SEMINAR nghiên cứu và khảo sát hàm lượng nitrate có trong một số loại rau củ quả bằng HPLC (dược PHÂN TÍCH SLIDE)

NGHIÊN CỨU VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG NITRATE CÓ TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU CỦ QUẢ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC GVHD:... Kết quả nghiên cứu 4.1 Kết quả thẩm định 4.2 Kết quả

NGHIÊN CỨU VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG NITRATE

CÓ TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU CỦ QUẢ BẰNG

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

HPLC

GVHD:

 Chương 1 Giới thiệu

 Chương 2.Tổng quan lý thuyết

2.1 Tổng quan về nitrat 2.2 Tổng quan về HPLC 2.3 Hệ thống HPLC

2.4 Chọn điều kiện sắc ký

 Chương 3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Quy trình thử nghiệm 3.2 Thẩm định quy trình thử nghiệm

 Chương 4 Kết quả nghiên cứu

4.1 Kết quả thẩm định 4.2 Kết quả khảo sát hàm lượng nitrate trên 1 số loại rau

củ quả bằng 2 phương pháp

4.3 Một số hình ảnh về sắc kí đồ của mẫu phân tích

Nội dung

Chương 1 Giới thiệu

1.1 Lý do chọn đề tài

1.2 Mục tiêu đối tượng nghiên cứu

Tìm hiểu tính chất vật lí, hoá lí, tác hại của nitrate có trong rau củ quả

 Đưa ra phương pháp xác định hàm lượng nitrate

trong rau củ quả bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

 Khảo sát hàm lượng nitrate có trong một số loại

rau củ quả có mặt trên thị thường

Đối tượng nghiên cứu: một số loại rau củ quả phổ

biến trong bữa ăn hang ngày

Phạm vi nghiên cứu: rau củ quả được mua từ một số chợ trên đia bàn thành phố Hồ Chí Minh

Chương 2 Tổng quan lý

thuyết

2.1 Tổng quan về nitrate

2.1.1 Giới thiệu về nitrate

2.1.2 Nguồn gốc của nitrat Vì sao nitrat

có nhiều trong đất?

Chương 2 Tổng quan lý

thuyết

Bảng 2.1 : Hàm lượng nitrate cho phép trong một số loại rau quả theo tiêu

chuẩn của WHO (đơn vị: mg/kg sản phẩm)

2.1.5.5 Phương pháp đo khí 2.1.5.4 Phương pháp cực phổ

 2Bộ phận khử khí  3.Hệ thống bơm cao áp.

 4.Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay

autosample).

 5.Cột sắc ký (pha tĩnh) ( để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt).

 6.Detector (nhận tín hiệu).

 7.Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu, xử lí dữ liệu

và điểu khiển hệ thống HPLC.

8.In dữ liệu.

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Quy trình thử nghiệm

3.1.1 Thuốc thử 3.1.2 Thiết bị - dụng cụ 3.1.3 Cách tiến hành

3.1.3.1 Quy trình xử lý mẫu 3.1.3.2 Dựng đường chuẩn 3.1.3.3Điều kiện thao tác của HPLC

3.1.3.4 Tính kết quả 3.2 Thẩm định quy trình thử nghiệm

3.2.1 Độ đúng 3.2.2 Độ chính xác 3.2.3 Tính đặc hiệu 3.2.4 Giới hạn phát hiện 3.2.5 Giới hạn định lượng 3.2.6 Tính tuyến tính

3.1.1 Thuốc thử

Các thuốc thử sử dụng phải là loại hoá chất tinh khiết dùng trong phân tích.

• ™ Metanol: loại dùng cho HPLC (Merck)

• ™ Acetonitril (ACN): loại dùng cho HPLC

(Merck)

•  Dung dịch Carrez số 1

• Dung dịch Carrez số 2

• Dung dịch chuẩn Nitrate 50ppm

• Dung dịch chuẩn Nitrate 5ppm

• HPLC pha động

• Máy trộn phòng thí nghiệm: máy cắt phòng thí

nghiệm

• Giấy lọc gấp nếp.

• Bộ phận siêu lọc: dùng cho dung dịch lỏng, có cỡ lỗ

0.45µm

• Cột chiết pha rắn SPE: cột RP C18 pha đảo

• Bộ chiết SPE với bơm hút chân không.

• Dụng cụ thủy tinh cần thiết: bình định mức các loại,

pipet các loại, pipet

• Pasteur, bình nón, cốc

3.1.2 Thiết bị - dụng cụ

Mẫu nhuyễ Xay

n

Cân 10g Hòa tan với

300ml nước cất

Đánh siêu âm

30 phút

Định mức lên 500ml Lọc

Lọ Vial 3.1.3.1 Quy trình xử lý mẫu

3.1.3 Cách tiến hành

tuyến tính của hàm số hiệu chuẩn.

3.1.3.3 Điều kiện thao tác của HPLC

3.1.3.5 Tính kết quả

Tính hàm lượng Nitrate trong mẫu theo công thức sau:

Với: ρ: hàm lượng nitrate trong mẫu (mg/kg hoặc mg/lít)

X: nồng độ nitrate trong dung dịch mẫu thử đọc

𝛒= 𝐗 𝐱 𝐅𝟏 𝐱 𝑽 𝒎

3.2 Thẩm định quy trình thử nghiệm

3.2.1 Độ đúng Định nghĩa:

• Độ đúng của một phương pháp phân tích là sự giám sát gần (closeness) của các kết quả thử nghiệm bằng phương pháp đó với giá trị thật sự

• Độ đúng của một phương pháp phân tích phải được xác định suốt trong khoảng áp dụng của phương pháp

3.2.2 Độ chính xác

Định nghĩa:

• Độ chính xác của một phương pháp phân tích là mức

độ phù hợp giữa các kết quả phù hợp giữa các kết

quả kiểm nghiệm cá thể khi phương pháp được áp dụng lập lại nhiều lần trên cùng một mẫu

• Độ chính xác của phương pháp phân tích thường

được thể hiện bằng độ lệch chuẩn (Standard

deviation- SD) hay độc lêch chuẩn tương đối

(Relative standard devition- RSD) của một loạt các lần đo

phân tích có thể được khắc phục bởi các phương

pháp phân tích hỗ trợ khác

3.2.4 Giới hạn phát hiện

Định nghĩa:

Giới hạn phát hiện là lượng chất cần phân tích thấp nhất trong mẫu thử có thể phát hiện bởi phương pháp phân tích trong các điều kiện thí nghiệm đã công bố, nhưng không nhất thiết phải có tính định lượng Giới hạn phát hiện là một đặc tính của các thử nghiệm giới hạn (limit tests) Giới hạn phát hiện thường được biểu thị theo tỷ lệ phần trăm, phần triệu (ppm), phần tỷ

(ppb) nồng độc chất cần phân tích…trong mẫu thử

nghiệm đã công bố với độc chính xác và độ đúng có thể chấp nhận được Giới hạn định lượng thường được biểu thị theo tỷ lệ phần trăm, phần triệu (ppm), phần

tỷ (ppb)…nồng độ chất cần phân tích trong mẫu thử

3.2.6 Tính tuyến tính

Định nghĩa:

Tính tuyến tính của một phương pháp phân tích là khả năng có thể rút ra các kết quả thử nghiệm bằng phương pháp đó một cách trực tiếp, hoặc bằng một

sự chuyển đổi toán

học cho biết sự tỷ lệ của hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu thử trong vòng một khoảng đã cho Trong cả hai trường hợp, giữa đại lượng đo được và nồng độ phải thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính Tính tuyến tính được biểu thị bằng hệ số tương R

Chương 4 Kết quả nghiên

cứu

Chuẩn nitrate Nồng độ

(ppm) Diện tích Thời gian lưu (phút)

y = 77.86x 7.4779 ‐

R 2 = 1

•Kiểm tra độ sai lệch của 2 phương pháp xử lý mẫu

Khảo sát trên mẫu rau xà lách:

Bảng 4.1: Kết quả chuẩn nitrate

Hình 4.1: Đường chuẩn nitrate

Mẫu Khối Lượng

(g)

Diện tích

Thời gian lưu (phút)

Bảng 4.2: Kết quả mẫu xà

lách

Như vậy cả hai phương pháp xử lý mẫu đều cho kết qua gần như

nhau Ta có thể áp dụng cả hai phương pháp này Để tính được ρ

(mg/kg) ta áp dụng công thức của TCVN:

Ví dụ:

Xà lách 1 với phương pháp Carrez:

Xà lách 1 với phương pháp qua cột C18:

(mg/kg)

(mg/kg)

Mẫu Khối lượng mẫu

thử (g) Diện tích Nồng độ ρ (mg/kg) Mẫu 1 10.19 1524.1 19.671 1206.5 Mẫu 2 10.02 1517.3 19.584 1221.5 Mẫu 3 10.01 1498.8 19.346 1207.9 Mẫu 4 10.00 1498.5 19.342 1208.9 Mẫu 5 10.15 1520.3 19.622 1208.3 Mẫu 6 10.09 1515.6 19.562 1211.7

Độ lặp lại  

Khảo sát trên mẫu rau xà lách

 Sử dụng phương pháp tinh sạch mẫu bằng Carrez:

Bảng 4.3: Kết quả mẫu xà lách tinh sạch bằng Carrez

Sử dụng phương pháp tinh sạch mẫu bằng cột

5 0 0 0

y = 77.86x ‐ 7.4779 R2 = 1

0 10 20 30 40 50 60

Hình 4.2: Đường chuẩn nitrate

Intercep (b): -7.4779 R2: 1

Nhận xét: Tính tuyến tính đạt yêu

cầu: R2 = 1 (R2 > 0,999) Với: Slope (a): 77.86

Độ đúng  

Khảo sát trên mẫu rau mồng tơi

Diện tích

Thời gian lưu (phút)

Nồng độ

ρ (mg/

kg)

Nồng

độ thực

tế (mg/kg )

Nồng độ thêm chuẩn (mg/kg)

Hiệu suất thu hồi Mẫu MT 10.08 1405.2 6.932 17.63 865.78      

Mẫu + 80% 10.02 2402.8 6.889 30.50 1494.91 629.12 640 98% Mẫu + 80% 10.23 2400.0 6.795 30.46 1488.76 622.96 640 97% Mẫu + 80% 10.15 2400.8 6.768 30.47 1500.10 635.21 640 99% Mẫu +100% 10.50 2683.4 6.889 34.12 1624.56 758.78 800 95% Mẫu +100% 10.46 2642.1 6.841 33.58 1605.30 739.52 800 92% Mẫu +100% 10.37 2640.2 6.800 33.56 1618.06 752.27 800 94% Mẫu +120% 10.29 2899.8 6.780 36.91 1793.36 629.12 960 96% Mẫu +120% 10.46 2955.3 6.787 37.62 1798.43 739.52 960 97% Mẫu +120% 10.47 2961.2 6.707 37.70 1800.3

5 934.57 960 97%

Phương pháp tinh sạch bằng Carrez

Bảng 4.8 : Kết quả mẫu mồng tơi tinh sạch bằng

Carrez Mẫu

Khối lượng (g)

Diện tích

Thời gian lưu (phút)

Nồng độ

ρ (mg/kg) Nồng độ thực

tế (mg/kg)

Nồng độ thêm chuẩn (mg/kg)

Hiệu suất thu hồi Mẫu MT 10.08 1163.2 6.674 14.51 890.57      

Mẫu + 80% 10.02 1879.5 6.688 23.75 1455.00 564.43 640 88% Mẫu + 80% 10.23 1951.2 6.723 24.67 1507.26 616.69 640 96% Mẫu + 80% 10.15 1890.6 6.756 23.89 1470.99 580.42 640 90% Mẫu +100% 10.50 2170.4 6.674 27.5 1636.8 746.23 800 93% Mẫu +100% 10.46 2145.1 6.685 27.17 1623.55 732.99 800 96% Mẫu +100% 10.37 2076.2 6.712 26.17 1577.08 686.51 800 86% Mẫu +120% 10.29 2312.4 6.728 29.33 1781.46 890.89 960 93% Mẫu +120% 10.46 2340.5 6.743 29.69 1774.16 883.6 960 92% Mẫu +120% 10.47 2361.9 6.736 29.97 1788.9

5 898.38 960 94%

Nhận xét: Hiệu suất thu hồi đạt yêu cầu: >80%

Giới hạn phát hiện

Hình 4.4: Đường nền của mẫu blank

Hình 4.5: Đường nền của chuẩn nitrate ở nồng độ 0.01ppm

Nhận xét: Tỉ lệ S/N (tín hiệu so với nhiễu ) là 3/1 Như vậy giới hạn

phát hiện của phương pháp là 0.01ppm.

Tính đặc hiệu

Hình 4.7: Phổ của nitrate (bên phải)

Hình 4.8: Phổ của nitrate (bên trái)

Hình 4.9: Phổ của nitrite

Nhận xét: Nitrate và Nitrite là hai chất có cấu trúc gần giống nhau

nhưng hình dạng của phổ và đạo hàm của chúng đều khác nhau Nitrite

có điểm cực đại là 220 và điểm cực đại của đạo hàm bậc 2 là 235 Còn

Nitrate có điểm cực đại là 205 và điểm cực đại của đạo hàm bậc 2 là

225 Ngoài ra, khi click chuột vào bên trái và bên phải của phổ Nitrate

đều cho những hình ảnh giống nhau, chứng tỏ đó là Nitrate, không phải

là chất khác

Kết quả khảo sát hàm lượng nitrate trên 1 số loại rau củ quả

Thời gian lưu (phút)

Nồng độ nitrate mẫu Nồng độ thực tế (mg/kg)

Phương pháp tinh sạch bằng Carrez

Diện tích peak

Thời gian lưu

(phút)

Nồng độ nitrate mẫu Nồng độ thực tế

(mg/kg) Khổ qua 10.02 681.7 5.7 8.3 517.2

1.Một số hình ảnh về sắc kí đồ của mẫu phân tích

Chồng phổ: Peak theo thứ tự: chuẩn nitrate 5ppm ( xanh dương ), củ dền

Carrez ( đỏ ), khoai tây Carrez ( xanh lá cây ).

Hình 4.10: Chồng phổ nitrate của mẫu củ dền, khoai tây với chuẩn nitrate

•Chồng phổ: Hành lá C18 ( xanh dương ) và hành lá Carrez ( đỏ )

Hình 4.11: Chồng phổ nitrate của mẫu hành lá C18 và Carrez

Sắc kí đồ của chuẩn: ví dụ chuẩn 5 ppm

Hình 4.12: Sắc ký đồ chuẩn nitrate 5ppm

DAD1 A, Sig=210,1 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\DATN\DEF_LC 2010-06-11 13-51-07 DAT\SIG1000024.D) mAU

400 300 200 100 50 0

DAD1 A, Sig=210,1 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\DATN\DEF_LC 2010-06-11 13-51-07 DAT\SIG1000011.D) mAU

Cải bẹ xanh Carrez

Hình 4.14: Sắc ký đồ mẫu cải bẹ xanh

DAD1 A, Sig=210,1 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\DATN\DEF_LC 2010-06-11 13-51-07 DAT\SIG1000014.D) mAU

DAD1 A, Sig=210,1 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\DATN\DEF_LC 2010-06-11 13-51-07 DAT\SIG1000022.D) mAU

Khoai tây Carrez

Hình 4.16: Sắc ký đồ mẫu khoai tây

DAD1 A, Sig=210,1 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\DATN\20100614000001.D) mAU

Cảm ơn cô và các bạn đã theo dõi!!!