông (nguồn gốc các giống bông) ðiều ñó ñã chứng minh rằng, chỉ thị EST-SSR là công cụ hữu hiệu ñể phân tích, ñánh giá ña hình bông

Sử dụng kết hợp các chỉ thị RAPD, ISSR, SSR Hussein và cs, 2006 [43] ñã ñánh giá 21 giống bông cho kết quả về tương ñồng di truyền tương ứng là 72,1 - 95,7%; 79,1 - 95,0% và 72,1 - 96,6% Trước ñó, các nhà khoa học Trung Quốc ñã nghiên cứu tương quan di truyền của 36 giống bông sử dụng các chỉ thị SSR, ISSR

và RAPD thu ñược mức tương ñồng di truyền của các giống nghiên cứu dao ñộng

từ 57,5 - 92,9% Phân tích sơ ñồ hình cây cho thấy, sử dụng chỉ thị RAPD cho kết quả thành hai nhóm chính, nhóm 1 gồm tất cả các giống thuộc loài bông Hải ñảo ngoại trừ giống PEA (Pima Early American) Tuy nhiên, chỉ thị ISSR và SSR cho kết quả là hai nhóm chính nhưng nhóm 1 gồm các giống bông Hải ñảo và nhóm 2 gồm các giống bông luồi và giống PEA Mặc dù kết quả phân tích hình cây có những khác nhau giữa các chỉ thị nhưng phần lớn vẫn tương ñồng với nhau Những khác nhau ñó có thể là do ảnh hưởng của môi trường của các loài bông hoặc do sự tiến hoá cơ học (Hussein và cs, 2002) [42]

Tóm lại, sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng ñược nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi Nhiều giống cây trồng với các tính trạng khác nhau ñã ñược tạo ra, cơ bản ñáp ứng ñược nhu cầu sản xuất ðối với cây bông, việc ứng dụng chỉ thị phân tử ñánh giá ña hình ñược nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên

cứu và ñạt ñược nhiều kết quả ñáng tin cậy Tuy nhiên trong một số nghiên cứu kết quả thu ñược ñã có sự khác nhau nhưng phần lớn các nhà nghiên cứu ñều cho rằng tương ñồng di truyền ñối với các giống bông Luồi tương ñối cao (0,70 - 0,93),

ña hình của loài nhị bội cao hơn tứ bội

Ở Việt Nam, việc chọn tạo giống bông ñã ñược nghiên cứu từ rất lâu nhưng chủ yếu dựa vào các ñặc ñiểm hình thái (di truyền số lượng) Việc ứng dụng công nghệ sinh học mới ñược quan tâm và bắt ñầu nghiên cứu trong những năm gần ñây theo các hướng như chuyển gen kháng sâu, kháng hạn cho bông, sử dụng các chỉ thị phân tử ñể kiểm tra, ñánh giá sự biểu hiện của gen Tuy nhiên, kết quả chỉ ở mức ñộ trong phòng thí nghiệm

Xuất phát từ thực tế ñó, ñể giải quyết những ñòi hỏi cấp bách về công tác chọn tạo giống bông, ngoài việc sử dụng các phương pháp chọn lọc truyền thống cần tăng cường kết hợp với việc ứng dụng các chỉ thị phân tử ñể nhanh chóng tạo

ra các giống mới phù hợp với nhu cầu sản xuất

Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Giống bông: Gồm 50 mẫu giống bông Luồi có nguồn gốc khác nhau Danh

sách cụ thể như sau:

TT Ký hiệu Mẫu giống Nguồn gốc TT Ký hiệu Mẫu giống Nguồn gốc

7 G7 1306 Zimbabue 32 G32 1646 Trung Quốc

8 G8 1308 Zimbabue 33 G33 1652 Trung Quốc

10 G10 1350 Trung Quốc 35 G35 TL00-34 Việt Nam

11 G11 1356 Nam Mỹ 36 G36 TL00-35 Việt Nam

12 G12 1360 Thái Lan 37 G37 VN36P Việt Nam

13 G13 1392 Indonesia 38 G38 KS02-63 Việt Nam

14 G14 1405 Pháp 39 G39 8-2-4-A2 Việt Nam

15 G15 1410 Pháp 40 G40 8-2-4-A3 Việt Nam

16 G16 1414 Pháp 41 G41 BO4-4-2 Trung Quốc

17 G17 1416 Pháp 42 G42 BO3-5-4 Trung Quốc

18 G18 1422 Pháp 43 G43 Au01 Australia

20 G20 1429 Pháp 45 G45 Bollgard II Mỹ

21 G21 1438 Thái Lan 46 G46 D20-20 Trung Quốc

22 G22 1441 Thái Lan 47 G47 D97-6 Trung Quốc

23 G23 1478 Thái Lan 48 G48 D99-4 Trung Quốc

24 G24 1480 Thái Lan 49 G49 TM1KS Trung Quốc

25 G25 1483 Thái Lan 50 G50 5-3-1 Việt Nam

3.1.2 Mồi (primers) và các vật tư khác

- Sử dụng 20 cặp mồi cho chỉ thị SSR ñược chọn lọc từ tổ hợp 60 cặp mồi sử dụng ñể ñánh giá ña hình ADN (phụ lục 2)

- Các vật tư và dụng cụ cần thiết cho các thí nghiệm

3.2 Thời gian nghiên cứu

Các thắ nghiệm của ựề tài ựược tiến hành từ tháng 11/2009 ựến tháng 5/2011 trong các vụ đông Xuân (bắt ựầu từ tháng 11 - 12 năm trước, kết thúc vào tháng 4 -

5 năm sau) và Hè Thu (bắt ựầu từ tháng 6 - 7, kết thúc vào tháng 11 - 12) đây là các vụ trồng bông chắnh tại Ninh Thuận

3.3 địa ựiểm nghiên cứu

Toàn bộ các thắ nghiệm ựược bố trắ tại Nha Hố, Nhơn Sơn, Ninh Sơn, Ninh Thuận Trong ựó:

- Các thắ nghiệm tách chiết ADN và ựánh giá ựa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR ựược tiến hành tại phòng thắ nghiệm Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học của Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển nông nghiệp Nha Hố

- Các thắ nghiệm: Tạo các tổ hợp lai; ựánh giá khả năng kết hợp và ưu thế lai của các giống bố mẹ ựược tiến hành trên các khu ựất thắ nghiệm của Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển nông nghiệp Nha Hố

3.4 Nội dung nghiên cứu

- đánh giá ựa dạng di truyền của bố mẹ theo các chỉ thị hình thái

- đánh giá ựa dạng di truyền của các giống bố mẹ theo các chỉ thị phân tử SSR

- Phân nhóm bố mẹ, lập sơ ựồ lai, tạo hạt lai theo kiểu lai ựỉnh (4 x 6 tổ hợp + 10 bố mẹ)

- đánh giá khả năng kết hợp của bố mẹ và ưu thế lai của các tổ hợp lai tạo theo sơ ựồ lai ựỉnh (4 x 6 tổ hợp + 10 bố mẹ)

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 đánh giá các ựặc ựiểm hình thái của các giống bố mẹ

- Công thức: 50 mẫu giống bông

- Phương pháp bố trắ: Các mẫu giống bông ựược bố trắ tuần tự không lặp lại; khoảng cách gieo 0,9m x 0,25m x 1cây/hốc; Diện tắch ô: 5,4 m2/bố mẹ

3.5.2 đánh giá ựa dạng di truyền của các giống bố mẹ theo các chỉ thị phân tử SSR

3.5.2.1 Chuẩn bị mẫu, tách chiết ADN

- Chuẩn bị mẫu lá bông: mẫu lá của các giống bông ựược thu từ những cây ựược treo biển ựánh dấu cho vào ống eppendorf 2ml, sau ựó nhanh chóng cho vào nitơ lỏng Mẫu lá ựược dùng ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ -850C

- Tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB

- định lượng ADN tổng số, ADN pha loãng, chuẩn hóa nồng ựộ ADN trên agarose 1,0% và trên máy quang phổ UV/vis

3.5.2.2 Phương pháp PCR-SSR

- Phản ứng PCR ựược thực hiện trên máy PCR iCycler, với thể tắch phản ứng 15ộl, trong ựó chứa các thành phần phản ứng là H2O, 1X PCR buffer, 2,5mM MgCl2, 100ộM dNTPs, 25pM mồi/1 mồi, 25 - 50 ng ADN tổng số và 0,5 - 1U Taq ADN polymerase

- Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR-SSR (1) 950C trong 7 phút, (2) 940C trong

30 giây, (3) 50 - 600C trong 1 phút, (4) 720C trong 1 phút, (5) các bước từ 2 ựến 4 ựược lặp lại là 35 chu kỳ, (6) 720C trong 5 phút, (7) giữ lạnh ở 40C

- điện di sản phẩm PCR trên agarose 3% ở 100V trong 3 giờ Nhuộm gel trong Ethidium Bromide 0,5ộg/ml 15 phút và soi dưới ựèn UV, chụp ảnh

3.5.3 Tạo các tổ hợp lai cho ựánh giá khả năng kết hợp và ưu thế lai theo kiểu lai ựỉnh (top cross)

- Số cặp lai: 24 cặp lai (bao gồm 4 giống mẹ và 6 giống bố)

- Phương pháp bố trắ: các bố mẹ ựược bố trắ tuần tự theo sơ ựồ lai, khoảng cách gieo 0,9m x 0,25m x 1cây/hốc; diện tắch ô: 5,4 m2/bố mẹ

3.5.4 đánh giá khả năng kết hợp và ưu thế lai của các tổ hợp lai với các khoảng cách di truyền khác nhau

- Công thức: 24 con lai và 10 bố mẹ

- Phương pháp bố trắ: khối ựầy ựủ ngẫu nhiên RCBD, nhắc lại 3 lần; khoảng cách 0,9m x 0,25m x 1 cây; mật ựộ: 4,5 vạn cây/ha Diện tắch ô 5,4 m2/công thức

3.6 Kỹ thuật canh tác và BVTV

- Lượng phân bón: 120N, 60P2O5 và 60K2O (kg/ha)

- Các biện pháp chăm sóc và BVTV theo quy trình chung của Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển nông nghiệp Nha Hố

3.7 Chỉ tiêu theo dõi

3.7.1 Theo dõi chỉ tiêu trong phòng

- Chất lượng và nồng ñộ ADN tổng số

- Số phân ñoạn ADN trên mỗi mồi và tổng số phân ñoạn

- Hệ số tương ñồng di truyền của bố mẹ theo chỉ thị hình thái và chỉ thị phân

tử SSR)

3.7.2 Theo dõi chỉ tiêu ngoài ñồng

3.7.2.1 Thời gian sinh trưởng

Thời gian nở hoa (số ngày từ gieo ñến 50% số cây có hoa ñầu tiên nở), thời gian nở quả (số ngày từ gieo ñến 50% số cây có quả ñầu tiên nở)

Theo dõi toàn bộ số cây/công thức/lần lặp

3.7.2.2 ðặc ñiểm hình thái

- Dạng hình cây;

- Thân: màu sắc thân;

- Cành: dạng cành, số cành ñực/cây và cành quả/cây (10 cây/công thức);

- Lá: dạng lá, kích thước lá, màu sắc lá, ñộ lông/lá, tuyến mật và tuyến gossypol;

- Quả: dạng quả, khối lượng quả và khối lượng 100 hạt;

- Hoa: ñốm cánh hoa, màu sắc cánh hoa, màu hạt phấn;

- Chiều cao cây (cm);

- Số cành quả/cây;

- Số cành ñực/cây

- Chiều dài cành quả trung bình

- Vị trí cành quả 1

ðối với các chỉ tiêu chiều cao cây, số cành quả/cây và số cành ñực/cây, chiều

dài cành quả trung bình và vị trí cành quả 1 theo dõi 10 cây/công thức/lần lặp (trừ những cây ñầu hàng); các chỉ tiêu còn lại theo dõi trên toàn bộ hàng; ñánh giá tại

giai ñoạn 50% số cây có quả ñầu tiên nở

3.7.2.3 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất

- Số quả/cây, số quả/m2, khối lượng quả, khối lượng 100 hạt và tỷ lệ xơ

- Năng suất lý thuyết, năng suất thực thu, năng suất bông xơ

Theo dõi toàn bộ số cây/công thức/lần lặp

3.7.2.4 Chất lượng xơ bông

Cách thu mẫu bông hạt ñể phân tích: thu 30 quả/công thức/lần lặp (thu quả ở

vị trí thứ 1 và thứ 2 trên cành quả thứ 4 - 6; chọn quả nở ñều, xơ trắng, không bị dính mưa và bị sâu bệnh hại) và phân tích trên máy HVI

3.8 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

- Các chỉ tiêu về hình thái thu thập theo phương pháp IPGRI và quy phạm khảo nghiệm DUS của ngành bông Số liệu thu thập ñược xử lý bằng phần mềm Excel và MSTATC

- Số liệu về sự xuất hiện của các băng ñiện di theo quy ước có xuất hiện băng (1) và không xuất hiện băng (0) sau ñó ñược xử lý trên phần mềm Excel và NTSYS

pc version 2.1

- Phân tích giữa line x tester theo mô hình Kempthom (1975) [51]