BÀO cáo (dược PHÂN TÍCH) xác định hàm lượng ure trong nước mắm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

KHOA CHĂN NUÔI THÚ YChủ đề :XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG URE TRONG NƯỚC MẮM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Giáo viên hướng dẫn : Danh sách sinh viên thực hiện: TP... Nguồn gốc sự h

KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y

Chủ đề :XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG URE TRONG

NƯỚC MẮM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Giáo viên hướng dẫn :

Danh sách sinh viên thực hiện:

TP HCM - Tháng 5 năm

MỤC LỤC

I ĐẶT VẤN ĐỀ 3

1 Đặt vấn đề 3

2 Tình hình nhiễm urea trong nước nắm ở Việt Nam 3

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4

1 Đối tượng: Urê trong nước mắm 4

2 Phương pháp nghiên cứu 4

2.1 Tính chất hóa học, hóa lý của Ure 4

2.2 Sơ lược về phương pháp xác định urea trong nước mắm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 5

2.3 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 6

2.4 Điều kiện quy trình và quá trình thực hiện 10

III TÍNH TOÁN KẾT QUẢ 15

1 Kết quả khảo sát thành phần qua động, chương trình chạy gradient để tách N-9H-xanthen-9-ylurea 15 2 Kết quả khảo sát và định danh phức N-9H-xanthen-9-ylurea 15

3 Kết quả khảo sát điều kiện phản ứng tạo dẫn xuất 16

4 Kết quả khảo sát bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu cho đầu do huỳnh quang 17

5 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng giữa xanthydrol với ure và độ bền của phức N-9H-xanthen-9-ylurea 17

5.1 Khảo sát thời gian phản ứng giữa xanthydrol với ure 17

5.2 Khảo sát độ bền của phức N-9H-xanthen-9-ylurea 17

6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của biuret và biure 18

7 Kết qủa khảo sát khoảng tuyến tính của đường chuẩn 18

8 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 20

9 Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp 20

10 Kết quả khảo sát qui trình chuẩn bị mẫu và hiệu suất thu hồi trên mẫu nước mắm có thêm ure khi sử dụng chất khử tạp 21

10.1 Kết quả khảo sát qui trình chuẩn bị mẫu khi sử dụng chất khử tạp 21

10.2 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi 21

11 Công thức tính nồng độ ure có trong mẫu 22

IV KẾT LUẬN 23

V TÀI LIỆU THAM KHẢO 23

I ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Đặt vấn đề

Thực phẩm là yếu tố quan trọng song hành với sự sinh tồn của loài người Theo quá trìnhtiến hoá và phát triển của loài người, thực phẩm cũng được phát triển theo, cùng với sựtiến triển của khoa học công nghệ, công nghệ chế biến thực phẩm cũng phát triển

Nhu cầu về một thực phẩm đáp ứng không những về dinh dưỡng mà còn về tính an toàn

và không gây hại cho sức khỏe đối với người tiêu dùng là cần thiết Nguy cơ ảnh hưởngđến sức khỏe từ những thực phẩm không an toản đang là mối lo lớn của mỗi người dân

và toàn xã hội Vì vậy mà các kỹ thuật đánh giá mối nguy hại của một thực phẩm đối vớisức khỏe cũng đòi hỏi phải phát triển để bắt kịp với công nghệ chế biến thức ăn ngàycàng cao và đa dạng, nhằm phát hiện và loại trừ bớt những nguy cơ tác hại đến cơ thểngười tiêu dùng

Nước nắm là một loại thực phẩm được sử dụng phổ biến ở nước ta, là loại gia vị thườngxuyên hiện diện trong các bữa ăn của người Việt Việc xác đinh hàm lượng urea có trongnước mắn cũng là một vấn đề được người tiêu dùng quan tâm

2 Tình hình nhiễm urea trong nước nắm ở Việt Nam

Theo chemical codex đề nghị mức cho phép urea trong nước mắm là 50mg/l

Theo một kết quả nghiên cứu của Viện Pasteur Nha Trang công bố, trong 45 mẫu nướcmắm chọn ngẫu nhiên trên thị trường Khánh Hòa thì mẫu có Hàm lượng urea lớn hơn0,1g/l, có mẫu lên đến 2,1g/l Trong khi đó, urea hoàn toàn không có trong danh mục cácchất phụ gia thực phẩm do bộ Y tế ban hành

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Đối tượng: Urê trong nước mắm

2 Phương pháp nghiên cứu

2.1 Tính chất hóa học, hóa lý của Ure

Urea được Hilaire Rouelle phát hiện vào năm 1773

Công thức hóa học

2.1.1 Tính chất hóa học của Ure

- Dạng tinh thể hoặc bột màu trắng

- Khối lượng riêng: 1,34g/cm3

- Nhiệt độ nóng chảy: 132-1350C

2.1.2 Nguồn gốc sự hình thành urea trong nước mắm

- Có sẵn trong một số loại cá, ví dụ như cá Nhám có chứa urea trên da

- Do người bắt cá thêm vào để ướp cá

- Do người chế biến nước mắm thêm vào để tăng độ đạm của sản phẩm

- Có thể hình thành một cách tự nhiên trong quá trình chế biến nước mắm

2.1.3 Sự bài thải và độc tính của urea

2.1.3.1 Sự bài thải của urea

Trong cơ thể urea được chuyển hóa ở gan dưới sự điều khiển của N-acetylglutamat, sau

đó chúng theo máu đến thận và đào thải ra ngoài thông qua nước tiểu

Nồng độ urea trong máu là 16-54 mg/ml đối với nam và 12-47mg/ml đối với nữ

2.1.3.2 Độc tính của urea

Người sản xuất cho urea (chủ yếu ở dạng phân đạm) vào để ướp cá hoặc để tăng độ đạm

có 2 gốc rất độc đối với cơ thể người là ammonium ( NH4 ) và nitrate (NO3)

- NH4+ trong máu tăng cao, làm giảm pH máu, ngăn cản quá trình vận chuyển oxy,làm rối loạn các phản ứng sinh hóa trong cơ thể, da và niêm mạc bị tím lại, có thểdẫn đến hôn mê, chết

- Nitrate khi đến ruột thì chuyển hóa thành nitrite (NO2-) gây Methaemoglobinemia,

do nitrite kết hợp với hemoglobin oxy hóa Fe2+ thành Fe3+, ngăn cản sự vận chuyểnoxy, dẫn đến có những biểu hiện như nôn ói, choáng váng, chóng mặt, tay chânbủn rủn, tím tái, có thể gây rối loạn thần kinh, đau nhức

- Nếu lượng urea quá mức có thể gây giảm hoạt động của tuyến giáp, rối loạn máucác tính, rối loạn thần kinh, nếu kéo dài có thể làm da chuyển sang màu xám

2.2 Sơ lược về phương pháp xác định urea trong nước mắm bằng phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao.

2.2.1 Nguyên lý của phương pháp sắc khí lỏng hiệu năng cao- đầu dò huỳnh quang

để xác định urea

Cho urea tạo dẫn xuất với thuốc thử xanthydrol tạo thành hợp chất ylurea và được đo bằng đầu dò huỳnh quang (λex=213nm; λem=308nm) sau khi tách bằngcột sắt khí pha đảo (C18) trên thiết bị HPLC

N-9H-xanthen-9-Phản ứng giữa thuốc thử Xanthydrol với urea: Sử dụng hệ phản ứng tự động phân tíchcarbamate để tạo dẫn xuất urea với xanthydrol (urea được pha trong dung dịch ethanol vàxanthydrol được pha trong propanol) trong môi trường có thêm 1 lượng nhỏ acid HCl1,5M Dưới điều kiện trên sau 5 phút thì chất tạo dẫn xuất được tách trên thiết bị HPLC

và đo trên đầu do huỳnh quang λex=213nm; λem=308nm Ở điều kiện này, urea phản ứngvới xanthydrol tạo thành hợp chất N-9H-xanthen-9-ylurea

2.2.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hình: Hệ thống máy sắc ký lỏng cao áp HPLC

 Bình chứa pha động :

Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta

sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn vàtổng tỉ lệ của 4 đường là 100%

Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc màthường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồngnhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải

Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dùngcho HPLC Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải làhóa chất tích khiết dùng cho phân tích

Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đườngnền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích

- Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể lọai trừ hết được thì bơmcao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất và hoạtđộng của cả hệ thống HPLC.

Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích

 Bơm cao áp

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký Bơm phảitạt được áp suất cao khỏang 250-600bar và tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ0.1 đến 10ml/phút

 Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đồi

Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động(autosample)

 Cột sắc ký

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,…

Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký

 Đầu dò

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trênsắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất phântích mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp.

Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độđiện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…

Trên cơ sở đó, người ta sản xuất các lọai đầu dò sau:

- Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát hiện UV

- Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát hiện cácchất hấp thụ quang Đây là lọai đầu dò thông dụng nhất

- Đầu dò hùynh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tựnhiên và các dẫn suất có huỳnh quang

- Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả năng quét chồng phổ để định tính cácchất theo độ hấp thụ cực đại của các chất.

- Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng đó các loại đường

- Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn

- Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,…

- Sodium acetate – Merck

- Acetronitril dùng cho HPLC – Merck

- Xanhthydrol – Fluka

- Chuẩn urea ≥ 99% - Merck

- Dung dịch xanthydrol 0,07M: hòa tan 140 mg xanthydrol trong dung dịchpropanol – 1 thành 10 ml Tránh ánh sáng trực tiếp

- Dung dịch acid HCl 1,5M: lấy 174 ml dung dịch HCl đậm đặc 37% vàobình

định mức 1 L rồi định mức bằng nước cất đến vạch trao đổi ion

- Dung dịch đệm sodium acetate 20 mM (pH = 7,2): hòa tan 1,64g sodiumacetate thành 1 L bằng nước cất trao đổi ion Chỉnh dung dịch về pH = 7,2bằng dung dịch acid acetic loãng trên máy pH Lọc qua giấy lọc 0,45µm.

- Dung dịch ZnSO4 2N: hòa tan 30g ZnSO4 thành 100ml bằng nước cất traođổi ion

- Dung dịch K4Fe(CN)6.3H2O 15%: hòa tan 15g K4Fe(CN)6.3H2O thành 100

ml bằng nước cất trao đổi ion

- Dung dịch Ethanol 75%: pha loãng 750 ml ethanol tuyệt đối thành 1L bằngdung dịch nước cất

- Dung dịch chuẩn:

bằng dung dịch nước cất

chuẩn 100ppm pha thành 100ml bằng nước cất

 Pha điểm chuẩn có nồng độ lần lượt là: 0.1 ; 0.4 ; 0.6; 0,8 ;1.0 ppmbằng cách hút lần lượt vào 1.0 ; 4.0 ; 6.0 ; 8.0 ; 10.0ml dung dịchchuẩn trung gian rồi định mức thành 100ml bằng dung dịch cồn75%

- Bình định mức: 10ml, 100ml, 1000ml

- Micropipet: 10 - 100µl và 100 - 1000µl

2.4 Điều kiện quy trình và quá trình thực hiện

2.4.1 Điều kiện quy trình

a Pha động

- Dung môi A: Axetonitril

- Dung môi B: Axetonitril và dung dịch natri axetat (pH = 7,2) với tỷ lệ 36 : 64(% thể tích);

- Lọc các dung môi pha động qua màng lọc và loại bỏ khí hòa tan bằng cách đểtrong thiết bị siêu âm khoảng 10 min trước khi sử dụng.

b Bước sóng kích hoạt 213 nm, bước sóng phát xạ 308 nm.

Chú thích: Các thông số về tỉ lệ pha động, chương trình gradient pha động, thể tích mẫu

bơm có thể được điều chỉnh tùy thuộc vào điều kiện thực tế của thiết bị HPLCđược sử dụng

2.4.2 Quá trình thực hiện

a Xác định các thông số kỹ thuật của hệ sắc ký lỏng với mẫu chỉ gồm

urea-xanthydrol.

- Khảo sát thành phần pha động, chương trình chạy gradient

 Tiến hành trên 2 loại cột C18 và C8 có đặc trưng sau: chiều dài 25cm, đườngkính 4,6 mm, đường kính hạt 5µm

chương trình chạy gradient

- Khảo sát tách và định danh phức N – 9H- xanthen- 9- ylurea

Để định danh chính xác phức N – 9H- xanthen- 9- ylurea thì thông thường dựa vàothời gian lưu và kết hợp them khối phổ của cấu tử cần định danh

- Khảo sát điều kiện phản ứng tạo dẫn xuất

Để tiến hành khảo sát, lấy 25µl dung dịch HCl ở nồng độ khác nhau, 50µl dungdịch thuốc thử xanthydrol ở nồng độ khác nhau, 500µl dung dịch mẫu vào vial cónắp đậy và lắc đều.

- Khảo sát bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu cho đầu dò huỳnh

quang

đã tạo dẫn xuất ở nồng độ 0,3 ppm bằng cách cố định bước sóng phát xạ ở308nm và thay đổi bước sóng kích thích khác nhau

tạo dẫn xuất ở nồng độ 0,3ppm bằng cách cố định bước sóng phát xạ ở213nm và tahy đổi bước sóng kích thích

- Khảo sát thời gian phản ứng giữa xanthydrol với urea và độ bền

Lấy 50µl dung dịch HCl 1,5M cho vào vial Thêm 50µl dung dịch xanthydrol0,07M và 500µl dung dịch chuẩn 0,6ppm Để yên hỗn hợp trong 1 thời gian vàtiến hành chạy trên thiết bị trong cùng điều kiện phân tích

- Khảo sát ảnh hưởng của biuret và biurea đến urea

Tiến hành với nồng độ urea là 0,64ppm có thêm lần lượt biuret với nồng độ là0,64ppm, 64ppm và 6,4ppm + 2,2ppm biurea

- Khảo sát khoảng tuyến tính của đường chuẩn

- Khảo sát độ lặp lại của phương pháp

Tiến hành thực hiện chạy 6 lần lặp lại của dung dịch chuẩn 0,3ppm trong cùngđiều kiện chạy giống nhau

- Khảo sát giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp

Cách thực hiện tính giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng: từ giá trị thực hiệnchạy 10 mẫu trắng, tính độ lệch chuẩn diện tích peak thu được của mẫu trắng.Giới hạn phát hiện: LOD = diện tích peak trung bình của mẫu trắng + 3SD diệntích mẫu trắng

Giới hạn định lượng: LOQ = LOD * 10/3

b Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu và hiệu suất thu hồi trên mẫu nước mắm

có thêm urea khi sử dụng chất khử tạp

-Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu

nước mắm được lắc đều và dùng pipet lấy 5ml mẫu + 10ml nước cất + 1gthan hoạt tính + V ml dung dịch ZnSO4 2N + V ml dung dịch

K4Fe(CN)6.3H2O 15% Định mức thành 100ml bằng dung dịch cồn tuyệt đối.Lọc qua giấy lọc băng xanh Khảo sát lượng dung dịch ZnSO4 2N và

K4Fe(CN)6.3H2O 15% dùng để xử lý mẫu

 Việc sử dụng chất khử tạp dung dịch ZnSO4 2N + K4Fe(CN)6.3H2O15% dùng để loại bỏ các chất như: các hạt lơ lững có trong mẫu, một sốprotein mạch dài… Dung dịch sau khi khử tạp rất dễ lọc và loại bỏ một số tạpchất Điều này rất quan trọng trong việc xác định các mẫu có nhiều chất rắn

lơ lửng, các dung dịch nước mắm chưa được chế biến

Sơ đồ: Quy trình xác định urea trong nước mắm

-Khảo sát hiệu suất thu hồi

Thực hiện phân tích các mẫu nước mắm có độ đạm lần lượt là: 10 độ đạm, 20 độđạm, 25 độ đạm, 30 độ đạm, 35 độ đạm, 40 độ đạm ( nước mắm 10N, 20N, 25N,30N, 35N, 40N) và mẫu nước mắm trên có thêm chuẩn Thực hiện các bước xử

lí mẫu, tạo dẫn xuất và xác định trên thiết bị Từ kết quả thu được, tính toán hiệusuất thu hồi đạt được

2.4.3 Tiến hành phân tích trên máy

-Thiết lập phương pháp chạy máy

Đối với máy sắc ký lỏng hiệu cao năng, các thông số cần phải thiết lập cho phù hợpvới việc phân tích Các thông số bao gồm thông số cho hệ thống bơm, chương trìnhcho autosampler, chương trình gradient pha động, bước sóng kích thích và bướcsóng phát xạ cho đầu dò huỳnh quang

Sau khi tất cả các yếu tố đạt yêu cầu, mẫu chuẩn và mẫu thật sẽ được tiêm vào máydùng hệ thống tiêm mẫu tự động autosampler

Định mức thành 100ml

- Lấy V1 µl dung dịch xanthyldrol 0,02M vào vial

- Thêm V2 µl dung dịch HCl 1,5M

- Thêm V3 µl dung dịch mẫu, lắc đều

Định lượng trên HPLC đầu dò

huỳnh quang

Kết quả thu được sẽ được tiến hành định tính và định lượng dựa vào phần mềmTCNAV của hãng Perkin Elmer.

X: là nồng độ urea có trong mẫu, mg/l

V: thể tích định mức mẫu, ml

M: thể tích mẫu, ml

k: hệ số pha loãng

III.TÍNH TOÁN KẾT QUẢ

1 Kết quả khảo sát thành phần qua động, chương trình chạy gradient để tách 9H-xanthen-9-ylurea

N-Để khảo sát quá trình tách N-9H-xanthen-9-ylurea, chúng tôi sử dụng pha động là đệm sodium acetate 20 mM (pH=7,2): acetonitril (ACN) theo chương trình gradient bằng cáchthay đổi thành phần pha động Qua khảo sát chương trình chạy gradient để tách hợp chất cần phân tích cho cột C18 và C8 ta thu được như sau:

Hình II-1: Chương trình chạy gradient bơm A ( đệm sodium acetate 20 mM ) và bơm C