SEMINAR xác định dư lượng penicillin g và v trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC (dược PHÂN TÍCH SLIDE)

XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG PENICILLIN G VÀ V TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên đề:... Mục tiêu: Xây dựng được phương pháp xác định penicillin G và V với độ nhạy và

XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG PENICILLIN G VÀ V

TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên đề:

Đặt vấn đề

Tổng quan penicillin

Tổng quan penicillin

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu

Tính toán kết

quả

Tính toán kết

quả Kết luận

Tổng quan về penicillin

Penicillin là kháng sinh thế hệ đầu tiên có tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều loại vi

khuẩn

Penicillin lần đầu tiên phát hiện có tác dụng

chống vi khuẩn gram dương Staphylococcus,

Diplococcus nhưng hầu như không có tác

dụng chống vi khuẩn gram âm và nấm men

Cấu trúc chung của penicillin

Tác hại của penicillin đối với con người

Làm đảo lộn công nghệ chế biến

Gây ra hiện tượng “chọn lọc” vi sinh vật kháng lại chất kháng sinh, đặc biệt hiện tượng “kháng

thuốc chéo”

Penicillin là kháng sinh thường gây dị ứng nhất: mẩn ngứa, mày đay, ngoại ban Nguy hiểm nhất là shock phản vệ, penicillin chiếm đầu

bảng với tỷ lệ shock phản vệ 1/70.000

Đối tượng nghiên cứu

Dư lượng penicillin G và V trong thực phẩm Mục tiêu: Xây dựng được phương pháp xác định penicillin G và V với độ nhạy và độ

chính xác cao.

PEN G

PEN V

- Cột chiết pha rắn Polymeric (500mg, 6ml)

- Máy cất quay chân không

- Máy lắc vortex

- Máy li tâm, đạt tốc độ 6000 vòng/phút

- Máy đồng nhất mẫu

- Máy đo pH

Hóa chất

Các loại hóa chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích:

- Chuẩn Benzyl penicillin (Penicillin G)

- Chuẩn phenoxymetyl penicillin Kali (Penicillin V)

- Acetonitril, Methanol, Natritungstat (Na2WO4),

Thuỷngân (II) clorid (HgCl2), 1,2,4- triazole (C2H3N3), Natrithiosulfat (Na2S2O3), Natrihydroxid (NaOH),

Natriclorid (NaCl), Kali dihydrophotphat (KH2PO4), Dikali hydro photphat (K2HPO4), Acid sulfuric

(H2SO4)

Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Chuẩn bị dung dịch chuẩn Penicillin G

•Dung dịch chuẩn gốc Penicillin G 1000mg/l

•Dung dịch chuẩn trung gian Penicillin G 10 mg/l

Chuẩn bị dung dịch chuẩn Penicillin V

•Dung dịch chuẩn gốc Penicillin V 1000mg/l

•Dung dịch chuẩn trung gian Penicillin V 10 mg/l

Đệm photphat 0,1M pH 6.5:

Cân 7,98 gam K2HPO4.3H2O; 8,84 gam KH2PO4 và 3,89 gam Na2S2O3 Hoà tan hỗn hợp

Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC

Xử lý mẫu

 Phần dịch còn lại cho vào môi trường có PH = 8-9, NAOH 0,4N với 5ml đệm phosphat 25mM rửa tạp, 3ml MeOH, 3ml H20 cho vào cột SPE

 Hút khô trong vòng 1p, rồi rửa giải với 10ml

CAN/bình cất quy, cố quay chúng đến cạn ở 400C

 Thêm 500 µm đệm photphat 25mM, pH 9, 500µL hỗn hợp dẫn xuất, đưa vào bể điều nhiệt 550C

trong vòng 30p

CÁC THÔNG SỐ TỐI ƯU

•Cột Symmestry waters C18 (250mm×4,6mm×5µm)

•Pha động: chương trình gradient

oA: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 700 : 240 : 60 oB: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 500 : 300 : 200

•Detectơ: PDA 323nm

•Nhiệt độ buồng cột: 40oC

•Tốc độ dòng: 1ml/phút

KHOẢNG TUYẾN TÍNH VÀ ĐƯỜNG CHUẨN

Phương pháp HPLC có khoảng tuyến tính rõ rệt

Tất cả hệ số hồi qui tuyến tính đều dao động trong khoảng từ 0,99 đến dưới 1

Khoảng tuyến tính (ng/g)

ĐƯỜNG CHUẨN

ĐỘ CHÍNH XÁC

 Giới hạn phát hiện của phương pháp (LOD) đối với

PEN G = 20ppb, PEN V = 40ppb

 Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ) đối

với PEN G = 67ppb, PEN V = 133ppb

 Kết quả phân tích cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao để phân tích dư lượng kháng sinh CAP

trong thịt

LOD và LOQ của thiết

bị cao hơn so với giới hạn cho phép nên cần phải làm giàu mẫu.

LOD và LOQ của thiết

bị cao hơn so với giới hạn cho phép nên cần phải làm giàu mẫu.

ĐỘ LẶP LẠI

Sử dụng nền mẫu trắng, thêm các mức chuẩn ở khoảng đầu, giữa và cuối đường chuẩn, mỗi

mức lặp 3 lần

Tính độ lệch chuẩn SD và hệ số biến thiên CV:

Si là diện tích của pic sắc ký thứ i

Stb là diện tích trung bình của n lần

chạy

n là số lần chạy lặp

Bảng: Độ lặp lại của Penicillin G tại các nồng độ khác nhau

Theo AOAC, CV% cho phép tại 100ppb là 15%, 1ppm là 11%.

Tại nồng độ penicillin thấp, độ dao động của

các kết quả lớn

Tuy nhiên, tại những cấp độ khảo sát, CV% của phương pháp nằm trong khoảng 3 – 10% là phù hợp với yêu cầu của AOAC

ĐỘ LẶP LẠI

ĐỘ THU HỒI

Tính hiệu suất thu hồi của phương pháp theo

các công thức sau :

C: nồng độ Pen xác định được (µg/g)

C': nồng độ Pen tính từ đường chuẩn (µg/ml)

V: thể tích định mức trước khi bơm vào HPLC ( V = 1ml) m: khối lượng mẫu (g)

Cm+c : nồng độ Pen xác định được trong mẫu thêm chuẩn (µg/g)

Cm: nồng độ Pen có trong mẫu (µg/g)

mc: lượng Pen thêm vào (µg)

Ứng dụng phân tích mẫu thực tế

Xác định Penicillin G và V trong 3 nhóm đối tượng: nhóm gia súc (thịt, gan, bầu dục lợn, bò); nhóm gia cầm (thịt gà, thịt ngan, thịt vịt); nhóm thuỷ hải sản

(một số loại tôm, cá) để thẩm định lại qui trình

Các mẫu được lấy ngẫu nhiên tại một số cửa

hàng trên địa bàn nội thành Hà nội

Chọn mẫu và kĩ thuật lấy mẫu theo TCVN 4833- 1:2002 Mỗi loại mẫu lấy tại 3 cửa hàng, trộn đều và phân tích

Trong số 10 loại mẫu không có mẫu nào phát hiện

có penicillin G và V Hiệu suất thu hồi nằm trong

khoảng 80 - 93%

KẾT LUẬN

Đã khảo sát và chọn được thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký

Đã tìm được điều kiện tối ưu cho quá trình xử lí

mẫu, hiệu suất thu hồi đạt từ 83 ÷ 90%

Đã khảo sát khoảng tuyến tính, lập đường chuẩn, xác định LOD, LOQ của phương pháp, thẩm định độ lặp lại, độ thu hồi

Tiến hành phân tích 40 mẫu thịt, gan, bầu dục lợn,

gà, ngan, vịt, tôm, cá…trên địa bàn thành phố Hà Nội

và không có mẫu nào phát hiện có penicillin G và V

Phương pháp HPLC phù hợp cho việc xác định

dư lượng Penicillin G và V trong thực phẩm.

Cảm ơ n cô v

à