BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) phân tích hàm lượng 3 MCPD trong nước tương BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký KHÍ KHỐI PHỔ

- Cho đến 11/2001, lần đầu tiên tại Việt Nam các kiểm nghiệm về 3-mcpd được tiến hành và xác định nồng độ chất này có mặt trong một số sản phẩm nước tương ở thị trường Việt Nam là cao qu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI THÚ Ý

BÁO CÁO DƯỢC PHÂN TÍCH

NƯỚC TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ KHÍ-KHỐI PHỔ.

GVHD:

SV:

NỘI DUNG:

I ĐẶT VẤN ĐỀ.

I.1 Tình hình nước tương có chứa 3-MCPD trên thế giới I.2 Tình hình nhiễm 3-MCPD trong nước tương tại thị trường Việt Nam.

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP.

II.1 Đối tượng

II.2 Phương pháp.

II.2.1 Nguyên lý.

II.2.2 Dấu hiệu nhận biết 3-MCPD.

a.Công thức cấu tạo.

b.Tính chất vật lý.

c Tính chất hóa học.

d.Ảnh hưởng của 3MCPD.

II.2.3 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất.

II.2.4 Cách tiến hành.

III TÍNH TOÁN.

IV NHẬN XÉT QUÁ TRÌNH

V PHỤ LỤC.

VI TÀI LIỆU THAM KHẢO

I ĐẶT VẤN ĐỀ.

- Thực phẩm là yếu tố quan trọng song hành với sự sinh tồn của loài người Theo quá trình tiến hoá và phát triển của loài người, thực phẩm cũng được phát triển theo Cùng với sự tiến triển của khoa học công nghệ, công nghệ chế biến thực phẩm cũng phát triển

- Nguy cơ tác hại đến sức khoẻ của thực phẩm từ nguồn thức ăn thô là nguy cơ tự nhiên đến

từ chính thành phần chứa trong thực phẩm hoặc tạp nhiễm môi trường, cũng biến đổi theo quy trình chế biến thực phẩm công nghiệp là tạp nhiễm và phát sinh

- Nhu cầu về một thực phẩm đáp ứng không những về dinh dưỡng mà còn về tính an toàn và không gây hại cho sức khoẻ đối với người tiêu dùng là cần thiết Vì vậy mà các kỹ thuật đánh giá mối nguy hại của một thực phẩm đối với sức khoẻ cũng đòi hỏi phải phát triển để bắt kịp với công nghệ chế biến thức ăn ngày càng cao và đa dạng, nhằm phát hiện và loại trừ bớt những nguy cơ tác hại đến cơ thể người tiêu dùng

- Đánh giá nguy cơ tác hại đến sức khoẻ của 3-MCPD một hoá chất được sản sinh trong khâu chế biến sản phẩm xì dầu nước tương và dầu hào, cũng là một vấn đề được người tiêu dùng quan tâm

1 Tình hình nước tương có chứa 3-MCPD trên thế giới.

Năm 2001, WHO quy định cơ thể tiêu thụ tối đa 2µg/kg trọng lượng

Do tình hình tiêu thụ các sản phẩm có chứa 3-MCPD ở từng vùng , từng nước khác nhau nên có những nồng độ cho phép sự hiện diện của chất này khác nhau

Quốc gia Nồng độ 3-mcpd cho phép trên 1kg

nước tương (mg/kg) Canada, Phần Lan, Áo, các tiểu

vương quốc Ả Rập 1,0

Mỹ 1,0

Úc, Newzealand 0,2

Hà Lan,Bồ Đào

Nha,Malaysia,Thụy Điển 0,02

Anh 0,01

Việt Nam 1,0

2 Tình hình nhiễm 3-MCPD trong nước tương tại thị trường Việt Nam

- Cho đến 11/2001, lần đầu tiên tại Việt Nam các kiểm nghiệm về 3-mcpd được tiến hành và xác định nồng độ chất này có mặt trong một số sản phẩm nước tương ở thị trường Việt Nam là cao quá ngưỡng cho phép rất nhiều Hàm lượng cao quá mức cho phép từ hơn 2 lần đến 2.215 lần

- Năm 2007 10/14 mẫu có chứa chất 3-MCPD vượt quá mức cho phép (mức cao nhất là 4.202 lần và thấp nhất là 1,65 lần)

- Đà nẵng: từ 38,7 - 49,17mg/kg, gấp 38 - 49 lần mức cho phép

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP.

1 Đối tượng : nước tương và dầu hào.

2 Phương pháp: Xác định hàm lượng 3-monoclo propan-1,2-diol (3-MCPD) bằng sắc ký khí/khối phổ Gas Chromatography Mass Spectometry (GC/MS).

Tương tự như các hệ thống sắc ký khí khác, hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ cũng bao gồm các bộ phận: nguồn cung cấp khí, lò cột, bộ phận tiêm mẫu, cột phân tích, đầu dò, bộ phận ghi nhận tín hiệu, và bộ phận in dữ liệu phân tích; trong đó, đầu dò là đầu dò khối phổ

Các cấu tử của mẫu sau khi tách ra khỏi cột mao quản sẽ đi vào trong đầu dò khối phổ Tại đây, tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, sẽ diễn ra quá trình ion hóa với các kiểu ion hóa khác nhau (API, ESI hay APPI), sau đó các ion được ghi nhận bởi đầu dò

Sắc ký khí (GC):

Cửa tiêm mẫu (injection port): 1µl dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được tiêm vào hệ thống

tại cửa này Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là helium Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 3000 C để mẫu trở thành dạng khí

Vỏ ngoài (Oven): Phần vỏ của hệ thống GC chính là một lò nung đặc biệt Nhiệt độ của lò này

dao động dao động từ 400 C cho tới 3200C

Cột nhồi ( column): Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30m với

mặt trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt Các chất trong hỗn hợp được phân tách bằng các chạy dọc theo cột này

Khối phổ (MS): Được dùng để xác định một loại chất hóa học dựa trên cấu trúc của nó.

Nguồn Ion( Ion source): Sau khi đi qua cột sắc ký khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối

phổ Các phân tử phải đi qua một luồng electrons và vì vậy chúng có thể bị phân chia thành các mảnh nhỏ hơn và tích điện dương Các mảnh này được gọi là ion Điều này là quan trọng bởi vì các hạt cần ở trạng thái điện tích thì mới đi qua được bộ lọc

Bộ lọc (Filter): Khi các ion di chuyển trong bộ phận khối phổ, dựa trên khối lượng mà chúng

được sàng lọc bởi 1 trường điện từ Bộ lọc này có khả năng lựa chọn, tức là chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua

Bộ cảm biến (detecter) : Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có cùng khối

lượng Thông tin này sau đó được chuyển đến máy tính Tại đây các phép tính được thực hiện và xuất ra kết quả gọi là khối phổ (mass spectrum) Khối phổ là một biểu đồ phản ánh số lượng các hạt ion với các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc

Máy tính: Bộ phận chịu trách nhiệm tính toán các tín hiệu do bộ cảm ứng cung cấp và đưa ra

kết quả khối phổ

2.1 Nguyên lý:

- Mẫu được cho hấp phụ qua cột extrelut, giải hấp 3-MCPD bằng dietyl ête Sau đó cho tạo dẫn xuất với dung dịch acid toluen-4-sulfonic trong aceton thành 4-(clometyl)-2,2-dimetyl-1,3-dioxolan, phản ứng này được thực hiện tại 40oC, trong 90 phút Sau đó đo trên máy sắc ký khí với detector khối phổ (GC/MS)

- Giới hạn phát hiện của phương pháp: 4,01 ppb; Giới hạn định lượng: 13,37ppb

2.2 Dấu hiệu nhận biết 3MCPD.

a Công thức cấu tạo:

3-MCPD(3-monochloropropane-1,2-diol)

Thuộc nhóm chlorapropanols

CT: C3H7O2Cl

b Tính chất vật lí

 Chất lỏng không màu có vị ngọt

 Nhiệt độ nóng chảy: -63oC

 Nhiệt độ sôi: 61oC

 Chiết suất: 1,4459 ở 200C, 589 nm

 Tỷ trọng: 1,48 g / cm3

c Tính chất hoá học

 Phân hủy khi bị chiếu sáng

 Không có khả năng phản ứng với các hợp chất peroxyde, kiềm mạnh, kim loại Mg, Al và các tác nhân oxi hóa mạnh

 Tạo phức với Cu ở điều kiện thường tạo thành hợp chất màu xanh đặc trưng

d Ảnh hưởng của 3MCPD đối với con người và động vật :

- Phần lớn những nghiên cứu về độc tính của chất 3-MCPD đã được thực hiện trên động vật,

vi sinh vật và các dòng tế bào chuẩn, các thí nghiệm trên động vật cho thấy, 3-MCPD gây hại đến hầu hết các cơ quan như cản trở cơ thể sản xuất testosterol dẫn đến giảm khả năng tình dục, làm teo tinh hoàn, xuất hiện u hạt viêm, gây bệnh thận mãn tính, tăng đường niệu, giảm tế bào máu do suy tủy, tăng nguy cơ ung thư vú của giống đực, có khả nắng gây ung thư, và có thể làm thay đổi quá trình nhân bản gene

- Khi vào cơ thể người, 3-MCPD sẽ biến đổi thành một số chất khác, và tất cả chúng đều gây nguy hiểm cho sức khoẻ con người

II.2.3 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất.

a Dụng cụ.

- Cân phân tích (chính xác đến mg)

- Bình định mức 100ml, 50ml, 20ml, 10ml

- Bình cầu cất 250ml

- Cốc thủy tinh 10ml, 50ml, 100ml

- Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 4ml, 5ml

- Ống thủy tinh có nắp vặn 5ml, 10ml

- Xylanh, Đũa thủy tinh

- Phễu lọc, giấy lọc

b Thiết bị

i. Bộ cất quay chân không

ii. Hệ thống máy sắc ký khí khối phổ

Có thể sử dụng hệ thống Trace GC-Trace MS Plus (Hãng sản xuất Thermo Finigan) hoặc các hệ thống máy sắc ký khí khối phổ tương đương với cấu hình kỹ thuật tối thiểu:

- Đầu dò khối phổ

- Bộ phận tiêm mẫu chia/ không chia dòng (Split/ Splitless Injector), chương trình nhiệt độ (PTV Injector: Programmed Temperature Vaporation Injector)

- Cột sắc ký mao quản SPB – 1701, dài 30m, đường kính 0.25mm, lớp film 0.25m

- Máy tính điều khiển thiết bị và xử lý dữ liệu

Điều kiện sắc ký:

- Chương trình nhiệt độ cột :

+ Nhiệt độ đầu 45oC, giữ ở 1 phút;

+ Sau đó tăng lên 120oC với tốc độ gia nhiệt 6oC/ phút;

+ Tiếp tục tăng nhiệt độ lên đến 250oC; với tốc độ gia nhiệt 15oC / phút, giữ ở nhiệt độ này 5 phút;

- Tiêm mẫu : Tiêm mẫu với chế độ không chia dòng

+ Nhiệt độ bộ phận tiêm mẫu : 250oC

+ Thể tích mẫu tiêm : 2l

- Tốc độ khí mang He : 1,5 ml/phút

Điều kiện khối phổ:

* MS Tune file:

+ Nguồn Ion hóa : EI

+ Năng lượng ion hóa : 70eV

+ Nhiệt độ nguồn ion : 180oC

+ Nhiệt độ Interface: 200oC

+ Giá trị của bộ khuếch đại Multiplier : 300 – 500V

* MS method

- Chế độ quét Fullscan

+ Thời gian quét : 5 - 15 phút

+ Khoảng khối quét : 35 - 150 amu

- Chế độ quét Ion chọn lọc SIM ( Selected Ion Monitoring) + Số khối lựa chọn để quét: 135

+Thời gian quét : 6 – 10 phút

c Hóa chất, thuốc thử

 Hoá chất, thuốc thử

Hóa chất sử dụng có độ tinh khiết phân tích (TKPT); dung môi là dung môi dùng cho sắc ký a) Chất chuẩn 3-MCPD

b) Diethyl ete loại dùng cho sắc ký

c) Aceton loại dùng cho sắc ký

d) Acid toluen -4-Sulfonic

đ) Ethyl acetat loại dùng cho sắc ký

e) Cột Extrelut: Dùng xylanh 60ml, nhồi bông thủy tinh vào đầu ống xylanh Sau đó cho từ từ 10g hạt Extrelut vào xy lanh, dùng đũa thủy tinh gõ nhẹ vào thành ống cho hạt xuống đều và chặt g) Natri clorua: Dung dịch bão hoà trong nước

h) Khí Nitơ 99,999%

i) Khí Hêli 99,999%

 Pha chế dung dịch

a) Dung dịch acid toluen - 4 - sulfonic trong Aceton (1g/L): Cân chính xác 0,1000g acid toluen

- 4 - sulfonic (3.3.1.d) cho vào bình định mức 100ml, định mức đến vạch bằng aceton, lắc đều

b) Dung dịch chuẩn 3-MCPD 100ppm: Cân chính xác 0,0100g 3-MCPD cho vào bình định mức

100ml, định mức đến vạch bằng ethyl acetat, lắc đều

c) Dung dịch chuẩn 3-MCPD 10ppm: Hút 1ml dung dịch 3-MCPD 100ppm vào bình định mức

10ml Định mức đến vạch bằng ethyl acetat, lắc đều

d) Dung dịch chuẩn 3-MCPD 200ppb: Hút 1ml dung dịch 3-MCPD 10ppm vào bình định mức

50ml Định mức đến vạch bằng ethyl acetat, lắc đều

đ) Dung dịch chuẩn 3-MCPD 20ppb: Hút 2ml dung dịch 3-MCPD 200ppb vào bình định mức

20ml Định mức đến vạch bằng ethyl acetat, lắc đều

Các dung dịch chuẩn này được bảo quản trong tủ lạnh

II.2.4 TIẾN HÀNH XÁC ĐỊNH.

a Chuẩn bị mẫu.

Cân 4g mẫu, chính xác đến 0,001g vào cốc thủy tinh 50ml Thêm vào 8g dung dịch NaCl bão hòa, khuấy đều

Cho toàn bộ dung dịch trên vào cột extrelut Để ổn định 15 phút cho toàn bộ nước và chất trong dung dịch phân bố đều trên bề mặt của hạt extrelut

Rửa giải 3-MCPD bằng 150ml dietyl ête Thu dịch rửa giải vào bình cầu cất Sau đó đem cô quay chân không đến gần cạn, rồi dùng khí nitơ thổi khô

b Dẫn xuất hóa

Dùng pipet hút chính xác 2ml dung dịch acid Toluen-4-sulfonic trong aceton (1g/L) vào bình cầu cất, lắc đều rồi chuyển toàn bộ dung dịch này vào ống nghiệm có nút Đặt ống nghiệm vào bếp cách thủy ở 40oC trong 90 phút, lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng, sau đó chuyển vào chai 1,5ml để

đo trên máy GC/MS (dịch thử)

c Chuẩn bị mẫu chuẩn

Các mẫu chuẩn theo từng nồng độ xác định được chuẩn bị, cụ thể theo các bước trong bảng sau:

Bảng 1 : Chuẩn bị mẫu chuẩn

ống 1 ống 2 ống 3 ống 4 3-MCPD chuẩn (20ppb) cho vào cột

extrelut 1ml 2ml 4ml 6ml Dung dịch sau rửa giải bằng dietyl ête Cô quay chân không đến gần cạn, thổi khô

bằng khí Nitơ Dung dịch acid Toluen-4-Sulfonic trong

aceton (1g/L) 2 ml

Lắc đều, đặt các ống nghiệm vào bếp cách

thủy ở 40oC trong 90 phút

Để nguội ở nhiệt độ phòng, chuyển vào lọ 1,5ml để đo trên máy GC/MS

Nồng độ 3-MCPD chuẩn (ppb) 10 20 40 60

d Xây dựng đường chuẩn.

Kiểm tra thiết bị đã được chạy ổn định theo các điều kiện mô tả, lần lượt tiêm các mẫu chuẩn đã được chuẩn bị Ghi lại diện tích pic tương ứng với từng nồng độ Dựa vào nồng độ và diện tích pic chuẩn, thiết lập phương trình biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ chuẩn và diện tích pic

e Tiến hành phân tích

Tiến hành tiêm mẫu phân tích vào máy, ghi lại sắc ký đồ mỗi lần tiêm mẫu Ghi lại diện tích có thời gian lưu và phổ khối tương ứng với thơì gian lưu và phổ khối của chất chuẩn

Dựa vào phương trình biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ chuẩn và diện tích pic, tính nồng độ 3-MCPD có trong dịch thử

III TÍNH KẾT QUẢ

Hàm lượng 3-MCPD trong mẫu thử được tính theo công thức sau :

Cx  V

C (ppm) =   F

m Trong đó :

Cx : nồng độ 3-MCPD trong dịch thử (ppm)

m : Khối lượng mẫu đem phân tích (g)

V : Thể tích cuối (ml)

F : Hệ số pha loãng khi đo (F=1: không pha loãng)

IV NHẬN XÉT QUÁ TRÌNH

Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đạinhất

hiện nay với độ nhạy,độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp

Hiệu suất thu hồi tính bằng % (X) theo công thức:

.100%

Trong đó :

xR : Lượnghoạtchất tìm thấy trong mẫu trắng đã cho thêm hoạt chất

X0 : Lượng hoạt chất tìm thấy trong mẫu trắng

XA : Lượng hoạt chất đưa vào mẫu trắng

V PHỤ LỤC

SẮC KÝ ĐỒ VÀ PHỔ KHỐI CỦA CHUẨN 3-MCPD

VI TÀI LIỆU THAM KHẢO.

- Quá trình hình thành 3-mcpd trong thực phẩm, Ths Tôn Nữ Minh Nguyệt

- http://luanvan.net.vn/luan-van/nghien-cuu-ve-3-mcpd-38672/

- D.C.Meierhans, S.Bruehlmann, J.Meili, C.Taeschler, Sensitive method for the

determination of 3-Chloropropane –1,2-diol and Chloropropane – 1,3-diol by capillary gas

chromatography with mass spectrometric detection, Journal of Chromatography A., 325-333, 1998

- Food Law News – EU – 2001 http://www.fst.rdg.ac.uk/foodlaw/news/eu-01125.htm

- Nguyễn Thanh Khuyến, Giáo trình giảng dạy lý thuyết sắc ký, 1998, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Tp.HCM

- Trung Tâm Kỹ Thuật 3 – Kỹ thuật sắc ký khối phổ

- Tiêu chuẩn ngành Y tế 52TCN TQTP 0010:2005