BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) xác định vitamin c sử dụng HPLC cùng với phát hiện điện hóa

Phân tích sự phun dòng chảy kết hợp với đầu dò điện hóa Coulochem III Tài liệu tham khảo 14 Tóm tắt: Vitamin C axit ascorbic, ascorbate, AA là một hợp chất hữu cơ hòa tan trong nước và

XÁC ĐỊNH VITAMIN C SỬ

DỤNG HPLC CÙNG VỚI PHÁT

HIỆN ĐIỆN HÓA

MỤC LỤC

2.2 Phân tích phun dòng chảy sắc ký / sắc kí lỏng cao năng với đầu dò

3.1 Phân tích sự phun dòng chảy kết hợp với đầu dò điện hóa CoulArray để

3.2 Phân tích sự phun dòng chảy kết hợp với đầu dò điện hóa Coulochem III

Tài liệu tham khảo 14

Tóm tắt: Vitamin C (axit ascorbic, ascorbate, AA) là một hợp chất hữu cơ hòa tan trong

nước và tham gia vào nhiều quá trình sinh học Mục đích chính của bài viết này là sử dụng hai máy dò điện hóa (amperometric - Coulochem III và coulometric - CoulArray) kết hợp với phân tích tiêm dòng chảy cho việc phát hiện axit ascorbic

Điều kiện thực nghiệm tối ưu như sau: điện thế máy dò 100 mV, nhiệt độ 25 ° C, pha động 0,09% TFA: ACN, 3:97 (v / v) và lưu lượng 0,13 mL/phút Các tiếp tuyến của đường chuẩn là 0,3788 cho phương pháp coulometric và 0,0136 đối với amperometric Các tiếp tuyến của đường chuẩn đo bởi máy dò coulometric cao hơn gần 30 lần các tiếp tuyến đo bằng máy dò amperometric Do đó, chúng tôi sử dụng máy dò điện hóa CoulArray với sắc

ký lỏng hiệu năng cao và ước tính giới hạn phát hiện cho AA 90 nM (450 fmol cho mỗi 5

ml tiêm) Phương pháp này đã được sử dụng để xác định vitamin C trong chế phẩm dược (98 ± 2 mg mỗi viên thuốc), trong cam tươi (Citrus aurantium) (dao động 30-56 mg / 100 g

trọng lượng tươi), trong táo tươi (Malus sp.) (dao động 11-19 mg / 100 g), và trong huyết thanh người (dao động 38-78 µM) Sự thu hồi cũng được xác định

1 Giới thiệu

1.1 C hức năng sinh học của vitamin C

Vitamin C (acid ascorbic, ascorbate, AA) là một dung dịch hòa tan hợp chất hữu cơ

có liên quan đến nhiều quá trình sinh học (Hình 1) AA có vai trò quan trọng trong việc vận chuyển điện tử, phản ứng hydroxyl và dị hóa oxy hóa của các hợp chất rượu mạch vòng trong quá trình biến dưỡng ở động vật [1] Mặc dù tất cả các chức năng AA không được giải thích đầy đủ, có khả năng là nó cũng tham gia trong việc duy trì giảm tình trạng đồng diếu tố kim loại, ví dụ như tại monooxygenase (Cu +) và dioxygenase (Fe2 +) [2] Trong các tế bào khác vai trò của AA là giảm hydro peroxide (H2O2), chống phản ứng oxi hóa các tế bào [3-5] Một chu trình oxy hóa acid ascorbic thành dehydroascorbic acid được thể hiện trong hình 1 Các thông tin chi tiết về hệ thống các chất chống oxy hóa acid ascorbic phối hợp với glutathione được mô tả bởi Meister [6] Bên cạnh đó, linh trưởng và một số động vật có vú khác không thể tổng hợp axit ascorbic [5] Các loài động vật có thể sản xuất phân tử này, sinh tổng hợp từ glucose xúc tác bởi L-Gulonolactoneoxidase [1,2] Mặc dù khả năng tổng hợp phân tử này cả hai nhóm loài động vật bị thiếu hụt AA

1.2 Nhu cầu vitamin C hàng ngày

Cách duy nhất con người hấp thu acid ascorbic là qua thực phẩm [7], nhưng nhu cầu vitamin C hàng ngày của một con người là không rõ ràng Linus Pauling cho rằng nhu cầu của người dân đối với các vitamin và các dưỡng chất khác thay đổi đáng kể và để duy trì sức khỏe tốt, nhiều người cần một lượng các chất dinh dưỡng lớn hơn, nhiều hơn so với liều khuyến cáo Theo đề xuất của ông, hấp thu hàng ngày vitamin C giảm tỷ lệ mắc bệnh cảm lạnh và các bệnh khác Ngày nay nhu cầu trung bình AA được ước tính và đề nghị bổ sung trong chế độ ăn uống là 100 mg - 120 mg mỗi ngày [8,9]

1.3 Hàm lượng vitamin C trong thực phẩm

AA có thể được tìm thấy chủ yếu trong các loại trái cây và rau quả Các nguồn chính của AA là loại trái cây họ cam quýt, quả cây tầm xuân, dâu tây, ớt, cà chua, bắp cải, rau bina và những nguồn khác [3] Nếu ai muốn dùng AA từ nguồn động vật thì gan và thận là các mô có hàm lượng cao nhất, nhưng so với nguồn AA từ thực vật thì thấp hơn Hàm lượng của AA trong thực phẩm có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như khí hậu, phương

không chỉ theo dõi AA trong nông nghiệp và thực phẩm, mà còn trong dịch cơ thể và mô bào [11] Tác giả cũng chú ý vào việc phát hiện AA trong huyết thanh [12-15]

Hình 1 Sơ đồ về một chức năng sinh học của axit ascorbic (GSH -glutathion bị

1.4 Phương pháp xác định axit ascorbic

Nhiều kỹ thuật phân tích bao gồm cảm biến và cảm biến sinh học [16-18] đã được đề xuất cho phát hiện acid ascorbic trong các loại mẫu khác nhau Các công cụ liên quan bao gồm phân tích phun dòng chảy[19-22], sắc ký lỏng cao năng[23-25] hoặc điện di mao dẫn[26-29] cùng với các dụng cụ và đầu dò chủ yếu được dùng trong xác định AA

Tuy nhiên, một số trong những phương pháp này tốn nhiều thời gian, một số là tốn kém, một số đòi hỏi những người thực hiện cần đào tạo đặc biệt, hoặc chúng bị thiếu độ nhạy hay tính chọn lọc Giới hạn phát hiện dao động từ µM [30-32] đển nM [33-36] và thấp hơn [12]

Phát hiện điện hóa là một phương pháp thay thế hấp dẫn để phát hiện các loại electroactive, vì những lợi thế vốn có của nó: đơn giản, dễ dàng thu nhỏ kích thước, độ nhạy cao và giá tương đối thấp Phát hiện điện hóa thường làm việc bởi đầu dò amperometric hoặc coulometric có thể kết hợp với sắc ký lỏng để cung cấp độ nhạy cảm cao với các loại electroactive Mục đích chính của bài viết này là sử dụng hai máy dò điện hóa (amperometric - Coulochem III và coulometric - CoulArray) kết hợp với phân tích phun dòng chảy để phát hiện acid ascorbic

Hơn nữa, kĩ thuật nhạy cảm hơn này được dùng vào việc phân tích các mẫu thực (chuẩn bị dược phẩm, cam và táo trái cây, và huyết thanh máu người)

2 Nguyên vật liệu và phương pháp

2.1 -Hóa chất, nguyên liệu, đo lường pH

Loại HPCL acetonitrile được sử dụng là từ Merck (Darmstadt, Đức) Các hóa chất khác sử dụng thì được mua từ Sigma-Aldrich (đường Louis, Mỹ) ở độ tinh khiết ACS trừ các ghi chú khác Các dung dịch mẫu của AA (100 mM) đã được chuẩn bị với ACS và được lưu trữ trong bóng tối ở -20 ° C Dung dịch chuẩn được chuẩn bị hàng ngày bằng cách pha loãng dung dịch mẫu Sự ổn định của AA trong các mẫu bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi ôxy, nhân tố mà oxi hóa AA thành dehydroascorbic acid Thí nghiệm sử dụng Dithiothreitol (DTT) Tất cả các dung dịch đã được lọc qua đĩa lọc Nylon 0,45 trước khi phân tích

HPLC

2.2 – Phân tích phun dòng chảy/ sắc kí lỏng cao năng với đầu dò điện hóa CoulArray hoặc Coulochem:

CoulArray Hệ thống FIA / HPLC-ECD bao gồm hai máy bơm dung môi hoạt động trong phạm vi 0,001-9,999 mL/ phút, một cuộn dây phản ứng 1 m và cột đảo ngược và một CoulArray dò điện hóa Các máy dò điện bao gồm hai tế bào dòng chảy Mỗi tế bào gồm bốn tế bào phân tích có chứa carbon làm điện cực xốp, hai phụ và hai điện cực tham chiếu, điện cực làm việc được đánh dấu âm dương và tăng dòng chảy của pha động (1 ml/phút)

Cả hai máy dò và cuộn phản ứng / cột được điều nhiệt Các mẫu (5 µl) được tiêm bằng tay

Coulochem III Hệ thống FIA-ED bao gồm một máy bơm cung cấp dung môi hoạt động trong phạm vi 0,001-9,999 mL/ phút, một tế bào bảo vệ, một cuộn dây phản ứng 1 m

và một máy dò điện hóa Các máy dò điện hóa (ED) gồm một lượng dòng chảy thấp qua các tế bào phân tích, bao gồm carbon thủy tinh làm điện cực, điện cực palladium như một điện cực tham khảo và điện cực carbon phụ trợ, Coulochem III như một module điều khiển Một điện cực carbon thủy tinh đã được đánh bóng cơ học 0,1 m bằng alumina ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 5 phút bằng cách sử dụng kỹ thuật số Sonorex 10 P sonicator ở 40

W Các mẫu l đã được tiêm bằng tay Các dữ liệu thu được được xử lý bằng phần mềm CSW 32 Các thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phòng

2.3 - Chuẩn bị mẫu thực

Chuẩn bị dược phẩm (viên) - Celaskon được nghiền trong cối (n = 5) Sau đó, bột

nghiền (khoảng 1 mg) được hòa tan trong nước ACS (1 ml) Cam và táo được bán tại các cửa hàng Tesco (n = 5) Vỏ của các loại trái cây đã được gỡ bỏ, và sau đó các loại trái cây (0,25 g) được đồng nhất bằng cách sử dụng vữa Các chiết xuất thu được được lọc qua giấy lọc, chuyển vào bình định mức và pha loãng với nước ACS Các phép đo của các mẫu được thực hiện ngay lập tức sau bước chuẩn bị, các mẫu huyết thanh máu người thu được từ Sở lâm sàng Hóa sinh, Bệnh viện Chấn thương Brno (Cộng hòa Séc), (n = 10), huyết thanh

người đã được đông lạnh ở -20 ° C ngay sau khi thu thập Các mẫu được pha loãng 100 lần với nước ACS và lọc qua màng lọc Teflon 0,45 m trước khi đo

2.4 -Tính đúng, độ chính xác và độ thu hồi

Tính đúng, độ chính xác và độ thu hồi của AA được đánh giá bằng dung dịch đồng chất (huyết thanh máu người, một loại trái cây và viên Celaskon) so với dung dịch chuẩn Trước khi thí nghiệm, dung dịch chuẩn AA (100 ml) và nước (100 ml) đã được thêm vào

dung dịch đồng chất của mẫu thật Các dung dịch đồng chất đã được kiểm định và nồng độ

AA từ những đường cong hiệu chuẩn Tính đúng được đánh giá bằng cách so sánh với nồng

độ lí thuyết

2.5 - Thống kê mô tả

Dữ liệu được xử lý bằng Microsoft Excel Kết quả được thể hiện như là ± S.D trừ khi có ghi chú khác Các giới hạn phát hiện được tính toán theo Long và Winefordner [42]

3 Kết quả và thảo luận

Các kĩ thuật điện hóa tĩnh và dòng chảy là những công cụ rất hấp dẫn cho việc xác định các thành phần sinh học khác nhau như protein, chất hữu cơ có nguồn gốc từ thực vật, thuốc… Ở đây, chúng tôi nhắm vào việc sử dụng các đầu dò Coulouchem III hoặc CoulArray kết hợp với sắc kí lỏng cao năng để xác định acid ascorbic

3.1 Phân tích sự phun dòng chảy kết hợp với đầu dò điện hóa CoulArray để xác định acid ascorbic

Một trạng thái điện hóa của AA tại bề mặt điện cực đang hoạt động đã được kiểm tra FIA cho phép chúng ta tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm cho việc phân tích xác định

AA một cách dễ dàng và nhanh chóng Trước hết, tác động của điện thế được đặt vào các điện cực hoạt động riêng lẻ dựa vào tín hiệu oxi hóa đã được nghiên cứu Điện thế thì thay

đổi trừ 100 đến 400 mV và tín hiệu của nồng độ AA khác nhau đã được đo lại (12.5, 25, 50,

100, 200, 300, 400, 500 và 1000µM)

Hình2 FIA kết hợp với đầu dò điện hóa CoulArray FIA-ED quét toàn bộ acid ascorbic (12.5, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 và 1000 µM) Các điện thế điện cực đầu dò quét toàn bộ: 100, 150, 200, 250, 300, 350, 380 và 400 mV (A) Sự phụ thuộc của độ cao peak acid ascorbic với nhiệt độ (B), với hàm lượng của acetonitrile trong pha động gồm acetonitrile

và acid triflouroacetic (C) và với nồng độ TFA (D) các thông số FIA-ED: tốc độ chảy trong pha động- 0.1 mL/phút; nồng độ acid ascorbic- 100µM; các mẫu 5µL đã được cho vào

Mỗi nồng độ thuộc về một kí hiệu được biễu diễn trên bảng ghi lại FIA-ED ở hình 2A Rõ ràng phản ứng dòng chảy tối đa đã được đo lại ở bề mặt của điện cực hoạt động đầu tiên Hiện tượng này đã được theo dõi ở tất cả nồng độ của AA mà đã được đo Hơn thế nữa, có thể kết luận rằng nồng độ AA đã được đo, tín hiệu này đã biến mất trước đó Hiện tượng này kết hợp với i) loại đầu dò được dùng vì đầu dò CoulArray hoạt động theo cơ chế

đo culong (coulometer) và đầu dò culong kích thích gần 100% sự chuyển hóa điện hóa của các mẫu phân tích dưới điện thế được chỉ định của đầu dò) sự oxi hóa điện hóa dễ dàng của

AA ở bề mặt của điện cực đã hoạt động rồi dưới điện thế thấp (khoảng 100-200mV) Để lựa chọn điện thế tốt nhất cho việc dò tìm AA, chúng tôi đặt một máy đo điện thế từ 100 đến 400nV mỗi điện cực cách nhau 50mV ở tất cả 8 điện cực và đo tín hiệu chỉ ở điện cực đầu

tiên Dựa trên kết quả này thì điện thế phù hợp nhất cho việc dò tìm AA là 100mV Thêm vào đó thì chiều cao tin hiệu bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ cũng đã được nghiên cứu Nhiệt độ trong khoảng 15-40°C đã được kiểm tra Sự phụ thuộc đó đã được thể hiện ở hình 2B Độ cao peak tăng khoảng 30% ở 25°C so với các tín hiệu thu được ở những nhiệt độ thấp hơn( 15 và 20°C) Ở các nhiệt độ cao hơn 25°C độ cao đã được theo dõi ở hình 2B là thay đổi rất ít Do đó, nhiệt độ 25°C đã được dùng trong các thực nghiệm sau này

Hầu hết ai cũng biết rằng việc phân tích điện hóa thì cần có chất điện phân, mặt dù

sự có mặt của dung môi không phải là nước trong pha động là cần thiết cho cho cả việc xác định thành công và nhanh chóng những hợp chất quan tâm Các dung môi không phải nước này ảnh hưởng không tốt đến việc phân tích điện hóa Vì thế, sự thay đổi của các tín hiệu bởi tỉ lệ acetonitrile: acid trifluoroacetic (ACN : TFA, v/v) đã được điều tra nghiên cứu ở hình 2C Chúng tôi đã không xác định được bất kì sự thay đổi nào trong việc lặp đi lặp lại hàm lượng ACN ngày càng tăng trong pha động Tín hiệu cao nhất đã được đo lúc hàm lượng ACN 3% (v/v) trong pha động

Hình 3 Ảnh hưởng của nồng độ AA Sự phụ thuộc độ cao peak với các nồng độ AA khác nhau (15, 30, 55, 85, 110 và 140 µM) (A) Huyết thanh người sự ảnh hưởng của chất nền sinh học trên tín hiệu AA Nồng độ AA- 57, 114, 227 và 341 µM (B) Các thông số FIA-ED thì như sau: pha động-acetonitrile và 0.09% acid trifluoroacetic có tỉ lệ 3:97; nhiệt

độ đầu dò- 25°C; tốc độ dòng chảy trong pha động – 0.13 mL/phút 5µL mẫu đã được cho vào

Các bạn cũng đã biết rằng acid trifluoroacetic (TFA) là ion bắt cặp trung gian trong sắc

kí lỏng, nó có thể phản ứng với vitamin và có lẽ đảm nhận một vai trò nào đó Vì vậy, chúng tôi đã chọn một hỗn hợp là acetonitrile và acid trifluoroacetic dạng dung dịch nước với tỉ lệ 3:97 (v/v) và kiểm tra sự ảnh hưởng của các nồng độ TFA khác nhau Chúng tôi đã nhận thấy rằng sự đáp ứng lại phản ứng tăng 0.005% nồng độ TFA, sau đó giảm nhẹ Tín hiệu cao nhất của AA đã được đo ở 0.009% TFA: ACN, 3:97 (v/v) ở hình 2D Hơn nữa, tốc

độ dòng chảy của pha động là một thông số quan trọng khác ảnh hưởng đến độ cao peak Chúng tôi kiểm tra dòng chảy của pha động từ 0.05 đến 0.2 mL/phút Các phản ứng ở dòng chảy cao nhất đã được ghi lại ở lưu lượng 3mL/phút

Đây là những điều kiện thực nghiệm tối ưu: điện thế dò 100mV, nhiệt độ 25°C, pha động 0.09% TFA: ACN, 3:97 (v/v) và tốc độ dòng chảy 0.13 mL/phút Dưới những điều kiện trên chúng tôi đo được sự phụ thuộc chiều cao của peak AA với nồng độ của nó Những peak đạt được thì được triển khai tốt và đối xứng (hình 3A) Đường cong định chuẩn được thể hiện ở hình 3A (y= 0.3788x- 0.1461; R2 = 0.9985) Giới hiện dò tìm (3 S/N) cho AA được định lượng là 100fmol/5 µM cho vào Hơn nữa phương pháp này đã được sử dụng để xác định AA pha vào các mẫu huyết thanh người AA đã được pha vào huyết thanh (pha loãng 100 lần) và các phản ứng điện hóa đã được ghi nhận Đường cong đạt được (y = 0.2897x + 0.6118; R2 = 0.9942) thể hiện ở hình 3B Giới hạn dò tìm(3 S/N)

đã được định lượng là 20pmol/5µL cho vào

3.2 phân tích phun dòng chảy với Coulochem III dò điện hóa để phát hiện AA

Coulochem III là một máy với các đầu dò amperometric không mấy hiệu quả vì chỉ

có một phần chất được phân tích (thường là 5-10%) đi qua các điện cực hoạt động và thực

sự khuếch tán lên trên bề mặt điện cực, rồi chuyển đổi điện hóa Người ta cho rằng đầu dò coulometric CoulArray nhạy cảm hơn Coulochem III 10-20 lần đơn giản chỉ vì khối lượng dịch chuyển được cải thiện Thật không may là hiệu suất chuyển đổi được tăng lên của chất được phân tích thì đi kèm với sự gia tăng các phản ứng của chất điện phân (nền) , và gần như không có sự hạ thấp giới hạn phát hiện Hơn nữa, có thể amperometry cung cấp LOD tốt hơn về nồng độ bởi những tế bào được thu nhỏ Vì vậy chúng tôi đã thông qua những điều kiện thực nghiệm tối ưu ở trên để phát hiện AA bởi FIA cùng đầu dò điện hóa Coulochem III và so sánh đầu dò Coulometric CoulArray và Coulochem Không giống như đầu dò CoulArray, Coulochem chứa một thiết bị gọi là "tế bào bảo vệ", mà có thể oxy hóa các tạp chất electroactive trong pha đoạn động, do đó giảm tạp chất Chúng tôi thử nghiệm năm điện thế (-100, -50, 0, 50 và 100 mV) áp dụng trên "tế bào bảo vệ" và đo các tín hiệu của AA Sự phụ thuộc thu được được thể hiện trong hình 4A Dựa trên kết quả thu được thì điện thế tối ưu cho "tế bào bảo vệ" là 0 mV Các điện thế thấp hơn hoặc cao hơn giá trị tối ưu làm giảm nhẹ tín hiệu của AA Để so sánh các máy dò chúng tôi một lần nữa

đo sự phụ thuộc của nồng độ AA về chiều cao của peak (Hình 4B) Các phương trình của đường chuẩn thu được là y = 0.0136x + 0,0189, với R2 = 0,9990

Các mức nồng độ AA phân tích bằng cả coulometric và thiết bị dò amperometric thu được gần như giống nhau qua sự so sánh về khả năng nhạy của dụng cụ Các tiếp tuyến của đường chuẩn là 0,3788 cho coulometric và 0,0136 cho amperometric Dựa trên những kết quả các tiếp tuyến của đường cong hiệu chuẩn cho AA đo bằng máy dò coulometric cao hơn gần 30 lần so với các tiếp tuyến đo bằng máy dò amperometric Máy dò Coulometric nhạy cảm hơn nhiều với sự hiện diện của AA, do đó, chúng tôi sử dụng mấy dò này trong các thí nghiệm sau đây

Hình 4 FIA kết hợp với đầu dò điện hóa Coulochem III Sự phụ thuộc của chiều cao peak với điện thế tế bào bảo vệ (-100, -50, 0, 50 và 100 mV) (A) và với các nồng độ AA khác nhau (15, 30, 55, 85, 110 và 140 μmol·L -1) (B) thông số FIA-ED là giống như thể hiện trong hình 3