Luận văn phân lập,xác định tính đặc sinh vật học,độc lực và định type 3 loại vi khuẩn pasteurrella, streptococus và actinobacillus từ phôi lợn trong đàn sảy ra hội chứng rối loạn

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-


    -

ðỖ XUÂN THỬ

PHÂN LẬP, XÁC ðỊNH ðẶC TÍNH SINH VẬT HỌC, ðỘC LỰC VÀ

ðỊNH TYPE 3 LOẠI VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA,

ðÀN SẢY RA HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, Ngày tháng năm 2009

Tác giả

ðỗ Xuân Thử

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn này, cùng với sự lỗ lực cố gắng của bản thân, tôi xin ñược ñặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy: TS Nguyễn Ngọc Nhiên, người ñã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin ñược chân thành cảm ơn tới thầy: PGS TS.Trương Quang, các thầy cô trong bộ môn Vi sinh vật truyền nhiễm cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Thú y; Viện sau ðại học – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn Ban lãnh ñạo Viện Thú y, các anh, chị, em Bộ môn Tiến bộ triển khai và bộ môn Vi trùng- Viện Thú Y, Lãnh ñạo Công ty Cổ phần giống Bò sữa Mộc Châu, Chi cục Thú y các tỉnh Thái Bình, Hải Phòng, Hưng Yên, Bắc Ninh và các bạn ñồng nghiệp ñặc biệt là gia ñình ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất giúp ñỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này

Hà Nội, Ngày tháng năm 2009

Tác giả

ðỗ Xuân Thử

2.2 Vi khuẩn Streptococcus suis và bệnh liên cầu khuẩn do vi khuẩn

4.3 Kết quả phân lập các loại vi khuẩn P multocida, A pleuropneumoniae,

4.4 Kết quả giám ñịnh hình thái, nuôi cấy và một số ñặc tính sinh hoá

4.4.2 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hoá của các vi khuẩn

4.4.3 Kết quả kiểm tra khả năng lên men ñường của các vi khuẩn phân

4.5.1 Kết quả kiểm tra ñộc lực của vi khuẩn P multocida phân lập ñược 53 4.5.2 Kết quả kiểm tra ñộc lực của vi khuẩn A pleuropneumoniae phân

lập ñược ít nhất 1 trong 3 loại vi khuẩn P multocida, A

DANH MỤC BẢNG

4.4 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hoá của các chủng vi

4.5 Kết quả kiểm tra khả năng lên men ñường của các chủng vi

4.6 Kết quả kiểm tra tính chất sinh hóa của các chủng vi khuẩn

4.8 Kết quả kiểm tra ñộc lực của vi khuẩn A pleuropneumoniae phân

4.9 Kết quả xác ñịnh serotype của các chủng vi khuẩn

4.11 Kết quả kiểm tra các mẫu dương tính với PRRS ñồng thời phân lập

ñược 3 loại vi khuẩn P multocida, A pleuropneumoniae và S

DANH MỤC ẢNH

4.1 Khuẩn lạc của vi khuẩn Pasteurella phân lập ñược trên môi

4.3 Khuẩn lạc của vi khuẩn Actinobacillus phân lập ñược trên môi

1 ðẶT VẤN ðỀ

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome - PRRS) còn gọi là bệnh Tai xanh là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, lây lan nhanh ở ñàn lợn mọi lứa tuổi với tỷ lệ ốm và chết cao Hội chứng này lần ñầu tiên ñược phát hiện ở Mỹ vào năm 1987 Từ ñó ñến nay bệnh ñã lây lan và bùng phát thành các ổ dịch lớn ở nhiều nước khác thuộc Bắc Mỹ, châu Âu, và châu Á, gây tổn thất lớn về kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn trên thế giới Theo kết quả ñánh giá thì hàng năm nước Mỹ phải gánh chịu những tổn thất và chi phí cho công tác phòng chống bệnh lên ñến

560 triệu USD

Cho ñến nay ñã có nhiều biện pháp khống chế bệnh ñược ñưa ra nhưng những tổn thất liên quan ñến PRRS vẫn còn tiếp tục xảy ra ở nhiều nước trên thế giới Vì vậy, những hiểu biết sâu về bệnh là một trong những khâu quan trọng trong công tác phòng chống dịch nhằm giảm thiểu những tổn thất không ñáng có

Ở Việt nam, dịch Tai xanh nổ ra lần ñầu tiên vào tháng 3 năm 2007 ở tỉnh Hải Dương, sau ñó lây lan nhanh và ñã xuất hiện từng ñợt tại cả 3 miền

sinh xã hội cho các ñịa phương này ðến nay, bệnh ñã và ñang ñược từng bước khống chế nhưng vẫn còn diễn biến phức tạp Nguy cơ dịch tái bùng phát, lây lan ở tất cả các ñịa phương trong cả nước là rất cao

Thực tế cho thấy ở trong vùng dịch, tỷ lệ lợn mắc bệnh chết hoặc phải tiêu hủy là rất cao ðiều này có thể ñược giải thích một phần là do sự nhiễm trùng kế phát ở những lợn mắc bệnh, làm tình trạng bệnh trầm trọng hơn, dẫn ñến tỷ lệ chết cao Những nguyên nhân gây nhiễm trùng kế phát có thể kể ñến

những vi khuẩn như: Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae,

Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae, … Tuy nhiên chưa

có một nghiên cứu chính thức nào ñược tiến hành ñể xác ñịnh vai trò của những vi khuẩn này trong PRRS

Xuất phát từ yêu cầu của thực tiễn, với mục ñích tìm hiểu vai trò gây bệnh của những vi khuẩn kế phát này trong hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn, từ ñó ñưa ra ñược biện pháp phòng chống có hiệu quả, giảm bớt thiệt hại do bệnh gây ra, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:

“Phân lập, xác ñịnh ñặc tính sinh vật học, ñộc lực và ñịnh type 3 loại vi khuẩn Pasteurella multocida, Streptococcus và Actinobacillus từ phổi lợn trong ñàn sảy ra hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRS) tại một số tỉnh phía Bắc ”

Mục tiêu của ñề tài

- Xác ñịnh ñược tình hình hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở ñàn lợn

nuôi tại một số tỉnh Thái Bình, Hải Phòng, Hưng Yên và Bắc Ninh

- Xác ñịnh vai trò gây bệnh của vi khuẩn kế phát trong hội chứng hô hấp và

sinh sản ở lợn

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome - PRRS) ñược ghi nhận lần ñầu tiên trên thế giới vào năm 1987 ở Mỹ tại vùng bắc của bang California, bang Iowa và Minnesota Năm 1988 bệnh lan sang Canada Sau ñó bệnh xuất hiện ở một số nước Châu

Âu như ðức năm 1990, Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh năm 1991 và Pháp năm 1992

Thời gian ñầu do chưa xác ñịnh ñược nguyên nhân nên người ta ñặt nhiều tên gọi như: Bệnh bí hiểm ở lợn (Mistery Disease of Swine – MDS), Bệnh Tai xanh (Blue Ear Disease – BED), Hội chứng hô hấp và xảy thai ở lợn (Porcine Endemic Abortion and Respiratory Syndrome – PEARS)…

Năm 1992, tại Hội nghị quốc tế về hội chứng này ñược tổ chức tại Minesota (Mỹ), Tổ chức Thú y thế giới (OIE) ñã thống nhất tên gọi là Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS)

Từ năm 2005 trở lại ñây, 25 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục trên thế giới ñều có dịch PRRS lưu hành (trừ châu Úc và Newzeland) Có thể khẳng ñịnh rằng PRRS là nguyên nhân gây tổn thất kinh

tế cho ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc gia trên thế giới (Nguyễn Bá Hiên và

cs, 2007)[3]

Tại Việt Nam, PRRS ñược phát hiện trên ñàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam năm 1997, kết quả kiểm tra huyết thanh học cho thấy 10/51 lợn giống nhập khẩu ñó có huyết thanh dương tính với PRRS Tuy nhiên, sự bùng phát thành dịch và gây tổn thất lớn ñáng báo ñộng cho ngành chăn nuôi lợn thực sự mới bắt ñầu từ tháng 3/2007, do không quản lý ñược việc buôn bán, vận chuyển lợn ốm

Theo báo cáo của Cục Thú y quốc gia, kể từ tháng 3 năm 2007 ựến nay, trên cả nước dịch tai xanh ựã bùng phát thành 4 ựợt lớn:

- đợt dịch thứ nhất diễn ra từ ngày 12/03/2007 ựến 15/5/2007

đây là lần ựầu tiên dịch PRRS bùng phát trên ựàn lợn nước ta Bắt ựầu tại Hải Dương sau ựó ựã lây lan nhanh và phát triển mạnh ở 07 tỉnh ựồng bằng Sông Hồng ựó là Hải Dương, Hưng Yên, Quảng Ninh, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang và Hải Phòng Số lợn mắc bệnh là 31.750 con, số lợn chết và

xử lý là 7.296 con Sau hơn 1 tháng tắch cực khống chế, dịch PRRS ở vùng này ựã tạm thời ựược dập tắt

- đợt dịch thứ hai diễn ra từ ngày 25/06/2007 ựến 11/12/2007

Dịch bắt ựầu xuất hiện tại tỉnh Quảng Nam, sau ựó lây lan ra 14 tỉnh, thành phố là Cà mau, Long An, Bà Rịa - Vũng Tàu, Khánh Hòa, Bình định, Quảng Ngãi, Quảng Nam, đà Nẵng, Thừa Thiên Huế, Quảng Trị, Lạng Sơn,

Hà Nội, Thái Bình, Hải Dương Tổng số lợn ốm là 38.827 con, số ựã chết và

xử lý là 13.070 con Như vậy, trong năm 2007, dịch Tai xanh ựã xuất hiện tại

19 tỉnh, thành phố Tổng số lợn mắc bệnh là 70.577 con, số chết và phải tiêu hủy là 20.366 con

- đợt dịch thứ ba diễn ra từ ngày 28/03/2008 ựến 20/5/2008

Dịch xuất hiện ở nhiều xã thuộc 10 tỉnh miền bắc trung bộ như Hà Tĩnh, Lâm đồng, Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Nghệ An, Thanh Hóa, Ninh Bình, Nam định, Thái Bình và Thái Nguyên Tổng số lợn mắc bệnh là 271.439 con, số chết và phải tiêu hủy là 270.393 con

- đợt dịch thứ tư diễn ra từ ngày 04/6/2008 ựến ngày 22/8/2008

Trong ựợt này, dịch bệnh xảy ra lẻ tẻ ở 128 xã trên 38 huyện thị của 17 tỉnh thành thuộc cả ba miền Bắc, Trung, Nam nhưng với quy mô nhỏ hơn so với các ựợt trước ựó Số lợn ốm là 37.247 con, trong ựó số lợn chết và tiêu huỷ là 29.383 con

Như vậy, tại Việt Nam, PRRS có thể sẽ có những diễn biến phức tạp và

có nguy cơ bùng phát ở tất cả các ñịa phương trong cả nước

Nguyên nhân gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản của lợn là một virut thuộc họ Arteriviridae, có cấu trúc vỏ bọc dạng chuỗi ñơn RNA Các thành viên trong họ Arteriviridae có cấu trúc và sự nhân lên giống với virut họ Coronaviridae Sự khác biệt giữa hai họ virut này chính là bộ gen của Arteriviridae chỉ bằng 1/2 bộ gen của Coronaviridae và nét giống nhau ñặc trưng của chúng là bản sao mã giống nhau ñặc trưng của lớp Nidoviral Họ Arteriviridae chỉ có 1 giống duy nhất

Năm 1991, Viện Thú y Lelystad (Hà Lan) ñã phân lập thành công virut gây ra PRRS, sau ñó là Mỹ và ðức Ngày nay, virut ñược gọi là Lelystad ñể ghi nhớ sự kiện nơi ñầu tiên virut này ñược phân lập Tuy nhiên, PRRSV vẫn

là tên gọi phổ biến

Hiện nay, dựa trên việc phân tích cấu trúc gen, người ta ñã xác ñịnh ñược virut gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản có 2 nhóm Nhóm I gồm các virut thuộc chủng châu Âu (tên gọi phổ thông là virut Lelystad) gồm

4 phân nhóm (subtype) ñã ñược xác ñịnh Nhóm II gồm các virut thuộc dòng Bắc Mỹ (tiêu biểu cho nhóm này là chủng virut VR-2332) Sự khác nhau về cấu trúc chuỗi nucleotide của virut thuộc hai chủng là khoảng 40%, do ñó ảnh hưởng ñến ñáp ứng miễn dịch bảo hộ chéo giữa hai chủng (Bùi Quang Anh và

cs, 2008)[2]

Những nghiên cứu gần ñây ở Trung Quốc cho thấy, virut PRRS tồn tại dưới hai dạng: dạng cổ ñiển ñộc lực thấp và dạng biến thể ñộc lực cao gây nhiễm và chết nhiều lợn Trong khi ñó, ở Việt Nam 2 ñợt dịch vừa qua cho thấy chủng virut PRRS mới xuất hiện ở nước ta ñã làm lợn ốm và chết nhiều, chết nhanh, ñặc biệt lợn nái và lợn con

Qua nghiên cứu giải mã gen của virut tại Mỹ và Trung Quốc cho thấy, các mẫu virut gây bệnh tai xanh tại Việt Nam có mức tương ñồng về

aminoaxít từ 99 - 99,7% so với chủng virut gây bệnh Tai xanh thể ñộc lực cao của Trung Quốc và ñều bị mất 30 axít amin ðiều này cho thấy chủng virut gây bệnh Tai xanh ở nước ta hiện nay thuộc dòng Bắc Mỹ, có ñộc lực cao giống Trung Quốc

Virut rất thích nghi với ñại thực bào, ñặc biệt là ñại thực bào hoạt ñộng

ở vùng phổi Bình thường, ñại thực bào sẽ tiêu diệt tất cả các kháng nguyên

là virut, vi khuẩn,…khi xâm nhập vào cơ thể; còn riêng ñối với virut PRRS thì nó có thể tồn tại và nhân lên ñược trong các ñại thực bào, sau ñó phá huỷ

và giết chết các ñại thực bào (tới 40%) Do vậy, khi virut ñã xuất hiện trong ñàn lợn, chúng thường có xu hướng duy trì sự tồn tại và hoạt ñộng âm thầm ðiều ñó, thấy rõ trong các ñàn lợn vỗ béo hoặc chuẩn bị giết thịt thì có sự ra tăng ñột biến về tỷ lệ viêm phổi

* C ấu trúc của virut:

Virus gây hội chứng hô hấp và sinh sản (Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus - PRRSV) là một virut có hình cầu, có vỏ bọc ngoài với ñường kính của virion vào khoảng 45 – 55nm, nucleocapsid có ñường kính từ 30 – 35 nm, là ARN virut với bộ gen là một phân tử ARN sợi ñơn dương, có những ñặc ñiểm chung của nhóm Arterivirut Sợi ARN này có kích thước khoảng 15 kilobase, có 9 ORF (open reading frame) mã hoá cho 9 protein cấu trúc

Tuy nhiên, có 6 phân tử protein chính có khả năng trung hoà kháng thể bao gồm 4 phân tử glycoprotein, 1 phân tử protein màng (M) và 1 protein vỏ nhân virut (N) Nhưng hoạt ñộng trung hoà xảy ra mạnh với các protein có khối lượng phân tử 45, 31 và 25 KD (Tô Long Thành, 2007)[13]; (M.Spagnoulo- Weaver và cs, 1998)[34]

* S ức ñề kháng của virut:

PRRS Virut có thể tồn tại 1 năm trong nhiệt ñộ lạnh từ -200C ñến

-700C Trong ñiều kiện 40C, virut có thể sống 1 tháng PRRS Virut ñề kháng

kém với nhiệt ñộ cao: ở 370C chịu ñược 48 giờ, 560C bị giết sau 1 giờ (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2007)[3], (Tô Long Thành, 2007)[13]

Với các hoá chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit, virut

dễ dàng bị tiêu diệt Ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại vô hoạt virut nhanh chóng

* Kh ả năng gây bệnh:

PRRS Virut chỉ gây bệnh cho lợn, lợn ở tất cả các lứa tuổi ñều cảm nhiễm, nhưng lợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm hơn cả Loài lợn rừng cũng mắc bệnh, ñây có thể coi là nguồn dịch thiên nhiên (Tô Long Thành, 2007)[13]

Về mặt ñộc lực, người ta thấy PRRS virut tồn tại dưới 2 dạng: Dạng cổ ñiển: có ñộc lực thấp, ở dạng này khi lợn mắc bệnh thì có tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1 – 5% trong tổng ñàn Dạng biến thể ñộc lực cao: gây nhiễm và chết nhiều lợn

Người và các ñộng vậy khác không mắc bệnh, tuy nhiên trong các loài thuỷ cầm chân màng, vịt trời (Mallard duck) lại mẫn cảm với virut PRRS Virut có thể nhân lên ở loài ñộng vật này và chính ñây là nguồn reo rắc mầm bệnh trên diện rộng rất khó khống chế

* C ơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây:

Virut có trong dịch mũi, nước bọt, phân và nước tiểu của lợn ốm hoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trường; tinh dịch của lợn ñực giống nhiễm virut cũng là nguồn lây lan bệnh Ở lợn nái mang thai, virut có thể từ mẹ xâm nhiễm sang bào thai và gây bệnh Lợn con nhiễm bệnh và lợn mang trùng có thể bài thải virut trong vòng 6 tháng

Bệnh có thể lây trực tiếp thông qua sự tiếp xúc giữa lợn ốm, lợn mang trùng với lợn khoẻ và có thể lây gián tiếp qua các nhân tố trung gian bị ô nhiễm virut

Sau khi xâm nhập, ñích tấn công của virut là các ñại thực bào ðây là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virut, vì thế virut hấp thụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này và phá huỷ nó Một tỷ lệ lớn

tế bào đại thực bào trong nang phổi bị virut xâm nhiễm rất sớm

Cần phải thấy rằng, trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, đại thực bào đĩng vai trị vơ cùng quan trọng trong đáp ứng miễn dịch cả khơng đặc hiệu

và đặc hiệu, đây là loại tế bào trình diện kháng nguyên thiết yếu, mở đầu cho quá trình đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Khi tế bào đại thực bào bị virut phá huỷ, các phản ứng miễn dịch khơng xảy ra được, lợn nhiễm bệnh rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch và dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát, điều này cĩ thể thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi bị nhiễm virut PRRS sẽ cĩ sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi kế phát do những

vi khuẩn vốn sẵn cĩ trong đường hơ hấp

* Ch ẩn đốn:

Hội chứng rối loạn hơ hấp và sinh sản ở lợn cĩ thể được chẩn đốn bằng hai phương pháp cĩ bản đĩ là chẩn đốn lâm sàng và chẩn đốn trong phịng thí nghiệm (đặc biệt là chẩn đốn huyết thanh học) Tuy nhiên, trên thực tế để đảm bảo độ chính xác cao, việc phối hợp cả hai phương pháp là cần thiết

Về chẩn đốn lâm sàng thường dựa vào hai nhĩm triệu chứng đĩ là các triệu chứng về rối loạn hơ hấp và rối loạn sinh sản:

- Ở lợn nái tăng đột biến tỷ lệ sảy thai, đẻ non, thai chết lưu, tỷ lệ lợn con sơ sinh chết cao, các hiện tượng này xảy ra trong khoảng từ 8-20% tổng

số lợn nái của cơ sở chăn nuơi;

- Ở các nhĩm lợn khác cĩ hiện tượng đồng loạt bỏ ăn hoặc ăn ít, sốt cao

40 - 410C, khĩ thở, ban đỏ da, táo bĩn hoặc ỉa chảy, tốc độ lây lan nhanh, đặc biệt ở một số con lợn bệnh chĩp tai bị ứ huyết cĩ màu xanh tím

Tuy nhiên, để đảm bảo độ chính xác cần phải lấy mẫu bệnh phẩm (máu lợn bệnh cịn sống hoặc các tổ chức bệnh phẩm phổi, hạch, của lợn chết) để làm các xét nghiệm chẩn đốn trong phịng thí nghiệm

- Dựa vào phương pháp miễn dịch đánh dấu bằng enzym (ELISA) hoặc phương pháp gián tiếp huỳnh quang kháng thể (IFAT) theo quy trình của OIE

- Phương pháp nhân gen PCR để phát hiện virut hoặc phương pháp phân lập virut gây bệnh trên các mơi trường phơi gà hoặc các mơi trường tế bào đặc biệt

Các phương pháp này cho độ chính xác cao (từ 92-95%) trong chẩn đốn xác định Hội chứng rối loạn hơ hấp và sinh sản ở lợn (Bùi Quang Anh

và cs, 2008)[2]

ðối với Hội chứng rối loạn hơ hấp và sinh sản ở lợn, hiện nay chưa cĩ thuốc điều trị đặc hiệu, do vậy việc phịng bệnh bằng vacxin và vệ sinh phịng bệnh hiện đang là hai phương pháp hữu hiệu ở nhiều cơ sở chăn nuơi

- Phịng bệnh bằng vacxin:

Cũng như nhiều bệnh truyền nhiễm khác, đối với Hội chứng rối loạn hơ hấp và sinh sản, việc phịng bệnh bằng vacxin là một trong những biện pháp quan trọng nhằm hạn chế dịch bệnh xảy ra Tuy nhiên, để đạt được mục tiêu này, việc lựa chọn loại vacxin phù hợp và sử dụng đúng quy trình kỹ thuật là mấu chốt hàng đầu quyết định đến hiệu quả biện pháp phịng ngừa

Hiện nay trên thị trường, đã cĩ một số loại vacxin phịng chống hội chứng PRRS của nhiều nhà sản xuất khác nhau và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất

cĩ nguồn gốc từ chủng JKL-100 thuộc dịng châu Mỹ Một liều chứa ít nhất

105.0TCID50 Cĩ độ an tồn rất cao, vacxin an tồn dù chủng cao gấp 20 liều

Hi ệu quả: Thực nghiệm chứng minh hiệu quả trên lợn con theo mẹ tỉ lệ

tử vong 0% so với lơ đối chứng khơng sử dụng vacxin là 7% Trên lợn thịt tăng trọng thêm 15% so với lợn khơng tiêm phịng

Một tuần sau khi tiêm phịng, hàm lượng kháng thể trong máu đạt được mức bảo hộ và thời gian miễn dịch kéo dài 16 tuần

Li ều lượng và lịch tiêm phòng:

Tiêm bắp 2ml/liều

Nái tơ và nái mang thai: Tiêm chủng trước khi cai sữa hoặc trước khi phối giống

Lợn ñực: tiêm chủng lúc 18 tuần tuổi và tái chủng hàng năm

Lợn con: Ở trại không có dịch tiêm một lần lúc 3 tuần tuổi, với trại có dịch tiêm phòng lần 1 vào lúc 3 tuần tuổi, chủng lại lần 2 lúc 6 tuần tuổi Nếu trại ñang có dịch tiêm ngay cho nái mang thai dưới 70 ngày của thai kỳ

châu Âu Một liều vacxin chứa ít nhất 107.5TCID50 Vacxin có ñộ an toàn rất cao, thử nghiệm ñã chứng minh BSK-PS100 an toàn dù chủng cao gấp 10 liều Vacxin an toàn với vật mang thai

Hi ệu quả: Thực nghiệm ñã chứng minh trên lô heo nái có chủng vacxin, tỷ lệ sống sót của heo sơ sinh cao hơn 6,4%, tỷ lệ heo sơ sinh chết thấp hơn 3,7%, tỷ lệ thai chết lưu và thai gỗ thấp hơn 3,6% và tỷ lệ heo con cai sữa cao hơn 9,1% so với lô heo nái không chủng vacxin

Li ều lượng và lịch tiêm phòng:

Tiêm bắp 2ml/liều

Lợn con: tiêm lúc 3-6 tuần tuổi

Nái hậu bị: tiêm lúc 18 tuần tuổi, tái chủng sau 3-4 tuần

Nái rạ: tiêm chủng 3-4 tuần trước khi phối giống

Nái mang thai: tiêm phòng lúc 60-70 ngày của thai kỳ

ðực giống: tiêm lúc 18 tuần tuổi, mỗi 6 tháng tái chủng một lần

virut PRRS dòng châu Âu VP046BIS, mỗi liều chứa ít nhất 103.5TCID50

Hi ệu quả: VP046BIS có khả năng bảo vệ tất cả các chủng châu Âu

khác và châu Mỹ ðây là chủng an toàn nhất trông các chủng châu Âu và hoàn toàn không gây hoàn nguyên ñộc lực

Li ều lượng và lịch tiêm phòng:

Tiêm bắp vào cơ cổ Mỗi liều 2ml/con

Lợn con: Chủng một lần vào lúc 3-4 tuần tuổi, khả năng bảo hộ tới 5 tháng tuổi

Nái hậu bị: Chủng một lần ở thời ñiểm 5 tuần trước khi phối giống ðực giống: Chủng lúc 5 tuần tuổi, sau ñó tái chủng 6 tháng 1 lần

Nái: Chủng 1 liều sau khi sinh 12 – 15 ngày

Hiện nay, Cục Thú y quốc gia Việt Nam ñang tiến hành sử dụng thí ñiểm vacxin chết phòng bệnh thể ñộc lực cao của Trung Quốc tại một số trại

và một số ñịa phương Nếu có kết quả tốt, vacxin này sẽ ñược nhập khẩu và

sử dụng ñại trà cho ñàn lợn cả nước

- Phòng bệnh bằng vệ sinh:

Trong tình hình dịch bệnh như hiện nay, việc sử dụng vacxin phòng PRRS nhằm tạo miễn dịch chủ ñộng cho lợn chống lại dịch bệnh này là một việc làm cần thiết và cấp bách Tuy nhiên, bên cạnh ñó cần chú ý thực hiện tốt công tác vệ sinh phòng bệnh và tăng cường công tác tuyên truyền, giáo dục nâng cao ý thức phòng bệnh cho người chăn nuôi cũng như các biện pháp kiểm dịch nhằm kiểm soát và ngăn ngừa dịch bệnh bùng phát, lây lan, nhất là trong ñiều kiện hội nhập mạnh mẽ như hiện nay

Chuồng trại phải ñảm bảo vệ sinh thú y, ấm áp vào mùa ñông, thoáng mát vào mùa hè, thường xuyên quét dọn, tiêu ñộc chuồng trại bằng một số hoá chất như vôi bột, Iodine, chloramin B,… Chăm sóc, nuôi dưỡng tốt cho lợn ñể nâng cao sức ñề kháng cho lợn ðối với lợn mới mua về cần cách ly ít nhất 3 tuần ñể theo dõi

Tổ chức tuyên truyền thường xuyên trên các phương tiện thông tin ñại chúng của Trung ương và ñịa phương ñể người dân hiểu ñúng, hiểu ñầy ñủ về mức ñộ nguy hiểm của dịch bệnh tai xanh và các biện pháp phòng chống dịch ñặc biệt cần phải khai báo khi lợn có biểu hiện của bệnh PRRS

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn mang tính truyền nhiễm nguy hiểm ñối với lợn gây ra do virus Bệnh lây lan nhanh với các biểu hiện ñặc trưng: Viêm ñường hô hấp rất nặng, sốt, ho, thở khó, các rối loạn sinh sản

ở lợn: sẩy thai, thai chết lưu, lợn sơ sinh chết yểu

ðể chủ ñộng phòng chống dịch, cần thực hiện ñồng bộ, kiên quyết các giải pháp phòng chống dịch như: phát hiện sớm, bao vây xử lý kịp thời các ổ dịch; công tác tuyên truyền thực hiện sâu rộng tới các ngành, các cấp và người dân tham gia chăn nuôi; ñặc biệt có sự chỉ ñạo quyết liệt của chính quyền các cấp từ Trung ương tới các ñịa phương

2.2 Vi khuẩn Streptococcus suis và bệnh liên cầu khuẩn do vi khuẩn gây

ra ở lợn

2.2.1 Một số ñặc tính của vi khuẩn Streptococcus suis

* ðặc tính hình thái và sinh vật học:

Vi khuẩn Streptococcus nói chung và vi khuẩn Streptococcus suis (S.suis)

nói riêng có hình cầu, hình bầu dục, ñưòng kính khoảng 1µm, vi khuẩn xếp thành chuỗi như chuỗi hạt có ñộ dài ngắn không ñều nhau: có khi chúng ñứng thành từng cặp, có thể xếp thành các chuỗi ngắn có 6 - 10 vi khuẩn hoặc dài hơn Vi khuẩn bắt màu gram dương

Vi khuẩn phát triển trong ñiều kiện hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện, nhiệt

ñộ thích hợp 370C, vi khuẩn không hình thành nha bào, ña số hình thành giáp

mô, sự hình thành giáp mô có thể ñược xác ñịnh khi chúng sinh sống trong các

mô hoặc mọc trong các môi trường nuôi cấy có chứa huyết thanh

Vi khuẩn S suis có khả năng lên men ñường: Glucose, Lactose,

Saccarose, Salicin, Innulin, Trehalose, Maltose Vi khuẩn không có khả năng lên men ñường: Mannit, Sorbitol, Mannitol, Dextrose, Xylose, Glyxerol Các phản ứng sinh hóa khác: Catalase âm tính, Oxidase âm tính, Indol âm tính, Coagulase âm tính

* S ức ñề kháng:

00C vi khuẩn có thể sống 104 ngày, ở 90C vi khuẩn sống ñược 10 ngày, ở 22-250C vi khuẩn có thể sống ñược 8 ngày Ở 700C vi khuẩn chết trong 35 -40 phút, ở 1000C vi khuẩn chết trong 1 phút; Vi khuẩn sống trong bụi 25 ngày ở

200C)/24 giờ Vi khuẩn bị diệt dưới ánh sáng mặt trời sau 40 – 60 phút

Lê Văn Tạo, 2005 [12] cho biết: S suis dễ bị diệt bởi nhiều chất sát trùng

như: Phenol, Iod, Hypochlorid, Acid phenic 3 - 5% diệt vi khuẩn trong vòng 3 -

15 phút, formol 1% diệt vi khuẩn trong vòng 60 phút, cồn 700 diệt vi khuẩn trong vòng 30 phút Vi khuẩn có thể sống trong xác lợn chết ở 400C trong 6 tuần

Vi khuẩn tồn tại lâu trong ñờm, chất bài xuất có protein Tuy nhiên vi khuẩn có thể tồn tại ở trên hạch amidan lợn mang trùng hơn 1 năm, ngay khi các yếu tố thực bào, kháng thể và bổ sung kháng sinh phù hợp trong thức ăn

* C ấu trúc kháng nguyên:

kháng nguyên ñã ñược tìm thấy:

Kháng nguyên polyozit hay khág nguyên “C” do Lancefield phát hiện năm 1928, ñây là một kháng nguyên thân Thành phần kháng nguyên thân có ý

nghĩa quan trọng, quyết ñịnh ñến tính ñộc lực của vi khuẩn Streptococcus và nó nằm ở thành vi khuẩn (Cell wall) Thành tế bào vi khuẩn S suis gồm 3 lớp:

Lớp ngoài có chứa acid và protein gọi là kháng nguyên M, T, R,…, Map (M - Assotated Protein), SOF (Serua Oparty Factor) Phía ngoài cùng của lớp này thường chứa các fimbriae; Lớp giữa chứa Polysaccharide; Lớp trong cùng là

Peptidoglycan Những Streptococcus khác nhau có cấu tạo chất “C” khác nhau, dựa vào ñó người ta chia Streptococcus thành các nhóm: A, B, C, D…,R, trong

ñó Streptococcus type A, B thuộc loại tan máu type β

- Kháng nguyên protein M là yếu tố ñộc lực chống lại quá trình thực

bào và là kháng nguyên ñặc hiệu của Streptococcus type A, người ta xác ñịnh

có khoảng 42 type trong ñó có 12 type quan trọng và thường hay gây bệnh

- Các mucopeptit: Làm cho vách tế bào của Streptococcus cứng rắn

và còn có khả năng gây ñộc

- Kháng nguyên bám dính: Fimbriae có lipoteibic acid (LTA) giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào biểu mô và ở tế bào lympho ña nhân có ñiểm tiếp nhận (receptor) tương ứng với LTA trong quá trình thực khuẩn (Trích theo Nguyễn Như Thanh và Cs [14])

Hiện có 20 nhóm huyết thanh và 25 serotype khác nhau Phần lớn các

vi khuẩn gây bệnh trên lợn ñều thuộc type 1 và type 2

* ðặc tính gây bệnh:

Vi khuẩn S suis thuộc nhóm D có 9 serotype; R và nhóm S có 2 serotype

gây ra các thể bệnh viêm họng, nhiễm trùng huyết và viêm khớp ở lợn

Vi khuẩn S suis thuộc nhóm E có 6 serotype, trong ñó serotye 2, 4, 1,

6, 7 gây các thể bệnh apxe hạch và các nội quan khác

Vi khuẩn S suis thuộc nhóm L và C gồm 11 serotype gây các thể bệnh

nhiễm trùng huyết, viêm nội tâm mạc và viêm ña khớp ở lợn

* C ơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây:

Vi khuẩn có thể tồn tại trong phân, bụi bẩn, xác lợn và ở cả những con ruồi trong một thời gian dài Bệnh có thể truyền qua ñường hô hấp, các chất bài tiết, máu của lợn bệnh, lây lan thông qua tiếp xúc trực tiếp hoặc lây qua kim tiêm nhiễm trùng Lợn con có thể bị lây nhiễm từ lợn mẹ qua ñường hô hấp, ñường tiêu hoá, ñường máu

Vi khuẩn S suis lây truyền theo ñường hô hấp xâm nhập vào hạch

amidan, vòm họng, từ ñó di chuyển theo hệ lâm ba tới hạch dưới hàm, cư trú

ở các mô Lúc này cơ thể chưa có dấu hiệu về lâm sàng của bệnh Ở các tổ chức cư trú, chúng sống và nhân lên trong tế bào monocyt rồi chuyển vào

xoang dịch não tuỷ, gây nên viêm màng não, có thể thông qua con ñường nhiễm trùng huyết ñể xâm nhập vào màng não, khớp xương và các mô khác (Lê Văn Tạo, 2005 [12])

2.2.2 Bệnh liên cầu khuẩn do Streptoccocus suis gây ra ở lợn

Bệnh do vi khuẩn S suis gây ra ở lợn hay còn gọi là bệnh liên cầu ở lợn

xảy ra ở lợn mọi lứa tuổi, nhưng phổ biến ở lợn con một vài tuần tuổi ñến sau cai sữa vài tuần ðặc trưng lâm sàng của bệnh là nhiễm trùng huyết, viêm

màng não, viêm khớp và viêm phế quản phổi ðặc biệt Streptoccocus suis typ

2 có thể gây bệnh cho người

Thể nhiễm trùng huyết và viêm não có dịch (thường thấy ở lợn từ 2 - 3 tháng tuổi); Thể viêm ñường hô hấp (ở lợn từ 2 tuần tuổi ñến 2 tháng tuổi); Thể viêm âm ñạo, tử cung (ở lợn cái hậu bị và lợn mang thai); Thể viêm vú (ở lợn ñang nuôi con); Thể viêm hạch (ở lợn sau cai sữa và vỗ béo)

huyết và xuất huyết ở một số phủ tạng (lách, thận, hạch lâm ba)

+ Thể viêm não tuỷ: sốt cao, bỏ ăn, ñi lại siêu vẹo, run rẩy, co giật, nôn mửa, hôn mê và chết sau 2 – 3 ngày Bệnh thường thấy ở lợn sau cai sữa, lợn

từ 2 – 3 tháng tuổi Tỷ lệ chết 100 % Bệnh tích: màng não tụ huyết và xuất huyết, dịch não và tủy vẩn ñục

+ Thể viêm họng, viêm phế quản phổi: sốt cao, chảy nước mắt, dịch mũi, họng sưng, bỏ ăn, thở khó, thở nhanh; da tụ huyết từng mảng Thường thấy ở lợn con ñang theo mẹ và sau cai sữa Tỷ lệ chết 60 – 70 % Bệnh tích:

họng và amidan sưng, tụ máu, niêm mạc phế quản tụ huyết, niêm mạc mũi cĩ màng giả, tiểu phế quản và phế nang viêm cĩ dịch thẩm xuất, cĩ mủ và bọt khí; hạch phổi sưng thũng, tụ huyết

+ Thể viêm hạch: sốt cao, hạch hầu và hạch mang tai sưng thũng, sau thành apxe mủ, lâu thành bã đậu Bệnh thấy ở lợn vỗ béo, diễn biến 5 – 8 ngày, tỷ lệ chết 20 – 30% Bệnh tích: hạch hầu, hạch trước vai, trước đùi sưng

tụ huyết ở giai đoạn đầu, giai đoạn cuối viêm bã đậu

Ch ẩn đốn:

Chủ yếu chẩn đốn bệnh dựa vào các triệu chứng, bệnh tích, đặc điểm

dịch tễ học của bệnh, phân lập và xác định vi khuẩn S suis trong phịng thí

nghiệm Cần lưu ý khi chẩn đốn, phải tiến hành phân lập vi khuẩn từ một vài

cơ quan phủ tạng khác nhau của cùng một lợn mắc bệnh và từ vài lợn trong cùng một đàn để tìm ra serotype gây bệnh chính

Các kỹ thuật sinh học phân tử là cơng cụ hữu ích giúp phân biệt các chủng

dịch hoặc tìm ra đúng chủng để bổ sung vào vacxin Gần đây nhiều phịng thí

nghiệm đã phát triển kỹ thuật PCR để giám định vi khuẩn S suis, xác định các yếu

tố độc lực và serotype của chủng vi khuẩn gây bệnh đã được ứng dụng rộng rãi

2.3 Vi khuẩn Pasteurella multocida và bệnh do vi khuẩn gây ra ở lợn

2.3.1 Một số đặc tính của vi khuẩn Pasteurella multocida

họ Pasteurellaceae, giống Pasteurella và thuộc lồi P multocida Tất cả các loại

các đặc tính cơ bản giống nhau về mặt hình thái, nuơi cấy, chỉ khác nhau ở tính thích nghi gây bệnh ở các lồi vật chủ (Nguyễn Như Thanh [14])

đầu trịn, kích thước 0,25-0,4 x 0,4-1,5 µm Vi khuẩn khơng cĩ lơng, khơng di

ñộng, không hình thành nha bào, bắt màu gram (-), bắt màu ñậm ở hai ñầu (vi khuẩn lưỡng cực)

thích hợp 370C (có thể nuôi ở 13 – 380C ), PH thích hợp từ 7,2 - 7,4 Trên các môi trường nuôi cấy thông thường vi khuẩn phát triển kém, khi môi trường ñược bổ sung huyết thanh hay máu vi khuẩn phát triển tốt

Sozbit, Xylose Không lên men ñường Lactose, Maltose, Arabinose, Rammo, Salixin, Dunxid, Adonit Các phản ứng Indol, Catalase, Oxidase, H2S dương tính; VP, MR , Urearse âm tính, không làm tan chảy gellatin

sát trùng thông thường: Vi khuẩn bị diệt sau khi ñun ở 580C/20 phút, 800C/10 phút, 1000C trong vài giây Ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp diệt vi khuẩn trong canh trùng sau 1 ngày Các chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn nhanh chóng: Axit phenic 5% diệt vi khuẩn trong 1 phút, nước vôi 1% trong 3-5 phút Vi khuẩn sống khá lâu và sinh sản trong ñất ẩm có nhiều nitrat và thiếu ánh sáng Trong tổ chức của cơ thể ñộng vật bị thối nát vi khuẩn sống ñược 1-3 tháng Trong chuồng nuôi súc vật, trên ñồng cỏ, trong ñất vi khuẩn

Như Thanh [14]) Vi khuẩn P multocida ñược chia thành các type giáp mô A, B,

D, E, F tuỳ thuộc vào cấu trúc polysaccharide bề mặt, trong ñó các serotype A, B, D

ñã ñược thông báo là gây bệnh cho lợn (ðỗ Ngọc Thuý, 2007 [15])

Kháng nguyên K có hai thành phần α và β, chúng ñược cấu tạo từ protein

và polysaccarit, ngoài ra còn một số ít các Lipopolysaccarit (LPS) Kháng nguyên

K của vi khuẩn P multocida còn có khả năng gắn với thụ thể của tế bào hồng cầu Một số chủng P multocida serotype D có sinh ra một yếu tố ñược gọi là ñộc

tố gây hoại tử da (Dermonecrotic Toxin - DNT) DNT của P multocida type D có

liên quan ñến bệnh viêm teo mũi ở lợn

Kháng nguyên thân O chỉ ñược bộc lộ khi kháng nguyên K ñược tách ra KNO là một phức hợp protein - lipid - polysaccarit, nó có 16 yếu tố ký hiệu từ 1- 16 (Theo phân loại của Heddleston, 1972).[28]

Vi khuẩn P multocida có thể xâm nhập vào cơ thể qua ñường hô hấp,

tiêu hoá hoặc qua da có vết thương Tuy nhiên, trong ñiều kiện bình thường

một tỷ lệ nhất ñịnh lợn khoẻ mạnh có vi khuẩn P multocida ký sinh ở niêm

mạc phần phía trên của bộ máy hô hấp Giữa cơ thể và mầm bệnh ở trạng thái cân bằng ñộng Khi ñiều kiện ngoại cảnh bất lợi hay sự xuất hiện ñồng thời của các bệnh truyền nhiễm gây ra bởi virus, vi khuẩn khác, làm trạng thái cân bằng trên bị phá vỡ, nhân cơ hội này, do sức ñề kháng của cơ thể giảm sút làm mầm bệnh trỗi dậy, tăng lên về số lượng, ñộc lực và gây bệnh

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978) [11], quá trình lây nhiễm P

xúc với chất thải của vật bệnh

2.3.2 Bệnh do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra ở lợn

Vi khuẩn P multocida có thể là nguyên nhân nguyên phát hoặc thứ

phát gây ra thể bệnh viêm phổi ở lợn, bệnh có thể gây chết lợn hoặc làm giảm khả năng tăng trọng của lợn do vậy gây thiệt hại rất lớn cho người chăn nuôi

Bệnh do P multocida gây ra nguyên phát ñược gọi là bệnh tụ huyết

trùng, nhưng trong ña số các trường hợp vi khuẩn thường kết hợp với các vi

khuẩn ñường hô hấp khác như: Actinobacillus pleuropneumoniae,,

Streptococcus sp, B bronchiseptica, Hemophilus parasuis,…gây nên hội chứng bệnh ñường hô hấp

Bệnh do vi khuẩn P multocida gây ra ñã ñược nhiều nhà khoa học

trên thế giới nghiên cứu trong nhiều năm

Tại Triều Tiên, trong 80 chủng P multocida phân lập từ 450 phổi lợn

bệnh có 96,3% thuộc type A; 3,9% thuộc type D (Ahn và Kim, 1994) [18]

Tại Nhật trong số 116 mẫu P multocida phân lập từ phổi lợn có bệnh

tích nhục hóa, áp xe phổi và viêm màng phổi có 81,9% thuộc type A; 18,1% thuộc type D (Theo Iwanmatsu và Sawada,1988 [31])

Ở nước ta P multocida cũng ñược thông báo là tác nhân gây bệnh quan trọng ở lợn và ñược quan tâm nghiên cứu

Nguyễn Ngọc Nhiên năm 1996 [6] khi nghiên cứu 72 phổi lợn có bệnh

tích bị nhục hóa, áp xe và viêm màng phổi cho biết: tỷ lệ nhiễm P multocida

là 37,5%, tỷ lệ nhiễm S suis là: 30,5% và ñã nghiên cứu chế tạo thành công

vaccine toàn khuẩn chết có bổ trợ keo phèn 20% phòng HCHTTN của lợn ñược chế tạo từ 9 chủng thuộc 3 giống gây bệnh ñường hô hấp ñó là: P

(6,64%)

Theo De Alwis, 1992 [19] hai hội chứng chủ yếu thường gặp do P

- Viêm teo mũi là bệnh phổ biến ở lợn nuôi hầu hết các nơi trên thế giới Bệnh ñược mô tả ñầu tiên ở ðức cách ñây gần 160 năm, nhưng chỉ trong

10 năm trước ñây nguyên nhân gây bệnh phức tạp và bệnh lý của nó mới ñược tìm ra Nhưng tổn thất kinh tế ñược ước tính là rất lớn do nó không chỉ gây chết mà quan trọng hơn nó còn làm giảm tăng trọng trong các ñàn vật nuôi bị nhiễm bệnh Hai loại vi khuẩn ñược cho là nguyên nhân gây bệnh là

thường thuộc type D)

- Bệnh viêm phổi do P multocida gây ra xuất hiện rộng khắp thế giới,

nhưng bệnh hay xảy ra và gây thiệt hại ở các nước nhiệt ñới và á nhiệt ñới như: Ấn ðộ, Pakistan, Iran, Thái Lan, Philippin, Indonexia, Triều tiên, Lào và Việt Nam, ở tất cả các ñiều kiện khí hậu và ñiều kiện chăn nuôi Vì vi khuẩn

khó tiêu diệt Vi khuẩn P multocida gây bệnh thường kết hợp với các tác nhân khác như Mycoplasma hyopneumoniae, App,…làm cho quá trình viêm

phổi càng nặng thêm

* Bệnh viêm phổi do vi khuẩn P multocida gây ra:

Triệu chứng lâm sàng của bệnh viêm phổi do P multocida gây ra rất khác

nhau tùy thuộc vào từng chủng vi khuẩn gây bệnh, thường xuất hiện 3 thể:

+ Thể cấp tính: Thể này thông thường do hầu hết các chủng P

hiện khó thở, hóp bụng vào ñể thở, gõ vào bụng có âm ñục “bịch, bịch”, sốt cao nhiệt ñộ lên tới 41- 420C, tỷ lệ chết cao (5-40%) ở những con vật chết và hấp hối có thể thấy những vết ñổi màu tím ở vùng bụng có thể là do sốc nội ñộc tố

+ Thể á cấp tính: Ở thể này hiện tượng ho và thở thể bụng thường thấy

ở những lợn lớn Ho ở những lợn ở lứa tuổi này thường ñược coi là tiêu chuẩn xác ñịnh mức ñộ nghiêm trọng của bệnh Triệu chứng lâm sàng của bệnh ở

thể này giống như viêm màng phổi do A pleuropneumoniae gây ra, nhưng

những đặc điểm phân biệt chính là bệnh viêm phổi do P multocida thì hiếm khi gây ra chết đột ngột, hơn nữa lợn mắc bệnh viêm phổi do P multocida

gây ra cĩ thể tồn tại một thời gian dài

+ Thể mãn tính: ðây là thể đặc trưng thường thấy của bệnh, con vật bệnh thỉnh thoảng xuất hiện ho, sốt nhẹ hoặc khơng Những con vật bị ảnh hưởng thường ở giai đoạn lợn lớn (10- 16 tuần tuổi)

- B ệnh tích:

Bệnh tích của bệnh do P multocida gây ra chủ yếu ở phần xoang ngực và thường kèm với bệnh tích của M hyopneumoniae ðặc trưng của bệnh này xuất

hiện ở thùy đỉnh và mặt trong của phổi, cùng với việc cĩ bọt khí trong khí quản

Cĩ sự phân ranh giới rõ rệt giữa vùng tổ chức phổi bị tổn thương và vùng tổ chức phổi bình thường Phần bị ảnh hưởng của phổi sẽ cĩ sự biến đổi màu sắc từ

đỏ sang xám xanh phụ thuộc vào giai đoạn của bệnh

Các trường hợp bệnh nghiêm trọng cĩ thể xuất hiện viêm phế mạc và apxe ở các mức độ khác nhau Trong các trường hợp này thường thấy phế mạc dính chặt vào thành xoang ngực và phế mạc cĩ vùng mờ đục, khơ ðây là

bệnh tích chủ yếu để phân biệt bệnh viêm phổi do Pasteurella với viêm phổi

do Actinobacillus, trong đĩ thường thấy mủ chảy ra cĩ màu vàng và dính

cùng với rất nhiều sợi fibrin (Pijoan, 1989)[37]

* Chẩn đốn:

Việc chẩn đốn đúng bệnh do vi khuẩn P multocida gây ra là hết sức

cần thiết, do đĩ cần tiến hành đồng thời nhiều phương pháp như: dịch tễ học, chẩn đốn lâm sàng, giải phẫu bệnh lý và đặc biệt là dựa trên kết quả xét nghiệm vi khuẩn học trong phịng thí nghiệm

Bên cạnh đĩ cịn cĩ thể sử dụng các phương pháp khác như: phản ứng kết tủa khuếch tán miễn dịch trên gel thạch AGID (Agargel Immuno Diffuse)

để xác định kháng nguyên thân (O) từ vi khuẩn phân lập được với kháng huyết thanh chuẩn, phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính để định loại

kháng nguyên vỏ (K), phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp để xác định kháng nguyên vỏ, phản ứng ELISA, kỹ thuật PCR,

Việc xác định chủng vi khuẩn P multocida phân lập được thuộc

serotype nào là hết sức cần thiết để cĩ thể xác định được thể bệnh mà chúng gây ra, từ đĩ cĩ biện pháp phịng trị bệnh phù hợp Gần đây, kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đã được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và

chẩn đốn bệnh do vi khuẩn gây ra ở vật nuơi, trong đĩ cĩ P multocida và đã

được OIE chuẩn hĩa thành quy trình chung, cĩ thể áp dụng ở các phịng thí

nghiệm để định type giáp mơ của vi khuẩn P multocida

2.4 Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae và bệnh do vi khuẩn gây

ra ở lợn

2.4.1 Một số đặc tính của vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae

* ðặc tính hình thái và tính chất nuơi cấy:

Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (A Pleuropneumoniae)

thuộc họ Pasteurellae, thuộc giống Actinobacillus, trước đây cịn cĩ tên là

minh là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi truyền nhiễm

ở lợn

Vi khuẩn A pleuropneumoniae là loại cầu trực khuẩn nhỏ, gram (-),

kích thước 0,3-0,5 x 0,6-1,4 µm, khơng di động, khơng sinh nha bào và cĩ hình thành giáp mơ Dưới kính hiển vi điện tử quan sát thấy vi khuẩn cĩ lơng hay cịn gọi là pili cĩ kích thước 0,5-2 x 60-450 nm

sinh trưởng trong mơi trường được bổ sung 5% huyết thanh ngựa, và trong điều

thường trừ khi thạch máu được bổ xung NAD và chúng mọc xung quanh các

khuẩn lạc của tụ cầu do Staphylococcus aureus trong quá trình phát triển trên

thạch máu đã phá huỷ hồng cầu cĩ trong máu và sản sinh ra chất NAD

Trong môi trường nuôi cấy, vi khuẩn ñòi hỏi yếu tố V ñể phát triển, nó phát triển tốt trên môi trường thạch Chocolate nhưng vi khuẩn không mọc

trên môi trường MacConkey Vi khuẩn A pleuropneumoniae có khả năng lên

men các loại ñường: Xylose, Ribose, Glucose, Fructose, Maltose, Mannitol, và không lên men: Trehalose, Arabinose, Lactose, Raffinose,… Phản ứng sinh Indol, Catalaza, Ureaza, CAMP Test dương tính

* S ức ñề kháng:

môi trường tự nhiên trong một thời gian ngắn Tuy nhiên khi ñược bảo vệ bởi chất nhầy hoặc các chất hữu cơ khác thì vi khuẩn có thể sống sót trong vài ngày Trong nước sạch ở nhiệt ñộ 4oC, vi khuẩn có thể sống ñược 30 ngày, nhiều giờ trong khí dung và có thể tồn tại ñược trong 4 ngày ở mô phổi và chất thải ở nhiệt ñộ phòng Nó bị diệt nhanh chóng ở ñộ khô và các chất sát trùng

màng phổi Có thể chia thành 2 biotype dựa trên nhu cầu sử dụng NAD của vi khuẩn (Pohl và cs, 1983)[38] Biotype 1 của vi khuẩn khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo phụ thuộc vào NAD, biotype 2 không phụ thuộc vào NAD nhưng cần có các pyridine nucleotide ñặc hiệu hoặc các chất tiền thân của pyridine nucleotide ñể tổng hợp NAD cần thiết cho sự phát triển của chúng Biotype 1 có ñộc lực cao hơn biotype 2

Trong biotype 1, 12 serotype ñược tìm thấy, chúng ñược phân loại theo type huyết thanh Type huyết thanh từ 1 - 5 ñã ñược (Kilian va cs 1978)[32] phát hiện (riêng serotype 5 ñược chia làm 5A và 5B), type huyết thanh 6 - 7 do

; type 8 , type 9 , type 10 , type 11 và type 12 (Nielsen, 1988)[35] xác ñịnh

Trong biotype 2, serotype 2, 4, 7, 9 có chung nhóm quyết ñịnh kháng nguyên như biotype 1 Gần ñây biotype 2 có serotype 13, 14 ñược mô tả có kháng nguyên khác với biotype 1 (Nielsen và cs, 1988)[35]

* Cấu trúc kháng nguyên và yếu tố độc lực:

- Lớp vỏ vi khuẩn:

Vi khuẩn A pleuropneumoniae được bao bọc bên ngồi bởi một lớp vỏ

cĩ bản chất là các polysaccharide ðây là thành phần quyết định độc lực của

vi khuẩn và gây hiệu ứng cho serotype đặc hiệu (Ward and Inzawa,

1997)[41]

nghĩa chẩn đốn và dịch tễ (Inzana, 1991)[31] Sự khác nhau về độc lực liên quan đến cấu trúc và những sản phẩm do vỏ và nội độc tố tạo nên (Dubreuil

và cs, 2000)[26] Quan sát dưới kính hiển vi điện tử thấy những chủng cĩ độc lực thì cĩ kích thước lớn hơn và cĩ lớp vỏ bám dính hơn trong khi những chủng ít độc thì nhỏ hơn và chỉ cĩ lớp vỏ mỏng (Steffens và cs 1990)[40]; (Inzana, 1991)[31]; (Jacques và cs 1987)[33] cũng xác định sự đa dạng trong cấu trúc vỏ khi phân tích lớp vỏ ở các serotype 1 - 10 dưới kính hiển vi điện

tử và cho thấy lớp vỏ dày khoảng 80 - 90mm đến 210 - 230mm tùy từng serotype Chính điều này đã giải thích cho sự khác nhau về độc lực giữa các serotype

động thực bào và hoạt động bổ thể Những chủng cĩ vỏ đề kháng với hoạt động tiêu diệt của bổ thể đã được Ward và Inzana chứng minh Những thể đột biến khơng cĩ vỏ sẽ bị tiêu diệt ngay sau khi cĩ mặt huyết thanh trong khi những chủng cĩ vỏ thì khơng (Ward và Inzana, 1997)[41]

- ðộc tố của vi khuẩn:

ða số các chủng A pleuropneumoniae đều tạo ra 1 hoặc nhiều hơn 1 độc tố phân hủy hồng cầu Phân tích những độc tố hồng cầu này quan sát thấy chúng là 1 protein hạt nhân của RTX (Repeat in Toxin) chúng được thấy ở

hầu hết các vi khuẩn Gram (-) như E coli, B pertussin, M haemolytica Ở A

II, Apx III và Apx IV ; (Cho và Chae, 2001c)[24] Người ta tin chắc chắn về

vai trò của Apx trong quá trình gây bệnh của A pleuropneumoniae Mỗi ñộc

tố này khác nhau do hoạt ñộng phân giải hồng cầu gây ñộc tế bào ; (Frey và

cs, 1993)[27]

Các chủng biotype 2 không thấy tất cả các ñộc tố tương ứng với các chủng thuộc biotype 1 Không serotype nào thuộc biotype 2 tạo Apx III nhưng có tạo ñộc tố Apx I và II

Vai trò ñộc lực của Apx ñã ñược chứng minh gây ra những triệu chứng của bệnh và những tổn thương ñặc trưng trên lợn

- Lipopolysaccarit:

Lipopolysaccarit (LPS) là thành phần chính của lớp màng ngoài vi khuẩn, và ñược cho là nguyên nhân gây tổn thương mô Những tổn thương do LPS tinh chế, không gây xuất huyết, không gây hoại tử khác với tổn thương ñặc trưng của viêm phổi - màng phổi Song LPS chắc chắn kết hợp với ñộc tố Apx làm tăng

ñộc lực và tăng tính mãnh liệt cho ñộc tố Apx

biểu mô và lớp màng nhầy khí quản của lợn Bám dính là hoạt ñộng ban ñầu giúp cho sự xâm nhập của vi khuẩn và có thể là ñặc tính gây bệnh, là nguyên nhân gây ra bệnh

Những nghiên cứu gần ñây chỉ ra rằng phần LPS của

lợn khi bị nhiễm vi khuẩn này Tuy nhiên cơ chế gây bệnh khác có thể tham gia trong quá trình sinh bệnh khi sự tổn thương vẫn phát triển sau khi lợn bị phơi nhiễm với vi khuẩn sống, có hiệu giá huyết thanh cao với lipit A và phần

carbonhydrat của phân tử Lipopolysaccarit

2.4.2 Bệnh viêm phổi màng phổi ở lợn do vi khuẩn A pleuropneumoniae gây ra

Bệnh viêm phổi màng phổi truyền nhiễm của lợn do A

Nam trong những năm gần ñây, A pleuropneumoniae ñã ñược phân lập và

ñược ñánh giá là một vi khuẩn gây nên một bệnh hô hấp khá quan trọng ở tất

cả các trại lợn siêu nạc quy mô lớn

Tất cả các lứa tuổi lợn ñều bị cảm nhiễm Trong trường hợp cấp tính của bệnh thì tỷ lệ chết thường cao Tỷ lệ chết cũng phụ thuộc vào ñộc lực của

vi khuẩn và sự lưu hành bệnh trong môi trường Bệnh nặng hơn và tỷ lệ tử vong cao hơn nếu nhiễm kế phát các bệnh khác như bệnh Aujeszky và hội chứng hô hấp sinh sản ở lợn (PRRS)

Triệu chứng lâm sàng có nhiều mức phụ thuộc vào tuổi của gia súc, tình trạng miễn dịch, ñiều kiện môi trường và mức ñộ cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh Biểu hiện lâm sàng của bệnh có thể là quá cấp tính, cấp tính hoặc

mãn tính

- Th ể quá cấp tính: Một hoặc nhiều lợn cai sữa cùng một chuồng hoặc

khác chuồng trở nên ốm nặng, sốt tới 41,50C, ñờ ñẫn và không muốn ăn, nôn mửa và ỉa chảy, con vật bị bệnh nằm trên nền chuồng, không có dấu hiệu thở

rõ ràng, mạch ñập tăng lên rất sớm và trụy tim mạch Da trên mũi, tai, chân và sau cùng là toàn bộ cơ thể trở nên tím tái ở giai ñoạn cuối và chết

Thời gian ngắn trước khi chết thường có những biểu hiện khó thở dữ dội, gia súc ở tư thế ngồi ñể thở, nhiệt ñộ ở hậu môn giảm nhanh Ngay trước khi chết thường có chảy nhiều dịch bọt nhuốm máu ở mồm và lỗ mũi Tử vong xảy ra 24 - 36 giờ sau khi xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng Một số trường hợp con vật chết ñột ngột không có biểu hiện lâm sàng Nhiều nghiên cứu cho thấy thời gian diễn biến của bệnh ít nhất là ba giờ từ khi bị nhiễm

trùng cho ñến chết ở lợn sơ sinh bệnh xảy ra như nhiễm trùng huyết dẫn tới hậu quả tử vong

- Th ể cấp tính: Nhiều lợn ở 1 chuồng hoặc ở những chuồng khác nhau cùng bị Lợn sốt cao từ 40,5 - 410C, da ñỏ, con vật mệt mỏi, không muốn dậy, không ăn uống Các dấu hiệu hô hấp nặng với khó thở, ho, và ñôi khi thở bằng mồm trở lên rõ Thường xuất hiện trụy tim mạch, với xung huyết ở các ñầu tứ chi Toàn thân suy sụp trong vòng 24 giờ ñầu, bệnh diễn biến khác nhau ở từng con vật, phụ thuộc mức ñộ tổn thương phổi và thời ñiểm bắt ñầu ñiều trị

- Thể bán cấp và mãn tính: xuất hiện sau khi các dấu hiệu cấp tính biến

ñi Không sốt hoặc sốt ít, xuất hiện ho tự phát hoặc thỉnh thoảng, với các cường ñộ khác nhau Có thể súc vật kém ăn, giảm tăng trọng, có thể xác ñịnh các gia súc bị ốm bằng dấu hiệu các con vật này không gắng sức ñược Khi di chuyển, chúng thường ñi lùi lại phía sau và khi bị chặn lại chúng thường ít chống cự ở các ñàn gia súc bị nhiễm mãn tính thường có nhiều súc vật bị nhiễm không biểu hiện rõ

trên lâm sàng

Các dấu hiệu lâm sàng có thể trở lên rõ hơn bởi sự kết hợp với các yếu

tố gây nhiễm trùng ñường hô hấp khác (Mycoplasma, Vi khuẩn, Virus) Các

biến chứng như viêm khớp, viêm nội tâm mạc và áp xe ở các vị trí khác nhau

có thể xảy ra cùng với nhiễm trùng A pleuropneumoniae

* B ệnh tích:

Tổn thương bệnh lý ñại thể chủ yếu ở ñường hô hấp ða số các trường hợp bị viêm phổi hai bên, với tổn thương ở các thùy ñỉnh và thùy tim, cũng như ít nhất một phần các mỏm trên của thuỳ hoành và ở ñó viêm phổi thường khu trú, ranh giới rõ

Ở các trường hợp tử vong nhanh chóng, khí quản và các phế quản bị lấp ñầy bởi các chất tiết nhầy bọt nhuốm máu Và có thể thấy một số tổn

thương ñại thể ở các trường hợp tối cấp tính các vùng viêm phổi trở nên sẫm màu và chắc với viêm màng phổi có ít tơ huyết hoặc không tơ huyết và mặt cắt thường mủn Viêm màng phổi tơ huyết thường rất rõ ở các gia súc chết trong giai ñoạn cấp tính của bệnh ít nhất 24 giờ sau khi nhiễm trùng và khoang màng phổi chứa dịch nhuốm máu

Khi tổn thương tiến triển lớn hơn, viêm màng phổi tơ huyết trên vùng phổi tổn thương trở nên xơ và có thể dính rất chặt màng phổi vào thành ngực tới mức làm cho phổi dính vào thành ngực ngay cả khi mổ tử thi lấy phổi ra phân tích Tổn thương sớm ở phổi là phổi trở nên ñỏ tím hoặc ñen ñồng ñều

và sau ñó trở nên sáng hơn và sau ñó vẫn cứng ở những khu vực bị nặng nhất Các tổn thương co lại kích cỡ khi bệnh giảm, ở trường hợp mãn tính hơn còn tồn tại các nốt kích thước khác nhau, phần lớn ở thuỳ tim Những nốt dạng apxe ñược giới hạn bởi vỏ dày tổ chức liên kết và có lẽ kết hợp với khu vực viêm phổi tơ huyết Trong một số trường hợp khi tổn thương phổi ñược phục hồi thì chỉ còn lại một số ổ di chứng của viêm dính màng phổi tơ huyết Tỷ lệ lưu hành bệnh viêm màng phổi mãn tính cao ở lợn giết thịt có nghĩa là viêm phổi

- màng phổi nhiều

Trong các giai ñoạn ñầu của bệnh, những biến ñổi về tổ chức bệnh lý ñược ñặc trưng bởi sự hoại tử, xuất huyết, thâm nhiễm các tế bào bạch cầu trung tính, sự hoạt hoá ñại thực bào và tiểu cầu, nghẽn mạch máu, phù rộng và tiết dịch gỉ viêm lẫn fibrin Sau phản ứng cấp tính ñặc trưng là sự thâm nhiễm ñại thực bào, xơ hoá rõ quanh những vùng hoại tử và viêm màng phổi fibrin

định chẩn đốn ở các động vật mới chết dễ dàng tìm thấy căn nguyên bệnh tại phế quản hoặc dịch tiết ở mũi và tổn thương phổi

Việc khẳng định là A pleuropneumoniae cĩ thể cĩ nhiều cách: bằng

kháng thể huỳnh quang, bằng Peroxidase miễn dịch, bằng đồng ngưng kết tìm kháng nguyên đặc hiệu cho serotype ở chiết xuất tổ chức phổi, sử dụng ngưng kết latex hoặc ELISA Axít nhân của vi khuẩn cĩ thể được tìm ra bởi một số phương pháp như đồng vị đánh dấu DNA trên các tế bào và các chuỗi phản ứng polymerase (PCR); Xác định trực tiếp sự cĩ mặt của A

Cĩ thể dùng kỹ thuật PCR hoặc test huyết thanh với kháng thể hấp thụ

hoặc kháng thể đơn dịng để xác định vi khuẩn phân lập được cĩ phải là A

kỹ thuật PCR cho các gen hoạt hố câú trúc của độc tố hoặc cĩ thể sử dụng kháng thể đơn dịng với từng serotype Việc định serotype cĩ thể xác định được khi cho ngưng kết từ nuơi cấy trên mơi trường giàu dinh dưỡng cùng với huyết thanh hoặc bằng phản ứng đồng ngưng kết Trong một số trường hợp dùng phương pháp khuếch tán trên gel thạch và bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp Các serotype của các chủng phân lập được sẽ nhanh chĩng cho khẳng định chẩn đốn vi khuẩn học và điều này là cần thiết khi dự định tiêm chủng cĩ trong Vacxin cho lợn ðiều đĩ chứng minh sự phân bố tại chỗ của các serotype, cho phép đánh giá tình trạng dịch tễ học và theo dõi sự tiến hành các phản ứng huyết thanh học đặc hiệu

Việc xác định kháng thể ít cĩ giá trị chẩn đốn trong những vụ dịch gần đây nhưng nĩ là một cơng cụ trong điều tra dịch tễ học (Nielsen,1988) [35] Kháng thể cĩ thể được phát hiện theo một số cách Phương pháp hồn thiện gần đây nhất là cố định bổ thể (CF) hoặc ngưng kết trên ống nghiệm Phương pháp đơn giản bao gồm ELISA Việc xác định kháng thể cĩ trong huyết thanh

cĩ thể được dùng để xác định kháng thể của đàn hay để giải thích sự cĩ mặt

của các kháng thể của lợn mẹ Trong tất cả các xét nghiệm huyết thanh học cần phải quan tâm đến sự loại trừ các kháng thể được phát sinh bởi sự nhiễm

Bệnh dịch tả lợn, đĩng dấu lợn và các bệnh nhiễm trùng do liên cầu phải được xem xét trong việc chẩn đốn phân biệt cĩ thể được ở các trường hợp quá cấp và cấp tính Trong những trường hợp nhiễm trùng cấp tính và mãn tính các bệnh tích của phổi phải được phân biệt với các bệnh tích gây ra

bởi các tác nhân vi khuẩn sinh mủ như A.pyogenes, Staphylococcus aureus, trực khuẩn dạng bạch cầu và Fusobacterium necrophorum Cĩ thể khơng thể phân biệt được các bệnh tích ở phổi gây ra bởi các Actinobacillus khác ở lợn

với các bệnh tích của bệnh viêm phổi màng phổi và bệnh tụ huyết trùng cấp tính đơi khi cĩ thể giống với bệnh viêm phổi màng phổi

3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae,

hô hấp và sinh sản ở các tỉnh Thái Bình, Hải Phòng, Hưng Yên, Bắc Ninh

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1. Tình hình hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở các ñàn lợn nuôi tại

các tỉnh Thái Bình, Hải Phòng, Hưng Yên, Bắc Ninh

3.2.2 Phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida, Actinobacillus

hô hấp và sinh sản

3.2.3. Xác ñịnh một số ñặc tính sinh vật hoá học của các chủng vi khuẩn phân lập ñược

3.2.4. Xác ñịnh ñộc lực của các chủng vi khuẩn phân lập ñược

3.2.5. Xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn phân lập ñược

3.3 Nguyên liệu dùng cho nghiên cứu

3.3.1 Mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm là phổi của những lợn ốm, chết do hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản nuôi tại các tỉnh Thái Bình, Hải Phòng, Hưng Yên, Bắc Ninh

3.3.2 ðộng vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng trọng lượng 18-20gram

- Lợn sau cai sữa 35 ngày tuổi khỏe mạnh

3.3.3 Môi trường, hóa chất

Môi trường dùng là môi trường do hãng Oxoid (Anh), Merck (Pháp) sản

xuất gồm: - Môi trường nước thịt

- Môi trường thạch trường

- Môi trường thạch máu

- Môi trường thạch TSA (Tryptic Soy Agar)

- Môi trường thạch Chocolate

- Môi trường MacConkey

- Môi trường BHI (Brain Heart Infusion)

- Môi trường các loại ñường:

- Dung dịch PBS (Phosphat Buffer Solution):

- Giấy thử Oxidase

- Thuốc thử phản ứng Catalase: Dung dịch H2O2 3%

- Dung dịch Kovac’s:

- Dung dịch thuốc nhuộm gram

3.3.4 Giống vi khuẩn - dụng cụ - máy móc

- Giống vi khuẩn P multocida, A Pleuropneumoniae, Streptococcus

chuẩn do Úc và Nhật Bản cung cấp Sử dụng là chủng ñối chiếu với các chủng vi khuẩn phân lập ñược trong phản ứng PCR và huyết thanh học

- Giống vi khuẩn Staphylococcus aureus dùng cấy kèm khi phân lập vi khuẩn A pleuropneumoniae

- Kháng huyết thanh chuẩn dùng ñịnh type vi khuẩn A

- Dụng cụ máy móc trong phòng thí nghiệm

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu

Lấy bệnh phẩm của những lợn ở các lứa tuổi nghi mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở các tỉnh Thái Bình, Hải Phòng, Hưng Yên, Bắc Ninh

3.4.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn

- ðối với bệnh phẩm là phổi, trước khi nuôi cấy lên các loại môi trường nêu ở trên thì vị trí phổi lẫy mẫu ñược ñốt cháy bề mặt, dùng mũi kéo cắt vào phần phổi ñã bị ñốt cháy và lấy phần bệnh phẩm ở phía sâu bên trong dùng nuôi cấy ñể tránh tạp khuẩn

Sau khi nuôi cấy 24 giờ, căn cứ vào ñặc ñiểm hình thái khuẩn lạc của vi

khuẩn Actinobacillus, Pasteurella và Streptococcus, tính chất mọc trên các

môi trường sẽ tiến hành chọn khuẩn lạc ñiển hình, phết kính nhuộm Gram kiểm tra hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi với ñộ phóng ñại 1500 lần, ñồng thời làm các phản ứng sinh hóa và cấy giữ giống ñể dùng cho các nghiên cứu tiếp theo

- Khuẩn lạc Pasteurella multocida ñược nuôi cấy trên môi trường thạch

máu ở 370C trong 24 giờ có dạng tròn trơn, màu trắng ñục, có mùi tanh của nước dãi khô Không dung huyết trên thạch máu, không mọc trên môi trường MacConkey, phản ứng Indol dương tính, phản ứng Oxydaza, Catalaza dương tính, không di ñộng

- Khuẩn lạc Actinobacillus pleuropneumoniae sau khi nuôi cấy trên

môi trường thạch máu và thạch Chocolate ở 370C trong 24 giờ trong ñiều kiện

dung huyết

- ðối với vi khuẩn Streptococcus: Sau khi bồi dưỡng vi khuẩn ở 37oC trong 24 giờ, căn cứ vào ñặc ñiểm khuẩn lạc ñể chọn ra những khuẩn lạc ñiển

hình của vi khuẩn Streptococcus trên môi trường thạch máu, phết kính nhuộm

Gram, kiểm tra hình thái, làm các phản ứng sinh hoá, cấy giữ giống ñể dùng cho các nghiên cứu tiếp theo

theo sơ ñồ sau: