Giám sát sự lưu hành của virus cúm type AH5N1 trên đàn thuỷ cầm tại một số xã thuộc huyện gia lâm, đông anh hà nội

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

ðẶNG THỊ THÚY YÊN

GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM TYPE A/H5N1 TRÊN ðÀN THUỶ CẦM TẠI MỘT SỐ Xà THUỘC HUYỆN

GIA LÂM, ðÔNG ANH - HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học: TS TRẦN THỊ LAN HƯƠNG

HÀ NỘI – 2011

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam đoan rằng:

- Các kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, khách quan và ch−a đ−ợc

sử dụng để bảo vệ một học vị nào

- Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã đ−ợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã đ−ợc chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 10 năm 2011 Tác gi

Tác giảảảả lu lu luậậậận vn vn văăăănnnn

ðặng Thị Thuý Yờn

LỜI CẢM ƠN

b ản thân tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân

và t ập thể, cho phép tôi ñược tỏ lòng biết ơn và cảm ơn chân thành tới:

ðại học; Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y và các thầy cô giáo

ñã giúp ñỡ, tạo ñiều kiện ñể tôi học tập, tiếp thu kiến thức của chương trình học

Ti ến sĩ Trần Thị Lan Hương, người trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện

lu ận văn tốt nghiệp

s ắc tới gia ñình, người thân cùng bạn bè ñã ñộng viên giúp ñỡ tôi vượt qua

m ọi khó khăn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, thực hiện ñề tài

Hà N ội, tháng 10 năm 2011

Tác giả

ðặng Thị Thuý Yên

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH MỤC BẢNG vi

PHẦN 1 MỞ đẦU 1

1.1 đặt vấn ựề 1

1.2 Mục tiêu ựề tài 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ựề tài 2

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 4

2.2 Căn bệnh cúm gia cầm 7

2.3 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 12

2.4 Triệu chứng và bệnh tắch bệnh cúm gia cầm 16

2.5 Chẩn ựoán bệnh cúm gia cầm 18

2.6 đáp ứng miễn dịch chống virus cúm gia cầm 18

2.7 Phòng chống bệnh cúm gia cầm 21

2.8 Sử dụng vaccine phòng chống bệnh cúm gia cầm 22

PHẦN 3 đỐI TƯỢNG NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 đối tượng nghiên cứu 26

3.2 Nội dung nghiên cứu 26

3.3 Nguyên liệu, dụng cụ 26

3.4 địa ựiểm và thời gian nghiên cứu 27

3.5 Phương pháp nghiên cứu 27

3.5.1 Phương pháp ựiều tra 27

3.5.2 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu 27

3.5.3 Phương pháp phân lập virus trên phôi trứng 28

3.5.4 Phương pháp làm phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) 28

3.5.5 Phương pháp làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu - phản ứng HI 30

3.5.6 Phương pháp Real-time RT Ờ PCR 32

3.5.7 Xử lý số liệu 36

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Tình hình chăn nuôi thuỷ cầm tại 4 xã: Xuân Nộn, Cổ Bi, Kim Sơn, đa Tốn thuộc 2 huyện Gia Lâm, đông Anh Ờ Hà Nội năm 2010 37

4.2 điều tra về tình hình sử dụng vaccine cúm gia cầm tại một số xã ở hai huyện đông Anh và Gia Lâm, Hà Nội trong năm 2009 và năm 2010 41

4.2.1 Kế hoạch tiêm phòng vaccine cúm gia cầm cho ựàn

thuỷ cầm 41

4.2.2 Kết quả tiêm phòng vaccine cúm gia cầm trên ựàn thuỷ cầm tại bốn xã thuộc hai huyện đông Anh và Gia Lâm, Hà Nội năm 2009 và 2010 42

4.3 Kết quả giám sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm trong ựàn thuỷ cầm tại một số xã ở hai huyện Gia Lâm và đông Anh, Hà Nội trong năm 2010 45

4.3.1 Kết quả giám sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm trong ựàn thủy cầm nuôi lẫn gia cầm cạn và thuỷ cầm không nuôi lẫn gia cầm cạn tại một số xã ở 2 huyện Gia Lâm và đông Anh, Hà Nội 45

4.3.2 Giám sát sự lưu hành của virus cúm trong ựàn thuỷ cầm ựược tiêm vaccine và không ựược tiêm vaccine tại bốn xã Xuân Nộn, Cổ Bi, Kim Sơn, đa Tốn thuộc 2 huyện Gia Lâm và đông Anh, Hà Nội 50

4.4 Kết quả giám sát huyết thanh học ựối với ựàn thuỷ tại một số xã

ở 2 huyện Gia Lâm và đông Anh, Hà trong năm 2010 56

4.4.1 Kết quả giám sát huyết thanh học ựối với ựàn thuỷ cầm nuôi tại một số xã ở 2 huyện Gia Lâm và đông Anh, Hà Nội trước và sau khi tiêm phòng ựợt I năm 2010 56

4.4.2 Kết quả giám sát huyết thanh học ựối với ựàn thuỷ cầm nuôi tại một số xã ở 2 huyện Gia Lâm và đông Anh, Hà Nội trước và sau khi tiêm phòng ựợt II năm 2010 62

5 KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 68

5.1 Kết luận 68

5.2 đề nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC 73

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 4.1: Tình hình chăn nuôi thuỷ cầm tại một số xã năm 2010 ở 2

huyện đông Anh, Gia Lâm, Hà Nội 39

Bảng 4.2: Tình hình sử dụng vaccine cúm gia cầm cho ựàn thuỷ cầm tại

một số xã ở2 huyện Gia Lâm, đông Anh, Hà Nội trong năm

2009 và năm 2010 44

Bảng 4.3: Kết quả giám sát virus cúm gia cầm trên ựàn thuỷ cầm có nuôi

lẫn gia cầm cạn và thuỷ cầm không nuôi lẫn gia cầm cạn bằng phương pháp phân lập trên phôi trứng 47

Bảng 4.4: Kết quả giám sát lưu giữ virus cúm trên ựàn thuỷ cầm nuôi lẫn gia

cầm cạn và ựàn thuỷ cầm không nuôi lẫn gia cầm cạn bằng phương pháp phân lập trên phôi trứng và phương pháp RRT Ờ PCR 49

Bảng 4.5: Kết quả giám sát virus cúm gia cầm trên ựàn thuỷ cầm ựược

tiêm vaccine và không tiêm vaccine tại 4 xã: Xuân Nộn, Kim Sơn, Cổ Bi, đa Tốn bằng phương pháp phân lập trên phôi trứng 53

Bảng 4.6: Kết quả giám sát lưu giữ virus cúm trên ựàn thuỷ cầm ựược

tiêm vaccine và ựàn thuỷ cầm không ựược tiêm vaccine bằng phương pháp phân lập phôi và phương pháp RRT Ờ PCR 55

Bảng 4.7: Kết quả giám sát kháng thể cúm gia cầm trong huyết thanh ựàn

thuỷ cầm nuôi tại 4 xã (trước khi dùng vaccine cúm H5N1 ựợt

1 năm 2010) 58

Bảng 4.8: Kết quả giám sát kháng thể cúm gia cầm trong huyết thanh ựàn

thuỷ cầm nuôi tại 4 xã (sau khi dùng vaccine cúm H5N1 ựợt I năm 2010) 61

Bảng 4.9: Kết quả giám sát kháng thể cúm gia cầm trong huyết thanh ựàn

thuỷ cầm nuôi tại 4 xã (trước khi dùng vaccine cúm H5N1 ựợt

II năm 2010) 64

Bảng 4.10: Kết quả giám sát kháng thể cúm gia cầm trong huyết thanh ựàn

thuỷ cầm nuôi tại 4 xã (sau khi dùng vaccine cúm H5N1 ựợt 2 năm 2010) 66

Song cùng với sự phát triển của chăn nuôi thì dịch bệnh cũng ngày càng xảy ra nhiều và diễn biến phức tạp ðặc biệt phải quan tâm ñến bệnh cúm gia cầm Bệnh cúm gia cầm ñược biết từ lâu sau những vụ dịch gây ra cho các ñàn gia cầm, thuỷ cầm ở nhiều nước trên thế giới ðây là một bệnh truyền nhiễm rất nguy hiểm có tốc ñộ lây lan nhanh với tỷ lệ chết cao trong ñàn gia cầm nhiễm bệnh Trong mấy năm gần ñây, dịch cúm gia cầm ñộc lực cao (HPAI – Highly Pathogenic Avian Influenza) xuất hiện và ñã giết chết hàng chục triệu gia cầm, thuỷ cầm trên thế giới, ñồng thời hàng tỷ gia cầm, thuỷ cầm phải tiêu hủy bắt buộc ñể tránh lây lan, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi và kinh tế các nước có dịch Bệnh ñược Tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE) xếp vào bảng A – danh mục các bệnh truyền nhiễm cực kỳ nguy hiểm Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) thì từ năm 2003 ñến tháng 2 năm 2011 ñã

có 519 ca nhiễm H5N1, trong ñó có 306 người tử vong tại 15 nước trên thế giới Còn tại Việt Nam, theo Bộ Y tế thì từ tháng 12/2003 ñến tháng 12/2010

có 119 người mắc cúm A/H5N1, trong ñó có 60 người tử vong ðiều người ta

ựáng lo ngại là virus cúm gia cầm có khả năng biến chủng mạnh, chắnh vì vậy

mà thế giới ựang phải ựối mặt với nguy cơ có thể xảy ra một ựại dịch cúm ở người mà nguyên nhân do các chủng cúm gia cầm biến ựổi thành những loại thắch nghi gây bệnh ở người

Các chuyên gia nghiên cứu về virus và bệnh cúm gia cầm ựã ựánh giá

Ộvịt nuôi có thể là mối ựe doạ bệnh cúm gia cầm mớiỢ Các tổ chức quốc tế như FAO, OIE, WHO ựã ựồng loạt cảnh báo về vai trò của vịt nuôi ựối với việc tàng trữ và truyền lây virus cúm gia cầm Hiện tại, vịt nuôi không những là con vật Ộthầm lặngỢ ựối với virus cúm H5N1 mà còn có thể gây bệnh thể ựộc lực cao và rất có khả năng gây biến chủng thành virus gây bệnh cho người

Thực tế ựặt ra là khi dịch bệnh xảy ra thì phải có biện pháp khoanh vùng dập dịch, nhằm ổn ựịnh và phát triển sản xuất, ựặc biệt ngăn chặn việc lây nhiễm sang người Muốn vậy phải giảm bớt ựược nguy cơ lây lan dịch bệnh, trong ựó công tác giám sát sự lưu hành của virus cúm nhằm tìm hiểu và ựưa ra những thông tin ựánh giá về sự tồn lưu của virus ngoài thực ựịa là ựiều cần thiết

Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện ựề tài:

ỘGiám sát sự lưu hành của virus cúm type A/H5N1 trên ựàn thuỷ cầm tại một số xã thuộc huyện Gia Lâm, đông Anh - Hà NộiỢ

1.2 Mục tiêu ựề tài

- Giám sát sự lưu hành của virus cúm type A/ H5N1 trên ựàn thuỷ cầm tại một số xã thuộc huyện Gia Lâm, đông Anh - Hà Nội Trên cơ sở ựó ựưa ra các biện pháp phòng, chống dịch cúm gia cầm phù hợp

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ựề tài

Khi ựặt vấn ựề về nghiên cứu về nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm gia cầm trên ựàn thuỷ cầm, chúng tôi ựã ý thức ựược tắnh phức tạp, khó khăn trong quá trình hợp tác với các hộ chăn nuôi trong quá trình thực hiện

Hy vọng với kết quả nghiên cứu của ựề tài sẽ ựưa ra những thông tin về tình

hình lưu dữ virus cúm trên ñàn thuỷ cầm, hiệu quả sử dụng vaccine cúm ở thuỷ cầm và là cơ sở cho cơ quan quản lý về thú y trên ñịa bàn và cho các nhà chăn nuôi có những biện pháp phòng, chống hữu hiệu ñối với dịch cúm gia cầm, nhằm hạn chế tối ña sự lây lan và bùng phát cúm gia cầm, nâng cao năng suất chăn nuôi, ñảm bảo vệ sinh môi trường, an toàn cho sức khoẻ người tiêu dùng

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm

* Lịch sử bệnh cúm gia cầm trên thế giới

Bruschke C (2007) cho biết bệnh cúm gia cầm xuất hiện từ cách ñây rất lâu, ñược Hypocrates mô tả rất kỹ từ năm 412 trước công nguyên Năm 1173, các ổ dịch cúm ñược Hirsch tổng hợp chi tiết Năm 1580, một ñại dịch xảy ra với các triệu chứng giống như cúm xuất hiện Từ ñó người ta ghi nhận có 31 ñại dịch xảy ra giống như cúm Trong hơn 100 năm qua ñã có 4 vụ ñại dịch cúm ở người xảy ra vào các năm: 1889,1918,1957 và 1968 Năm 1918, ñại dịch cúm xảy ra ở Châu âu do virus cúm type A H1N1 gây ra ñược gọi là dịch cúm Tây Ban Nha, khiến cho khoảng 20 triệu người chết ðến năm 1957, virus H2N2 xuất hiện ở miền Nam Trung Quốc gây ra bệnh cúm Châu Á Năm 1968, ñến lượt virus H3N2 là nguồn gốc gây bệnh cúm Hồng Kông Năm 1977, virus cúm H1N1 quay trở lại gây bệnh cúm ở Nga nhưng không nghiêm trọng như năm 1918

Năm 1878, bệnh cúm gia cầm ñược phát hiện ở Italia Ở giai ñoạn này bệnh ñược coi là bệnh dịch hạch gia cầm và ñến năm 1955 nguyên nhân của bệnh ñược xác ñịnh là do virus type A (H7N7 và H1N1) (Phạm Sỹ Lăng và

cs, 2004)

Hầu hết các loại gia cầm ñều mẫn cảm với ít nhất một loại virus cúm Vào năm 1957 và năm 1968, có nhiều ổ dịch cúm gia cầm thể ñộc lực cao do virus H5 và H7 gây nên cho gà và gà tây Những năm gần ñây virus cúm gia cầm type A subtype H5 ñã vượt qua “hàng rào loài” lây bệnh trực tiếp từ gà sang người Thuỷ cầm, ñặc biệt là vịt trở thành vật tàng trữ và trung gian truyền lây sang các loài khác, lây sang cả người (Tô Long Thành, 2005)

* Tình hình bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao trên thế giới

Chủng virus gây bệnh chủ yếu là H5N1 và tổng số gia cầm bị tiêu huỷ là 400.000 con, chỉ có một ổ dịch cúm do chủng H5N2 gây ra vào 10/12/2004

Nh ật Bản: Thời gian diễn ra dịch cúm gia cầm từ 27/01/2004 ñến

05/03/2004, nguyên nhân do virus chủng H5N1

Quảng Tây, sau ñó lan ra 15 tỉnh thành khác, ñặc biệt các tỉnh biên giới với Việt Nam ñều có dịch

Lào: Dịch cúm gia cầm xảy ra từ 27/01/2004 ñến 13/02/2004

Nga: Xảy ra các ổ dịch H5N1 gia cầm và thuỷ cầm ở Sibêri và virus thuộc chủng có ñộc lực cao giống như chủng virus của Trung Quốc vào tháng 7/2005

* Bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam

Theo Bùi Quang Anh và Văn ðăng Kỳ (2004), ổ dịch ñầu tiên bùng phát tại Việt Nam vào cuối tháng 12/2003, ñến nay có thể chia thành 8 ñợt dịch chính như sau:

* ðợt dịch thứ nhất (từ tháng 12/2003 ñến 30/03/2004):

Lần ñầu tiên dịch cúm gia cầm xuất hiện vào cuối tháng 12/2003 ở tỉnh

Hà Tây cũ (nay là Hà Nội), Long An và Tiền Giang Dịch lây lan rất nhanh, ñến ngày 27/02/2004, chỉ trong vòng 2 tháng dịch ñã xuất hiện ở 2.574 xã,

381 huyện và 57 tỉnh thành trong cả nước Tổng số gà và thuỷ cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là hơn 43,9 triệu con; trong ñó có 30,4 triệu con gà; thuỷ cầm là 13,5 triệu con chiếm 16,79% tổng ñàn Ngoài ra còn có 14,76 triệu con chim cút và các loại chim khác bị chết và tiêu huỷ

* ðợt dịch thứ hai (từ tháng 4/2004 ñến tháng 11/2004):

Trong giai ñoạn này dịch phát ra rải rác với quy mô nhỏ Bệnh xuất hiện ở 46 xã, phường; 32 quận, huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh Tổng số gia cầm, thuỷ cầm bị tiêu huỷ trong giai ñoạn này là 84.078 con; trong ñó gà là 55.999 con , vịt là 8.132 con và chim cút là 19.947 con

* ðợt dịch thứ ba (từ tháng 12/2005 ñến tháng 5/2005):

Có 670 xã, phường tại 182 huyện, thị thuộc 36 tỉnh, thành phố (15 tỉnh phía Bắc, 21 tỉnh phía Nam) Tổng số gia cầm tiêu huỷ là 1.847.213 con, trong ñó gà là 470.495 con; vịt, ngan là 825.689 con; chim cút là 551.029 con Dịch xuất hiện ở tất cả các tỉnh thành thuộc ðồng bằng sông Cửu Long

Hà Giang) Tổng số gia cầm chết và tiêu huỷ là 3.972.943 con (gà là 1.338.523 con; vịt, ngan là 2.135.116 con; chim cảnh là 499.304 con)

Dịch cúm tái phát tại 18 tỉnh thành trong cả nước, sau ñó ñến tháng 8/2007 có 23 tỉnh có dịch là: Nghệ An, Quảng Ninh, Cần Thơ, Sơn La, Nam ðịnh, ðồng Tháp, Bắc Giang, Hải Phòng, Ninh Bình, Bắc Ninh, Hà Nam, Vĩnh Phúc, Hưng Yên, Quảng Nam, Thái Bình, Phú Thọ, Hà Tĩnh, Cao Bằng,

Cà Mau, ðiện Biên, Quảng Bình, Thái Nguyên và Trà Vinh Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 294.849 con (gà 21.525 con; vịt, ngan 273.324 con) Sau khi bị khống chế trong vòng một tháng, ñến tháng 10/2007 dịch lại tái phát trên ñịa bàn các tỉnh Trà Vinh, Quảng Trị, Nam ðịnh, Cao Bằng, Hà Nam và Bến Tre

* ðợt dịch thứ 7 (từ ñầu năm 2008 ñến năm 2009):

Nhìn chung từ năm 2008 ñến nay dịch cúm gia cầm chỉ xảy ra ở diện hẹp, lác ñác ở các ñịa phương, không phát ra diện rộng Năm 2008 có tổng số

80 xã ở 54 huyện thuộc 27 tỉnh, thành có dịch Tổng số gia cầm bệnh, chết và tiêu huỷ là 106.058 con (gà 40.525 con, vịt 61.027 con, ngan 4.506 con) (Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2005)

Năm 2009, dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở 68 xã, phường, thị trấn của 34 huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh, thành với tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy trên 127.000 con

* ðợt dịch thứ 8 (từ ñầu năm 2010 ñến 3/2011):

Theo Cục Thú Y cho biết, trong năm 2010, dịch cúm gia cầm ñã xuất hiện ở 63 xã phường của 37 huyện, quận thuộc 23 tỉnh, thành trong cả nước Tổng số gia cầm mắc, chết và tiêu huỷ là hơn 100.000 nghìn con, trong ñó chủ yếu là vịt

Tính ñến hết tháng 3/2011, cả nước còn 4 tỉnh là Nam ðịnh, Hải Phòng, Quảng Ngãi và Quảng Trị có dịch cúm gia cầm chưa qua 21 ngày

2.2 Căn bệnh cúm gia cầm

Virus gây bệnh cúm gia cầm là virus cúm Type A, một trong bốn nhóm thuộc họ Orthomyxoviridae, bao gồm các nhóm virus cúm A, nhóm virus cúm

B, nhóm virus cúm C và nhóm Thogotovirus

* Hình thái và cấu trúc của virus cúm A

Virus gây bệnh cúm gia cầm nhóm A là virus ARN một sợi âm, cấu trúc có vỏ bọc là glycoprotein với kháng nguyên bề mặt có hoạt tắnh gây ngưng kết hồng cầu Hemagglutinin (HA), protein có thụ thể Neuraminidase (NA) và protein ựệm Matrix (MA) đó là những gai, mấu có ựộ dài 10-14 nm, ựường kắnh 4 - 6nm

Hạt virus có dạng hình cầu tròn, hình trứng, hoặc dạng khối kéo dài, ựường kắnh khoảng 80-120 nm, phân tử lượng của một hạt virion khoảng 250 triệu Dalton

Virus có bản chất là protein, lipidprotein và hydrocarbon Protein có nguồn gốc từ màng tế bào mà virus gây nhiễm

ựoạn, có cấu trúc ựối xứng xoắn, ựộ dài 130-150nm Hệ gen của virus chỉ chứa duy nhất axit ribonucleic (RNA) một sợi, có cấu trúc là sợi âm, chia thành 8 phân ựoạn, mã hoá cho các loại protein của virus là: HA, NA, PB1, PB2, M1, M2, NP, PA, NS1, NS2 (Phạm Sỹ Lăng và cs, 2005) Trong ựó: Phân ựoạn 1-3 mã hoá cho protein PB1, PB2, PA Phân ựoạn 4 mã hoá cho

HA Phân ựoạn 5 mã hoá cho protein Nucleprotein (NP) Phân ựoạn 6 là gen chịu trách nhiệm tổng hợp protein Neuraminidaza Phân ựoạn 7 mã hoá cho 2 tiểu phần ựệm M1 và M2 Phân ựoạn 8 mã hoá cho 2 tiểu phần không cấu trúc NS1, NS2 Chức năng của các protein như sau:

HA: có bản chất glycoprotein type I có chức năng bám dắnh vào thụ thể

tế bào để hình thành ựặc tắnh truyền nhiễm của virus, protein H phải phân thành các tiểu phần HA1 và HA2 Protein HA có tỷ lệ biến ựổi cao 2/1000 phân tử ở mỗi vị trắ của mỗi ựời virus do lỗi hoạt tắnh enzyme khó tránh khỏi của virus

NA: có nhiệm vụ cắt acid sialic, giúp HA gắn vào thụ thể và giúp giải

phóng RNA từ endosome (thể nội bào) và tạo hạt virus mới

M2: có chức năng tạo khe H+ nhằm giúp cởi vỏ virus sau khi xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm

M1: tập hợp các thành phần của virus và gây ra hiện tượng nảy chồi

ñể giải phóng virus mới hình thành

PB1, PB2, NP và PA: có nhiệm vụ bảo vệ, sao chép, biên dịch RNA NS2: kết hợp với M1 có nhiệm vụ chuyển RNA từ trong nhân tế bào ra ngoài nguyên sinh chất

NS1: là protein không cấu trúc (không là ñơn vị tạo thành hạt virus) ñược tổng hợp trong quá trình nhân lên của virus và có nhiệm vụ cắt xén RNA và kích thích sự phiên mã trong quá trình nhân lên của virus (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2005)

* Kháng nguyên của virus cúm

Yếu tố ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin viết tắt là HA) và enzym cắt thụ thể (Neuraminidase viết tắt là NA) là những kháng nguyên có vai trò

quan trọng trong miễn dịch bảo hộ Có tất cả 16 biến thể HA (H1 ñến H16) và

9 biến thể NA (N1 ñến N9) HA ñược coi là yếu tố vừa quyết ñịnh tính kháng nguyên, vừa quyết ñịnh ñộc lực của virus cúm A (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2005)

Mỗi một hợp thể kháng nguyên HA và NA tạo nên một subtype Về mặt huyết thanh học, giữa các subtype không hoặc rất ít có phản ứng chéo ðây là trở ngại cho việc nghiên cứu vaccine

Các kháng nguyên của virus có thể kích thích cơ thể sinh ra nhiều loại kháng thể, nhưng chỉ có loại kháng thể kháng HA mới có vai trò trung hoà virus cho bảo hộ miễn dịch Một số kháng thể khác, có tác dụng kìm hãm số lượng virus nhân lên Ví dụ, kháng thể kháng NA có tác dụng ngăn cản virus giải phóng, kháng thể M2 ngăn cản chức năng M2 không cho quá trình bao gói virus xảy ra Nhưng thông thường ñộng vật và

người chết rất nhanh trước khi hệ miễn dịch sản sinh kháng thể (Phạm Sỹ Lăng và cs, 2004)

* độc lực của virus

đánh giá ựộc lực của virus cúm bằng phương pháp gây bệnh cho gà 3-6 tuần tuổi: tiêm vào tĩnh mạch cánh 0,2ml nước trứng ựã ựược gây nhiễm virus với tỷ lệ pha loãng 1/10, sau ựó ựánh giá mức ựộ bệnh của gà ựể cho ựiểm (chỉ số IVPI) điểm tối ựa là 3 và ựó là virus có ựộc lực cao nhất Theo quy ựịnh của Tổ chức dịch tễ thế giới OIE, virus cúm nào có chỉ số IVPI >1.2 trên gà 6 tuần tuổi, hoặc bất cứ virus cúm nào thuộc subtype H5 hoặc H7 có trình tự axit amin trùng với trình tự axit amin của chủng ựộc lực cao, ựều

thuộc loại ựộc lực cao (HPAI)

Biến chủng virus cúm gây bệnh ở loài chim ựược phân chia theo tắnh gây bệnh với 2 mức ựộ ựộc lực khác nhau Loại virus có ựộc lực cao gọi là HPAI thường gây chết 100% gia cầm nhiễm bệnh, sau vài giờ ựến vài ngày gây nhiễm Người ta ựã phân lập ựược 19 chủng cúm A thuộc loại HPAI từ loài lông vũ, trong ựó, một số ựã lây nhiễm và thắch ứng gây bệnh trên người

Loại thứ hai có ựộc lực thấp, gọi là LPAI(Low pathogenic avian influenza)

thường nhiễm ở gia cầm nhưng không hoặc có rất ắt biểu hiện lâm sàng và tỷ

lệ chết cũng rất thấp Sự bội nhiễm vi khuẩn hoặc các bệnh khác cùng với cúm gà làm cho LPAI trở nên có ựộc lực hơn và gây bệnh ác liệt hơn Bằng chứng cho thấy các chủng có ựộc lực thấp LPAI trong quá trình lưu cữu trong thiên nhiên và ựàn gia cầm, sẽ ựột biến nội gen, hoặc biến ựổi tái tổ hợp trở thành các chủng HPAI (Phạm Sỹ Lăng và cs)

Theo Mary-Jackwood và cộng sự [15] tất cả các virus cúm phân lập ựược của Việt Nam trong năm 2005-2007 không chỉ có ựộc lực cao với gà,

mà còn gia tăng ựáng kể ựộc lực ựối với vịt so với các virus phân lập trước

ựó Sự tăng ựộc tắnh này là hệ quả của sự gia tăng virus nhân lên trong các cơ quan nội tạng và sự thắch nghi ở diện rộng hơn của virus ựối với các cơ quan

nội tạng Sự thay ñổi ñộc tính của các virus ñang lưu hành có ảnh hưởng lớn tới dịch tễ học của virus và công tác khống chế

* Khả năng biến chủng của virus

Virus cúm gia cầm có 2 khả năng ñột biến sau:

+ ðột biến ñiểm (hiện tượng lệch về kháng nguyên - antigen drift) là

kiểu ñột biến thường xảy ra, ñặc biệt là ñối với kháng nguyên H và kháng nguyên N, tạo ra những sự thay ñổi nhỏ về trình tự nucleotit của gen mã hoá Kết quả là tạo ra các phân type cúm khác với phân type ở giai ñoạn ñầu ổ dịch Cũng chính nhờ sự biến ñổi này mà virus cúm A tạo nên 16 biến thể HA (H1-H16) và 9 kháng nguyên N (N1-N9) (Cục thú y, 2004)

+ ðột biến do tái tổ hợp di truyền (ñột biến thay ñổi bản chất kháng

nguyên - antigenic shift) là sự tái tổ hợp di truyền xảy ra ñịnh kỳ trong ñó có

sự sắp xếp lại các nucleotit do sự trộn lẫn 2 bộ gen của virus cúm khác nhau ðiều ñó ñã tạo nên những sai khác cơ bản về bộ gen của virus ñời con so với ñời bố mẹ Khi nhiều virus khác nhau cùng xâm nhập vào một tế bào chủ, các thế hệ virus ñược sinh ra sau có thể ñược sinh ra từ sự tái tổ hợp của các gen

bố mẹ xuất phát từ nhiều virus khác nhau Vì vậy do kiểu gen của virus type

A gồm 8 ñoạn gen nên từ 2 virus bố mẹ có thể xuất hiện 256 tổ hợp của các virus thế hệ sau (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2008)

Từ ñợt dịch cúm ñầu tiên tại Việt Nam, virus cúm type A H5N1 vẫn luôn tồn tại trong môi trường và ñã có những biến ñổi về mặt kháng nguyên

Theo Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự (2004,2008), virus cúm gây bệnh

từ cuối năm 2003 ñến nay chỉ là một loại duy nhất, có nguồn gốc từ virus

cúm lưu hành ở Trung Quốc, là virus A/Gs/Guangdong/1/96/H5N1 Sự xâm

nhập của subtype virus H5N1 gennotype Z-ñược WHO ký hiệu là nhánh 1 (clade 1) từ Trung Quốc ñã gây nên các ổ dịch lan tràn chưa từng thấy tại Việt Nam suốt từ Bắc ñến Nam Tuy nhiên, ñến năm 2005, một nhánh mới của subtype H5N1 là clade 2.3.2 (gennotype G) ñã ñược nhận biết tại nước

ta, dần thay thế cho clade 1 tại miền Bắc Trong khi ñó virus cúm thuộc clade 1 vẫn tiếp tục gây bệnh tại các tỉnh phía Nam

Theo Ken Inui (2008) [12] [13] cũng cho biết, trong vòng 10 năm, virus

cúm H5N1 (Gs/GD/1/96) ñã biến ñổi và tạo ra 9 clade HA trong dòng này

Trung Quốc có tất cả các clade này còn các nước láng giềng chỉ có một số clade Tại Việt Nam, các clade 3, 5 và 8 khó bám rễ, nhưng các clade 1 và 2

có thể tồn tại và gây thành dịch lớn Tuy nhiên, các loại vaccine cúm ñược sử dụng ở Việt Nam hiện vẫn có hiệu quả ñối với các clade này

* Sức ñề kháng của virus

Virus cúm type A tương ñối nhạy cảm với các chất hoá học như:formalin, natri hypochlorite 5,52%, axit pha loãng 2%… cồn 70% diệt virus nhanh chóng

Chất sát trùng alpha terpineol từ tinh dầu tràm có khả năng sát khuẩn và làm giảm sự nhân lên của virus H5N1 trên môi trường tế bào Tuy nhiên, cơ chế tác ñộng của chất này như thế nào cần nghiên cứu tiếp

Virus không bền với nhiệt ñộ, ở 50-600C chỉ vài phút là virus mất ñộc tính Virus trong nước niệu của phôi thai gà bảo tồn ñược vài tuần ở 40C; ở -700C có thể bảo quản virus lâu dài Dưới ánh nắng mặt trời chiếu trực tiếp virus chỉ sống ñược 40 giờ Tia cực tím có thể diệt virus dễ dàng Virus H5N1 còn có khả năng gây nhiễm sau 35 ngày sống trong phân, nước và ñất ở chuồng gia cầm Trong phủ tạng gà, virus tồn tại 24-39 ngày Trong máu và thịt gia cầm ñông lạnh, virus sống ñược tới 3 tuần

ðiểm ñẳng ñiện của virus tương ứng pH = 5,3 nên ở môi trường axit, ñộc tính của virus giảm nhanh hơn ở môi trường kiềm (Bùi Quang Anh và Văn ðăng Kỳ, 2004)

2.3 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm

* Loài vật mang virus

Virus cúm ñã ñược phân lập ở hầu hết các loài chim hoang dã như vịt

trời, thiên nga, hải âu, vẹt, mòng biển, diều hâu, chim họ sẻ , tuy nhiên tần suất và số lượng virus phân lập ựược ở loài thuỷ cầm ựều cao hơn các loài khác điều tra thuỷ cầm di trú ở Bắc Mỹ cho thấy trên 60% chim non bị nhiễm virus do tập hợp ựàn trước khi di trú

Trong các loài thuỷ cầm thì vịt trời có tỷ lệ nhiễm virus cao hơn cả Những virus này không gây bệnh cho vật chủ, mà ựược nhân lên trong ựường ruột và bài thải ra ngoài, trở thành nguồn reo rắc virus cho các loài khác, ựặc biệt là gia cầm (Bùi Quang Anh và Văn đăng Kỳ, 2004) Cuối tháng 10/2004, OIE, FAO và WHO ựã lưu ý các nước ựã trải qua dịch cúm gia cầm H5N1 rằng vịt nuôi có thể ựóng vai trò quan trọng trong việc làm lây lan chủng virus cúm gia cầm H5N1 thể ựộc lực cao cho các gia cầm khoẻ và rất có thể lây truyền virus trực tiếp cho con người vì vịt nuôi và gà nhiễm bệnh cùng bài thải lượng virus như nhau, nhưng vịt nuôi thường không thể hiện các triệu chứng lâm sàng bệnh lý (FAO, 2004) [26] điều này ựặc biệt có ý nghĩa ở vùng nông thôn, nơi có tập quán chăn nuôi vịt thả rông, các loài gia cầm thường ựược nhốt chung, sử dụng chung một nguồn nước Trên thực tế, trong cùng một khu vực có thể có một số ựàn gia cầm nhiễm virus và phát hiện bệnh, còn một số không phát bệnh mà chỉ có huyết thanh dương tắnh đó là virus bài thải ra từ vịt rất dễ bị thay ựổi tắnh kháng nguyên Những ựàn có huyết thanh dương tắnh ựã nhiễm virus H5N1 không cường ựộc hoặc nhiễm loài virus H5N1 không ựộc Hiện FAO và OIE ựang phối hợp ựánh giá vai trò của vịt nuôi nhằm ựưa ra chiến lược lâu dài với mục ựắch khống chế các ổ dịch cúm gia cầm ở châu Á

Virus cúm H5N1 lưu hành ở một số khu vực châu Á có ựộc lực với gà, chuột ựã ựược tăng lên và ựã mở rộng phổ gây bệnh của nó trên cả loài mèo Một số ựộng vật có vú như cầy vằn, chồn hay chó cũng nhiễm bệnh và bài thải virus (Tô Long Thành, 2005)

* ðộng vật cảm nhiễm

Bệnh cúm ñược phát hiện ở tất cả các loài chim thuần dưỡng (gia cầm, thuỷ cầm) hoặc chim hoang dã Gà, gà tây, chim cút, bồ câu, vịt, ngan ñều mắc bệnh Hiện ñã phân lập ñược virus từ vịt bầu, ngỗng, chim cút, gà gô, gà lôi Vịt nuôi nhiễm virus cúm nhưng khó phát hiện triệu chứng do vịt có sức ñề kháng cao với virus gây bệnh, kể cả với chủng có ñộc lực cao Các loài dã cầm cũng có thể bị bệnh nhưng khó có thể phát hiện ñược do cách sống hoang dã và ñặc tính

di trú của chúng ðây là nguồn tàng trữ và reo rắc virus nguy hiểm nhất (Phạm

Sỹ Lăng và cs, 2004)

Gà, ngan, vịt, chim cút mọi lứa tuổi ñều mắc bệnh cúm, nhưng ở 4-6 tuần tuổi là mẫn cảm nhất Gia cầm dễ mắc bệnh và có tỷ lệ chết cao nhất ở nơi bệnh phát ra lần ñầu và trong tuổi sắp ñẻ hoặc thời kỳ ñẻ cao nhất Gia cầm có khả năng sản xuất càng cao thì càng mẫn cảm với virus Con non và già mẫn cảm với mầm bệnh hơn con trưởng thành

Không chỉ ñối với loài chim, virus có thể gây bệnh cho các loài ñộng vật có vú khác như lợn, ngựa, chồn, hải cẩu, cá voi và cả con người Nhiều nghiên cứu mới ñây cho thấy loài mèo, vốn ñược coi là không cảm nhiễm với cúm, cũng mắc bệnh và chết (Tô Long Thành, 2005)

* Sự truyền lây

Khi gia cầm nhiễm virus cúm thì chỉ sau vài giờ virus ñược nhân lên rất nhanh trong ñường hô hấp và ñường tiêu hoá Sự truyền lây ñược thực hiện theo 2 phương thức là trực tiếp và gián tiếp:

- Lây trực tiếp do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thông qua các hạt khí dung ñược bài tiết từ ñường hô hấp hoặc qua phân, thức

ăn và nước uống bị nhiễm

- Lây gián tiếp qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gần hoặc những dụng cụ chứa virus do gia cầm mắc bệnh bài thải qua phân hoặc lây qua chim, thú, thức ăn, nước uống, lồng nhốt, quần áo, xe vận chuyển, côn trùng

Như vậy, virus cúm dễ dàng truyền qua những vùng khác do con người, phương tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi

ðối với gia cầm nuôi, nguồn dịch ñầu tiên thường thấy là:

- Từ các loài gia cầm nuôi khác nhau ở trong cùng một trang trại hoặc trang trại khác liền kề (như vịt lây sang gà)

- Lây truyền qua trứng

- Từ gia cầm nhập khẩu

- Từ chim di cư, ñặc biệt các loài chim nước di trú

- Từ người và các ñộng vật có vú khác (Bùi Quang Anh và Trần Hữu Cồn, 2004)

* Một số kết quả nghiên cứu của Viện thú y Việt Nam

Sự lưu hành của virus cúm gia cầm lần ñầu tiên ñược nghiên cứu tại Việt Nam, ñã phân lập các loại virus cúm trong ñàn gia súc và gia cầm, xác ñịnh sự có mặt của virus cúm thông qua việc phân lập virus và xét nghiệm huyết thanh Viện thú y cộng tác với cơ quan nghiên cứu trong và ngoài nước,

ñã phân lập và ñịnh typ 337 chủng virus cúm lưu hành trong ñàn gia cầm ở Việt Nam Qua kết quả nghiên cứu, Viện thú y có một số kết luận sau:

- Virus cúm gia cầm H5N1 gây bệnh cho gia cầm Việt Nam có nguồn gốc từ Trung Quốc và thuộc gennotype Z

- Trong các năm tiếp theo của ổ dịch, virus vẫn tiếp tục xâm nhập từ Trung Quốc vào Việt Nam, có thể thông qua ñường nhập lậu gia cầm Loại virus xâm nhập về sau, ngoài gennotype Z còn có cả genotype G, loại virus chuyên lưu hành ở Quảng Tây và Hồ Nam (Trung Quốc)

- Virus lưu hành ở Việt Nam luôn biến ñổi cấu trúc di truyền Chỉ riêng ñoạn gen tại vị trí tách ñã có 5 cấu trúc khác nhau

- Sự biến ñổi di truyền của virus cúm H5N1 tại Việt Nam ñã xảy ra tại

vị trí thụ thể của vị trí với tế bào

- Virus H5N1 gây bệnh cho gia cầm năm 2003 vẫn tồn tại ở Việt Nam

Các loại virus lưu hành ở phắa Nam ựã phát triển thành một nhóm riêng (nhóm S) và khác với nhóm virus (nhóm N) lưu hành ở phắa Bắc

-Virus cúm H5N1 có tắnh kháng nguyên rất ựa dạng từ khi xuất hiện tại Việt Nam và ựã xuất hiện một số chủng có tắnh kháng nguyên hoàn toàn khác

và ựược phân vào nhóm kháng nguyên HA genotyp G

- Xác ựịnh phương pháp chẩn ựoán virus cúm bằng phương pháp PCR, trong ựó xác ựịnh virus typ A trước (thông qua xác ựịnh gen M) sau ựó mới xét nghiệm các ựặc tắnh subtype khác

RT Nghiên cứu tình hình nhiễm virus H5N1 trong ựàn chim hoang dã cho thấy cò trắng có khả năng nhiễm virus H5N1 nhưng tỷ lệ thấp đối với loài thú, ngoài nghiên cứu về lợn, ựã phát hiện cầy hương tại rừng Cúc Phương bị chết do virus cúm H5N1 điều này cho thấy cần có các biện pháp an toàn sinh học cho các vườn quốc gia, nhất là các sở thú

- đã chế tạo thành công kháng nguyên HA H5N1 dùng trong giám sát huyết thanh cúm gia cầm Mặt khác cũng ựã chết tạo thành công kháng huyết thanh kháng H5N1 dùng trong nghiên cứu và chẩn ựoán bệnh

2.4 Triệu chứng và bệnh tắch bệnh cúm gia cầm

* Triệu chứng

Theo Lê Văn Năm (2004), thời kỳ ủ bệnh rất ngắn, từ vài giờ ựến 3 ngày sau khi virus xâm nhập vào cơ thể Thể quá cấp tắnh (hay gặp): xảy ra từ vài giờ ựến 24 giờ Thể cấp tắnh từ 1 ựến 4 ngày Thể á cấp tắnh (ắt gặp) có thể tới 7 ngày Bệnh lây lan rất nhanh, gây chết ác tắnh, chết nhanh và nhiều Biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh khác nhau, nó phụ thuộc nhiều yếu tố: chủng virus gây ựộc, số lượng virus xâm nhập, loài cảm nhiễm, tuổi, giới tắnh, chế ựộ dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ trước khi nhiễm, môi trường, sự cộng nhiễm cùng với các virus, vi khuẩn khác

Triệu chứng ựiển hình của bệnh cúm thể ựộc lực cao ở gia cầm là:

- Chết cao ựột ngột, tỷ lệ tử vong cao, có khi ựến 100%

- Có các biểu hiện ở ñường hô hấp như hắt hơi, thở khò khè, viêm xoang, chảy nhiều nước mắt, nước mũi, dịch nhày màu xám hoặc ñỏ xám

- Sưng phù ñầu và mặt, mào, tích sưng phù màu tím sẫm

- Xuất huyết dưới da (ñặc biệt dưới da chân), tím tái

- ðường tiêu hoá: ỉa chảy

- Thần kinh: Con vật ñi lại không bình thường, run rẩy, chệnh choạng,

co giật, mất thăng bằng, vận ñộng xoay tròn, nằm li bì tụm ñống với nhau

Trong một số trường hợp, bệnh bùng phát nhanh, trước khi gia cầm chết không thấy có biểu hiện lâm sàng (Bùi Quang Anh và Văn ðăng Kỳ, 2004)

Gia cầm bị nhiễm các chủng virus cúm có ñộc lực yếu hơn cũng có những triệu chứng tương tự, với mức ñộ nhẹ hơn và tỷ lệ chết thấp hơn

Các loài thuỷ cầm (vịt, ngan, ngỗng ) ít khi biểu hiện triệu chứng, nhưng nếu phát bệnh thì viêm xoang, viêm mí mắt, viêm ñường hô hấp, tỷ lệ chết cao

* Bệnh tích

Khi mổ khám gia cầm chết do cúm có thể thấy các bệnh tích ñặc trưng:

- Mào, tích sưng to tím sẫm, phù mí mắt Phù keo nhày và xuất huyết dưới da ñầu, cơ ñùi Xuất huyết thành dải, vệt dưới da chân

- Viêm cata và viêm tơ huyết niêm mạc khí quản, niêm mạc ñường tiêu hoá Khí quản phù, chứa nhiều dịch nhầy

- Tăng sinh túi khí, viêm tơ huyết tương mạc của các cơ quan nội tạng như: màng bao tim, màng gan, màng ruột xuất huyết mỡ vành tim

- Ruột viêm cata và xuất huyết Nội tạng xuất huyết, có thể hoại tử

- Lách, gan, thận, phổi sưng to, hoại tử Viêm ống dẫn trứng, vỡ trứng non Bệnh gây ra do các chủng virus có ñộc lực cao thì thấy tụ huyết, xuất huyết ở

da, gan, thận, tim, lách, phổi Nhưng gia cầm chết ñột ngột không có các bệnh tích này (Phạm Sỹ Lăng và cs, 2004)

2.5 Chẩn ựoán bệnh cúm gia cầm

* Chẩn ựoán dựa vào ựặc ựiểm dịch tễ, triệu chứng, bệnh tắch

Bệnh xảy ra dồn dập, nhanh chóng thành dịch Gà mọi lứa tuổi ựều mắc nhưng hay gặp nhất là gà từ 4 ựến 6 tuần tuổi đặc biệt bệnh nặng nhất ở gia cầm ựang ựẻ, ở giai ựoạn ựẻ cao nhất hoặc lần ựầu tiên bị bệnh cúm Triệu chứng ựiển hình: thở khó, viêm tịt mũi, sưng ựầu, phù mặt, thuỷ thũng, xuất huyết, hoại tử mào, tắch, xuất huyết dưới da thành vệt ựỏ Bệnh tắch ựiển hình: thịt thâm, viêm dắnh phúc mạc, cơ quan nội tạng bị teo, viêm xuất huyết và hoại tử buồng trứng, ống dẫn trứng viêm, vỡ trứng non

* Chẩn ựoán thường qui bệnh cúm gia cầm của trung tâm chẩn ựoán Thú y trung ương Ờ Cục thú y theo sơ ựồ sau:

2.6 đáp ứng miễn dịch chống virus cúm gia cầm

* đáp ứng miễn dịch không ựặc hiệu

Hệ thống miễn dịch không ựặc hiệu là hàng rào phòng thủ ựầu tiên

chống lại bất cứ vật ngoại lai nào xâm nhập vào cơ thể Chức năng này ựược thể hiện qua các cơ chế:

- Các hàng rào vật lý, hoá học: gồm da, màng nhầy, khu hệ sinh vật thường trú, các lông mao, axit trong dạ dày và các men tiêu hoá protein

- Hàng rào tế bào: các yếu tố kháng khuẩn có trong dịch tiết của cơ thể: gồm các Enzym, Interferon γ, các yếu tố gây hoại tử mô bào, tế bào thực bào (Nguyễn Hoài Tạo và Nguyễn Tuấn Anh, 2004)

* đáp ứng miễn dịch ựặc hiệu

Miễn dịch ựặc hiệu là trạng thái miễn dịch xuất hiện khi cơ thể ựã tiếp xúc với kháng nguyên và có phản ứng tạo ra kháng thể ựặc hiệu chống lại chúng Kháng thể ựặc hiệu có thể là dịch thể hoặc có thể là tế bào, ựó là các lympho T mẫn cảm Vì vậy người ta chia miễn dịch ựặc hiệu làm 2 loại:

+ đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

Trong miễn dịch qua trung gian tế bào, có sự tham gia của các tế bào lympho T, B và các ựại thực bào Tế bào T nhận biết kháng nguyên lạ sau khi

nó ựược các tế bào ựại thực bào xử lý và trình diện kháng nguyên Tế bào B thành thục trong túi Fabricius nhận biết các kháng nguyên hoà tan và trình diện chúng trên bề mặt Các tế bào mang dấu ấnTCD4 nhận biết các tế bào có kháng nguyên gắn với MHC lớp II, sau ựó tiết ra các lymphokin kắch thắch các tế bào B hoạt hoá thành tương bào sản xuất kháng thể tiêu diệt kháng nguyên Các tế bào TCD8 (T gây ựộc) có tác dụng gây dung giải các tế bào có mang kháng nguyên gắn với MHC lớp I Các tế bào T diệt tự nhiên có khả năng nhận biết nhiều loại kháng nguyên ngoại lai và kháng nguyên của chắnh

cơ thể vật chủ ựã bị biến ựổi, ựóng vai trò quan trọng trong tuần tra miễn dịch

và tiêu huỷ các tế bào lạ (Lê Thanh Hòa, Nguyễn Như Thanh, 1997)

+ đáp ứng miễn dịch dịch thể

Các globulin miễn dịch (Immuno globulin-Ig) hay kháng thể ựược tiết

ra bởi các tương bào là thành phần chắnh của miễn dịch dịch thể Kháng thể

có trong các dịch của cơ thể và ựược ựịnh lượng trong huyết thanh hoặc huyết tương Ở gia cầm có các lớp Ig chắnh là IgM, IgY và IgA (Ig Y của gia cầm chắnh là IgG của ựộng vật có vú)

Sau khi xuất hiện vài ngày, hàm lượng kháng thể trong máu tăng và các kháng thể ựầu tiên chủ yếu là IgM đáp ứng tiên phát cũng có IgG cũng

có nhưng hàm lượng thấp Sau ựó ựáp ứng miễn dịch chuyển sang sản xuất IgG đây là kháng thể chắnh sinh ra trong miễn dịch thứ phát và chiếm ưu thế trong máu của gia cầm Kháng thể IgM có thể phát hiện ở gia cầm chỉ sau khi

bị nhiễm 5 ngày trong khi kháng thể IgG chỉ phát hiện ở 7-9 ngày sau khi bị nhiễm Kháng thể liên kết một cách ựặc hiệu với kháng nguyên và trung hoà kháng nguyên, ựặc biệt ựối với các kháng nguyên là virus Kháng thể dịch thể chỉ có tác dụng với virus khi nó ở ngoài tế bào; lớp IgM, IgG kết hợp với virus với sự tham gia của bổ thể làm tiêu diệt virus Những virus bị trung hoà không thể bám vào ựiểm tiếp nhận trên bề mặt của tế bào ựắch và bởi vậy virus không nhân lên ựược đối với mầm bệnh là vi khuẩn, có thể nhân lên ngoài tế bào, nếu mầm bệnh bị bao bọc bởi kháng thể thì có thể bị nuốt vào trong tế bào và bị phá huỷ bởi thể thực bào Kháng thể bao quanh bề mặt mầm bệnh cũng có thể hoạt hoá bổ thể và sản xuất protein bổ thể mới Protein

bổ thể gắn với receptor của thể thực bào, kắch thắch cho sự thực bào phân huỷ mầm bệnh (Lê Thanh Hòa, Nguyễn Như Thanh, 1997)

tiên phát xuất hiện khi tiếp xúc lần ựầu với kháng nguyên, có ựộ dài miễn dịch ngắn, kết quả là tạo ra một nhóm các tế bào lympho T nhớ có tác dụng làm cho ựáp ứng miễn dịch khi phơi nhiễm lần sau với cùng loại kháng nguyên ựược tăng cường mạnh hơn đáp ứng miễn dịch này có sự tham gia ngay từ ựầu của các tế bào T nhớ Kháng thể ựược sản xuất ra nhanh hơn, nhiều hơn và ựáp ứng miễn dịch kéo dài hơn so với ựáp ứng miễn dịch tiên phát đây chắnh là cơ sở của việc tiêm phòng vaccine cúm và nhắc lại sau một thời gian ở gia cầm

Các y ếu tố ảnh hưởng ñến sự hình thành kháng thể:

- Bản chất kháng nguyên

- ðường xâm nhập của kháng nguyên

- Liều lượng kháng nguyên

- Số lần ñưa kháng nguyên vào cơ thể

Hiện nay, việc sử dụng vaccine ñược coi là cách ñể làm giảm thiệt hại

do bệnh cúm gia cầm gây ra ñối với ngành chăn nuôi gia cầm ở Châu Á Song ñiều này có thể dẫn ñến sự tiến hoá của các chủng virus ñang lưu hành thành các chủng mới (Phạm Sỹ Lăng và cs, 2004) Do ñó, sử dụng vaccine phải kết hợp chặt chẽ với giám sát sau tiêm phòng, giám sát lưu hành virus ở các ñàn

ñã ñược tiêm phòng ñể có biện pháp xử lý kịp thời

Dù ở quốc gia hay quốc tế, chính sách về kiểm soát bệnh Cúm gia cầm ñều ban hành khung hành pháp lý ñể ñảm bảo hoạt ñộng phòng chống dịch có hiệu quả

- Cấm buôn bán với các nước ñã xảy ra bệnh Cúm gia cầm

- Cấm vận chuyển gia cầm, khoanh vùng xung quanh khu vực dịch và tiến hành tiêu huỷ gia cầm nhiễm bệnh

- Tuyên truyền nâng cao nhận thức cho người chăn nuôi gia cầm và nhân dân về bệnh cúm gia cầm, biện pháp ngăn chặn lây lan …

* Áp dụng các biện pháp an toàn sinh học

- Cung cấp quần áo sạch và phương tiện tiêu ñộc cho người lao ñộng

- Vệ sinh tiêu ñộc kỹ lưỡng thiết bị và xe cộ ra vào trại

- Không ñưa gia cầm ñể giết mổ, ñặc biệt là từ các chợ buôn bán về trang trại

- Cùng nhập cùng xuất ñối với từng dãy chuồng…

* Áp dụng các biện pháp giám sát dịch bệnh

- Hạn chế tiếp xúc của con người với gia cầm và trại chăn nuôi gia cầm

- Khi có dịch phải thực hiện triệt ñể việc tiêu huỷ gia cầm, phân và các chất khác tại trại

- Ở các khu vực có nguy cơ dịch cao phải áp dụng các biện pháp an toàn sinh học

- Có bồn khử trùng cho phương tiện vận chuyển và trại nuôi gia cầm…

* Tiêm phòng

* Biện pháp tiêm phòng vaccine có 2 lợi thế cơ bản:

- Vaccine làm giảm sự cảm nhiễm của bệnh ñối với gia cầm ñã ñược tiêm phòng

- Giảm ñáng kể lượng virus bài thải ra môi trường bên ngoài ở gia cầm

ñã ñược tiêm phòng Như vậy, lượng virus ít ñi, giảm nguy cơ lây lan sang các gia cầm khác, giảm nguy cơ gây ô nhiễm cho con người và giảm cơ hội cho virus biến chủng tạo thành chủng virus cúm mới ở người

chất bổ trợ nhũ dầu ựể tăng tắnh kháng nguyên Sự tương ựồng giữa kháng nguyên vaccine với kháng nguyên của virus ở môi trường có cùng subtype

HA sẽ quyết ựịnh hiệu lực của vaccine (Tô Long Thành, 2007)

- Vaccine vô hoạt ựồng chủng: hiệu lực của vaccine này trong việc ngăn ngừa bệnh và giảm thải lượng virus ra ngoài môi trường ựã ựược chứng minh qua các thử nghiệm Tuy nhiên nhược ựiểm của các loại vaccine này là không phân biệt ựược gia cầm ựã tiêm vaccine với những con tiếp xúc với mầm bệnh, trừ những con chưa tiêm phòng ựược nhốt riêng ở trong chuồng

Vắ dụ: Vaccine H5N1 của hãngWeike (Trung Quốc)

- Vaccine vô hoạt dị chủng: loại vaccine này có ựặc ựiểm là chủng virus vaccine có kháng nguyên H giống với chủng virus trên thực ựịa nhưng có kháng nguyên N dị chủng đáp ứng miễn dịch sinh ra bởi nhóm kháng nguyên

H ựồng chủng, trong khi kháng thể chống N sản sinh ra bởi virus thực ựịa có thể coi như chất ựánh dấu sự lây nhiễm trên thực ựịa Vắ dụ: Vaccine vô hoạt dị chủng H5N2 của Intervet (Hà Lan), vaccine H5N2 của Weike (Trung Quốc)

Trong hai loại vaccine ựồng chủng và dị chủng, mức ựộ bảo hộ lâm sàng và việc làm giảm thải trừ virus ra môi trường của vaccine ựồng chủng cải thiện hơn, do cùng một khối lượng vaccine thì vaccine ựồng chủng có nhiều kháng nguyên hơn Việc lựa chọn vaccine dị chủng cho phép áp dụng

chiến lược DIVA (Difference Infection between Vaccination) nhằm phân biệt

con nhiễm bệnh tự nhiên với con tiêm vaccine (Tô Long Thành, 2007) (D.L Suares và Mary J.Pantin-Jack wood, 2008)

Vaccine tái tổ hợp cho phép phân biệt giữa ựộng vật nhiễm bệnh và ựộng vật ựược tiêm vaccine, vì chúng không sản sinh kháng thể chống lại kháng nguyên nucleoprotein phổ biến ở tất cả các virus cúm gia cầm Chỉ những ựộng vật nhiễm bệnh trên thực ựịa mới tạo ra kháng thể nhóm A (nucleoprotein) và phát hiện ra kháng thể này qua phản ứng kết tủa kép trên

thạch hoặc phản ứng ELISA Việc sử dụng các vaccine này cũng được giới hạn với những lồi mà virus đích sẽ nhân lên hoặc chỉ giới hạn trong đàn gà

cĩ huyết thanh âm tính đối với virus đích Ví dụ: vaccine sống Trovac (virus đậu tái tổ hợp cúm H5) của Merial và H5N1 củaWeike (Trung Quốc)

* Tình hình sử dụng vaccine cúm gia cầm trên thế giới

Mặc dù cĩ một số loại vaccine đã được nghiên cứu và thử nghiệm trong phịng thí nghiệm về khả năng ứng dụng ngồi thực địa nhưng chỉ cĩ 2 loại , 2007) (Guus kock, 2007)

Trung Quốc là nước sử dụng nhiều vaccine cúm nhất Trung Quốc đã

cĩ bản tường trình về kết quả của các loại vaccine đang được sử dụng tại nước này, bao gồm:

- Vaccine vơ hoạt chủng H5, N-28: được phê chuẩn từ tháng 12/2003

và được sử dụng rộng rãi ở Trung Quốc trong các ổ dịch cúm gia cầm thể độc lực cao vào đầu năm 2004

- Vaccine vơ hoạt virus cúm tái tổ hợp (subtype H5N1, chủng Re-1): được phê chuẩn tháng 1/2005 Vaccine được đánh giá là rất cĩ hiệu quả trong tạo miễn dịch chống cúm với hiệu giá kháng thể cao và thời gian bảo hộ dài hơn Thuỷ cầm được tiêm vaccine này khơng bị nhiễm và bài thải virus cúm

- Vaccine sống virus đậu tái tổ hợp phịng cúm gia cầm H5: được phê chuẩn tháng 1/2005 và được nhiều nước sử dụng như Trung Quốc, Mexico sử dụng loại vaccine này cĩ thể phân biệt được miễn dịch do tiêm phịng vaccine hay bị nhiễm tự nhiên (Garcia-Garcia Et al, 1998) (Mingxiao M Et al, 2006)

- Hiện Trung Quốc đang đưa vào sử dụng một loại vaccine mới là vaccine dạng vơ hoạt nhũ dầu H5N1 chủng Re-5

* Những điểm chú ý khi sử dụng vaccine cúm gia cầm

Theo quan điểm của OIE, FAO, thì vaccine nên được sử dụng trong một chiến lược tồn diện phịng chống bệnh cúm gia cầm, bao gồm 5 bước là:

an tồn sinh học, nâng cao nhận thức người dân, chẩn đốn và giám sát, loại

bỏ gia cầm nhiễm bệnh và sử dụng vaccine (Lê Văn Năm, 2007)

Trước khi sử dụng vaccine cần phải lưu ý những vấn ñề sau:

- Vaccine sử dụng phải cùng subtype H và phải ñược chứng minh trên bản ñộng vật là có ñủ khả năng bảo hộ chống lại sự xâm nhập của virus thực ñịa

- Vaccine cần phải ñược sản xuất theo công nghệ ñã tiêu chuẩn hoá ñể ñảm bảo có một vaccine hiệu quả và phù hợp về chủng virus

- Cần có các hoạch ñịnh trước về bảo quản tốt vaccine, phân phối sử dụng vaccine hợp lý

- ðảm bảo ñược việc giám sát huyết thanh học và virus học ñể xác ñịnh virus cường ñộc có lưu hành trong ñàn gia cầm ñược dùng vaccine hay không

- Phải có một kế hoạch loại trừ ñể phòng tránh việc sử dụng vĩnh viễn vaccine

* Tình hình sử dụng vaccine cúm gia cầm tại Việt Nam

Từ tháng 7/2005, “Dự án sử dụng vaccine nhằm khống chế và thanh toán bệnh cúm gia cầm” ñã triển khai tại Việt Nam Mỗi năm có 2 ñợt tiêm phòng vào tháng 4-5 và tháng 9-10, trước thời ñiểm dịch cúm gia cầm có nguy cơ bùng phát cao nhất Một số loại vaccine ñược sử dụng ở Việt Nam như:

- Vaccine nhũ dầu vô hoạt H5N2 (Trung Quốc): là loại vaccine dị chủng bất hoạt, sử dụng chủng virusA/Turkey/England/N28/73 (H5N2)

- Vaccine vô hoạt dạng nhũ dầu H5N1 (Trung Quốc): là loại vaccine ñồng chủng bất hoạt, sử dụng chủng virus A/Harbin/Re-1/2003

- Vaccine Nobilis Influenza H5 (Hà Lan): là loại vaccine dị chủng, sử dụng chủng virusA/chicken/Mexico/232/94/CPA

- Vaccine Trovac AIV H5 (vaccine ñậu-cúm dạng sống, ñông khô): là vaccine chứa virus ñậu gà sống làm vectơ có mang gen virus cúm gia cầm chủng A, sử dụng chủng A/Turkey/Treland/1378/83

- Hiện Việt Nam ñang thí nghiệm ñể ñưa vào sử dụng một loại vaccine mới là vaccine dạng vô hoạt nhũ dầu H5N1 chủng Re-5

PHẦN 3 đỐI TƯỢNG NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 3.1 đối tượng nghiên cứu

- Các ựàn vịt, ngan nuôi tại 4 xã: Xuân Nộn, Cổ Bi, Kim Sơn, đa Tốn thuộc 2 huyện Gia Lâm, đông Anh (Hà Nội)

- Virus cúm gia cầm phân lập trên ựàn thuỷ cầm nuôi tại 4 xã: Xuân Nộn, Cổ Bi, Kim Sơn, đa Tốn thuộc 2 huyện Gia Lâm, đông Anh (Hà Nội)

3.2 Nội dung nghiên cứu

- điều tra tình hình chăn nuôi và tình hình sử dụng vaccine tại một số xã ở

2 huyện Gia Lâm, đông Anh (Hà Nội)

- Giám sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm trên ựàn thuỷ cầm tại một số xã ở 2 huyện Gia Lâm, đông Anh (Hà Nội)

- Giám sát huyết thanh học ựối với ựàn thuỷ cầm ựã tiêm vaccine tại một số xã ở 2 huyện Gia Lâm, đông Anh (Hà Nội)

- Dịch ổ nhớp, hầu họng của vịt, ngan

- Huyết thanh của vịt, ngan không tiêm phòng vaccine cúm gia cầm

- Huyết thanh của vịt, ngan ựã tiêm phòng vaccine cúm gia cầm

+ Môi trường kiểm tra vi khuẩn: nước thịt, nước thịt gan yếm khắ, thạch thường, thạch Sabourand

+ Các dụng cụ và thiết bị thắ nghiệm của phòng thắ nghiệm tại bộ môn

Vi sinh vật Ờ Truyền nhiễm, khoa Thú y, trường đại học Nông nghiệp Hà nội

3.4 ðịa điểm và thời gian nghiên cứu

- ðịa điểm nghiên cứu: Bộ mơn vi sinh vật – truyền nhiễm, khoa Thú y, trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội và Trung tâm chẩn đốn Thú y Trung ương

- Thời gian nghiên cứu: Năm 2010

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp điều tra

- ðiều tra trực tiếp

- Dựa vào thơng tin thứ cấp, qua tài liệu của thú y xã và người chăn nuơi

3.5.2 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu

* Lấy mẫu để phân lập virus:

Với thuỷ cầm sống, bệnh phẩm thường lấy là dịch ngốy họng, dịch ổ nhớp

Cách lấy:

+ Dịch ngốy họng: Dùng tăm bơng vơ trùng cho vào miệng ngốy quanh thành họng thuỷ cầm, giữ vài giây rồi rút que từ từ theo đường xốy, cho ngay vào ống typ đựng mơi trường bảo quản (dùng mơi trường MEM), đậy nắp kín

+ Dịch ngốy ổ nhớp: Dùng tăm bơng vơ trùng cho sâu vào hậu mơn thuỷ cầm, ngốy quanh thành hậu mơn rồi rút ra cho ngay vào typ đựng mơi trường bảo quản, đậy nắp kín

+ Xử lý mẫu bệnh phẩm:

Lấy mẫu bệnh phẩm từ trong tủ lạnh âm, làm băng tan Ép kỹ bơng lên thành ống nhiều lần để vắt hết bệnh phẩm vào mơi trường sau đĩ bỏ bơng đi Cho vào bệnh phẩm một lượng kháng sinh: 1 triệu đơn vị Penicilin và 1g Streptomycin trong 1 lít huyễn dịch, để ở tủ lạnh 40C trong thời gian ít nhất 1 giờ Ly tâm nhẹ 2000 vịng/phút/5phút; loại bỏ cặn, lấy dịch nổi phân lập virus

* Lấy mẫu kiểm tra huyết thanh học

Lấy máu của thuỷ cầm, chắt huyết thanh làm phản ứng huyết thanh học Cách lấy máu: Dùng syringe lấy 2ml máu tĩnh mạch cánh của thuỷ cầm, cho vào ống nghiệm nhỏ, ñặt nằm ngang cho máu ñông, ñể ở tủ lạnh

40C, chắt huyết thanh cho vào ampul, hàn kín Bảo quản huyết thanh ở -860C trước khi xét nghiệm

3.5.3 Phương pháp phân lập virus trên phôi trứng

- Chọn trứng có phôi 9-10 ngày tuổi khoẻ mạnh, 3 trứng/1 bệnh phẩm

- Lau trứng bằng cồn 700 và ñục lỗ nhỏ ở phía trên buồng hơi

- Dùng syringe 1ml hút dịch bệnh phẩm ñã xử lý ở trên tiêm vào xoang niệu mô với lượng 0,2ml/trứng

- Gắn lỗ tiêm bằng farafin Ấp trứng tiếp 7 ngày ở nhiệt ñộ 370C

- Theo dõi sau khi tiêm, soi trứng ngày 2 lần, trứng chết ñược cất vào tủ lạnh 40C Sau thời gian ấp, trứng chết hoặc sống ñược cất vào tủ lạnh 40C qua hoặc ít nhất 4 giờ trước khi thu hoạch

- Lau trứng bằng cồn 700 Sát trùng vùng buồng hơi bằng cồn Iot 5% Dùng kéo vô trùng cắt vỏ trứng, bộc lộ buồng hơi, bộc lộ xoang niệu mô

- Thu dịch niệu mô vào ống nghiệm, bảo quản ở -860C

- Kiểm tra sự có mặt của virus gây ngưng kết hồng cầu bằng phản ứng HA

- Giám ñịnh virus cúm gia cầm bằng phản ứng HI với kháng huyết thanh chuẩn serotype H5

3.5.4 Phương pháp làm phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)

+ Nước trứng nghi chứa virus gây ngưng kết hồng cầu

+ Virus chuẩn ñã biết: Inactivated antigen H5N1 ðược chế bằng cách: Virus cúm subtype H5N1 ñược tiêm truyền vào xoang niệt mô của phôi

gà Sau khi virus nhân lên, thu hoạch nước trứng, vô hoạt virus bằng propiolacton Khi dùng pha kháng nguyên cho phản ứng HI là 4 ñơn vị HA/25µl

β Hồng cầu gà 1%: ñược chế từ gà trống trưởng thành, khoẻ mạnh có phản ứng HI âm tính

Cách làm:

Lấy máu tĩnh mạch cánh của gà, chống ñông máu bằng Xitrat Natri 5%

Ly tâm 1500 vòng/phút/10 phút, loại bỏ huyết tương ở trên Cho dung dịch PBS (pH = 7,2) vào, trộn ñều, ly tâm 1500 vòng/phút, loại bỏ nước trong

ở trên Làm như vậy trong 3 lần, nước ở bên trên trong là ñược Lấy 1 ml hồng cầu ñặc cho vào 99 ml PBS, lắc nhẹ, ñược hồng cầu 1%

- Cho 100 µl nước trứng chứa virus vào lỗ 1

- Pha loãng kháng nguyên (virus) theo bậc 2 Chuyển 50 µl từ lỗ 1 sang

lỗ 2, trộn ñều hỗn dịch ở lỗ 2 Hút 50 µl từ lỗ 2 sang lỗ 3 Làm như vậy pha loãng kháng nguyên ñến lỗ 11, rồi hút bỏ ñi 50µl

- Lỗ 12 làm ñối chứng chỉ chứa 50µl PBS

- Cho 50µl hồng cầu gà 1% vào tất cả các lỗ

- Lắc nhẹ tấm nhựa ðể ở nhiệt ñộ phòng thí nghiệm, 20 phút sau ñọc kết quả

ðọc kết quả

- Phản ứng dương tính: Hồng cầu bị ngưng kết nằm rải ñều ở ñáy lỗ

- Hiệu giá của phản ứng ngưng kết hồng cầu: Là ñộ pha loãng virus cao nhất mà ở ñó vẫn còn virus gây ngưng kết hồng cầu Người ta gọi ñó là 1 ñơn

vị HA

- Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống ñáy thành cục tròn, nước bên trên trong giống như lỗ ñối chứng

Trong trường hợp xác ñịnh virus gây ngưng kết hồng cầu

- Nếu phản ứng HA dương tính, chứng tỏ trong nước trứng có virus gây ngưng kết hồng cầu Tiếp tục làm phản ứng HI giám ñịnh virus cúm với kháng huyết thanh chuẩn của một số subtype virus cúm

- Nếu phản ứng HA âm tính, phôi phát triển bình thường, tiêm lại lần 2 trên trứng

3.5.5 Phương pháp làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu - phản

ứng HI

* Ứng dụng

Trong bệnh cúm gia cầm, phản ứng HI thường ñược sử dụng ñể:

- Giám ñịnh serotype virus cúm gia cầm phân lập ñược

- Huyết thanh cần kiểm tra:

ðược tách từ máu của thuỷ cầm sau khi dùng vaccine Bảo quản ở -860C

- Hồng cầu gà 1%

Pha kháng nguyên 4HA/25µl

Lấy ñộ pha loãng cuối cùng có phản ứng ngưng kết hồng cầu 1HA nhân với 4 Ví dụ: Hiệu giá ngưng kết hồng cầu của dịch niệu mô là 1/64 ñơn vị

4HA = 4 x 1/64 = 1/16 Như vậy trộn 1 phần nước trứng với 15 phần PBS ñể ñạt ñược dung dịch kháng nguyên 4HA

Chu ẩn ñộ kháng nguyên 4HA

Sau khi pha, kháng nguyên 4HA phải ñược chuẩn ñộ lại

- Pha chuẩn: Ngưng kết hồng cầu xảy ra ở 2 giếng ñầu

- Pha không chuẩn: Nếu ngưng kết ñến giếng thứ 3 tức là thừa kháng nguyên Như vậy hỗn dịch kháng nguyên có 8HA phải ñược pha loãng (có thể gấp ñôi) ñể có ngưng kết ñến giếng thứ 2 Nếu ngưng kết chỉ xảy ra ở giếng 1 tức là thiếu kháng nguyên

Ti ến hành phản ứng HI:

Thực hiện phản ứng trên tấm nhựa vi ngưng kết 96 lỗ ñáy chữ U, chữ V (12x8) Mỗi mẫu huyết thanh dùng 1 dãy lỗ

- Cho 25µl PBS vào các lỗ từ 2 ñến 12

- Cho 50µl huyết thanh cần kiểm tra vào lỗ 1

- Pha loãng huyết thanh theo bậc 2: Chuyển 25µl huyết thanh từ lỗ 1 sang lỗ 2, trộn ñều, hút 25µl từ lỗ 2 sang lỗ 3 Làm như vậy pha loãng huyết thanh ñến lỗ 11, hút bỏ ñi 25µl

Hiệu giá của phản ứng HI: là ñộ pha loãng huyết thanh cao nhất mà ở

ñó vẫn còn khả năng ngăn trở ngưng kết hồng cầu

- Phản ứng HI âm tính: Hồng cầu bị ngưng kết nằm rải ñều thành mảnh

- Nước cất vô trùng (RNase free H2O)

- Dung dịch rửa RW1 buffer

- Dung dịch rửa RPE buffer

- Quiagen®buffer RLT có b-ME

- Cồn Ethanol 70%

- Trizol® LS reagent; Isopropanol; Chloroform

- RNA ñối chứng dương tính M, H5 và H7 (ñược NVSL cung cấp)

- Kít chiết tách Qiagen® Rmeasy Extraction

- Kít RT/PCR One-Step RT/PCR với Platinium taq DNA polymerase

- Mẫu dò Primer: có thể ñặt primer và mẫu dò Integarated DNA technogies, trình tự chuỗi của mẫu dò và primer cho RT/PCR phát hiện cúm gia cầm (xem phụ lục 2)

- RNase Inhibitor (13,3 units/µl); MgCl2; ñệm TE PH 8.0, 1 x

- β-Mercap toetanol (β-ME)

Khi sử dụng phải dùng băng hút, ñeo găng

- Hạt chất phản ứng M và H5 cho AVI RT/PCR

- Chất ñiều khiển trong M là một ARN chuỗi ñơn ñã phiên mã

Chất phản ứng có thể bảo quản trong túi thiếc ở 40C trong 6 tháng Không cởi bỏ túi nếu chưa sử dụng

- Lắc mạnh (bằng máy Votex) ống chứa dịch ngoáy và chuyển lượng 500µl sang ống ly tâm nhỏ và ghi ký hiệu mẫu

- Cho 500µl Qiagen® buffer RLT có b-ME vào ống ly tâm trên Lắc ñều trên máy Votex

- Ly tâm (bằng máy Spindown) ñể dịch bệnh phẩm ñọng trên nắp trôi xuống ñáy ống Cho 500µl cồn ETOH 70% (ethanol), lắc mạnh bằng Votex

Ly tâm mẫu ñã bị dung giải trong 5 phút ở tốc ñộ 5000xg ở nhiệt ñộ phòng

- Chuyển tất cả dịch nổi chứa mẫu bị dung giải sang cột RNeasy®Qiagen ñã ghi sẵn ký hiệu mẫu Ly tâm trong 15 giây tốc ñộ ≥ 8000xg ở nhiệt ñộ phòng Kiểm tra dịch mẫu ñã thấm qua cột lọc chưa Lặp lại bước này cho toàn bộ mẫu ñã qua cột lọc

Ngoài ra có thể dùng ống hút Quivac® ñể hút dịch mẫu và rửa thông qua cột thu mẫu Phương pháp này làm tăng hiệu quả và không phải ly tâm cột lọc

- Bổ sung 700µl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy®Qiagen, ly tâm trong 15 giây ở tốc ñộ ≥ 8000 xg, thay ống thu mẫu mới (collection tube) vào cột lọc

- Cho 500µl RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm trong 15 giây ở tốc

ñộ ≥ 8000xg, thay ống thu mẫu mới vào cột lọc

- Lặp lại bước trên 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer Sau lần rửa cuối cùng thay ống thu mẫu mới loại 2ml vào cột lọc

- Ly tâm cột lọc trống không trong 2 phút ở tốc ñộ tối ña (khoảng 12.000 vòng/phút), bỏ ống thu mẫu

- ðặt cột lọc vào ống thu hoạch hoặc ống 1,5 ml ñã ñược ghi sẵn ký hiệu mẫu Cho 50µl RNase free vào cột lọc Chú ý không ñược chạm ñầu