MỘT số kỹ THUẬT SINH học PHÂN tử ỨNG DỤNG TRONG y học (DI TRUYỀN học NGƯỜI SLIDE)

Phương pháp Sanger Các bước tiến hànhBước 1: Biến tính DNA khuôn Điện di trên gel polyacrylamid để thu các mạch đơn DNA, dùng DNA này để tiến hành các bước xử lý tiếp theo.. Bước 2 : Ch

M c tiêu ụ

- Trình bày đ ượ ỹ c k thu t tách chi t và đi n di ADN ậ ế ệ

- Trình bày đ ượ c KT PCR

- Trình bày đ ượ c nguyên lý, n i dung c a các p/p ộ ủ

xác đ nh trình t Nu trong phân t ADN ị ự ử (sequencing)

- Nêu đ ượ c đ c đi m, vai trò c a enzym gi i h n ặ ể ủ ớ ạ

- Trình bày đ ượ c n i dung c a KT lai acide nucleic ộ ủ

dµi c¸c ®o¹n ADN do enzym giíi h¹n t¹o nªn.

MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC

1 tách chiết ADN, Điện di ADN 1.1 Kỹ thuật tách chiết ADN

Giải phóng ADN ra khỏi màng TB Hủy bỏ phần Protein

Kết tủa ADN

Hũa tan ADN

1.2 Điện di ADN

- Điện di ADN trên thạch, đi từ cực (-) sang cực (+)

- Phân tử ADN càng nhỏ càng di động nhanh

Hình ảnh điện di ADN sau chiết tách

Hình ảnh điện di ADN sau PCR

2 PhƯương pháp nhân đoạn ADN in vitro (PCR)

(PCR = Polymerase Chain Reaction)

Nguyên liệu:

- Phân tử ADN ban đầu, 4 loại Nu, PCR buffer

- 2 mồi (primers) gồm mồi ngựược, mồi xuôi,

- Enzym Taq polymerase (VK Thermus aquaticus)

3 Giai đoạn tổng hợp: Taq polymerase điều khiển

ghép Nu vào ADN to = 70 -72o C

Sau 1 chu kỳ, ADN mới làm khuôn tổng hợp ở chu kỳ tiếp Sau 30 chu kỳ tạo thành 230 phân tử ADN

ĐỒ THỊ BIỂU DIỄN CHUƠNG TRÌNH LUÂN NHIỆT

CỦA PHẢN ỨNG PCR

CÁC LOẠI MÁY PCR CHỦ YẾU

Nguyên lý: Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt

động của enzyme DNA Polymerase Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotid

(ddNTP) và các deoxynucleotid thông thường.

3 Xác định trình tự Nucleotit trong phân tử ADN (Sequencing)

3.1 Phưương pháp enzym học (phưương pháp

Sanger)

Việc tổng hợp mạch bổ sung sẽ bị dừng lại do ddNTP không có khả năng hình

thành liên kết phosphodieste

Phương pháp Sanger

Phương pháp Sanger

Phương pháp Sanger Các bước tiến hành

Bước 1: Biến tính DNA khuôn

Điện di trên gel polyacrylamid để thu các mạch đơn DNA, dùng DNA này để

tiến hành các bước xử lý tiếp theo.

Bước 2 : Chuẩn bị cho phản ứng tổng hợp DNA

Lấy 4 ống Eppendorf, cho các thành phần cần thiết vào mỗi ống :

mạch khuôn, mồi có đánh dấu phóng xạ P32, enzyme DNA polymerase, dNTP,

dung dịch đệm thích hợp và thêm vào mỗi ống tương ứng một loại ddNTP

nhất định.

Bước 3 : Thực hiện các phản ứng tổng hợp DNA

Bước 4 : Điện di kết quả, so sánh kết quả các chuỗi mạch đơn DNA được tổng

hợp để xác định trình tự của mạch khuôn.

Phương pháp Sanger

https://www.youtube.com/watch? v=AI4CnG5Jp4s

5’OH P32, ATP, enzyme

Nguyên lý: Thủy giải đặc trưng phân tử DNA cần xác định trình tự

- Điện di tách lấy một mạch DNA làm

mạch khuôn, dùng mạch khuôn này cho

các xử lý tiếp theo.

Các bước thực hiện

3.2 Phương pháp Maxam - Gilbert

Bước 2 : Thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệu

Có thể sử dụng 4 ống nghiệm để thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệu khác nhau, tạo các đoạn DNA cắt dài ngắn khác nhau.

Phương pháp Maxam - Gilbert

Bước 3 : Lấy sản phẩm xử lý trong mỗi ống

nghiệm đem chạy điện di, hiện hình phóng xạ

và xác định kết quả

Ví dụ: Xử lý Dimethylsunfat ở ống phản ứng 1, phản ứng cắt tại G.

Phương pháp Maxam - Gilbert

Trình tự gen ban đầu

Sau khi xử lý bằng DMSO

4

Phương pháp Maxam - Gilbert

Bước 4: Tập hợp kết quả thu được ở tất cả các ống nghiệm, thu được các đoạn polynucleotid dài ngắn hơn kém nhau 1 nucleotid, từ đó xác định được trình tự của DNA mạch khuôn.

Phương pháp Maxam - Gilbert

4 Enzym giới hạn và chức năng của enzym giới hạn

- Enzym giới hạn (Restriction Enzym)

+ Tách chiết enzym từ VK (tên enzym là tên VK)

- Chữ thứ tư viết hoa để chỉ chủng vi khuẩn sử dụng (nếu có)

- Chữ số La mã chỉ thứ tự enzyme giới hạn được phát hiện ( trong trường hợp nhiều enzyme giới hạn cùng được tìm thấy ở một loài vi khuẩn).

- Chức năng của enzym giới hạn

+ Trong VK: enzym giới hạn phân giải ADN của

VR

(VK có enzym methyl hoá làm enzym giới hạn mất hoạt tính, không đ đến ADN của chính

VK).

-C-T-T-A-A

G-

A-A-T-T-C-Bam HI Bacillus

faciens

amylolique- -C-C-T- A-G-G- -G

-C- C-T-A- G

G-

G-A-T-C-C-Sma I Serratia

marcesciens

-G-G-G-C-C-C- -C-C-C -G-G-G

C-C-C-

G-G-G-5 Lai acid nucleic

5.1 ADN dò (DNA probes)

- Khi lai cần ADN dò

+ Là 1 đoạn ADN sợi đơn có trình tự Nu đã biết

+ Gọi ADN dò vì dò được sợi đơn tưương ứng trên ADN n/c

- Phưương pháp tạo ADN dò:

+ Phiên mã ngưược từ Pr  mARN  cADN

+ Tổng hợp từ các Nu theo trình tự đã biết

+ Tách chiết từ ADN của bộ gen

5.2 Các phưương pháp lai acid nucleic

5.2.1 Phưương pháp Southern blotting

1 Chiết tách ADN từ mẫu vật: b/c, TB ối, TB tua rau

2 Cắt ADN bằng enzym giới hạn khác nhau

3 Điện di ADN trên gel agarose

4 Biến tính ADN thành sợi đơn bằng NAOH hoặc tocao

5 Thấm ADN sang giấy Nitrocellulose

6 Cho giấy Nitrocellulose vào bình lai có ADN dò

7 Quan sát: tự chụp hình phóng xạ hoặc KHV huỳnh quang (tựy thuộc đỏnh dấu của ADN dũ)

ThÊm ADN vµo giÊy nitrocellulose

GiÊy nitrocellulose

§ iÖn di agarose gel

globulin DNA probes

5.2.2 Kỹ thuật lai tại chỗ FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)

- Là p/p vừa di truyền TB, vừa phân tử.

- Mẫu dò là ADN sợi đơn có đánh dấu

Mẫu dò đưược lai bổ sung với ADN nhân TB cần n/c (NST ở gian kỳ hoặc kỳ giữa biến tính tạo sợi đơn)

- Phân tử ADN phát hiện tùy p/p đánh dấu

Kỹ thuật FISH (Fluorescence In-Situ

Phân tử lai trong

công nghệ

sinh học

Kháng Kanamycin Kháng Kanamycin Cảm ứng tetracyclin Kháng tetracyclin

- ADN cho có chất lưượng tốt, ADN nhận có k/n nhân lên nhanh.

- Chọn ADN cho và ADN nhận còn gọi thể

chuyển(vector) thưường là plasmid của VK, phage, đôi khi là cosmid

- Dùng enzym giới hạn nhưư nhau cắt ADN cho và

ADN nhận

- Nối ADN cho vào ADN nhận tạo ADN lai (dùng

ligase)

- Các phân tử ADN nhân lên trong VK.

5.2.3 Phân tử lai trong công nghệ sinh học

Mục đích: đưa đoạn ADN (gen) cần thiết vào, loại bỏ đoạn ADN bất lợi để tạo nên những phân tử lai tổng hợp sản phẩm chất lượng cao.

6 Tính đa hình chiều dài các đoạn giới hạn = RFLP

(Restriction Fragment Length Polymorphism)

Là p/pháp gián tiếp dựa vào tính đa hình tự nhiên của ADN gọi là p/p RFLP

- RFLP là h/tưượng đa hình về chiều dài các đoạn

ADN được đ bởi enzym giới hạn đ/hiệu, n/diện = điện

-Dựa vào nguyên lý tính đa hình ADN (Variable

Number of Tandem Repeats (VNTR) còn gọi

microstallite có từ 11-60 đôi base, lặp nhiều lần

trong bộ gen, đ/trưng từng cá thể  phân biệt cá thể nhờ các vạch ADN như dấu vân tay

- Các bước tương tự Southern Blotting với ADN dò đặc hiệu p/hiện phân tử lai.

- ứng dụng: đ phụ hệ, tìm thủ phạm trong pháp y

7 Dấu ấn ADN (DNA Fingerprinting)

- RFLP dùng như Marker trong đ trước sinh, p/biệt

đồng và dị hợp tử

- - RFLP được DT theo quy luật Mendel.

- - RFLP là 1 p/p dùng để lập bản đồ gen.