Khả năng kháng viêm của chế phẩm Độc hoạt ký sinh thang LĐ trên chuột nhắt trắng

Độc hoạt tang ký sinh là bài thuốc cổ phương đã được sử dụng nhiều trên lâm sàng và có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng của nó trong điều trị các bệnh lý về xương khớp 15, 19, 20, 65. Dây đau xương là một vị thuốc nam đã được sử dụng rộng rãi trong dân gian để điều trị đau xương1khớp 5, 9, 12. Ở nhiều nước trên thế giới, đã có nghiên cứu về tác dụng của Dây đau xương như kháng viêm, giảm đau, chống loét dạ dày... 23, 25, 36, 41, 57. Chế phẩm viên nang Độc hoạt ký sinh thang LĐ là sự kết hợp bài thuốc Độc hoạt tang ký sinh và Dây đau xương dùng để hỗ trợ điều trị các bệnh lý xương khớp trên lâm sàng, nhưng chưa có nghiên cứu ghi nhận khả năng kháng viêm, giảm đau thật sự của chế phẩm này.

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT III DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC BIỂU ĐỒ VI

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CƠ CHẾ VIÊM, ĐAU 3

1.1.1 Cơ chế viêm 3

1.1.2 Cơ chế đau 4

1.2 CHẾ PHẨM ĐỘC HOẠT KÝ SINH THANG LĐ 5

1.2.1 Thành phần 5

1.2.2 Tác dụng dược lý theo YHCT 6

1.2.3 Tác dụng dược lý theo Y học hiện đại 7

1.2.4 Một số công trình nghiên cứu về khả năng kháng viêm, giảm đau 12

1.3 MÔ HÌNH GÂY VIÊM, ĐAU THỰC NGHIỆM 14

1.3.1 Mô hình gây viêm 14

1.3.2 Mô hình gây đau 19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 23

2.1.1 Chế phẩm nghiên cứu 23

2.1.2 Thuốc đối chứng 23

2.1.3 Hóa chất 23

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 23

2.1.5 Động vật thí nghiệm 24

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Độc tính cấp 24

2.2.2 Đánh giá khả năng kháng viêm cấp bằng mô hình gây phù chân chuột với carrageenan 26

2.2.3 Đánh giá khả năng kháng viêm mạn bằng mô hình cấy viên cotton 28

2.2.4 Đánh giá khả năng giảm đau bằng mô hình gây đau quặn với acid acetic 29

2.2.5 Đánh giá khả năng giảm đau bằng mô hình mâm móng 30

2.3 XỬ LÝ SỐ LIỆU THỰC NGHIỆM 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 32

3.1 KẾT QUẢ 32

3.1.1 Độc tính cấp 32

3.1.2 Khả năng kháng viêm trong mô hình gây phù chân chuột với carrageenan 33 3.1.3 Khả năng kháng viêm trong mô hình cấy viên cotton 37

3.1.4 Khả năng giảm đau trong mô hình gây đau quặn với acid acetic 41

3.1.5 Khả năng giảm đau trong mô hình mâm nóng 44

3.2 BÀN LUẬN 46

3.2.1 Độc tính cấp của ĐHLĐ 46

3.2.2 Khả năng kháng viêm của ĐHLĐ 46

3.2.3 Khả năng giảm đau của ĐHLĐ 49

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

4.1 KẾT LUẬN 53

4.1.1 Khả năng kháng viêm của ĐHLĐ 53

4.1.2 Khả năng giảm đau ĐHLĐ 53

4.2 KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO A PHỤ LỤC K PHỤ LỤC 1 MÔ HÌNH GÂY PHÙ CHÂN CHUỘT VỚI

CARRAGEENAN K PHỤ LỤC 2 MÔ HÌNH CẤY VIÊN COTTON P PHỤ LỤC 3 MÔ HÌNH GÂY ĐAU QUẶN VỚI AICID ACETIC U PHỤ LỤC 4 MÔ HÌNH MÂM NÓNG X

Chế phẩm Độc hoạt ký sinh thang LĐ

Độc hoạt ký sinh thang LĐ liều 450mg/kg

Độc hoạt ký sinh thang LĐ liều 560mg/kg

Độc hoạt ký sinh thang LĐ liều 750mg/kg

Liều tối đa không gây chết

Liều tối đa gây chết 100 % chuột

Trọng lượng

Meloxicam liều 8 mg/kg

Số lượng chuột trong mỗi lô thí nghiệm

Thuốc kháng viêm không steroid

Prostaglandin

Số thứ tự

Thời gian phản ứng với nhiệt của chuột trước thí nghiệm

Thời gian phản ứng với nhiệt của chuột sau uống thuốc 30 phút Thời gian phản ứng với nhiệt của chuột sau uống thuốc 90 phút Tumor necrosis factor: Yếu tố hoại tử khối u

Thể tích chân chuột trước thí nghiệm

Thể tích chân chuột sau gây viêm 3 giờ

Thể tích chân chuột sau gây viêm 5 giờ

Thể tích chân chuột sau gây viêm 24 giờ

Y học cổ truyền

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độc tính cấp đường uống 32

Bảng 3.2 Thể tích chân chuột 33

Bảng 3.3 Độ phù chân chuột 34

Bảng 3.4 Mức độ giảm phù chân chuột so với lô chứng 36

Bảng 3.5 Trọng lượng chuột 37

Bảng 3.6 Tác dụng của ĐHLĐ trên trọng lượng u hạt (sau sấy khô) 38

Bảng 3.7 Trọng lượng chuột trước và sau thí nghiệm 40

Bảng 3.8 Số cơn đau quặn sau tiêm acid acetic 41

Bảng 3.9 Tác dụng của ĐHLĐ lên thời gian phản ứng với nhiệt 44

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ (%) độ phù chân chuột sau tiêm carrageenan 35

Biểu đồ 3.2 Trọng lượng u hạt sau sấy khô 39

Biểu đồ 3.3 Số cơn đau quặn sau tiêm acid acetic 42

Biểu đồ 3.4 Thời gian phản ứng với nhiệt 45

MỞ ĐẦU

Ở nước ta hiện nay, bệnh cơ xương khớp đang ngày càng chiếm một tỉ

lệ đáng kể trong tổng số các bệnh Theo thống kê của Bộ Y Tế về cơ cấu bệnh tật và tử vong trên toàn quốc năm 2014, bệnh của hệ cơ xương khớp và mô liên kết chiếm tỉ lệ mắc 3,85 %, tỉ lệ chết 0,24 %; trong bảng thống kê các bệnh có tỉ lệ mắc cao nhất, các bệnh khác của cột sống đứng hàng thứ 9 với tần suất là 181 ca/100000 dân [4] Một trong những nguyên tắc quan trọng của điều trị bệnh lý xương khớp là điều trị triệu chứng, giảm viêm, giảm đau cho bệnh nhân Những thuốc kháng viêm, giảm đau đang được dùng phổ biến hiện nay, đơn cử là các kháng viêm không steroid (NSAID) ít nhiều đều có tác dụng phụ không mong muốn ở nhiều cơ quan, đặc biệt trên đường tiêu hóa, gan, thận và ngoài da [3], [42] Ở bệnh nhân từ 60 tuổi trở lên, 1/10 bệnh nhân nhập viện là do tác dụng phụ không mong muốn của thuốc, và các NSAID là thuốc liên quan hàng đầu với những trường hợp này [61] Mặc dù các loại thuốc kháng viêm và giảm đau có sẵn rất đa dạng, nhưng tác dụng phụ của chúng và sự kém hiệu quả của một số thuốc trong một số trường hợp đòi hỏi phải tìm kiếm các loại thuốc kháng viêm, giảm đau mới liên tục Như vậy, đánh giá khả năng kháng viêm, giảm đau của các chế phẩm có nguồn gốc thực vật đóng vai trò quan trọng để tìm ra các loại thuốc kháng viêm, giảm đau có hiệu quả và ít độc hại [48] Theo tinh thần đó, thuốc Y học cổ truyền (YHCT) đã và đang được ứng dụng trong điều trị bệnh xương khớp ngày càng nhiều hơn với mong muốn có thể đem lại hiệu quả điều trị và hạn chế các tác dụng không mong muốn

Độc hoạt tang ký sinh là bài thuốc cổ phương đã được sử dụng nhiều trên lâm sàng và có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng của nó trong điều trị các bệnh lý về xương khớp [15], [19], [20], [65] Dây đau xương là một vị thuốc nam đã được sử dụng rộng rãi trong dân gian để điều trị đau xương

khớp [5], [9], [12] Ở nhiều nước trên thế giới, đã có nghiên cứu về tác dụng của Dây đau xương như kháng viêm, giảm đau, chống loét dạ dày… [23], [25], [36], [41], [57] Chế phẩm viên nang Độc hoạt ký sinh thang LĐ là sự kết hợp bài thuốc Độc hoạt tang ký sinh và Dây đau xương dùng để hỗ trợ điều trị các bệnh lý xương khớp trên lâm sàng, nhưng chưa có nghiên cứu ghi nhận khả năng kháng viêm, giảm đau thật sự của chế phẩm này

Nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho chế phẩm để tăng cường sử dụng chế phẩm nói riêng và sử dụng nguồn thuốc nam nói chung trong điều trị bệnh lý xương khớp bằng YHCT, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, “Đánh giá khả năng kháng viêm, giảm đau của chế phẩm Độc hoạt ký sinh thang LĐ trên chuột nhắt trắng”, trả lời cho câu hỏi “Chế phẩm Độc hoạt ký sinh thang

LĐ có khả năng kháng viêm, giảm đau không?”

2 Đánh giá khả năng giảm đau của chế phẩm Độc hoạt ký sinh thang

LĐ trên chuột nhắt trắng trong mô hình gây đau quặn với acid acetic

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CƠ CHẾ VIÊM, ĐAU

1.1.1 Cơ chế viêm

Viêm là phản ứng của hệ miễn dịch đối với nhiễm trùng, tổn thương và liên quan đến các bệnh như viêm khớp, ung thư, xơ vữa động mạch, đột quỵ, động kinh, cũng như các bệnh thoái hóa thần kinh (ví dụ: Bệnh đa xơ cứng, bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson)… [18]

Các nguyên nhân gây viêm như vi khuẩn, các yếu tố vật lý, yếu tố hóa học, yếu tố sinh học; sự hoại tử tổ chức do nghẽn mạch, xuất huyết, viêm tắc động mạch, miễn dịch… sẽ gây tổn thương tế bào làm cho các tế bào mast phóng hạt, hoạt hóa 3 hệ thống protein huyết tương và có sự phóng thích các thành phần từ tế bào bị tổn thương [9]

Các tế bào tham gia quá trình viêm là: Tế bào mast phóng hạt; bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân giữ vai trò thực bào; bạch cầu ái toan giữ vai trò kiềm chế phản ứng viêm Ngoài ra còn có, bạch cầu ái kiềm giữ vai trò như tế bào mast, và tiểu cầu giữ vai trò cầm máu Các tế bào và tiểu cầu thực hiện chức năng với sự hỗ trợ của 3 hệ thống protein huyết tương là: Hệ thống

bổ thể hoạt hóa, hỗ trợ viêm và miễn dịch, đồng thời giữ vai trò quan trọng trong phá hủy tế bào (vi khuẩn, virus…); hệ thống đông máu giữ vai trò bao vây vi khuẩn và tác động qua lại với tiểu cầu chống chảy máu; hệ thống kinin giúp kiểm soát tính thấm thành mạch Globulin miễn dịch là thành phần thứ tư tham gia vào quá trình viêm [9]

Dưới tác động của các nguyên nhân gây viêm, các tế bào mast phóng thích các chất có sẵn bao gồm histamin, chất hóa hướng động bạch cầu trung

tính, chất hóa hướng động bạch cầu ái toan, đồng thời cũng có sự phóng thích serotonin từ tiểu cầu Tế bào mast còn tổng hợp các leucotrien và prostaglandin (PG) tham gia vào quá trình viêm Có 4 loại PG (E, A, F, B) tùy theo cấu trúc, trong đó PG thuộc nhóm E nhất là E1 và E2 gây tăng tính thấm thành mạch, co thắt cơ trơn và dãn tiểu tĩnh mạch sau mao mạch Tuy nhiên, cũng có vài loại PG ức chế viêm, làm giảm phóng thích histamin từ tế bào mast và giảm sự phóng thích các enzym từ lysosom của bạch cầu trung tính [9]

Hai đồng phân của cyclooxygenase (COX), COX-1 và COX-2, đã được xác định COX-1 được cho là chịu trách nhiệm sản xuất các PG trung gian cho các chức năng ‘vệ sinh’, cần thiết cho các hoạt động sinh lý bình thường của cơ thể Trong khi đó, COX-2 cảm ứng được biểu hiện trong các tế bào miễn dịch Acid arachidonic, một acid béo đa không bão hòa, nhờ COX biến thành PG tiền viêm (chủ yếu là PGE2 ) và kích hoạt sản xuất các chemokin, cytokin tiền viêm khác Do đó, chiến lược điều trị viêm có liên quan đến sự

ức chế COX-2, mặc dù điều này hiện đang bị thách thức bởi phát hiện rằng COX-2 dẫn xuất các chất chuyển hóa oxy hóa của acid arachidonic ω-3 trong các đại thực bào được kích hoạt Như vậy, COX-2 có vai trò kép trong khởi đầu và giải quyết quá trình viêm bằng cách tạo ra các hóa chất trung gian tiền viêm và kháng viêm có nguồn gốc từ acid arachidonic ω-6 và ω-3 [18]

1.1.2 Cơ chế đau

Bước đầu tiên trong tiến trình đau phức tạp là sự kích thích của một tác nhân độc hại lên các dây thần kinh đặc biệt có các thụ thể cảm nhận đau Các thụ thể cảm nhận đau này có mặt trong hầu hết các cơ quan và mô cơ thể, được kích hoạt bởi các tác nhân cơ học (sờ chạm hoặc áp lực), nhiệt (nóng hoặc lạnh), hoặc hóa chất (nội sinh hoặc ngoại sinh) Các tác nhân độc hại

kích thích lên các dây thần kinh đặc biệt để đáp ứng với các kích thích mạnh gây tổn thương mô Các thụ cảm thể cơ học, nhiệt và hóa học sẽ phản ứng với các kích thích nhẹ hơn nằm dưới mức gây tổn thương mô [51]

Ngoài các hóa chất ngoại sinh, một số hóa chất nội sinh đã được xác định là có thể kích hoạt các thụ thể cảm nhận đau gồm kali, bradykinin, serotonin, histamin, các PG và một số chất khác Những tác nhân độc hại sau khi kích hoạt các thụ thể cảm nhận đau, sẽ được truyền đi như một điện thế hoạt động dọc theo các dây thần kinh cảm giác Aδ và C từ mô ngoại biên đến sừng sau tủy sống Sau đó các tín hiệu được dẫn truyền qua một hoặc nhiều neuron có sợi trục ngắn bắt chéo qua bên đối diện của tủy sống ở mép trước rồi đi lên não qua đường gai-đồi thị trước bên Tín hiệu đau truyền tới vỏ não gây ra các phản ứng phù hợp đáp lại, phản ứng vận động, phản ứng tâm lý và kích thích hệ thống giảm đau của cơ thể hoạt động [51]

1.2 CHẾ PHẨM ĐỘC HOẠT KÝ SINH THANG LĐ

1.2.2 Tác dụng dược lý theo YHCT

Chế phẩm Độc hoạt ký sinh thang LĐ (ĐHLĐ) có thành phần gồm bài thuốc Độc hoạt tang ký sinh cổ phương và Dây đau xương

Bài thuốc Độc hoạt tang ký sinh

Độc hoạt, Tang ký sinh khu phong, tán hàn, trừ thấp [2], làm Quân [7] Ngưu tất, Đỗ trọng, Thục địa bổ Can, Thận, mạnh gân cốt [2], tương sử với hai vị Độc hoạt, Tang ký sinh nên làm Thần [7] Xuyên khung, Đương quy, Bạch Thược bổ huyết hoạt huyết [2], tương sử với Nhân sâm để ích khí huyết [2], cũng làm Thần [7] Tần giao, Phòng phong phát tán phong hàn thấp [2], tương sử với Tế tân, Quế chi để trừ phong thấp [2], làm Tá [7] Chích thảo bổ trung ích khí, hòa trung, thanh nhiệt giải độc [2], làm Sứ [7]

Bài thuốc có tác dụng: Ích Can Thận, bổ khí huyết, khu phong, thanh nhiệt, trừ thấp, tán hàn, thông kinh hoạt lạc [1], [2] Chủ trị: Cảm nhiễm 3 khí phong, hàn, thấp ở người có cơ địa Can, Thận hư khiến chân tay đau chức, co duỗi khó khăn [7]

Dây đau xương

Tính vị, quy kinh: Vị đắng, tính mát Quy vào kinh Can [1], [5], [12] Công năng, chủ trị: Khu phong trừ thấp, thư cân hoạt lạc, mạnh gân cốt, trị phong thấp tê bại, đau nhức cơ khớp Còn được dùng làm thuốc bổ [9] Dùng ngoài chữa đụng dập, sang chấn, rắn cắn [2]

Như vậy Dây đau xương có tác dụng khu phong, trừ thấp, bổ Can, Thận phù hợp với tác dụng của các vị thuốc trong bài thuốc Độc hoạt tang ký sinh

1.2.3 Tác dụng dược lý theo Y học hiện đại

B đến H [12]

Bảo vệ thần kinh, tạo xương, điều hòa miễn dịch, chống ung thư, bảo

vệ gan, bảo vệ tim mạch, kháng khuẩn, kháng ký sinh trùng, chống oxy hóa, kháng viêm, cải thiện đề kháng insulin, chống loét dạ dày [12], [73]

Tang ký sinh

Herba Loranthi

Coriaria lacton gồm các sesquiterpen lacton:

coriamyrtin, tutin, corianin, và coriatin

Ngoài ra còn có 2 proanthocyanidin, cụ thể

là trimer AC và catechin [13], [56]

(+)-Bảo vệ thần kinh, chống ung thư, điều hòa miễn dịch, lợi tiểu, hạ huyết

áp, chống oxy hoá, kháng virus, chống gây đột biến, bảo vệ gan, bảo vệ thận [13], [56]

Dây đau xương

Caulis Tinosporae

tomentosae

Tinosinesid, tinocordifoliosid,

1-Kháng viêm, giảm đau, điều hòa miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm, chống

eacetyltinospormal, acid 4-hydroxyl-heptadec-6-

synergin, palmatin, diosgenin, daucasterol, columbin, β-setosterol, 20b-hydroxyecdyson, berberin [12], [52]

đái tháo đường, chống ung thư, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, an thần, chống trầm cảm, kháng khuẩn, kháng virus, lợi tiểu, tăng cường hoạt động tình dục, chống sỏi thận, giảm đường huyết, bảo

vệ gan [52], kháng viêm [23], giảm đau [25], chống loét dạ dày [41], [57]

Bạch thược

lactiflorae

Flavonoid, các tannin thủy phân (polyphenol)

monoterpen [45]

virus, kháng khuẩn, chống oxy hoá, giảm đường huyết, chống loét

dạ dày [12], [45]

Tần giao

Radix Gentianae

Isoorientin, kushenol I, kurarinon, gentianin, loganin, acid loganic,

swerosid, entimacrosid, septemfidosid, acid oleanolic, acid ursolic, β-sitosterol, acid 7-methoxyanofinic, acid

Kháng viêm, giảm đau,

khuẩn, hạ áp, kháng ung, an thần [44]

montanic, gentiobios [44]

Thục địa

Radix Rehmanniae

glutinosae praeparata

Catalpol, rehmanniosid A-D ionon glucosid;

maninotrios, D-glucos [12], [33]

Điều hòa miễn dịch, hạ đường huyết, điều trị xuất huyết dạ dày-ruột,

ức chế xơ chai cầu thận [33]

phthalid, acid loganic

và polysaccharid [68]

Bảo vệ gan, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, chống ung thư, kháng xạ, chống bệnh Alzheimer, kháng viêm, giảm đau, chống độc tính nicotin, ức chế sự

co thắt tử cung, ngăn giảm tiểu cầu, kháng nấm, kháng khuẩn, bảo

hệ thần kinh, chống loãng xương, đặc tính estrogen và androgen, bảo vệ gan [29]

Phục linh

Poria cocos

polysaccharid, steroid, amino acid, cholin, histidin [12], [59]

Chống ung thư, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, diệt nấm, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống đái tháo đường, chống tăng huyết áp [59], [67] Phòng phong

tetramethylpyrazin [13], [32]

Bảo vệ tim mạch, ức chế kết tập tiểu cầu, chống huyết khối, bảo vệ thần kinh, bảo vệ gan, chống oxy hóa, kháng viêm, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm, hạ

mỡ máu, chống ung thư [32]

flavonoid, anthraquinon, acid hữu cơ [13], [27]

Điều hòa miễn dịch, bảo

vệ thần kinh, ức chế sự chết theo chương trình của các tế bào thần kinh, duy trì cân bằng trong

kháng đông, kháng kết

tập tiểu cầu, kháng u, chống oxy hóa, kháng virus, chống lão hóa, hạ đường huyết, giảm đau, kháng viêm khớp [27] Đảng sâm

Radix Codonopsis

pilosula

triterpenoid, polyacetylen, flavon,

polysaccharid [12], [26]

Chống ung thư, chống đái tháo đường, chống lão hóa, bảo vệ dạ dày,

ức chế tán huyết, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, bảo vệ tế bào gốc thần kinh [26]

Quế chi

Ramulus Cinnamomi

Cinnamaldehyd, coumarin, tinh dầu [60]

Kháng viêm, chống oxy hóa, chống ung thư,

khuẩn, kháng ấu trùng,

hạ sốt, chống tân sinh mạch, chống nhồi máu

và bảo vệ tế bào thần kinh, chống bệnh tiểu đường, chống H pylori bảo vệ dạ dày, chống dị ứng, ức chế tổng hợp melanin [13], [60]

Cam thảo

Radix Glycyrrhizae

Triterpenoid, flavonoid [72]

Kháng viêm [72], kháng

vi khuẩn, chống oxy hóa, chống ung thư, điều

hòa miễn dịch, bảo vệ gan, bảo vệ tim, bảo vệ

dạ dày [12], [47]

Tế tân

Herba Asari

cường hướng tế bào gốc tủy xương đến vùng tiêu điểm [71]

1.2.4 Một số công trình nghiên cứu về khả năng kháng viêm, giảm đau

1.2.4.1 Bài thuốc Độc hoạt tang ký sinh

1 Chen Chao Wei, Sun Jian, Li Yu Mei, Shen Pi An, và Chen Yong Qiang (2011) đã nghiên cứu tác dụng bài thuốc ĐHTKS đối với sự thoái hóa sụn khớp trên mô hình thỏ gây viêm dây chằng chéo trước khớp gối 30 con thỏ bị viêm dây chằng chéo trước khớp gối sau gây viêm 6 tuần được chia thành 6 nhóm: Nhóm cho uống ĐHTKS liều 0,923 g/kg/ngày, 2 nhóm uống osaminethacin và 3 nhóm không điều được điều trị gì, sẽ bị giết để kiểm tra sau 6 tuần Kết quả sau 4 tuần cho thấy ĐHTKS có tác dụng điều trị đáng kể viêm khớp ở thỏ, thông qua cơ chế ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào sụn, và điều chỉnh sự biểu hiện của VEGF (yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch máu) và HIF1 (yếu tố cảm ứng tình trạng thiếu oxy trong sụn alpha) [17]

2 Chen Yan, Li Jin Long, Li Qiang, Wang Teng Teng, Xing Lian Ping,

Xu Hao, Wang Yong Jun, Shi Qi, Zhou Quan, và Liang Qian Qian (2016) nghiên cứu tác dụng kháng viêm trong viêm khớp dạng thấp có liên quan đến thúc đẩy tuần hoàn bạch huyết ở chuột biến đổi gen TNF (yếu tố hoại tử khối

u) 3 tháng tuổi với viên ĐHTKS liều 12 g/kg/ngày Kết quả sau 12 tuần cho thấy ĐHTKS ức chế mức độ nghiêm trọng của viêm, kích thích sự hình thành cách mạch bạch huyết và làm tăng tuần hoàn bạch huyết ở chuột biến đổi gen TNF Như vậy ĐHTKS là một thuốc đầy hứa hẹn cho điều trị viêm khớp dạng thấp [20]

3 Wang Jir You, Chen Wei Ming, Wen Che Sheng, Hung Shih Chieh, Chen Pei Wen, và Chiu Jen Hwey (2017) nghiên cứu tác dụng của ĐHTKS và Xuyên Khung đối với sự hình thành tế bào xương và lão hóa tế bào gốc trung

mô ở người Nghiên cứu trong ống nghiệm cho thấy ĐHTKS và Xuyên Khung có thể thúc đẩy hoạt động tạo xương thông qua kích hoạt tín hiệu SMAD 1/5/8 và ERK (kinase đáp ứng tín hiệu ngoại bào) để tăng biểu hiện gen BMP2 và RUNX2 trong tế bào gốc trung mô ở người Ngoài ra, chúng còn làm trì hoãn quá trình lão hóa của tế bào gốc trung mô người [65]

4 Chen Wen Jin và Wang Jian Wei (2017) nghiên cứu khả năng kháng viêm của gentianin, một chất chiết từ bài thuốc ĐHTKS, trên mô hình viêm khớp do FCA (Adjuvant-Induced của Freund) ở chuột nhắt Kết quả nghiên cứu cho thấy, gentianin có khả năng kháng viêm nhờ làm suy giảm các cytokin bao gồm interleukin-6, interleukin-1 beta và TNF-α (yếu tố hoại tử khối u alpha) Ngoài ra, phân tích cho thấy gentianin có thể làm tăng biểu hiện của các đường dẫn tín hiệu Rho/NF-κB (yếu tố nhân kappa B) cũng như các đường dẫn truyền TGF-β (yếu tố tăng trưởng chuyển hóa-beta)/smad-3 [19]

1.2.4.2 Dây đau xương

1 David Punitha, Madathupatti Ramanathan Udhayasankar, Uthaman Danya, Karuppanan Arumugasamy, và Adi Shalimol (2013) nghiên cứu tác dụng khác viêm của diosgenin, hoạt chất đặc trưng phân lập từ Dây đau

xương, trên mô hình gây phù chân chuột nhắt trắng với carrageenan 1 % ở các liều khác nhau Kết quả ở liều diosgenin 400 μg/kg thể trọng cho thấy khả năng kháng viêm tối đa (82,25 %) Như vậy, nghiên cứu ủng hộ việc sử dụng các thành phần có hoạt tính sinh học từ Dây đau xương để điều trị viêm [23]

2 Guggilla Sandhyarani and Praveen Kumar (2014) nghiên cứu khả năng giảm đau của chiết xuất ethanol từ lá Dây đau xương trên mô hình gây đau bằng kẹp đuôi và gây đau quặn với acid acetic ở chuột Kết quả cho thấy, trong mô hình kẹp đuôi chuột, khả năng giảm đau cao nhất và kéo dài nhất ở liều 500 mg/kg và duy trì trong thời gian dài hơn khi so sánh với diclofenac

10 mg/kg; trong mô hình đau quặn với acid acetic, liều 500 mg/kg có khả năng giảm đau hơn liều 250 mg/kg, nhưng không có tác dụng bằng diclofenac liều 10 mg/kg [25]

1.3 MÔ HÌNH GÂY VIÊM, ĐAU THỰC NGHIỆM

1.3.1 Mô hình gây viêm

Dưới đây là các mô hình gây viêm thực nghiệm thường dùng

1.3.1.1 Gây phù bàn chân chuột bằng kaolin [14]

Dùng chuột cống trắng

Trước thí nghiệm, cho chuột uống nước cất 0,5 mg/100g thể trọng Gây phù bàn chân chuột bằng cách tiêm vào bề mặt gan bàn chân sau chuột 0,1 mg dịch treo chứa 1 g kaolin trong 10 ml dung dịch có 0,2 % gôm adragan, được pha chế ngay trước khi tiêm, vì nếu để lâu kaolin sẽ lắng xuống Thuốc thí nghiệm nếu cho uống thì uống 1 giờ trước khi tiêm kaolin; nếu tiêm thì tiêm

30 phút trước khi tiêm kaolin

Chỉ tiêu đánh giá: Đo thể tích bàn chân sau tới khớp cổ chân bằng một dụng cụ đo thể tích trước và 5 giờ sau tiêm kaolin (thời điểm phù chân chuột

ở mức cao nhất) Khả năng kháng viêm của thuốc sẽ được đánh giá bằng khả năng ức chế phù bàn chân chuột

Khó khăn khi thực hiện: Phải dùng chuột cống

1.3.1.2 Tạo ban đỏ gây bởi tia tử ngoại ở chuột lang [14]

Dùng chuột lang, cân nặng tối thiểu 300 g

Cạo lông thật kỹ một bên cột sống (xén rồi bôi nước làm rụng lông), 4 giờ sau thực hiện thí nghiệm Chuột được giữ ở tư thế nằm sấp cách 30 cm với đèn tử ngoại 400 Watt, chiếu tia kéo dài 30 phút; 2 giờ sau ban đỏ ở mức tối đa và trông rõ Ngày tiếp theo, tiếp tục chiếu tia tử ngoại ở bên kia của cột sống, cho thuốc thí nghiệm vào cơ thể chuột qua ống thông dạ dày hoặc dùng đường trên da

Chỉ tiêu đánh giá: Mức độ viêm được đánh giá bằng cách đo diện tích ban đỏ trên da Thuốc có khả năng kháng viêm sẽ làm giảm diện tích vùng da

có ban đỏ

Khó khăn khi thực hiện: Phải dùng chuột lang Việc chọn chất làm rụng

lông rất quan trọng; một số chế phẩm làm rụng lông gây kích thích da ngay cả sau 4 giờ, làm sai lệch sự đánh giá về ban đỏ Cho thuốc vào cơ thể chuột qua ống thông dạ dày hoặc đường bôi

1.3.1.3 Gây phù bàn chân chuột với carrageenan

Dùng chuột nhắt hoặc chuột cống

Dùng carrageenan 1 % tiêm vào lòng bàn chân sau bên phải để gây phù bàn chân chuột Các dấu hiệu ban đầu của viêm gồm phù nề, nóng, đỏ xuất hiện ngay sau tiêm carrageenan Độ phù chân chuột đạt tối đa khoảng 3-4 giờ sau gây viêm và giảm hết sau khoảng 24 giờ [21], [70]

Chỉ tiêu đánh giá: Đo thể tích chân chuột để đánh giá mức độ gây viêm Khả năng kháng viêm của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế phù bàn chân chuột [70]

Thuận lợi khi thực hiện: Đây là mô hình thí nghiệm khả năng kháng

viêm cấp kinh điển, với ưu điểm đơn giản, thuận tiện, thời gian tiến hành nhanh, khả năng tái lặp cao [70] Có thể dùng chuột nhắt

Hơn nữa, sự ức chế viêm do carrageenan gây ra đã được chứng minh là

có khả năng dự đoán rất cao hoạt động kháng viêm của các thuốc điều trị viêm ở người và liều lượng các NSAID trong mô hình này tương quan tốt với liều hiệu quả ở bệnh nhân [21]

1.3.1.4 Tạo u hạt bằng tinh dầu thông [14]

Dùng chuột cống trắng

Tiêm vào vùng gian vai, khoảng chỏm xương bả vai chuột 0,5 ml tinh dầu thông Vùng này có mô liên kết dưới da dày đặc và được lót bởi một lớp đáng kể tế bào mỡ ngăn cản sự lan tỏa của chất kích thích Tinh dầu phải tuyệt đối vô khuẩn U hạt được hình thành rõ sau trung bình 8 ngày, khi đó bóc tách u hạt và cân

Chỉ tiêu đánh giá: Trọng lượng u hạt lấy ra Khả năng kháng viêm của thuốc được đánh giá theo nguyên tắc: Thuốc kháng viêm mạn sẽ ức chế sự tạo thành u hạt, thông qua xác định sự thay đổi trọng lượng u hạt sau khi sấy khô đến trọng lượng không đổi

Khó khăn khi thực hiện: Phải dùng chuột cống Yêu cầu kỹ thuật tiêm

chính xác, nếu không có thể gây hoại tử rộng vùng da chung quanh chỗ tiêm, ảnh hưởng kết quả đánh giá

1.3.1.5 Gây viêm khớp thực nghiệm bằng chất bổ trợ Freund [14] Dùng chuột cống trắng, cân nặng khoảng 200 g

Cho chuột uống thuốc thí nghiệm Một ngày sau, đo độ dày bàn chân phải sau của chuột bằng một trắc vi kế qua phần dọc giữa Tiêm vào gan bàn chân phải sau của chuột 0,05 ml chất bổ trợ Freund Chất bổ trợ Freund là hỗn

hợp của vi khuẩn Mycobacterium chết trong parafin lỏng, hoặc dầu khoáng

thực vật, và một số trực khuẩn kháng acid, gây hội chứng kiểu viêm khớp Hỗn hợp vi khuẩn này được sấy khô trong tủ sấy chân không Tiếp tục cho chuột uống thuốc thí nghiệm tới ngày thứ 13, cân thể trọng, đo dộ dày bàn chân phải sau của chuột

Chỉ tiêu đánh giá: Đo độ dày bàn chân đã tiêm chất bổ trợ Freund Mức

độ nghiêm trọng của các tổn thương thứ phát như sưng bàn chân trái sau, sưng các bàn chân trước, sưng tai và sưng đuôi được đánh giá là không, nhẹ, vừa, nặng vừa và nặng Khả năng kháng viêm của thuốc được đánh giá dựa vào mức độ ức chế sự tăng độ dày bàn chân phải sau của chuột

Khó khăn khi thực hiện: Phải dùng chuột cống trắng Mức độ tổn

thương có thể lan rộng gây khó khăn cho việc đánh giá tác dụng, bởi vì ngoài tổn thương nguyên phát, còn có cả những tổn thương thứ phát trên nhiều hệ

cơ quan Khó mua được chất bổ trợ Freund

1.3.1.6 Gây viêm nhiều khớp ở chuột cống trắng bằng chất bổ trợ (chất sáp D) phân lập từ trực khuẩn lao [14]

Dùng chuột cống trắng Wistar, từ 30-90 ngày tuổi (để có tỷ lệ viêm

giờ, tiến triển kín đáo trong 8-9 ngày rồi tăng lên khi xuất hiện viêm nhiều khớp thứ phát Viêm khớp thứ phát đạt mức tối đa giữa các ngày thứ 10 và 15 sau khi xuất hiện, mất đi trung bình sau 1 tháng, để lại những tổn thương dinh dưỡng tiến triển gồm: Phì đại xương, cứng khớp, co rút mô liên kết quanh khớp Bên cạnh đó, có thể kèm tổn thương nội tạng trong một số trường hợp: Tổn thương hệ bạch huyết, tổn thương niêm mạc, mắt, niệu dục, đường tiêu hóa… Cho chuột dùng thuốc thử hằng ngày trong 21 ngày kể từ khi tiêm chất

bổ trợ Ngày thứ 13 xác định hiệu lực của thuốc thí nghiệm

Chỉ tiêu đánh giá: Có 2 cách để giá các biểu hiện viêm nguyên phát và thứ phát Cách 1, xác định chủ quan cường độ đỏ và phù của các khớp ở chi Đánh giá cường độ viêm ở các khớp theo thang điểm từ 0 đến 4 Cụ thể: 0 là trạng thái bình thường, 1 là ban đỏ, 2 là vừa đỏ vừa phù, 3 là viêm tấy giả, 4

là tổn thương hoại tử ở nơi tiêm Chỉ số viêm tối đa là 36 đối với viêm nhiều khớp thứ phát và 16 với viêm khớp nguyên phát Cách 2, đo sự thay đổi độ dày của bàn chân chuột sau tiêm, cũng có 4 mức đánh giá: bình thường, nhẹ, vừa, nặng (chú ý ảnh hưởng của thể trọng chuột) Thuốc có khả năng kháng viêm sẽ làm giảm các biểu hiện viêm trên

Khó khăn khi thực hiện: Tương tự mô hình gây viêm khớp thực nghiệm

bằng chất bổ trợ Freund Phải dùng chuột cống trắng Mức độ tổn thương có thể lan rộng gây khó khăn cho việc đánh giá, bởi vì ngoài tổn thương nguyên phát, còn có cả những tổn thương thứ phát trên nhiều hệ cơ quan Khó mua được chất sáp D

1.3.1.7 Tạo u hạt bằng viên cotton tẩm carrageenan

Dùng chuột nhắt hoặc chuột cống

Cấy dưới da lưng của chuột viên cotton đã tẩm carragenan 1 %, cho chuột uống thuốc thí nghiệm trong 7 ngày Đến ngày thứ 8, viên cotton đã tạo thành u hạt, bóc tách u hạt, sấy khô đến trọng lượng không đổi và cân [30]

Khả năng kháng viêm của thuốc được đánh giá theo nguyên tắc: Thuốc

có khả năng kháng viêm mạn sẽ ức chế sự tạo thành u hạt, thể hiện qua khả năng làm giảm trọng lượng u hạt sau khi sấy khô đến trọng lượng không đổi

so với lô chứng

Thuận lợi khi thực hiện: Viên cotton tẩm carragenan 1 % dễ thực hiện

Viên cotton được tẩm carragenan 1 %, sẽ tạo u hạt lớn, dễ phân tích hơn so với chỉ sử dụng viên cotton không tẩm, sẽ ít có biến đổi về trọng lượng hơn [30] Do đó, kết quả thí nghiệm thu được có độ chính xác cao hơn

Từ những khó khăn và thuận lợi nêu trên của các mô hình thực nghiệm cũng như dựa vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm thực hiện, mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan được chọn để đánh giá khả năng kháng viêm cấp của ĐHLĐ; và mô hình tạo u hạt bằng viên cotton được chọn để đánh giá khả năng kháng viêm mạn của ĐHLĐ

1.3.2 Mô hình gây đau

Để đánh giá khả năng giảm đau của một thuốc trên thực nghiệm, các thí nghiệm thường tiến hành trên động vật được gây đau bằng nhiều phương pháp khác nhau như: Gây đau bằng nhiệt (mâm nóng), gây đau bằng kẹp đuôi, gây đau bằng hóa chất (bradykinin, prostaglandin, acid acetic…) Dưới đây là các mô hình gây đau thực nghiệm thường dùng

1.3.2.1 Mô hình kẹp đuôi chuột [14]

Dùng chuột nhắt trắng

Cho uống thuốc thí nghiệm bằng đường uống, để chuột nhịn đói qua đêm Đặt kẹp, làm bằng cách bọc các gọng của một cái kẹp động mạch trong

cao su mỏng vào gốc đuôi chuột trong 30 giây, điều chỉnh áp lực kẹp vừa đủ

để làm tất cả chuột đều có đáp ứng cố gắng làm bật kẹp ra bằng cách cắn vào kẹp Loại bỏ những chuột không cố gắng liên tục để loại bỏ kẹp trong vòng

15 giây Sau 30 phút, 60 phút, và 90 phút, lặp lại việc kẹp

Chỉ tiêu đánh giá: Thời gian từ lúc kẹp tới lúc chuột bắt đầu cắn làm bật kẹp ra Thuốc có khả năng giảm đau sẽ giúp kéo dài khoảng thời gian này

Khó khăn khi thực hiện: Đòi hỏi kỹ thuật điều chỉnh lực kẹp sao cho

đồng đều giữa các chuột thí nghiệm, khi thực hiện bằng tay khả năng sai số cao

1.3.2.2 Mô hình nhúng đuôi chuột trong nước nóng [14]

Dùng chuột nhắt trắng

Sau tiêm vào màng bụng chuột thuốc thí nghiệm, cho chuột nhắt trắng vào trong các túi cá nhân hình nón làm từ mảnh giấy cứng, đuôi chuột thò ra ngoài; 15 phút sau, giữ chuột để đuôi được nhúng hoàn toàn trong nước có nhiệt độ 58oC

Chỉ tiêu đánh giá: Khoảng thời gian từ khi bắt đầu nhúng đuôi đến khi

có phản ứng điển hình chuột giật mạnh đuôi ra khỏi nước Khả năng giảm đau của thuốc được đánh giá dựa trên mức độ kéo dài khoảng thời gian này

Khó khăn khi thực hiện: Phải dùng chuột cống

1.3.2.1 Mô hình mâm nóng

Mô hình mâm nóng với tác nhân là nhiệt độ để gây đau Dùng chuột nhắt trắng

Thả chuột lên mâm nóng duy trì nhiệt độ khoảng 55oC

Chỉ tiêu đánh giá: Thời gian phản ứng từ lúc thả chuột lên mâm nóng tới khi chuột có biểu hiện liếm chân hoặc đá và nhảy chồm lên Thuốc có khả năng giảm đau sẽ làm kéo dài thời gian phản ứng với nhiệt của chuột

Thuận lợi khi thực hiện: Dùng chuột nhắt Mâm nóng có bộ ổn nhiệt,

tự động duy trì được nhiệt độ ổn định, đo thời gian bằng máy chính xác

Mô hình mâm nóng gây đau bằng kích thích nhiệt trên da là một trong những mô hình phổ biến nhất sử dụng để đánh giá ngưỡng nhận cảm đau [63]

1.3.2.2 Mô hình đo độ đau ở chân chuột [14]

Dùng chuột nhắt

Đặt chuột nhắt trong chuồng với sàn làm bằng các dải kim loại dẫn điện

và có điện áp biết trước Xác định điện áp tối thiểu khiến chuột phát ra một tiếng kêu Ngắt điện áp Thực hiện đo cứ 10 phút/lần trong 1 giờ Sau lần thứ

2 hoặc 3, cho chuột dùng thuốc thí nghiệm, tiếp tục thực hiện 10 phút/lần

Chỉ tiêu đánh giá: Trị số điện áp khiến chuột phát ra tiếng kêu Thuốc

có khả năng giảm đau sẽ làm tăng điện áp cần thiết để chuột phát ra tiếng kêu

Khó khăn khi thực hiện: Tiếng kêu khi chuột bị kích thích có thể bị

nhiễu bởi những tiếng kêu thông thường

1.3.2.3 Mô hình đo độ đau ở trực tràng [14]

Dùng chuột cống trắng

Đặt chuột trong một chuồng nhốt nhỏ, có tấm đồng làm sàn, nối với một cuộn cảm ứng Cực thứ hai của cuộn cảm ứng nối với một điện cực bằng đồng hình trụ đưa vào trực tràng chuột Một vôn kế nhạy cảm với thay đổi 0,1 vôn được nối với các dây dẫn tới cuộn cảm ứng Điện cực ở trực tràng được

cố định tại chỗ bằng cách buộc vào đuôi chuột, sau đó nối dài ra ngoài chuồng

Chỉ số đánh giá: Trị số điện áp khiến chuột phát ra tiếng kêu Thuốc có khả năng giảm đau sẽ làm tăng điện áp cần thiết để chuột phát ra tiếng kêu

Khó khăn khi thực hiện: Tương tự mô hình đo độ đau ở chân, tiếng kêu

khi chuột bị kích thích có thể bị nhiễu bởi những tiếng kêu thông thường

1.3.2.4 Mô hình gây đau quặn với acid acetic

Thuận lợi khi thực hiện: Dễ thực hiện Acid acetic dễ mua, rẻ tiền

Phần lớn các trạng thái đau trên lâm sàng liên quan đến đau phát sinh từ các mô sâu và đau nội tạng Mô hình gây đau quặn với acid acetic là mô hình thường được sử dụng để đánh giá đau nội tạng ở chuột nhắt [49]

Từ những khó khăn và thuận lợi nêu trên của các mô hình gây đau thực nghiệm cũng như dựa vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm thực hiện,

mô hình gây đau quặn với acid acetic và mô hình gây đau bằng mâm nóng được chọn để đánh giá khả năng giảm đau của ĐHLĐ

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

an toàn thực phẩm

Liều sử dụng trên người lớn: 2 viên x 2-3 lần/ngày

Quy cách đóng gói: Viên nang cứng, hộp 3 vỉ x 10 viên

Cho bột thuốc vào trong cốc, thêm nước cất và khuấy đều

2.1.2 Thuốc đối chứng

Meloxicam (Meloxicam 7,5 mg Stada®); liều dùng trên chuột: 8 mg/kg (uống 0,1 ml/10g thể trọng); nghiền viên thuốc meloxicam 7,5 mg trong cối thành dạng bột mịn, pha thêm nước cất

2.1.3 Hóa chất

Carrageenan (Sigma-Aldrich, Mỹ)

Acid acetic (Trung Quốc)

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ

Mâm nóng 35100-Ugo Basile

Máy đo thể tích chân chuột-Ugo Basile

Tủ sấy hiệu Memmert (Đức)

Cân kỹ thuật 4 số BOECO

Cân kỹ thuật 2 số Sartorius

Một số dụng cụ thường quy trong phòng thí nghiệm: Kim uống thốc đầu tù, ống tiêm 1 ml, lồng nuôi chuột, bình hút ẩm…

Một số dụng cụ phẫu thuật: Dao mổ, kẹp mổ, bông, gạc…

2.1.5 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, khỏe mạnh, trọng lượng trung

bình 20-25 g, cung cấp bởi Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh, được nuôi

ổn định 1 tuần trước khi thực hiện thí nghiệm Điều này giúp giữ mức độ căng thẳng của chuột thấp, là yếu tố quan trọng cho sự hình thành một phản ứng viêm tốt [21]

Chuột được nuôi trong các lồng nhựa có kích thước 28x17x14 cm, với cám viên (mua tại Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh), có bổ sung thêm giá đậu xanh, nước uống

Tất cả các thí nghiệm được tiến hành từ 8-16 giờ trong điều kiện ổn định về nhiệt độ và độ ẩm

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Độc tính cấp

2.2.1.1 Nguyên tắc chung

Độc tính cấp đường uống là xác định độc tính cấp của một chất sau khi dùng một liều đơn ngắn hạn qua đường uống Căn cứ vào các dấu hiệu bất thường của động vật thí nghiệm để đánh giá độc tính cấp của chất thí nghiệm [8]

2.2.1.2 Điều kiện thí nghiệm

Thuốc thí nghiệm: ĐHLĐ hòa tan trong nước cất

Chuẩn bị động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng Swiss albino đực và

cái, được nuôi ổn định 1 tuần trước khi thực hiện thí nghiệm, cung cấp đủ thức ăn và nước uống Cho chuột nhịn đói 12 giờ trước khi cho uống thuốc

Đường dùng thuốc: Đường uống Thể tích uống 0,2 ml/10g thể trọng

Số lần uống: 1 lần duy nhất trong ngày, vào khoảng 8-9 giờ sáng

Thí nghiệm thực hiện qua 2 giai đoạn [8]:

Giai đoạn thăm dò (4 chuột: 2 chuột đực, 2 chuột cái): Khởi đầu cho uống từ liều cao nhất có thể bơm được qua kim đầu tù Xác định liều LD0 (liều tối đa không gây chết) và liều LD100 (liều tối đa gây chết 100 % chuột)

Giai đoạn xác định (12 chuột: 6 chuột đực, 6 chuột cái): Cho uống thuốc với các liều trong khoảng LD0 và LD100 chia theo cấp số nhân

Chỉ tiêu đánh giá kết quả: Theo dõi các biểu hiện về hành vi và vận

động của chuột trong vòng 72 giờ đầu sau uống thuốc Ghi chép các diễn tiến trong thời gian đó Ghi giờ cho chuột uống thuốc, giờ xuất hiện các triệu chứng khác thường Ghi nhận số chuột chết trong từng lô Xác định LD50 theo phương pháp Karber-Behrens (nếu có) [8]

Công thức Karber-Behrens:

Df: Liều tối thiểu làm chết tất cả động vật thí nghiệm

a: Trung bình số động vật thí nghiệm chết ở hai liều kế tiếp

b: Hiệu số giữa hai liều kế tiếp

n: Số động vật thí nghiệm dùng ở mỗi liều hoặc trung bình của những trị số trên

Có thể xảy ra 3 trường hợp:

Trường hợp 1: Xác định được LD50

Trường hợp 2: Nếu cho chuột uống thuốc mà không có con nào chết thì

xác định được Liều cao nhất có thể cho uống bằng kim không làm chết chuột,

kí hiệu là Dmax Liều tương đối an toàn dùng để thí nghiệm có thể bằng hoặc nhỏ hơn 1/5 Dmax

Trường hợp 3: Đã thử đến liều có chuột chết, nhưng không làm chết

100 % chuột thí nghiệm Khi đó không thể xác định được LD50 nhưng vẫn xác định được liều tối đa mà không có con vật nào chết, gọi là liều dưới liều chết, kí hiệu LD0 Liều tương đối an toàn dùng để thí nghiệm lấy giá trị bằng 1/5-1/10 LD0

2.2.2 Đánh giá khả năng kháng viêm cấp bằng mô hình gây phù chân chuột với carrageenan

Gây phù chân chuột với carragenan 1 % theo mô hình của Winter

Charles A., Risley Edwin A và Nuss George W [70] Dùng chuột Swiss albino đực

Đánh dấu mức đo thể thích chân chuột bằng bút mực không tan, ngay dưới khuỷu chân sau phải của chuột

Đo thể tích chân chuột trước thí nghiệm (V0) trên máy đo thể tích chân chuột Nhúng chân sau phải của chuột vào dung dịch chống thấm dến mức đánh dấu, nhấn giữ bàn đạp để cố định, ghi nhận số trên máy

Chuột được gây viêm bằng cách tiêm trong da gan bàn chân phải 0,05

ml hỗn hợp dung dịch carrageenan 1 %, dùng ngón tay xoa nhẹ vùng tiêm cho thuốc thấm đều vào mô (hỗn hợp dung dịch carrageenan 1 % pha trong dung dịch nước muối sinh lý 0,9 % được chuẩn bị trước thí nghiệm 1 giờ để carrageenan trương nở) Chuột sau gây viêm cho vào lồng có giá đỡ để tránh nhiễm trùng chân

Sau tiêm 3 giờ, đo thể tích chân chuột (V3) Các chuột có chân sưng phù trên 50 % so với V0 được chọn cho thí nghiệm và chia ngẫu nhiên vào 5

lô, mỗi lô 8 con Chuột trong mỗi lô được cho uống nước cất hoặc thuốc cùng thể tích 0,1 ml/10g thể trọng

Lô chứng: Uống nước cất

Lô Melo: Uống meloxicam liều 8 mg/kg thể trọng

Lô ĐH 450: Uống ĐHLĐ liều 450 mg/kg thể trọng

Lô ĐH 560: Uống ĐHLĐ liều 560 mg/kg thể trọng

Lô ĐH 750: Uống ĐHLĐ liều 750 mg/kg thể trọng

Đo tiếp thể tích chân chuột sau gây viêm 5 giờ (V5) Ngày tiếp theo của thí nghiệm cho chuột uống thuốc hoặc nước cất và đo thể tích chân chuột sau gây viêm 24 giờ (V24)

V0: Thể tích chân chuột trước gây viêm

Vt: Thể tích chân chuột ở thời điểm t sau gây viêm

Đánh giá khả năng kháng viêm cấp bằng tỉ lệ % giảm phù chân chuột ở các lô uống thuốc so với lô chứng theo công thức:

Trong đó:

I: Tỉ lệ % giảm phù chân chuột ở lô uống thuốc so với lô chứng

: Trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô chứng : Trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô uống thuốc

2.2.3 Đánh giá khả năng kháng viêm mạn bằng mô hình cấy viên cotton

Thực hiện mô hình theo mô tả của Bush Ian E và Robert Wayner

Alexander [30] Dùng chuột Swiss albino đực

Một mẩu cotton có trọng lượng 10±0,1 mg được vê tròn và tiệt trùng (hấp tiệt trùng, sau đó sấy trong 2 giờ ở nhiệt độ 90oC trong tủ sấy)

Chuột được cạo sạch lông vùng lưng trên, sát trùng bằng cồn, dùng kéo phẫu thuật bấm một lỗ chếch sang bên, luồn kéo vào hướng lên đầu, mở rộng

2 mũi kéo để tách da lưng ra khỏi cơ, cấy viên cotton đã sấy khô và tẩm carrageenan 1 % vào Khâu da lại bằng chỉ và lau cồn một lần nữa xung quanh vết mổ

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 8 con, cho uống nước cất hoặc thuốc cùng thể tích 0,1 ml/10g thể trọng

Lô chứng: Uống nước cất

Lô Melo: Uống meloxicam liều 8 mg/kg thể trọng

Lô ĐH 450: Uống ĐHLĐ liều 450 mg/kg thể trọng

Lô ĐH 560: Uống ĐHLĐ liều 560 mg/kg thể trọng

Lô ĐH 750: Uống ĐHLĐ liều 750 mg/kg thể trọng

Sau khi cấy viên cotton, chuột được uống nước cất hoặc thuốc liên tục trong 7 ngày Ngày thứ 8, tiến hành bóc tách u hạt, sau đó sấy khô u hạt ở nhiệt độ 90oC đến trọng lượng không đổi (khoảng 4 giờ) Cân trọng lượng u hạt sau khi đã sấy khô

Đánh giá kết quả:

Tỉ lệ % độ giảm trọng lượng u hạt ở các lô uống thuốc so với lô chứng biểu thị bằng công thức:

Trong đó

X: Tỉ lệ % giảm trọng lượng u hạt ở lô uống thuốc so với lô chứng Mch: Trọng lượng u hạt trung bình ở lô chứng

Mth: Trọng lượng u hạt trung bình ở lô uống thuốc

2.2.4 Đánh giá khả năng giảm đau bằng mô hình gây đau quặn với acid acetic

Thực hiện mô hình theo mô tả của Raph Koster [50]

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con, cho uống nước cất hoặc thuốc cùng thể tích 0,1 ml/10g thể trọng

Lô chứng: Uống nước cất

Lô Melo: Uống meloxicam liều 8 mg/kg thể trọng

Lô ĐH 450: Uống ĐHLĐ liều 450 mg/kg thể trọng

Lô ĐH 560: Uống ĐHLĐ liều 560 mg/kg thể trọng

Lô ĐH 750: Uống ĐHLĐ liều 750 mg/kg thể trọng

Sau uống thuốc 30 phút, tiến hành gây đau quặn bằng cách tiêm phúc mạc dung dịch acid acetic 1 % liều 0,1 ml/10g thể trọng Chuột sẽ xuất hiện những cơn đau quặn biểu hiện như thóp bụng lại, áp bụng xuống sàn, duỗi dài thân và chân sau Đếm số cơn đau quặn mỗi 5 phút trong thời gian 20 phút kể

từ khi tiêm acid acetic

Đánh giá kết quả:

Tính % ức chế đau quặn theo công thức:

A= (Dc – Dt) x 100/ Dc

Trong đó:

A: Tỉ lệ % giảm số cơn đau quặn ở lô uống thuốc so với lô chứng

Dc: Số cơn đau quặn ở lô chứng

Dt: Số cơn đau quặn ở lô uống thuốc

2.2.5 Đánh giá khả năng giảm đau bằng mô hình mâm móng

Thực hiện theo mô tả của Nathan Eddy và Dorothy Leimbach [43]

Dùng chuột Swiss albino đực

Đo thời gian phản ứng với nhiệt của chuột trước khi thí nghiệm (T0) Đặt chuột lên mâm nóng luôn duy trì ở nhiệt độ 55±0,1oC bằng hệ thống ổn nhiệt Thời gian phản ứng với kích thích được tính từ lúc đặt chuột lên mâm nóng đến khi chuột có phản xạ liếm chân, hay giẫy chân sau, hay nhảy chồm lên Loại bỏ những chuột phản ứng quá nhanh trước 8 giây, hoặc quá chậm sau 20 giây Sau đó, chuột được chia ngẫu nhiên làm 4 lô, mỗi lô 10 con, cho uống thuốc cùng thể tích 0,1 ml/10g thể trọng

Lô Melo: Uống meloxicam liều 8 mg/kg thể trọng

Lô ĐH 450: Uống ĐHLĐ liều 450 mg/kg thể trọng

Lô ĐH 560: Uống ĐHLĐ liều 560 mg/kg thể trọng

Lô ĐH 750: Uống ĐHLĐ liều 750 mg/kg thể trọng

Đo thời gian phản ứng với nhiệt của chuột sau khi cho uống thuốc thuốc 30 phút (T30), và 90 phút (T90)

X: Phần trăm hiệu quả tối đa có thể

T0: Thời gian phản ứng với nhiệt của chuột trước thí nghiệm

Ti: Thời gian phản ứng với nhiệt của chuột sau uống thuốc 30 phút, 90 phút

30: Thời gian cắt 30 giây

2.3 XỬ LÝ SỐ LIỆU THỰC NGHIỆM

Số liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình±sai số chuẩn của trung bình Dùng phép kiểm T-test và Anova một chiều, một yếu tố với phần mềm Stata 13.0 để thống kê dữ liệu Đồ thị được vẽ bằng chương trình Microsoft Excel 2013

Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi P < 0,05; độ tin cậy 95

%

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

Số chuột thử thăm dò Số chuột chết

Tỷ lệ chuột chết (%)

Nhận xét:

Trong 72 giờ đầu và 2 tuần quan sát tiếp theo, chuột trong các lô không

có bất kỳ dấu hiệu bất thường nào Tất cả chuột đều sống, ăn uống bình thường Do đó, không xác định được LD50, chỉ xác định được Dmax là 11,2 g/kg

Kết luận:

ĐHLĐ không thể hiện độc tính cấp đường uống ở liều tối đa có thể bơm qua kim đầu tù cho chuột uống Không xác định được LD50 của chế phẩm Liều 11,2 g/kg được quy định là Dmax Liều an toàn có thể dùng trong các thí nghiệm dược lý là bằng hoặc nhỏ hơn 1/5 Dmax

Từ đó, chọn liều dùng cho các thí nghiệm là 1/25, 1/20 và 1/15 Dmax, tương ứng 450 mg/kg, 560 mg/kg và 750 mg/kg

3.1.2 Khả năng kháng viêm trong mô hình gây phù chân chuột với carrageenan

###: P<0,001; khác biệt có ý nghĩa thống kê so với V0

**: P<0,01; khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng

***: P< 0,001; khác biệt có nghĩa thống kê so với lô chứng

Bảng 3.3 Độ phù chân chuột

Lô chuột thí

nghiệm (n=8)

Độ phù chân chuột (%) Sau gây viêm

**: P<0,01; khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng

***: P< 0,001; khác biệt có nghĩa thống kê so với lô chứng