Bài giảng Kỹ thuật cơ bản phân tích vi sinh vật trong thực phẩm - Trương Huỳnh Anh Vũ_1137949

YÊU CẦU CHUNG Các khu vực phải được tách biệt: - Nhận và bảo quản mẫu - Chuẩn bị mẫu - Cấy/kiểm tra mẫu - Ủ và cấy chuyền vi sinh vật - Bảo quản, cấy chủng chuẩn - Chuẩn bị và khử trùng

ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ, PHÂN LOẠI

VI SINH VẬT

ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA VI SINH VẬT

Tham gia quá trình tuần hoàn vật chất

trong tự nhiên: phân giải chất hữu cơ,

khởi đầu chuỗi thức ăn, tham gia chu

trình carbon, nitơ,…

Trong công nghiệp: tham gia vào qui

trình sản xuất các hợp chất như cồn, acid

hữu cơ, enzyme,…

Trong y học: vaccin, kháng sinh, vitamin,

hormon,…

Vi sinh vật là nguyên nhân gây ra các căn bệnh

chết người: thương hàn, dịch hạch, ung thư,…

Là tác nhân gây bệnh cho người, động/thực vật

THIẾT KẾ PHÒNG THỬ NGHIỆM

VI SINH VẬT

Không được ảnh hưởng đến độ tin

cậy của phép phân tích.

Tránh nguy cơ tạp nhiễm chéo Các

cách để đạt được mục tiêu đó là:

a) xây dựng phòng thử nghiệm theo

nguyên tắc “đường một chiều”

b) thực hiện phòng ngừa thích hợp để

đảm bảo phép thử và độ nguyên vẹn của

mẫu (ví dụ: sử dụng các hộp chứa được

hàn kín)

c) tách riêng các hoạt động theo thời

YÊU CẦU CHUNG

YÊU CẦU CHUNG

Để giảm nguy cơ nhiễm chéo:

a) Tường, trần và sàn nhà phải nhẵn, dễ rửa và

chịu được các chất tẩy rửa/chất khử trùng.

b) Sàn nhà không được trơn.

c) Mọi cấu trúc nổi phía trên cần được bọc kín

hoặc dễ làm vệ sinh định kỳ.

d) Các cửa ra vào và cửa sổ cần được đóng kín,

chống được bụi bám và dễ lau rửa.

e) Nhiệt độ môi trường (18°C – 27°C).

f) Môi trường phòng thử nghiệm cần được bảo

vệ chống bức xạ mặt trời ở phía ngoài.

g) Không sử dụng rèm che phía trong vì khó

làm vệ sinh và trở thành nguồn tích bụi.

YÊU CẦU CHUNG Các khu vực phải được tách biệt:

- Nhận và bảo quản mẫu

- Chuẩn bị mẫu

- Cấy/kiểm tra mẫu

- Ủ và cấy chuyền vi sinh vật

- Bảo quản, cấy chủng chuẩn

- Chuẩn bị và khử trùng môi trường nuôi cấy/dụng cụ

- Bảo quản môi trường nuôi cấy và thuốc thử

- Khử nhiễm,…

KỸ THUẬT TIỆT TRÙNG/KHỬ NHIỄM

1 Tiệt trùng bằng nhiệt khô

- Tiệt trùng các dụng cụ thủy tinh, đĩa petri,…

- 170 °C ± 10 °C hoặc tương đương, ít nhất 1 giờ.

2 Tiệt trùng bằng nhiệt ẩm (hơi nước)

- Tiệt trùng các dụng cụ thủy tinh, môi trường

nuôi cấy và vật liệu phòng thử nghiệm.

- Nhiệt độ 121 °C ± 3 °C, ít nhất 15 phút.

3 Tiệt trùng bằng phương pháp lọc

- Thường sử dụng cho các đối tượng không bền nhiệt

hoặc dễ mất hoạt tính khi tiếp xúc với nhiệt độ cao.

- Kích thước lỗ thường dùng 0.22, 0.45 µm

4 Khử nhiễm bằng các hợp chất hóa học

Sử dụng các hợp chất hóa học như các sản phẩm chứa clo,

cồn, các hợp chất amoni bậc bốn,… ở nồng độ thích hợp

và để tiếp xúc với dụng cụ trong một thời gian phù hợp.

Đảm bảo rằng dư lượng hóa chất không ảnh hưởng đến sự

phục hồi của các vi sinh vật.

5 Khử nhiễm bằng tia UV

Tia UV (tia cực tím) là sóng điện từ nằm trong phổ điện từ giữa ánh sáng nhìn

thấy và tia X Theo ISO 21348 tia UV được chia thành ba loại như sau:

- Tia UVA (400nm÷315nm; 3.1÷3.94eV) UV gần

- Tia UVB (280nm÷315nm; 3.94÷4.43eV) UV trung

- Tia UVC (180nm÷280nm; 4.43÷12.4eV) UV xa

MỘT SỐ THIẾT BỊ VÀ

DỤNG CỤ CƠ BẢN

TỦ AN TOÀN SINH HỌC

Không nên sử dụng đầu đốt khí hoặc đèn cồn trong tủ.

Sử dụng các dụng cụ dùng một lần (que cấy vòng, pipet, v.v ) là sự lựa chọn thích hợp.

Cần để các tủ càng xa các thiết bị khác càng tốt.

Bố trí thiết bị và vật liệu để giảm thiểu xáo trộn luồng không khí tại khoang làm việc.

CÂN PHÂN TÍCH

Cân chủ yếu được sử dụng để cân mẫu thử, môi

trường nuôi cấy và thuốc thử.

Ngoài ra, cân có thể được sử dụng để đo các thể

tích dịch pha loãng theo khối lượng.

Độ chính xác của cân cần đạt dung sai 1% nhưng

phải đủ để đạt được dung sai tối đa 5% khối

lượng, trừ khi có quy định khác.

Ví dụ: Để cân 10g, thì cân cần có khả năng đọc đến

0,1 g.

Để cân 1g, thì cân cần có khả năng đọc đến 0,01 g.

Đặt cân trên một mặt phẳng nằm ngang ổn định,

điều chỉnh nếu cần để đảm bảo mức thăng bằng,

chống rung và xê dịch.

BỘ ĐỒNG HÓA/MÁY DẬP MẪU

Được sử dụng để chuẩn bị huyền phù ban đầu từ mẫu thử nghiệm

Không sử dụng đối với một số loại thực phẩm như:

- Có nguy cơ làm thủng túi (có mặt các hạt sắc nhọn, cứng hoặc khô)

- Các sản phẩm khó đồng hóa do cấu trúc của chúng (ví dụ: xúc xích dạng salami)

Các máy trộn rung có thể được sử dụng cho hầu hết các loại thực phẩm, bao

gồm các sản phẩm cứng/khô Thông thường thời gian hoạt động là từ 0,5 min

đến 1 min Nếu các vi sinh vật có thể nằm sâu bên trong cấu trúc thì cần cắt mẫu

thành từng miếng nhỏ trước khi xử lý.

Được sử dụng để đo chênh lệch điện thế, tại nhiệt độ xác định.

Phải có khả năng đọc được đến 0,01 đơn MÁY ĐO pH

Để khử trùng môi trường nuôi cấy, dụng cụ thử nghiệm,

Không sử dụng nồi hấp áp lực để tiệt trùng các dụng cụ sạch (hoặc các môi trường nuôi cấy) đồng thời với dụng

cụ (hoặc môi trường nuôi cấy) đã qua sử dụng.

Tốt nhất là sử dụng các nồi hấp áp lực riêng biệt cho hai quá trình này.

Sau khi hấp khử trùng, tất cả các vật liệu và dụng cụ phải được làm nguội trong nồi hấp, trước khi lấy ra.

Vì lý do an toàn, không lấy sản phẩm

ra khỏi nồi hấp áp lực khi nhiệt độ chưa giảm xuống dưới 80°C.

NỒI HẤP ÁP LỰC

TỦ ẤM

Các tủ ấm phải điều chỉnh nhiệt độ hoặc các

thông số khác được đồng đều và ổn định.

Nếu nhiệt độ môi trường xung quanh cao hơn

TỦ LẠNH/TỦ ĐÔNG

Tủ lạnh

Để tránh nhiễm chéo, bảo quản các mẫu vật

riêng rẽ ở các ngăn khác nhau:

- Môi trường chưa nuôi cấy và thuốc thử;

- Các mẫu thử nghiệm;

- Các chủng chuẩn vi sinh vật làm việc.

Việc để sản phẩm vào tủ lạnh được bố trí sao

cho không khí lưu thông thích hợp và giảm

thiểu khả năng lây nhiễm chéo.

Tủ đông

Tủ đông lạnh, nhiệt độ phải thấp dưới -15°C, tốt

nhất là dưới -18°C.

Tủ đông sâu, nhiệt độ phải thấp dưới -70°C.

Sử dụng để bảo quản các vi sinh vật, các chủng

làm việc/chủng chuẩn và các thuốc thử.

KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

VI SINH VẬT

YÊU CẦU CHUNG

Môi trường nuôi cấy được dùng cho

việc tăng sinh, phân lập, cấy chuyền và

định danh vi sinh vật.

Phân loại môi trường theo thành phần

• Môi trường tự nhiên

• Môi trường tổng hợp

• Môi trường bán tổng hợp

Phân loại môi trường theo công dụng

• Môi trường tiền tăng sinh

• Môi trường tăng sinh chọn lọc

• Môi trường phân lập

• Môi trường thử nghiệm sinh hóa

Thành phần: nước, thạch, nguồn

cacbon, đạm, vi khoáng, chất ức chế

tăng trưởng, kháng sinh, chỉ thị,…

ĐỐI VỚI NƯỚC

Chỉ sử dụng nước tinh khiết hoặc nước có

chất lượng tương đương không chứa các chất

gây ức chế/ảnh hưởng đến sự phát triển của

vi sinh vật trong các điều kiện thử nghiệm, ví

dụ: tồn dư clo, amoniac và ion kim loại.

Nước phải được bảo quản trong vật chứa có

nắp đậy kín làm bằng vật liệu trơ (thủy tinh

trung tính, polyetylen v.v ) không chứa các

chất gây ức chế.

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

ĐỐI VỚI AGAR

Agar (thạch) là tác nhân gây đông đặc để

tạo môi trường rắn nuôi cấy vi sinh vật.

Ưu điểm cơ bản của agar là rất nhiều loài

vi sinh vật không sử dụng làm cơ chất

ĐỐI VỚI NITƠ HỮU CƠ

Peptone

Peptone là sản phẩm phân giải trung gian của protein, dùng làm môi trường

nuôi cấy vi sinh vật dị dưỡng

Peptone trypticase là sản phẩm phân giải casein bằng pancreatin

Phytone hay peptone papainic được trích xuất từ đậu nành

Peptone thịt là sản phẩm phân giải thịt bằng pepsin

Cao nấm men (Yeast extract)

Cao nấm men rất giàu các loại axit amin, vitamin, tạo điều kiện phát triển

tốt cho nhiều loại vi sinh vật

Cao nấm men được điều chế bằng cách đông khô dung dịch ly trích từ nấm

men đã qua quá trình tự phân

Cao thịt (Meat extract)

Được chế từ thịt đã loại bỏ gân, mỡ và xử lý sơ bộ bằng các enzym trước khi

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

ĐỐI VỚI CÁC CHẤT ỨC CHẾ CHỌN LỌC

Azide và sulfite : ức chế các trực khuẩn gram âm trong môi trường

chọn lọc Streptococcii.

Chất hoạt động bề mặt (Sodium Lauryl Sulphate, Sodium Dodecyl

Sulfate): ức chế phần lớn vi khuẩn tạp nhiễm trong môi trường canh

lauryl sulfate dung tăng sinh chọn lọc và sang lọc sơ bộ Coliforms.

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Các chế phẩm từ mật bò (Ox bile)

Mật bò: làm giảm sức căng bề mặt tại vùng tiếp xúc giữa màng và môi trường, kích thích men

autolysin nội bào dẫn đến sự phân giải màng tế bào.

• Thường dùng làm môi trường chọn lọc hoặc phân lập do khả năng kích thích sự phát triển

của hệ vi sinh vật đường ruột và ức chế các vi khuẩn gram dương.

Hỗn hợp muối mật (Bile salts): là hỗn hợp muối Na của các acid có trong mật bò (cholic,

taurocholic, desoxycholic,…) tác dụng giống như mật bò nhưng hoạt tính cao hơn và được dùng

với nồng độ thấp hơn Trong đó desoxycholate và taurocholate là 2 hợp chất có khả năng phân

giải màng mạnh nhất.

Sodium desoxycholate: là chế phẩm muối mật được dùng nhiều trong môi trường chọn lọc hoặc

phân lập vi khuẩn đường ruột, gram âm.

ĐỐI VỚI CƠ CHẤT PHẢN ỨNG SINH HÓA

Những cơ chất thường dùng là các loại đường như

lactose, glucose, saccharose, fructose, maltose,

arabinose, xylose, galactose, raffinose, melibiose,

glycerine, mannitol, sorbitol, adonitol, … với nồng

độ khoảng 0,5 – 1%.

Các vi sinh vật sẽ tạo ra enzym phân giải hoặc

biến đổi những chất trong môi trường thành chất

mới, các chất mới được nhận diện bằng thuốc thử

hoặc thay đổi pH qua những chất chỉ thị màu

thích hợp.

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

KỸ THUẬT PHÂN TÍCH

CƠ BẢN VI SINH VẬT

KỸ THUẬT PHA LOÃNG

KỸ THUẬT ĐỔ/TRÃI ĐĨA

KỸ THUẬT CẤY RIA/CẤY ĐÂM SÂU

KỸ THUẬT LỌC MÀNG

KỸ THUẬT MPN

KỸ THUẬT CRYOBANK BẢO QUẢN CHỦNG CHUẨN

Gồm các hạt sứ, xốp, rỗng tự nhiên đã được sử lý

với axit và chất lưu trữ lạnh phù hợp

(cryopreservative fluid) tạo điều kiện cho tế bào của

vi khuẩn dễ dàng bám lên bề mặt của các hạt.

CÁCH SỬ DỤNG PIPET

1

http://nihe.org.vn/vn/tin-tuc-su-kien/dao-tao/dao-tao-ngan-han-

tap-huan/ky-thuat-pha-che-moi-truong-nuoi-cay-phan-lap-vi-khuan-c12326i14680.htm

2 ISO 7218:2007/Amd.1:2013 Microbiology of food and animal

feeding stuffs — General requirements and guidance for

microbiological examinations AMENDMENT 1

3 F Power, P Pell, and P Sneath, 1978 A simple method for storage

of bacteria at −76°C J Appl Bacteriol 44:313-316.

4

http://www.mastgrp.biz/MASTD_en/MIBI-Fly-291XXX-Cryobank-Rekultivierungsstudie-e.pdf

5 https://www.idexx.com/en/water/water-products-services/colisure/

6 https://www.idexx.com/en/water/water-products-services/colilert/

7 Một số hình ảnh sử dụng trong tài liệu được trích dẫn từ nhiều

nguồn từ internet khác nhau.

TÀI LIỆU THAM KHẢO