BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) nghiên cứu và khảo sát hàm lượng nitrate có trong một số loại rau củ quả bằng HPLC

Ion amoni NH4+ trong nước sau một thời gian tương đối dài sẽ chuyển dần thành NO3- • Các nguồn thải từ một số ngành công nghiệp hoá chất, công nghiệp thực phẩm chứa acid nitrite hoà tan

NGHIÊN CỨU VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG NITRATE CÓ TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU CỦ QUẢ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO HPLC

Chương 1 Giới thiệu

1.1 Lý do chọn lựa đề tài

1.2 Mục tiêu, đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

Chương 2.Tổng quan lý thuyết

2.1 Tổng quan về nitrat

2.1.1 Giới thiệu về nitrate

2.1.2 Nguồn gốc của nitrate Vì sao nitrate có nhiều trong đất ? 2.1.3 Ảnh hưởng của nitrat đối với sức khoẻ con người

2.1.4 Quy định hàm lượng nitrate trong một số loại rau củ2.1.5 Một số phương pháp xác định hàm lượng nitrate

2.2 Tổng quan về HPLC

2.2.1 Giới thiệu HPLC

2.2.2 Khái niệm HPLC

2.2.3 Phân loại sắc ký

2.2.4 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

2.2.5 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ

2.4.3 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc

2.4.4 Chuẩn bị dung môi pha động

2.4.5 Chuẩn bị mẫu đo HPLC

4.3 Một số hình ảnh về sắc kí đồ của mẫu phân tích

Chương 5 Kết luận và kiến nghị

Chương 1 Giới thiệu

kỳ quan trọng đối với việc cung cấp vitamin, khoáng và các chất bổ dưỡng khácliên quan đến sức khoẻ con người Nhiều loại rau quả được con người sử dụng

ở dạng tươi sống vì thế các tác nhân hoá học sử dụng cho rau quả dễ bị haaos thụ và chuyển trực tiếp vào cơ thể con người

Nitrate là một ion đọc có trong rau quả, hàm lượng nó liên quan chặt chẽ đến liều lượng phân đạm sử dụng Sự có măt của nitrate với hàm lượng lớn gây hại tác động xấu đến sức khoẻ

Do vậy, việc phân tích xác định hàm lượng của các độc tố (trong đó có nitrate)

có trong rau quả trên thị trường đồng thời có thể giúp các cơ quan chức năng trong việc kiểm tra giám sát chất lượng lương thực, thực phẩm nhằm bảo vệ sứckhoẻ người tiêu dung

1.2 Mục tiêu đối tượng nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu:

Tìm hiểu tính chất vật lí, hoá lí, tác hại của nitrate có trong rau củ quả

 Đưa ra phương pháp xác định hàm lượng nitrate trong rau củ quả bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

 Khảo sát hàm lượng nitrate có trong một số loại rau củ quả có mặt trên thị thường

Đối tượng nghiên cứu: một số loại rau củ quả phổ biến trong bữa ăn hang ngày

Phạm vi nghiên cứu: rau củ quả được mua từ một số chợ trên đia bàn thành phố Hồ Chí Minh

Chương 2 Tổng quan lý thuyết

2.1 Tổng quan về nitrate

2.1.1 Giới thiệu về nitrate

Nitrate là muối của acid nitrite Trong muối nitrate, ion NO3- có cấu tạo hìnhtam giác đều với góc ONO bằng 1200 và độ dài liên kết N-O bằng 1,218 A0 .Ion NO3- không có màu nên các muối nitrate của những cation không màu đều không có màu Hầu hết các muối nitrate đều dễ tan trong nước Muối nitrate của những kim loại hoá trị hai và hoá trị ba thường ở dạng hydrat

Muối nitrate khan của kim loại kiềm khá bền với nhiệt ( chúng có thể thăng hoa trong chân không ở 3800 – 5000 ) Còn các nitrate của kim loại khác dễ phân huỷ khi đun nóng Độ bền nhiệt của muối nitrate phụ thuộc vào bản chất cation kim loại.

2.1.2 Nguồn gốc của nitrat Vì sao nitrat có nhiều trong đất?

Nitrat được tạo thành tự nhiên từ nito trong lòng đất Nito tồn tại trong thiên chủ yếu dưới dạng phân tử hai nguyên tử N2 và là một nguyên tố khá phổ biến trong thiên nhiên, chiếm 78,03% thể tích của không khí Một cách gần đúng có thể coi thể tích của không khí gồn có 4 phần N2 và 1 phần 02

Trong phân tử N2, nito liên kết với nhau bằng ba liên kết hoá trị Để phá vỡ liên kết này cần một năng lượng rất lớn khoảng 942kJ/mol Điều này giải thích tính trơ của phân tử N2 và giải thích tại sao đa số hợp chất đơn giản củaN2, mặc dù trong đó có liên kết bền, đều là hợp chất thu nhiệt Cũng chính vìthế mà phần lớn các sinh vật sống không thể sử dụng trực tiếp nó được

Nito có trong mọi sinh vật dưới dạng hợp chất hữu cơ phức tạp như protein, acid nucleic, một số sinh tố và kích thích tố, chất màu của máu, clorophin… Nito là mộttrong những nguyên tố dinh dưỡng chính đối với thực vật Bởi vậy trong nông nghiệp, những lượng lớn hợp chất của nito được thường xuyên cung cấp cho đất dưới dạng phân tử đạm để nuôi cây trồng

Nito tồn tại ở nhiều trạng thái ox khác nhau như NO3-, NO2 và NH4 Trong các dạng tồn tại của nito thì NO3- và NO2- được quan tâm hơn cả vì chúng là những ion có khả năng gây độc cho con người Ngoài các trạng thái trên nito còn tồn tại ở trạng thái khí như N2, NO, N2O Trong các dạng tồn tại của nito thì NO3- là dạng bến nhất và được tìm thấy nhiều trong nước ngầm tại các khu vực đất trồng trọt.Quá trình hình thành nitrate là một giai đoạn không thể thiếu trong vòng tuần hoàn của nito trong tự nhiên

Chu trình của nito chủ yếu liên quan đến các phản ứng sinh học.Tất cả các phản ứng trong chuỗi:

N2 -> NH3 - > NO2- >NO3- -> NH4+ - > Protein

 Các hợp chất của nitơ xuất hiện trong nước như NH4+, NO2-, NO3-

là sản phẩm của quá trình phân huỷ vi sinh yếm khí (NH4+), hiếu khí (NO2-, NO3-) các chất hữu cơ chứa nitơ từ xác các sinh vật, chất thải hữu cơ ở giai đoạn đầu các chất đạm dưới tác dụng cuả vi khuẩn yếm khí sẽ phân huỷ thành NH3:

(NH2)2CO H2O -> 2 NH3 CO2

Ion amoni (NH4+) trong nước sau một thời gian tương đối dài sẽ chuyển dần thành NO3-

• Các nguồn thải từ một số ngành công nghiệp hoá chất, công nghiệp thực phẩm chứa acid nitrite ( hoà tan trong nước mưa tạo HNO3) cũng đưa vào nước một lượng khá lớn NO3

- Thành phần nitơ trong đất chủ yếu ở dạng hữu cơ, do kết quả của quá trình phân huỷ thực vật và động vật chết, phân, nước tiểu nó được chuyển hoá thành NH3, NH4+ sau đó bị oxi hoá bởi vi khuẩn tạo thành NO2- rồi NO3- và thực vật sử dụng NO3- làm chất dinh dưỡng Tuy nhiên, nồng độ tự nhiên của nitrate trong đất không cao lắm, chưa đủ để đảm bảo cho cây trồng có năng suất cao Vì vậy, người nông dân phải bổ sung vào đất các loại phân đạm như urê (NH2)2CO , NH4NO3,

(NH4)2SO4 đều đặn để cấp thêm nitơ cho đất, nhất là sau khi thu hoạch đất bị bạc màu Khi đó các vi khuẩn sẽ chuyển hoá NH4+ thành NO3- để cho cây hấp thụ Ngày nay do sử dụng phân đạm trong sản suất nông nghiệp quá nhiều và chưa đúng quy định là nguyên nhân chủ yếu gây ô nhiễm NO3- trong nước Tuy nhiên, nitrate và amoni một phần chủyếu được cây cối hấp thụ, một phần giải phóng ra ngoài khí quyển dưới dạng N2, NH3 và phần còn lại tích tụ trong đất và tan trong nước ngầm

Từ đó cho thấy nếu luợng đạm đưa vào đất càng nhiều thì lượng NO3-

dư thừa càng tăng Thực phẩm và đồ uống có chứa một hàm lượng nitratethấp thì không có hại cho sức khỏe Cây cối hấp thụ nitrate trong đất để lấy dưỡng chất và có thể sẽ tạo một dư lượng nhỏ trong lá và quả Do tính cơ động cao, nitrate dễ dàng thấm vào nguồn nước ngầm Nếu con người và súc vật uống phải nước có nhiều nitrate sẽ dễ bị mắc các chứng bệnh về máu, đặc biệt là đối với trẻ nhỏ Nitrate hình thành khi vi sinh vật chuyển hóa phân bón, phân hủy xác động thực vật Nếu cây cối không kịp hấp thụ hết lượng nitrate này thì nước mưa và nước tưới sẽ làm cho nó ngấm vào lòng đất, làm ô nhiễm nguồn nước ngầm Rất tiếc

là con người lại chính là thủ phạm tạo ra nguồn ô nhiễm nitrate lớn nhất thông qua các hoạt động nông nghiệp:

• Sử dụng phân bón hóa học hoặc hữu cơ

Nitrate là chất dinh dưỡng cho cây cỏ (phân bón) để chúng có thể sanh trưởng Khi thiếu ánh nắng, vào buổi sáng tinh mơ, mùa xuân và mùa thu hoặc trong mùa đông nếu lượng phân nitrate quá cao cây cỏ sẽ

dự trữ lại trong các tế bào Tự bản thân nitrate không có độc tố, nhưng trong cơ thể con người nitrate sẽ tạo ra nitrite ở những điều kiện nhất định

Một người trưởng thành khỏe mạnh có thể chịu được một lượng nitrate tương đối lớn mà không bị ảnh hưởng đến sức khỏe Trên thực tế, phần lớn lượng nitrate xâm nhập cơ thể qua thực phẩm, cụ thể là các loại rau củ Tuy nhiên, lượng nitrate này sẽ bị thải theo nước tiểu Thế nhưng, nếu liên tục phải hấp thụ nitrate có thể sẽ dẫn đến mắc phải một số bệnh

do sự hình thành của các Nitrosamines (chất gây ung thư) và làm rối loạnsức khỏe như sự thay đổi hàm lượng vitamin, rối loạn việc tạo ra

thyroxin của tuyến giáp, sự thay đổi trong máu, ảnh hưởng xấu đến việc tái sản xuất…Hầu hết tất cả thực phẩm đều có chứa nitrate bởi vì nitrate

có mặt trong tự nhiên trong đất, nước và không khí Sự ảnh hưởng xấu của nitrate đến sức khỏe con người bắt đầu từ những sự chuyển đổi của chúng thành nitrite bởi một enzyme Enzyme này có trong tuyến nước bọt, trong dạ dày hoặc bất cứ ở đâu trong cơ thể người có pH thấp

Nitrosamine là một hộp chất có cấu trúc hóa-học là R1N N=O, trong đó có carcinogenic, đó là tác nhân kích thích sự phát triển của bệnh ung thư hay bệnh ác tính nào đó

(-R2)-Hình 2.2: Công thức của Nitrosamine

Tại sao có Nitrosamine?

Trong thức ăn, Nitrosamine do hai yếu tố tạo nên nó là nitrites và amines Ta thấy sự hợp thành của nó thường xảy ra trong các proteins Với điều kiện thích hợp, chẳng hạn như trong các điều kiện quá ư là acid,như trong bao tử chúng ta, hay tại nơi nào có chiên xào với nhiệt độ cao, thì Nitrosamine dễ hợp thành Như ta biết nitrite hợp thành nitrous acid (HNO2), và khi ta tách chúng ra làm đôi ta có hai phần: nơi cực dương ta

có nitrosonium cation N = O+ còn nơi cực âm ta có hydroxide anion OH- Rồi nơi phía cực dương chính cation nitrosonium tác dụng với amine cho ta một chất gọi là Nitrosamine.

Ngoài ra, Nitrosamine còn có do các hoá chất dùng hằng ngày trong

kỹ nghệ hấp khô (dry cleaning industry) cũng gây độc chất cho con người Thêm nữa, hai nhà khoa học người Anh kể trên là Magee và Barnes còn nghiên cứu thêm những tính chất khác có được của

Nitrosamine và của cả hợp chất N-Nitroso (N-Nitroso compounds) Trên

300 hợp chất Nitroso được thí nghiệm thì thấy rằng khỏang 90% đều có thấy chất carcinogenic tạo ra các bướu ác tính trên nhiều loại thú được thínghiệm Tất cả các Nitrosamines là đều là những tác nhân gây đột biến (mutagens) bên ngoài tác dụng vào các tế bào trong cơ-thể và một số tạo thành carcinogens, cho từng phần lớn các cơ quan đặc biệt trong cơ thể

Ví như: chất dimethylNitrosamine thì tạo ung thư gan (liver cancer) cho các động vật được thí nghiệm, trong khi Nitrosamine từ khói thuốc lá tạo ung thư phổi (lung cancer)

Nitrosamine có mặt trong :

Hiện diện trong các thức ăn Ngoài ra Nitrosamine còn thấy hiện diện trong nhiều thực phẩm chế biến như: beer, cá, cá chế biến, sản phẩmcủa thịt và cheese thường dùng muối nitrite để bảo quản và tạo màu đỏ thịt Vì sự nguy hiểm của Nitrosamine, nên chính phủ Mỹ cho một hàm lượng giới hạn được dùng nitrite trong thịt để giảm thiểu sự gia tăng ung thư trong cộng đồng Mỹ Quốc Nitrosamines trong thực phẩm ở trong giới hạn: <120 ppm (part per million) cho các nước Âu châu và Bắc Mỹ Nitrosamine cũng được tìm thấy trong khói thuốc lá và các sản phẩm

do cao su chế biến mà ra (latex products) Nhiều cuộc thử nghiệm về Nitrosamine trên các bong bóng (ballons) và các bao cao su an toàn sinh

lý gọi là condoms, đều thấy rằng chúng có một lượng nhỏ Nitrosamine phóng thích ra vào nơi tiếp xúc

Khi thử trên các động vật, thì Nitrosamine hiện rõ nét báo hiệu là triệu chứng ung thư Nên người ta lo sợ rằng con người ăn phải nó sẽ bị ung thư như các loài vật Tuy nhiên, khó thấy rõ sự cấu trúc ung thư do Nitrosamine gây ra trên các ngũ tạng trong cơ thể Tuy nhiên, một sự khẳng định là những dữ kiện có được do các cuộc nghiên cứu các bệnh dịch đã xác quyết là Nitrosamine gây ra ung thư bao tử (stomach cancer).Tại sao là tại bao tử vì tại đó có hàm lượng acid rất cao

Còn một số lớn thuốc sát trùng, chính nó là nguồn chứa Nitrosamine gây ra ung thư cho những ai vô tình hay bị bắt hít nó, hay ăn phải nó, nhất là ở Việt Nam hiện nay việc dùng thuốc sát trùng xịt trên rau cải rất bừa bãi khắp nơi cùng nước tưới bị ô nhiễm.

NO3- khi vào cơ thể người tham gia phản ứng khử ở dạ dày và đường ruột do tác dụng của các men tiêu hoá sinh ra NO2- Sau khi nitrite được tạo thành, sẽ tác dụng với hemoglobine (phương tiện vận chuyển oxy trong máu) để tạo thành methemoglobine dẫn đến tình trạng thiếu oxy trong máu (ngộ độc nitrate) hay còn gọi là bệnh da xanh,

thường gặp ở trẻ nhỏ (blue baby)

4HbFe2(O2) 4 No2- 2 H2O -> 2 HbFe3 OH- 4 No3- O2

Methemoglobine là gì ?

Đó là sản phẩm của Hemoglobine bị oxy hóa, trong đó Fe++ hóa trị 2trong hemoglobine được chuyển thành Fe3+ hóa trị 3 Hemoglobine có khả năng chuyên chở oxy đến mô cơ thể nên làm da niêm có màu hồng trong khi methemoglobine không có khả năng vận chuyển oxy nên làm

da niêm tím tái Bình thường trong hồng cầu vẫn hình thành

methemoglobine (<1%) nhưng không tồn tại lâu, vì cơ thể có hệ thống men khử methemoglobine thành hemoglobine bình thường Tuy nhiên, cómột số tác nhân oxy hóa mạnh như hóa chất (Chlorates, Aniline - phẩm nhuộm, Trinitrotoluene - thuốc nổ)., thuốc (Nitroglycerine, Sulfonamide, Primaquine, Chloroquine, Lidocain, Prilocain - EMLA, Benzocain - gây

tê tại chỗ, Nitrate bạc - xức bỏng), thức ăn (nước giếng, củ dền, carrot, nước cải bẹ xanh, bắp cải, củ cải đường – những thức ăn này có hàm lượng nitrate cao, khi ăn nhiều và dày ngày sẽ gây methemoglobin ở trẻ nhỏ) biến đổi hemoglobine thành methemoglobine quá khả năng bù trừ của hệ thống men khử đưa đến tăng methemoglobine máu, dẫn đến bệnh nhân bị tím tái, có thể tử vong nếu không điều trị kịp thời

2.1.4 Quy định hàm lượng nitrate trong một số loại rau củ

Trong hoạt động thương mại quốc tế, các nước nhập khẩu rau tươi đều phải kiểm tra lượng nitrate trước khi cho nhập Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và cộng đồng kinh tế châu Âu (EC) giới hạn hàm lượng nitrate trong nước uống là 50 mg/l, hàm lượng rau không quá 300 mg/kg rau tươi

Bảng 2.1 : Hàm lượng nitrate cho phép trong một số loại rau quả theo tiêu chuẩn của WHO (đơn vị: mg/kg sản phẩm)

Bản thân lượng nitrate dư thừa trong cây trồng là một hiện tượng bình thườngcho sự dinh dưỡng của cây Tuy nhiên, để đảm bảo năng suất cao, người sản xuất thường dùng một lượng thừa phân hóa học, nhất là phâm đạm Sự tích tụ nitrate trong nông phẩm phụ thuộc vào số lượng và phương pháp bón phân đạm, bên cạnh

đó còn phụ thuộc vào đặc điểm sinh học của cây trồng, kỹ thuật canh tác và nhiều yếu tố môi trường khác Sản xuất nông nghiệp hiện nay đang tiến dần đến việc sử dụng các giống lai với đặc điểm di truyền cho phép không tích lũy nitrate với lượngcao

Việc tích lũy nitrate trong cây trồng do nhiều yếu tố tác động Người ta đã nhận thấy có gần 20 yếu tố ảnh hưởng đến việc tích lũy nitrate trong cây trồng, từ

sự can thiệp của người sản xuất bằng chế độ dinh dưỡng cho đến tác động của các yếu tố môi trường Khi trời râm và độ ẩm cao, lượng nitrate tích lũy trong cây cao gấp 3 lần bình thường Lượng nitrate cũng tăng cao khi trời nắng và nhiệt độ cao Nhưng trong điều kiện trời nắng và nhiệt độ thấp thì lượng tích lũy nitrate trong câygiảm đi rất nhiều Khả năng tích lũy nitrate trong nông phẩm còn phụ thuộc vào từng chủng loại cây trồng và từng bộ phậm khác nhau của nông phẩm

• Tích lũy NO3 rất cao (5.000 mg/kg trọng lượng tươi) gồm có các loại cây trồng như xà lách, bó xôi, củ cải, cải bắp, hành ăn lá, xà lách xoong

• Tích lũy NO3 trung bình (600-3.000 mg/kg trọng lượng tươi) gồm có sú lơ, càrốt, bí

• Tích lũy NO3 thấp (80-100 mg/kg trọng lượng tươi) gồm có đậu các loại, khoai tây, cà chua, hành tây, dưa, các loại trái cây

• Ở cà rốt, NO3 tập trung ở phần chóp củ • Ở bắp cải, NO3 tập trung ở phần lõi

• Ở củ cải, NO3 tập trung ở phần rễ con

Các cây trồng trong điều kiện bình thường có dư lượng NO3 thấp hơn cây trồng trong nhà kính từ 2-12 lần, nhất là các cây ăn lá Mật độ cây trồng cũng là yếu tố làm tăng hoặc giảm lượng nitrate trong cây Khi trồng dày, lượng nitrate sẽ tăng lên do điều kiện chiếu sáng yếu Tưới nước đầy đủ cho cây cũng làm giảm hàm lượng này, từ 2-8 lần Sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật không đúng phương pháp cũng là yếu tố góp phần làm tăng lượng nitrate dư thừa trong nông phẩm Khi chế biến rau quả, nhất là ăn tươi, thông thường nên loại bỏ những phần

có khả năng tích lũy nhiều nitrate Quá trình nấu chín thức ăn cũng làm giảm lượngnitrate từ 20-40%

Ở nhiều nước phát triển như Hoa Kỳ, quy định hàm lượng nitrate phụ thuộc vào từng loại rau Ví dụ: măng tây không được vượt quá 50 mg/kg, cải củ được phép tới 3600 mg/kg Ở Nga lại quy định hàm lượng nitrate trong cải bắp phải dưới

500 mg/kg, cà rốt dưới 250 mg/kg, dưa chuột dưới 150 mg/kg… Trong khi đó, lượng tồn dư nitrate ở Việt Nam là quá cao so với các quy định trên Đây là một vấn đề cần được quan tâm và giải quyết một cách hợp lý để rau sạch Việt Nam có chỗ đứng trên thị trường quốc tế

Do nitrate và nitrite có độc tính cao như vậy, ảnh hưởng rất nhiều đến sức khỏe con người nên cần có phương pháp xác định hàm lượng nitrate trong rau củ đểđưa ra khuyến cáo cho mọi người Dưới đây là một số phương pháp xác định hàm lượng nitrate

2.1.5 Một số phương pháp xác định hàm lượng nitrate

2.1.5.1 Phương pháp thể tích

Người ta có thể xác định nitrate theo phương pháp này dựa trên phản ứng khử NO3- về các trạng thái oxi hoá thấp hơn bằng các chất khử thích hợp Sau đó tiến hành phép chuẩn độ ( có thể sử dụng chuẩn độ trực tiếp hay chuẩn độ ngược) Với phép chuẩn độ ngược thì một lượng chính xác dung dịch chuẩn Fe2+ đượccho dư so với lượng cần thiết vào dung dịch mẫu Sau đó lượng dư Fe2+ được

chuẩn độ bằng dung dịch Cr2O72+ với chất chỉ thị là ferroin Các phản ứng xảy ra như sau:

NO3- 3 Fe2 4 H -> NO 3 Fe3 2 H2O

2 Fe2 Cr2O72 14H -> 6Fe3 2 Cr3 7H2O

Phản ứng giữa Fe2+ và NO3- xảy ra nhanh hơn khi đung nóng dung dịch và cómặt của lượng dư acid H2SO4 65% Do NO sinh ra phản ứng với oxi không khí tạothành các chất có khả năng bị khử hay bị oxi hoá bởi Fe2+ nên trong quá trình phảnứng và chuẩn độ phải được tiến hành trong môi trường khí CO2 Điều này được thực hiện bằng cách thêm một lượng nhỏ NaHCO3 trước khi đun nóng và chuẩn độ

2.1.5.2 Phương pháp so màu

Các phương pháp so màu cũng được dùng để xác định NO3- dựa trên ba loại phản ứng sau:

 Nitrate hoá các hợp chất phenolic

 Oxi hoá các hợp chất hữu cơ có nhóm mang màu đặc trưng

 Khử NO3- thành NO2- hoặc NH3 rồi xác định chúng theo phương pháp thích hợp

Trong đó phương pháp nitrate hoá chủ yếu được sử dụng để xác định NO3- với thuốc thử thường dùng là acid Phenol đisunfonic

Khi sử dụng thuốc thử acid Phenol 2,4 đisunfonic, ion NO3- phản ứng với acidnày tạo thành acid Nitro phenol đisunfonic Trong môi trường kiềm, acid Nitro phenol đisunfonic tạo thành một muối có màu vàng cho độ hấp thụ quang cực đại ởbước sóng 410nm

Phương pháp này đơn giản và cho độ nhạy khá cao (0,05ppm) Nhưng khi có mặt các chất hữu cơ, clorua, NO2-, các ion có màu sẽ gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích Do đú cần phải loại bỏ chúng trước khi phân tích Sử dụng acid

Sunfamin, urê, hay thiurê để tách loại NO2- Cl- được loại bỏ bằng cách phản ứng kết tủa với Ag2SO4 Loại trừ ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ bằng cách oxi hoá bằng H2O2 hay sử dụng than hoạt tính

Hiện nay, ở châu Âu người ta chú ý nhiều đến thuốc thử Natri salixylat Với sự

có mặt của Natri salixylat, nitrate tạo thành hợp chất có màu vàng dạng p -

Nitrosalixylat cho độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 410nm

Ưu điểm của phương pháp này là sử dụng đơn giản và có độ nhạy cao

Tuy nhiên, nếu trong mẫu có mặt các hợp chất hữu cơ thì làm thay đổi màu của sản phẩm màu Do đó, cần phải loại bỏ chất hữu cơ trước khi phân tích Hơn nữa, khi có mặt Clorua sẽ tạo thành Nitrosylclorua ảnh hưởng đến kết quả phân tích Vì vậy, trước khi phân tích cũng phải loại trừ ảnh hưởng của clorua

2.1.5.3 Phương pháp dòng chảy FIA (Flow injection analysis)

FIA là một phương pháp kĩ thuật phân tích động, trong đó mẫu phân tích ở dạng lỏng được bơm trực tiếp vào dòng chất mang chuyển động liên tục Sau đó mẫu đi đến vòng phản ứng, rồi trong vòng phản ứng chất phân tích sẽ phản ứng vớithuốc thử có trong chất mang để tạo ra sản phẩm có thể phát hiện được theo một tính chất hoá lí nào đó của nó nhờ một Dertector thích hợp Các tính chất hóa lí có thể phát hiện như:

• Sự hấp thụ quang phân tử UV-VIS

• Sự hấp thụ quang nguyên tử

• Tính chất huỳnh quang

• Sự thay đổi chiết suất trong pha động  

• Sự thay đổi điện thế

Để xác định nitrate bằng phương pháp FIA người ta tiến hành hai thí

nghiệm sau:

Thí nghiệm 1: Xác định hàm lượng NO2-.

Trong môi trường acid yếu ion NO2- phản ứng với thuốc thử Sunfanyl amin

và N- etylen điamin một cách định lượng và tạo thành hỗn hợp điazo hấp thụ mạnh

ở bước sóng 540 nm Nếu bơm mẫu phân tích vào FIA có dòng chất mang chứa thuốc thử trên thì có thể xác định được nồng độ NO2- trong mẫu nhờ Detector hấp thụ quang UV-VIS ở bước sóng 540 nm

Thí nghiệm 2: Xác định tổng NO3- và NO2-.

Bằng cách lắp vào thêm vào hệ FIA một cột khử để khử ion NO2- về sau đó xác định tổng hàm lượng NO2- như thí nghiệm một

Hiệu số kết quả của cả hai lần đo chính là hàm lượng nitrate

Kolthoff và các cộng sự là những người đầu tiên nghiên cứu xác định NO3- bằng dòng cực phổ xúc tác Các tác giả cho rằng trong nền HCl (0,1M) chứa một lượng nhỏ Urani axetat sự khử U(VI) xảy ra theo hai bước:

U(VI) + e -> U(V)

U(V) + e -> U(III)

Tạo nên hai sóng cực phổ :

- Sóng thứ nhất ứng với sự khử U(VI) xuống U(V) có thế bán sóng 0,18V

- Sóng thứ hai ứng với sự khử U(V) xuống U(III) có thế bán sóng 0,94V Khi có mặt của ion NO3- thì chiều cao của sóng thứ hai tăng lên tỉ lệ tuyến tính với nồng độ NO3- trong khoảng 5.10-5- 4.10-4 M

2.1.5.5 Phương pháp đo khí

Hassan là người đưa ra một phương pháp đo khí đơn giản thích hợp cho việc xác định đồng thời nitrate và nitrite trong cùng một mẫu Theo ông, đầu tiên nitrite được phân huỷ bằng Urê ( CO(NH2)2 ) hoặc acid Sunfamit ( HSO3NH2 ) để tạo ra khí N2 trong môi trường acid yếu Trong điều kiện này, nitrate không tham gia phản ứng Khí Nitơ tạo ra được đo bằng một trắc đạm rất nhỏ

Các phản ứng xảy ra:

2KNO2 + CO(NH2) + 2HCl -> 2N2 + CO2 + 3H2O + 2KCl

KNO2 + HSO3 -> N2 + KHSO4 + H2O

Sau đó, đun nóng dung dịch và tạo môi trường acid mạnh thì nitrate sẽ phản ứng tạo thành khí N2O:

2KNO3 + CO(NH2)2 + 2HCl -> 2N2O + CO2 + 3H2O + 2KCl

2KNO3 + HSO3NH2 + HCl -> N2O + H2SO4 + H2O + KCl

Khí N2 và N2O được giữ lại trong trắc đạm kế bằng dung dịch KOH trên 50%

Người ta có thể xác định tổng NO3- và NO2- trong cùng một mẫu bằng phương pháp khá đơn giản là sử dụng hỗn hợp Cd-Cu

Nguyên tắc của phương pháp như sau:

- Ion NO3- bị khử thành ion NO2- với sự có mặt của Cd Các hạt Cd được

xử lý với dung dịch CuSO4, sau đó được nạp vào cột thuỷ tinh Phản ứng khử tiến hành tốt nhất ở pH = 6-8 Hiệu suất khử đạt 88-90%

-Ion NO2- được xác định nhờ phản ứng tạo màu azô hoá bằng acid

sunfanilic và αnaphtylamin Phức tạo thành có cường độ màu lớn Cực đại hấp thụ

ở bước sóng 520nm Phương pháp này được dùng để phân tích NO3- với nồng độ nhở hơn 1ppm mà các phương pháp khác không đủ nhạy để phát hiện.

2.1.5.7 Phương pháp bắt cặp ion trong HPLC

Đây là phương pháp chúng tôi sử dụng trong đề tài nghiên cứu này

2.1.5.7.1 Giới thiệu phương pháp bắt cặp ion

Sắc ký bắt cặp ion là một dạng hình thức khác của sắc ký trao đổi ion Nhiều vấn đề có thể được giải quyết bằng một trong hai phương pháp nhưng sắc kýtrao đổi ion không hiệu quả bằng sắc ký bắt cặp ion trong việc tách những hỗn hợp acid, base và trung tính trong một số tình huống Pha tĩnh sử dụng trong sắc ký bắt cặp ion là cột pha đảo

Những mẫu có ion có thể được tách ra bởi sắc ký hấp phụ pha đảo, với điềukiện là chúng chỉ chứa những acid yếu hoặc những base yếu, được xác định trong việc chọn pH, điều này được gọi là ức chế ion Một hợp chất ion hòa tan được trongnước có thể được ly trích vào trong một dung môi hữu cơ bằng cách dùng một ion trái dấu thích hợp để tạo thành phân tử hữu cơ trơ (kém phân cực) theo phương trình sau:

Mẫu+ + ion đếm- => (mẫu+ion đếm-)org

Mẫu- + ion đếm+ => (mẫu-ion đếm+)org

Cặp ion (mẫu+ ion đếm-) hoặc (mẫu- ion đếm+) thể hiện như một phân tử phân cực không ion hoá và tan được trong dung môi hữu cơ Bằng cách chọn một cặp đôi thích hợp và điều chỉnh nồng độ của nó, ion Mẫu+ và ion Mẫu- có thể được ly trích một cách hiệu quả vào trong một pha hữu cơ

Việc sử dụng phương pháp sắc ký bắt cặp ion để tách những mẫu chứa ion có những điều thuận lợi được tóm tắt như sau:

• Có thể sử dụng hệ thống pha đảo để tách vì cột C18 có hiệu năng cao hơn

so với cột trao đổi ion và thường nhanh chóng hơn

• Hỗn hợp của acid, base, trung tính và cả lưỡng tính (vừa có cation và vừa

có anion) có thể được tách ra

• Sắc ký bắt cặp ion có thể là một lựa chọn tốt nếu giá trị pKa của phân tích

là phù hợp

• Tính chọn lọc có thể bị ảnh hưởng bởi việc lựa chọn của ion đếm

2.1.5.7.2 Sắc ký bắt cặp ion trong thực tế

Sắc ký bắt cặp ion phù hợp cho tất cả các hợp chất chứa ion nhưng không phải tất cả các ion đếm đều tốt như nhau trong mọi trường hợp Bảng 2.2 liệt kê một số ion đếm phù hợp cho sắc ký hấp phụ pha đảo với pha động Methanol- Nướchoặc Acetonitril- Nước

Bảng 2.2: Tính ứng dụng của các ion đếm khác nhau

Có nhiều hỗn hợp thuốc thử thích hợp để pha trong dung dịch đệm, tuy nhiên nhiều nhà phân tích thích trộn lại tạo thành “cocktail” pha động phù hợp với vấn đề của họ Một vài ví dụ:

- Tetrabutylammonium (C4H9)4N+, dung dịch đệm có pH 7.5, tạo thành cặp ion với acid mạnh và yếu và ion base yếu của dung dịch đệm

- Alkylsulphonic acid CH3 (CH2)nSO3- với n = 4-7, dung dịch đệm có pH 3.5, tạo thành cặp ion với base yếu và mạnh và ion acid yếu của dung dịch đệm Chuỗi alkyl càng dài, thời gian lưu càng đẹp

Gloor và Johnson đã cung cấp một số hướng dẫn cho sắc ký bắt cặp ion: ¾ Nên sử dụng phương pháp này khi mẫu vừa chứa cả hợp chất ion và không ion

 Hỗn hợp Methanol- Nước nên dùng làm pha động, vì thế làm giảm tối thiểu vấn đề tính tan của ion đếm Sử dụng Acetonitril nếu tính chọn lọc không phù hợp, nhưng trong trường hợp này tính tan có thể khác

 Việc chọn đúng ion đếm rất quan trọng, nếu ít sự khác biệt trong cấu trúc phân tử của mẫu thì sử dụng các chuỗi ion đếm ngắn, sử dụng chuỗi dài hơn hay các loại kỵ nước nếu thời gian lưu được yêu cầu dài hơn

 Tính tan của ion đếm nên được kiểm tra cho các tỉ lệ pha trộn của tất cả pha động để đảm bảo rằng nó sẽ xuất hiện trong suốt quá trình phân tích

 pH của pha động nên được chọn để tạo sự ion hóa mẫu cao nhất ¾ Pha đảo C8 hoặc C18 nên được chọn làm pha tĩnh Chuỗi alkyl ngắn hơn dường như thiếu sự ổn định

 Pha động nên được khử khí trước để tránh tạo bọt khí

2.2 Tổng quan về HPLC

2.2.1 Giới thiệu HPLC

HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc kýlỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển

và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm nghiệm, đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng

2.2.2 Khái niệm HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử)

Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh, yếu khác nhau của pha tĩnh đối vớicác chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột

Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ Trong trường hợp loại này có 2 loại hấp phụ:

• Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP – HPLC): pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực

• Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP – HPLC): pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực.

Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin, thuốc hạ nhiệt, giảm đau…

Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng loại sắc ký hấp phụ pha đảo (RP)

Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột có giá trị tương ứng như sau:

- L1: RP 18 : Kích thước hạt tương ứng từ 5 – 10

- L7: RP 8 : Kích thước hạt tương ứng từ 5 – 10

- L3: Si 60 : Kích thước hạt tương ứng từ 5 – 10

- Và một số loại cột khác như cột Diol, cột NH2, CN…

2.2.3.2 Sắc ký trao đổi ion

Pha tĩnh chứa những nhóm ion (NR3+ hay SO3-) tương tác với những nhóm

ion của phân tử mẫu Phương pháp này phù hợp tách các chất (ví dụ như amino acid), những sản phẩm chuyển hóa ion và ion hữu cơ

2.2.3.3 Sắc ký ghép cặp ion

Phương pháp ion ghép cặp có thể cũng được sử dụng cho sự tách ra của những

hỗn hợp ion và vượt qua một số vấn đề cố hữu của phương pháp trao đổi ion

2.2.3.4 Sắc ký rây phân tử- sắc ký gel

Chế độ này có thể được chia thành sắc ký thấm chất gel ( với những dung môi hữu cơ) và sắc ký lọc gel (với những dung dịch nước)

Sắc ký rây phân tử tách phân tử dựa vào kích thước, tức là dựa vào khối lượngphân tử Những phân tử lớn nhất được tách ra đầu tiên và những phân tử nhỏ nhất được tách cuối cùng Đây là phương pháp tốt nhất để lựa chọn khi hỗn hợp chứa các chất khác nhau về khối lượng phân tử ít nhất 10%

Ngoài ra còn có sắc ký phân bố, sắc ký chiết

Nhưng thực tế hiện nay chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào phân tích mẫu

2.2.4 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký:

 Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo

 Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion

 Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết

 Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử

Cùng với với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có mộtpha động

Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất A, B, C…vào cột

phân tích, kết quả các chất A, B, C…sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác:

Hình 2.4: Hình biểu diễn sự tương tác các chất trong quá trình sắc ký

 Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải

ra khỏi cột trước tiên khi lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại

 Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1, F2, F3.Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn

 Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột

 Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khácnhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột

Hình 2.5: Hình minh họa cho quá trình tách các chất trong cột sắc ký

2.2.5 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ

Kết quả của quá trình tách các chất được Detector phát hiện ghi thành sắc ký đồnhư hình trên

Sắc ký đồ gồm nhiều peak :

- Các peak có thể tách rời nhau hoàn toàn

- Các peak có thể chập nhau một phần

- Các peak có thể chập nhau hoàn toàn

Từ các thông số của peak trên đây, nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết đượcđưa ra để đánh giá một quá trình sắc ký Dưới đây là một số đại lượng thường dùngtrong thực tế và cách thay đổi các đại lượng này có lợi cho quá trình phân tích sắc ký

Hình 2.7: Sắc ký đồ biễu diễn thời gian lưu của các chất

Chú thích:

T0 : Thời gian lưu chết

t’r1 : Thời gian lưu thực chất A

t’r2 : Thời gian lưu thực chất B

tr1 : Thời gian lưu chất A

tr2 : Thời gian lưu chất B

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại

Thời gian lưu của một chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố :

 Bản chất sắc ký của pha tĩnh

 Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

 Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

 Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động

Trong một phép phân tích nếu tr nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu tr quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hóa chất, độ chính xác của phép phân tích kém

Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên đã trình bày

2.2.5.2 Hệ số dung lượng K’ : Capacity factor

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng

α = K’B/ K’A (với điều kiện K’B > K’A )

Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố :

 Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh

 Tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động

Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột

Vì vậy với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định

Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức sau :

N = 5.54 (tR / W0.5)2

Trong đó : tR : thời gian lưu của chất phân tích

W0.5 :Độ rộng tại điểm ½ của peak

Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ.

2.2.5.5 Độ phân giải R : (Resolution)

 Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho Độ phân giải của 2 peak cạnh nhau phải được tính theo công thức sau :

R = 2(t’RB – t’RA) / (wA + wB) 

Trong thực tế nếu các peak cân đối (Gass) thì độ phân giải tối thiểu để 2 peak tách ra là R = 1.0 Trong phép định lượng R = 1.5 là phù hợp

Nếu R nhỏ thì các peak chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích peak sẽ không chính xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo 3 cách sau:

 Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động (thay đổi độ phân cực nếu là RP – HPLC, thay đổi cường độ ion nếu là IE – HPLC

 Làm tăng số dĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc cột

và diện tích của các peak ta phân tích

Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình Gradient dung môi

mà chủ yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đápứng các yêu cầu trong quá trình phân tích

2.2.5.6 Hệ số không đối xứng T (Tailing factor)

Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của peak trên sắc ký đồ thu được



T được tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nửa peak tại điểm 1/10 chiều caopeak :

T = a/b

Hình 2.9: Hình biễu diễn hệ số không đối xứng T

• Khi T ≤ 2.5 thì phép định lượng được chấp nhận

• Khi T ≥ 2.5 thì điểm cuối của peak rất khó xác định

Vì vậy phép định lượng cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để làmcho peak cân đối hơn theo cách sau :

 Làm giảm thể tích chết tức là giảm đoạn ống nối từ cột đến Detector

 Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên

 Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu hay giảm thể tích tiêm mẫu

Hệ thống HPLC

4 Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay autosample).

5 Cột sắc ký (pha tĩnh) ( để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt).

6 Detector (nhận tín hiệu).

7 Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu, xử lí dữ liệu và điểu khiển

hệ thống HPLC.

8 In dữ liệu.

Bình đựng dung môi

Cấu tạo :

 Thủy tinh màu, trung tính, 100 – 2000ml, kín (tránh bay hơi dung môi).

 Xử lý dung môi : lọc qua màng lọc 0.45 hoặc 0.22 m và đuổi khí hòa tan Vật liệu lọc dung môi :

 Nước : cellulose nitrate, cellulose acetat.

 Hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước : màng lọc RC (Regenerated cellulose), polyamid hay nylon.

 Dung môi hữu cơ : màng lọc teflon.

Hình 2.11: Bộ phận lọc dung môi

Bình luôn luôn có một cái nắp bảo vệ không cho bụi rơi vào trong bình, nắp có lỗ hở

để bình luôn thông với khí trời Trong bình , có một ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc

ký, ở đầu này có gắn nút lọc bằng kim loại với mục đích lọc dung môi và cũng để giữ ống luôn ở dưới mặt thoáng chất lỏng Các nhà sản xuất có những bình chuyên dùng để cho nút lọc bằng kim loại nói trên lọt vào một lỗ giếng, bảo đảm đầu ống luôn chạm sát đáy bình,

có thể sử dụng đến giọt dung môi cuối cùng trong bình.

Trước khi lắp một bình dung môi vào vị trí hoạt động, cần phải loại bỏ phần không khí đã hòa tan vào dung môi trước đó, gọi là khử bọt khí (degassing), bởi vì nếu còn lẫn

những bọt không khí vào trong luồng dung môi đi vào máy sẽ làm cho máy bơm và đầu dò hoạt động kém hiệu quả.

Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp Cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 4 đường là 100%.

Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa là 2 hay 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định, tránh nhiễu đường nền gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích.

Lưu ý : Nhằm mục đích tránh làm hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các

peak tạp trong quá trình phân tích :

➢ Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và có ghi

rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích.

➢ Tất cả các hóa chất dùng pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích.

Có hai cách sử dụng pha động trong việc rửa giải: rửa giải đơn nồng độ (isocratic elution) và rửa giải nồng độ tăng dần tuyến tính (gradient elution) :

 Rửa giải đơn nồng độ: với một pha động lựa chọn (một dung môi hay hỗn hợp hai dung môi với tỉ lệ xác định) được sử dụng trong suốt quá trình sắc ký cột Muốn thay đổi qua một loại pha động khác, phải ngưng quá trình sắc ký, thay bình chứa dung môi, cho pha động hoạt động trở lại.

 Rửa giải nồng độ tăng dần tuyến tính: trong quá trình sắc ký, tính phân cực của pha động được thiết kế để tăng dần lên từ từ đều đặn, tương tự như sắc ký khí, nhiệt

độ của cột phân tích được chỉnh lên tăng dần.

Hai kiểu chương trình dung môi :

- Trộn dung môi ở áp suất thấp

Bộ phận hòa trộn

Dung môi 2 Bơm 2 Van mẫu

Dung môi 3 Bơm 3

- Trộn dung mơi ở áp suất cao

Bộ phận khử khí (Degasse)

Mục đích : loại trừ các bọt nhỏ cịn sĩt lại ngay trong bình chứa dung mơi (lọc dưới

áp suất giảm, siêu âm, sục khí trơ) hoặc trên dịng chảy của pha động trước khi dung mơi vào bơm.

Các cách khử khí :

 Lọc dưới áp suất giảm : vừa loại khí hịa tan vừa loại tạp.

 Siêu âm : đuổi khí thừa khỏi dung mơi, kết hợp với đuổi khí bằng áp suất giảm.

 Sục khí trơ (Helium) : đuổi khí hịa tan khỏi dung mơi.

 Khử ngay trên dịng (online membrane degassing).

Hình 2.12: Hệ thống khử dung môi ngay trên dòng

Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót lại các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra :

- Tỷ lệ pha động của các dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của peak thay đổi.

- Trong trường hợp bọt quá nhiều Bộ khử khí không thể loại hết được thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi (bị e) khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động.

Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai.

Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt Hiện tại bơm có 2 pistone để

thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục.

Có 2 loại bơm:

 Loại bơm áp suất không đổi (constant pressure pump) thực hiện điều này bằng cách thiết lập một áp suất không đổi lên pha động Vận tốc qua cột được xác định bằng sự đề kháng dòng chảy (flow resistance) của cột và bất cứ sự ngăn cản nào khác giữa bơm và đầu ra của detector.

 Loại bơm khác là bơm dòng chảy không đổi (constant flow pump) Chúng tạo

ra sự chảy định trước của chất lỏng, khiến áp suất sinh ra tùy thuộc vào sự đề kháng dòng chảy.

Sự đề kháng dòng chảy của hệ thống có thể thay đổi theo thời gian, điều này có thể gây ra bởi sự trương phồng hoặc lắng xuống của chất nhồi cột, những thay đổi nhồi cột, những thay đổi nhỏ về nhiệt độ, tốc độ dòng sẽ thay đổi nếu thay đổi sự đề kháng dòng chảy, nhưng đối với các bơm dòng chảy không đổi các thay đổi về sự đề kháng dòng chảy được bù trừ bởi sự thay đổi áp suất Các thay đổi nhỏ về dòng chảy là không mong muốn,

vì chúng sẽ gây nên các dữ liệu về sự lưu (retention data) thiếu chính xác, và có thể gây một đường nền không đều trên máy ghi Do đó không nên dùng bơm áp suất không đổi trong các dụng cụ HPLC, mặc dù chúng rất thích hợp cho việc nhồi cột, khi ấy những thay đổi nhỏ về sự chảy không thành vấn đề.

Ngoài khả năng có thể bơm pha động ở áp suất cao và tốc độ dòng không đổi, bơm còn phải có những đặc tính sau:

o Bên trong bơm phải không bị ăn mòn bởi bất cứ dung môi nào sử dụng.

o Phải cung cấp 1 khoảng tốc độ dòng và có thể thay đổi tốc độ dòng dễ dàng.

o Sự chảy dung môi phải không tạo ra các xung (pulse).

o Có thể chuyển dễ dàng từ 1 pha động này sang 1 pha động khác.

o Bơm có thể được tháo ráp dễ dàng để sửa

chữa Một số yêu cầu khác:

▪ Tất cả các bộ phận tiếp xúc dung môi của bơm phải được chế tạo bằng các vật liệu trơ đã mô tả Tuy thế, các vật liệu này cũng không thích hợp với một số hệ dung môi Ví dụ: các nồng độ ion hay citrate cao có thể ăn mòn từ từ thép không rỉ.

▪ Áp suất cần để đạt tốc độ dòng cần thiết trong phép HPLC phân tích không

nên vượt quá 150-200 bar Phần lớn bơm được chế tạo chịu được áp suất cao hơn các áp

suất này nhiều Ở áp suất cao, tốc độ dòng qua cột có thể thấp hơn tốc độ tốc độ đã chọn,

do tính chịu nén nhỏ của pha động hoặc do các rò rỉ nhỏ.

▪ Một vài loại bơm dòng chảy không đổi gây ra dòng chảy dạng xung của pha động Nếu detector nhạy với sự chảy có thể gây ra sự nhiễu đường nền (base line) trên sắc ký đồ Máy ghi sẽ biểu thị một đường có hình răng cưa ghi lại các cử động của piston trong bơm Những thay đổi về dòng chảy này có thể làm giảm bằng cách dùng 1 bộ phận đệm xung (pulse damper), là 1 thể tích chết có thể nén được giữa bơm và bộ phận tiêm Đôi khi bản thân thể tích chết của cột đủ để tạo ra sự đệm thích hợp, nếu không một cuộn ống nhỏ có thể được dùng Tuy nhiên cần phải tránh các thể tích chết lớn giữa bơm

và bộ phận tiêm.

▪ Thể tích trong bơm và trong toàn bộ đường ống giữa bơm và bộ phận tiêm phải được giảm tối thiểu và hệ thống phải không có bất cứ một khoảng trống ngoại tuyến nào Nếu không, sự thay đổi thành phần của pha động sẽ tốn nhiều thời gian, vì pha động mới phải đuổi sạch pha động cũ Một thí dụ về khoảng trống ngoại tuyến là áp kế Bourdon đặt vào trong hệ thống như là 1 phương pháp đơn giản và rẻ tiền để đo áp suất Điều này tạo ra 1 khoảng trống không bị đuổi bởi dòng chảy dung môi Nếu pha động mới không hoà lẫn với pha nguyên thuỷ, sự hoán đổi phải được thực hiện thông qua 1 dung môi thứ 3 hoà lẫn với từng pha động này Vì thế phần lớn thiết bị HPLC hiện nay sử dụng các dụng cụ đo áp suất cho phép pha động chảy qua.

Ngay cả khi có sự lưu ý cẩn thận về bơm, thỉnh thoảng cũng phải thay các mối nối, các vòng và các miếng đệm niêm (seal) Mặc dù không bị tác dụng về mặt hoá học, các mối nối và vòng tương đối mềm và có khuynh hướng bị ăn mòn Nếu pha động không được lọc một cách thích hợp, các phân tử nhỏ sẽ bị giữ lại giữa viên bi và mặt tiếp xúc van trong một van kiểm soát, làm cho van bị mòn Trong lúc vận hành bơm, dung dịch có thể bốc hơi và nếu có chứa chất rắn hoà tan (như trong các dung dịch đệm) một cặn chất rắn sẽ lưu lại trên piston, và miếng đệm niêm sẽ bị tổn hại khi bơm được sử dụng trở lại Các vi khuẩn đôi khi có thể phát triển trong các chất đệm và chúng có thể làm nghẽn cột, hay ngay cả gây nghẽn bơm nếu nó được gắn với các lọc bên trong hệ thống Vì thế cần phải loại các dung dịch đệm kĩ lưỡng sau khi sắc ký bằng cách bơm nước hay 1 dung môi thích hợp trong vài phút để rửa sạch.

Bộ phận tiêm mẫu

Mục đích: để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy với dung tích của loop là 5-10l.

Có nhiều cách đưa mẫu vào cột:

 Phương pháp tiêm mẫu trực tiếp bằng ống tiêm (Syringe)

Là phương pháp đầu tiên trong HPLC, sử dụng kĩ thuật vay mượn từ sắc kí khí trong

đó một ống tiêm chính xác đến microlit được dùng để tiêm mẫu qua một vách ngăn cao su

tự liền (self-sealing rubber septum) đặt tại một bộ phận tiêm ở đầu cột Có thể thay cao su bằng Teflon, silicon…

Phương pháp này tiện lợi, đơn giản, ít tốn kém vì bộ phận bơm có thể tự tạo được, tuy nhiên khuyết điểm của nó là độ lặp lại không cao vì thể tích của mỗi lần tiêm khác nhau, hơn nữa các hạt chất nhồi bé có thể làm tắc kim, chất liệu trong vách ngăn có thể làm bẩn cột…

 Phương pháp chảy gián đoạn (Stopped flow)

Trong phương pháp này, dòng chảy của pha động qua cột được dừng lại và khi cột đạt đến áp suất phòng, đầu cột được mở ra và mẫu được đưa vào trên mặt chất nhồi cột bằng ống tiêm Phương pháp này có nhược điểm giống như phương pháp trên, ngoài ra phải mất thời gian gián đoạn trong mỗi lần tiêm mẫu.

 Phương pháp sử dụng van tiêm (Valve-loop injector)

Các máy sắc kí trên thị trường hiện nay đều thiết kế các van để tiêm mẫu Mặc dù khá đắt tiền, chúng dễ dùng, có độ chính xác cao và rất đễ thích nghi với việc bơm mẫu tự động Các van tiêm mẫu có thể được tạo bằng các loop (còn gọi là vòng chứa mẫu hay các

bộ phận chứa mẫu) đặt phía trong máy hoặc ở ngoài máy Các van loop đặt phía ngoài (external loop) có 6 ngõ, với một loop có thể tích cố định được nối chéo một cặp ngõ, 4 ngõ còn lại được dùng để chứa pha động và mẫu thử vào và ra khỏi van.

Đầu tiên, loop được làm đầy mẫu bằng một ống tiêm microlit, khi vặn van từ vị trí

“tải” (load) sang vị trí “tiêm” (injection), các chất chứa trong loop được đưa vào bên trong

cột nhờ pha động Các van có loop đặt phía ngoài được dùng cho các mẫu tương đối lớn Loop đặt ngoài nhỏ nhất có thể tích khoảng 10 microlit Đối với các mẫu nhỏ hơn, có thể

dùng van 4 ngõ với một loop đặt bên trong Trong các van loại này, loop là một rãnh khắc trong thân van.

Với cả hai loại, thể tích của mẫu thử dùng để xả hoặc để làm đầy loop phải vào khoảng 5-10 lần thể tích loop.

Phương pháp dùng van tiêm có nhiều ưu điểm:

 Hệ thống bơm có thể làm việc dưới áp suất rất cao mà không gián đoạn dòng chảy.

 Cột không bị tắc hay bị làm bẩn bởi các mảnh của vách ngăn.

 Thể tích đưa vào cột hằng định nên có độ lặp lại cao.

 Có thể thiết kế việc tiêm mẫu tự động.

Nhược điểm của phương pháp này là phải dùng 1 lượng mẫu thử lớn cho 1 thể tích loop nhất định Thường gấp 5-10 lần (chẳng hạn phải dùng đến 100-200 microlit mẫu thử

để làm đầy một loop 20 microlit).

Hình 2.13: Bộ phận tiêm mẫu tự động

Cột sắc ký

Phân loại

 Cột bảo vệ (Guard column), tiền cột (Pre-column) hay cột “quét dọn” (scavebger column): là 1 cột có kích thước nhỏ đặt trước cột phân tích nhằm loại trừ các

tiểu phân tạp chất có thể làm bẩn, nghẹt cột phân tích nhằm kéo dài tuổi thọ của cột phân tích Ngoài ra, trong sắc kí lỏng-lỏng, cột bảo vệ có tác dụng bão hoà pha động với pha tĩnh làm cho sự mất dung môi trở nên tối thiểu Chất nhồi cột bảo vệ giống như cột phân tích nhưng kích thước hạt lớn hơn để làm giảm áp suất khi sắc ký.

 Cột phân tích (Analytical column): là cột có kích thước nhỏ dùng cho mục đích phân tích Cột có thể phân tích lượng µg-mg mẫu thử.

 Cột bán điều chế (Semi-preparative column): có thể tách 100-200 mg mẫu thử để phân lập các chất.

 Cột điều chế (Preparative column): có thể tách 0.5-1g mẫu thử Ở quy mô công nghiệp, các cột được thiết kế đặc biệt để có thể đạt tải lượng lên đến hàng kg mẫu thử.

Hình 2.14: Cột phân tích Hình 2.15: Cột bảo vệ

Cấu tạo và kích thước cột

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Yêu cầu chung của cột sắc ký sử dụng trong HPLC là phải trơ về mặt hoá học, chịu được áp suất cao, thành cột phẳng, có bề mặt đồng nhất.