khảo sát trực khuẩn gram âm tiết men kháng β lactam và sự đề kháng kháng sinh

57 Biểu đồ 3.7 Tỷ lệ tiết men kháng -lactam của các trực khuẩn Gram âm thường được phân lập trong 3 loại bệnh phẩm ..... Vì vậy việc điều trị nhiễm khuẩn do VK tiết men carbapenemase là

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VÀ

SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được aicông bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Đề tài đã được chấp thuận về mặt đạo đức trong nghiên cứu từ Hội đồngĐạo đức trong nghiên cứu y sinh học Đại Học Y Dược TP.HCM

LƯƠNG HỒNG LOAN

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC TÊN KHÁNG SINH VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Tác nhân vi khuẩn thường gặp gây nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn hô hấp dưới và nhiễm khuẩn niệu 4

1.1.1 Nhiễm khuẩn huyết 4

1.1.2 Nhiễm khuẩn hô hấp dưới 4

1.1.3 Nhiễm khuẩn niệu 5

1.2 Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh 5

1.2.1 Khái niệm thuốc kháng sinh 5

1.2.2 Cơ chế tác động của kháng sinh 6

1.2.3 Cơ chế đề kháng kháng sinh 8

1.2.4 Tình hình đề kháng kháng sinh hiện nay của trực khuẩn Gram âm 11 1.3 Kháng sinh -lactam và men kháng -lactam 13

1.3.1 Kháng sinh -lactam 13

1.3.2 Sơ lược về men β-lactamase 16

1.3.3 Men -lactamase phổ rộng (ESBL) 20

1.3.4 Men β-lactamase AmpC 22

1.3.5 Men carbapenemase 25

1.3.6 Tình hình nhiễm trực khuẩn Gram âm tiết men β-lactamase phổ rộng, β-lactamase AmpC, carbapenemase hiện nay 29

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 32

2.1 Thiết kế nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu 32

2.1.1 Dân số mục tiêu 32

2.1.2 Dân số chọn mẫu 32

2.1.3 Kỹ thuật chọn mẫu 32

2.1.4 Tiêu chuẩn chọn vào 32

2.1.5 Tiêu chuẩn loại ra 32

2.1.6 Thiết kế nghiên cứu 32

2.2 Các kỹ thuật xét nghiệm Vi sinh 33

2.2.1 Lấy bệnh phẩm, cấy phân lập, định danh và kháng sinh đồ 33

2.2.2 Phát hiện ESBL 33

2.2.3 Phát hiện AmpC 34

2.2.4 Phát hiện kháng/trung gian với carbapenem 34

2.2.5 Xác định và phân lớp carbapenemase 35

2.3 Biến số nghiên cứu 37

2.4 Thu thập dữ liệu 38

2.4.1 Phương pháp thu thập dữ liệu 38

2.4.2 Công cụ thu thập dữ liệu 38

2.5 Phân tích dữ liệu 38

2.6 Sơ đồ tóm tắt các công việc trong nghiên cứu 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 40

3.1 Đặc điểm dịch tễ và lâm sàng 40

3.2 Tác nhân phân lập được và đặc tính tiết các men kháng thuốc ESBL, AmpC, carbapenemase 41

3.2.1 Máu 41

3.2.2 Đàm 45

3.2.3 Nước tiểu 49

3.2.4 Tổng 53

3.3 Tính đề kháng kháng sinh của một số chủng vi khuẩn phân lập được 62 3.3.1 Escherichia coli 62

3.3.2 Klebsiella pneumoniae 66

3.3.3 Pseudomonas aeruginnosa 70

3.3.4 Acinetobacter baumannii 73

3.3.5 Trực khuẩn Gram âm đường ruột theo lớp carbapenemase 75

3.3.6 Acinetobacter baumannii theo lớp carbapenemase 77

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 79

4.1 Đặc điểm dịch tễ và lâm sàng 79

4.2 Tác nhân phân lập được và đặc tính tiết các men kháng thuốc ESBL, AmpC, carbapenemase 79

4.2.1 Máu 79

4.2.2 Đàm 81

4.2.3 Nước tiểu 82

4.2.4 Tổng 83

4.3 Tính đề kháng kháng sinh của một số chủng vi khuẩn phân lập được 87 4.3.1 Escherichia coli 87

4.3.2 Klebsiella pneumoniae 88

4.3.3 Pseudomonas aeruginosa 89

4.3.4 Acinetobacter baumannii 90

KẾT LUẬN 92

KIẾN NGHỊ 95

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BP Breakpoint (Điểm gãy)

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

ESBL Extended spectrum β-lactamase (β-lactamase phổ rộng)EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

mCIM Modified Carbapenem Inactivation Method

MBL Metallo-β-lactamase

MHA Mueller Hinton Agar

MIC Minimum Inhibitory Concentration

PABA p-aminobenzoic acid

PBP Penicillin binding protein

PCR Polymerase chain reaction

SIM Sulfide Indole Motility

DANH MỤC TÊN KHÁNG SINH VIẾT TẮT

AMK AmikacinATM AztreonamCAZ CeftazidimeCFZ CefazolinCIP CiprofloxacinCRO Ceftriaxone

CS Cefoperaxone-sulbactamCST Colistin

CTX CefotaximeCXM CefuroximeCZA Ceftazidime-avibactamDOR Doripenem

ETP ErtapenemFEP CefepimeFOF FosfomycinFOX CefoxitinGEN GentamicinIPM ImipenemLVX LevofloxacinMEM MeropenemMIN MinocyclinNET NetilmicinNIT NitrofurantoinNOR NorfloxacinSAM Ampicillin-sulbactamSXT Trimethoprim-sulfamethoxazoleTGC Tygecycline

TZP Piperacillin-tazobactam

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Cơ chế đề kháng KS ở một số VK quan trọng trong lâm sàng 10

Bảng 1.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh của trực khuẩn Gram âm gây nhiễm khuẩn bệnh viện 12

Bảng 1.3 Phân loại β-lactam 15

Bảng 1.4 Phân loại -lactamase theo cấu trúc và chức năng 19

Bảng 2.1 Điểm gãy xác định kháng/trung gian với meropenem của các loại VK 34

Bảng 3.1 Người bệnh và trực khuẩn Gram âm phân lập được 40

Bảng 3.2 Tỷ lệ các loài trực khuẩn Gram âm phân lập được trong máu 41

Bảng 3.3 Tỷ lệ tiết ESBL và AmpC của các trực khuẩn Gram âm trong máu 42

Bảng 3.4 Tỷ lệ tiết carbapenemase của các trực khuẩn Gram âm trong máu 43

Bảng 3.5 Tỷ lệ các lớp carbapenemase theo loài vi khuẩn trong máu 44

Bảng 3.6 Tỷ lệ các loài trực khuẩn Gram âm phân lập được trong đàm 45

Bảng 3.7 Tỷ lệ tiết ESBL và AmpC của các trực khuẩn Gram âm trong đàm 46

Bảng 3.8 Tỷ lệ tiết carbapenemase của các trực khuẩn Gram âm trong đàm 47

Bảng 3.9 Tỷ lệ các lớp carbapenemase theo loài vi khuẩn trong đàm 48

Bảng 3.10 Tỷ lệ các loài trực khuẩn Gram âm phân lập được trong nước tiểu 49

Bảng 3.11 Tỷ lệ tiết ESBL và AmpC của các trực khuẩn Gram âm trong nước tiểu 50

Bảng 3.12 Tỷ lệ tiết carbapenemase của các trực khuẩn Gram âm trong nước tiểu 51

Bảng 3.13 Tỷ lệ các lớp carbapenemase theo loài vi khuẩn trong nước tiểu 52

Bảng 3.14 Tỷ lệ các loài trực khuẩn Gram âm phân lập được trong 3 loại bệnh phẩm 54

Bảng 3.15 Tỷ lệ tiết ESBL và AmpC của các trực khuẩn Gram âm trong 3 loại bệnh phẩm 56

Bảng 3.16 Tỷ lệ loài vi khuẩn tiết carbapenemase trong nghiên cứu 58

Bảng 3.17 Tỷ lệ tiết carbapenemase của các trực khuẩn Gram âm trong 3 loại bệnh phẩm 59

Bảng 3.18 Tỷ lệ các lớp carbapenemase theo loài vi khuẩn trong 3 loại bệnh phẩm 61

Bảng 3.19 Tỷ lệ kháng kháng sinh của E coli trong 3 loại bệnh phẩm 63

Bảng 3.20 Tỷ lệ kháng kháng sinh của E coli theo đặc tính tiết ESBL 64

Bảng 3.21 Tỷ lệ kháng kháng sinh của E coli theo đặc tính tiết AmpC 65

Bảng 3.22 Tỷ lệ kháng kháng sinh của E coli theo đặc tính tiết carbapenemase 66

Bảng 3.23 Tỷ lệ kháng kháng sinh của K pneumoniae trong 3 loại bệnh phẩm 67

Bảng 3.24 Tỷ lệ kháng kháng sinh của K pneumoniae theo đặc tính tiết ESBL 68

Bảng 3.25 Tỷ lệ kháng kháng sinh của K pneumoniae theo đặc tính tiết AmpC 69

Bảng 3.26 Tỷ lệ kháng kháng sinh của K pneumoniae theo đặc tính tiết carbapenemase 70

Bảng 3.27 Tỷ lệ kháng kháng sinh của P aeruginosa trong 3 loại bệnh phẩm 71

Bảng 3.28 Tỷ lệ kháng kháng sinh của P aeruginosa theo đặc tính tiết AmpC 72

Bảng 3.29 Tỷ lệ kháng kháng sinh của P aeruginosa theo đặc tính tiết carbapenemase 72

Bảng 3.30 Tỷ lệ kháng kháng sinh của A baumannii trong 3 loại bệnh phẩm 74

Bảng 3.31 Tỷ lệ kháng kháng sinh của A baumannii theo đặc tính tiết carbapenemase 75

Bảng 3.32 Tỷ lệ kháng KS của trực khuẩn Gram âm đường ruột theo lớp carbapenemase 76

Bảng 3.33 So sánh tỷ lệ kháng ceftazidime-avibactam của trực khuẩn Gram âm đường ruột theo lớp carbapenemase 77

Bảng 3.34 Tỷ lệ kháng KS của A baumannii theo lớp carbapenemase 78

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Vị trí tác động của các nhóm kháng sinh thường dùng 8

Hình 1.2 Phương pháp kiểu hình phát hiện AmpC 25

Hình 1.3 Phân bố các loại carbapenemase thường gặp theo khu vực địa lý 27

Hình 2.1 Chuẩn bị huyền dịch ID broth, AST broth và panel NMIC500 CPO 36

Hình 2.2 Cho panel vào máy Phoenix BD 36

Hình 2.3 Kết quả của thử nghiệm xác định và phân lớp carbapenemase 37

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ tiết men kháng β-lactam của các trực khuẩn Gram âm thường được phân lập trong máu 45

Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ tiết men kháng β-lactam của các trực khuẩn Gram âm thường được phân lập trong đàm 49

Biểu đồ 3.5 Tỷ lệ tiết men kháng β-lactam của các trực khuẩn Gram âm thường được phân lập trong nước tiểu 53

Biểu đồ 3.6 Tỷ lệ trực khuẩn Gram âm tiết carbapenemase trong số kháng/trung gian carbapenem 57

Biểu đồ 3.7 Tỷ lệ tiết men kháng -lactam của các trực khuẩn Gram âm thường được phân lập trong 3 loại bệnh phẩm 60

Biểu đồ 3.8 Tỷ lệ các lớp carbapenemase theo loài vi khuẩn 61

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, tình trạng vi khuẩn (VK) đề kháng với kháng sinh (KS) đangtrở thành một mối đe dọa cho sức khỏe của con người Với tình trạng sử dụng KSrộng rãi, áp lực chọn lọc lên VK gia tăng làm những cơ chế đề kháng mới xuấthiện và các VK đề kháng KS lan rộng trên toàn thế giới

Năm 2017, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đưa ra danh sách tác nhân ưu tiên chonghiên cứu và phát triển các KS mới, trong đó ba tác nhân ưu tiên hàng đầu là ba

loại trực khuẩn Gram âm: A baumannii kháng carbapenem, P aeruginosa kháng

carbapenem và trực khuẩn Gram âm đường ruột kháng cephalosporin thế hệIII[75] Sự tiết các men phá hủy KS là cơ chế kháng thường gặp nhất của VKGram âm Trong đó, -lactamase phổ rộng (ESBL), β-lactamase AmpC vàcarbapenemase được quan tâm nhiều nhất vì chúng thủy phân được hầu hết các

KS họ β-lactam như penicillin, cephalosporin, monobactam và kể cảcarbapenem Các KS thuộc họ β-lactam là KS quan trọng trong điều trị các bệnhnhiễm khuẩn, vì thế việc xác định VK tiết ra các loại β-lactamase trên là rất cầnthiết cho lâm sàng, khảo sát dịch tễ học và kiểm soát các chủng VK kháng thuốc

Trên thế giới cũng như tại Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về trực khuẩnGram âm tiết men -lactamase phổ rộng (ESBL), β-lactamase AmpC vàcarbapenemase bằng các phương pháp xác định kiểu hình và kiểu gien Cácnghiên cứu đã cho thấy tỷ lệ VK tiết các men trên thay đổi tùy theo thời gian,khu vực địa lý và quốc gia[74] Vì thế, tỷ lệ VK tiết ra các men kháng β-lactam

và tình hình kháng KS của chúng cần được nghiên cứu và cập nhật thường xuyên

để có những chiến lược hành động phù hợp trong tương lai

Ngoài ra, cho đến hiện nay, các KS nhóm carbapenem được xem nhưhàng rào cuối cùng trong điều trị các VK Gram âm kháng thuốc, nhất là các VKtiết ESBL Vì vậy việc điều trị nhiễm khuẩn do VK tiết men carbapenemase làmột thách thức trên lâm sàng vì các men này có khả năng phân hủy hầu hết các

KS họ β-lactam, kể cả carbapenem; các VK mang gien tiết carbapenemasethường đi kèm các gien đề kháng các KS nhóm khác, làm cho VK trở thành tácnhân đa kháng, toàn kháng Hiện tại, vẫn chưa có phương pháp nào được xem là

tối ưu trong việc điều trị nhiễm khuẩn do VK kháng carbapenem Một số giảipháp được đưa ra như sử dụng các nhóm KS cũ, tối ưu hóa liều dùng, kết hợpKS; trong đó có sử dụng thế hệ mới của phối hợp β-lactam/chất ức chế β-lactamase là ceftazidime-avibactam[60],[57] Avibactam là một chất ức chế β-lactamase thế hệ mới, có tác dụng ức chế β-lactamase nhóm serine, chủ yếu là β-lactamase lớp A, C và một số β-lactamase lớp D, bao gồm cả các carbapenemase.Nhờ đó, ceftazidime-avibactam có hiệu quả trên các trực khuẩn Gram âm đườngruột tiết men β-lactamase lớp A, C và một số men lớp D, không hiệu quả với menβ-lactamase lớp B[36] Vì vậy, việc xác định và phân lớp carbapenemase là cầnthiết và có ý nghĩa trong điều trị lâm sàng.

Vì thế, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm cung cấp những số liệumới nhất về tính kháng KS và tỷ lệ các trực khuẩn Gram âm tiết men -lactamasephổ rộng (ESBL), β-lactamase AmpC và carbapenemase từ các mẫu bệnh phẩmđược phân lập tại Bệnh Viện Đại Học Y Dược TP.HCM bằng phương pháp xácđịnh kiểu hình, đồng thời xác định tỷ lệ các lớp của carbapenemase Chúng tôi hivọng rằng những số liệu này sẽ bổ sung thêm thông tin về tình trạng VK kháng

KS, giúp ích cho việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn trên lâm sàng cũng nhưkiểm soát các VK kháng KS

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Xác định tỷ lệ các loại trực khuẩn Gram âm tiết β-lactamase phổ rộng(ESBL), β-lactamase AmpC và carbapenemase phân lập trong các loại bệnhphẩm máu, đàm, nước tiểu tại Bệnh Viện Đại Học Y Dược TP.HCM từ 11/2018đến 4/2019

2 Khảo sát sự đề kháng kháng sinh của một số trực khuẩn Gram âm phânlập trong các loại bệnh phẩm máu, đàm, nước tiểu tại Bệnh Viện Đại Học YDược TP.HCM từ 11/2018 đến 4/2019

Trực khuẩn Gram âm là tác nhân gây bệnh chiếm ưu thế trên lâm sàng, gấpkhoảng 3 lần các vi khuẩn Gram dương, có thể chiếm 71-79% tổng số vi khuẩn phânlập được[3],[30],[43].

1.1.1 Nhiễm khuẩn huyết

Nhiễm khuẩn huyết (sepsis) là tình trạng suy phủ tạng đe dọa tính mạng ngườibệnh, gây ra bởi sự rối loạn đáp ứng điều hòa của ký chủ đối với nhiễm khuẩn[64]

Du khuẩn huyết (bacteremie) là sự hiện diện của VK sống trong máu, được xác địnhbởi cấy máu dương tính Vì vậy, kết quả cấy máu dương tính có thể là biểu hiện củatình trạng nhiễm khuẩn huyết hoặc không[56]

Các VK gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp[6]:

- VK Gram âm: VK Gram âm đường ruột gồm Salmonella, Escherichia coli, Klebsiella, Serratia, Enterobacter,…; Pseudomonas aeruginosa; Burkholderia pseudomallei.

- VK Gram dương: Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus suis,…

- VK kị khí: Clostridium perfringens và Bacteroides fragilis.

1.1.2 Nhiễm khuẩn hô hấp dưới

Bệnh cảnh nhiễm khuẩn hô hấp dưới thường gặp nhất trên lâm sàng là viêmphổi Tác nhân gây bệnh viêm phổi khác nhau tùy theo độ tuổi và tình trạng củangười bệnh Các VK gây viêm phổi thường gặp là[56],[46]:

- Trẻ em từ 5-18 tháng: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, trẻ từ 3 tháng đến vị thành niên: Staphylococcus aureus, Mycoplasma pneumoniae.

- Người trẻ (18 đến 45 tuổi): M pneumoniae.

- Người già: S pneumoniae, Legionella spp.

- VK gây viêm phổi cộng đồng thường gặp: S pneumoniae, H influenzae, M catarrhalis, S aureus, K pneumoniae.

- VK gây viêm phổi bệnh viện thường gặp: S aureus, P aeruginosa, K pneumoniae, các Enterobacteriaceae khác (E coli, Enterobacter

spp., ), các trực khuẩn Gram âm dễ mọc khác

1.1.3 Nhiễm khuẩn niệu

Nhiễm khuẩn niệu có thể chỉ là tình trạng nhiễm khuẩn đường tiết niệu dưới(viêm bàng quang, viêm niệu đạo, ) hoặc nhiễm khuẩn cả đường tiết niệu trên (viêmthận-bể thận) và dưới[56]

E coli là tác nhân gây bệnh chiếm 80–90% các trường hợp nhiễm khuẩn niệu

dưới cấp đơn thuần ở phụ nữ trẻ Các trực khuẩn Gram âm đường ruột khác và

Staphylococcus saprophyticus cũng là tác nhân thường gặp ở nhóm người bệnh

này[46]

Ở những người bệnh nhiễm khuẩn niệu trên phức tạp, bất thường cấu trúc

đường tiết niệu hoặc đặt dẫn lưu đường tiểu, tác nhân gây bệnh đa dạng hơn E coli vẫn là VK thường gặp nhưng các trực khuẩn Gram âm khác (Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Pseudomonas, ), Enterococci, Staphylococci cũng là những tác nhân

gây bệnh phổ biến Trong nhiều trường hợp, có thể phân lập được nhiều tác nhân gâybệnh[46]

1.2 Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh

1.2.1 Khái niệm thuốc kháng sinh

Thuốc KS là những chất có tác động chống lại sự sống của VK, ngăn VK nhânlên bằng cách tác động ở mức phân tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạnchuyển hóa cần thiết của đời sống VK hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa[4]

KS có tác dụng đặc hiệu, nghĩa là một loại KS sẽ tác động lên một VK hay

một nhóm VK nhất định KS có phổ tác động khác nhau, một số có hoạt phổ rộng (cóhoạt tính với nhiều loại VK khác nhau), một số có hoạt phổ hẹp (chỉ có hoạt tính vớimột hay một số ít loại VK) KS có nguồn gốc khác nhau, có thể được tổng hợp bằngphương pháp hóa học, có thể được ly trích từ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật[4]

1.2.2 Cơ chế tác động của kháng sinh

Có thể chia làm 4 loại cơ chế[4],[45]:

có vách không hoàn chỉnh (spheroplast) Ở môi trường có trương lực bình thường,các hình thức này của VK dễ bị vỡ

Các KS penicillin và cephalosporin là những chất ức chế sự tổng hợp vách tếbào VK Giai đoạn tác động đầu tiên của thuốc là gắn vào các thụ thể penicillin-binding protein (PBP) Có ít nhất 3-6 thụ thể PBP, trong đó có một số là các enzymetranspeptidase Sau khi gắn vào thụ thể, thuốc sẽ phong bế transpeptidase, làm ngănchặn việc tổng hợp peptidoglycan, một thành phần quan trọng của vách tế bào Giaiđoạn tiếp theo liên quan đến việc hoạt hóa các enzyme tự tiêu, làm ly giải tế bào VK

D-1.2.2.2 Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào

Gồm các KS như amphotericin B, colistin, imidazole, nystatin, polymyxin,

Tế bào chất của tất cả tế bào sống đều được bao bọc bởi màng tế bào chất.Màng này được xem như một hàng rào thẩm thấu chọn lọc và vận chuyển chủ động,

qua đó kiểm soát các thành phần bên trong màng tế bào Khi sự toàn vẹn chức năngcủa màng tế bào chất bị phá vỡ, những đại phân tử và ion sẽ thoát khỏi tế bào làm tếbào chết Màng tế bào chất của VK và vi nấm có cấu trúc khác với màng tế bào chấtcủa động vật và dễ dàng bị phá hủy bởi một số tác nhân.

1.2.2.3 Ức chế sự tổng hợp protein

Gồm các KS như aminoglycoside (amikacin, gentamicin, kanamycin,neomycin, netilmicin, streptomycin, tobramycin, ), tetracycline, chloramphenicol,macrolide, lincomycin,

Các KS này ức chế sự tổng hợp protein của VK với cơ chế tác động khác nhaugiữa các loại KS

Các aminoglycoside có cơ chế tác động tương tự nhau Giai đoạn đầu, thuốcgắn vào thụ thể chuyên biệt trên tiểu đơn vị 30S của ribô thể Giai đoạn thứ 2, thuốcphong bế hoạt tính của phức hợp đầu tiên của quá trình tổng hợp chuỗi peptide Giaiđoạn 3, thông tin mRNA bị đọc sai ở vùng nhận diện của ribô thể, kết quả là mộtamino acid không phù hợp được đưa vào chuỗi peptide, tạo ra một protein không cóchức năng Giai đoạn 4, sự gắn của thuốc làm vỡ các polysome thành các monosomekhông có khả năng tổng hợp protein, tế bào VK bị giết

Tetracycline gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribô thể, ngăn chặn các amino acidmới nối vào chuỗi peptide mới thành lập

Chloramphenicol gắn vào tiểu đơn vị 50S của ribô thể, ức chế enzymepeptidyl transferase làm ngăn chặn các amino acid mới nối vào chuỗi peptide mớithành lập

Macrolide gắn vào tiểu đơn vị 50S của ribô thể ở vị trí 23S rRNA, ngăn cảnviệc thành lập phức hợp đầu tiên để tổng hợp chuỗi peptide

Sulfonamide có cấu trúc tương tự nên cạnh tranh với p-aminobenzoic acid(PABA), một chất biến dưỡng cần thiết để tổng hợp acid folic cho quá trình tổng hợpacid nucleic Kết quả là tạo ra những chất tương tự như acid folic nhưng không cóchức năng, làm cản trở sự phát triển của VK.

Trimethoprim ức chế enzyme dihydrofolic acid reductase, làm ức chế tổnghợp purine của DNA

Hình 1.1 Vị trí tác động của các nhóm kháng sinh thường dùng [56]

1.2.3 Cơ chế đề kháng kháng sinh

Có nhiều cơ chế khác nhau dẫn đến sự đề kháng KS ở VK

1.2.3.1 Tiết men phá hủy hoạt tính của KS

Staphylococci kháng penicillin G do sản xuất được β-lactamase, một số trực

khuẩn Gram âm cũng sản xuất được men này

VK Gram âm kháng aminoglycoside do tiết các men adenylylase,phosphorylase hay acetylase, kháng chloramphenicol do tiết men chloramphenicolacetyltransferase

1.2.3.2 Thay đổi khả năng thẩm thấu của màng tế bào đối với KS

Tetracycline tích tụ bên trong những VK nhạy cảm, trong khi ở những VK đềkháng thì thuốc không tích tụ bên trong tế bào được.

Các VK kháng polymyxin, amikacin và một số aminoglycoside khác cũng dothiếu khả năng thẩm thấu của màng tế bào

1.2.3.3 Thay đổi cấu trúc điểm gắn của KS

Một số VK kháng aminoglycoside do đột biến nhiễm sắc thể, làm mất hoặcthay đổi một loại protein đặc biệt ở tiểu đơn vị 30S của ribô thể, được sử dụng nhưđiểm gắn của thuốc ở những VK nhạy cảm

Những VK kháng erythromycin do thụ thể trên tiểu đơn vị 50S bị thay đổi,kháng penicillin do mất hoặc thay đổi các PBP

1.2.3.4 Thay đổi đường biến dưỡng làm mất tác dụng của thuốc

Một số VK kháng sulfonamide, không còn cần PABA ở ngoài tế bào để tổnghợp acid folic mà có thể sử dụng acid folic có sẵn cho quá trình biến dưỡng

1.2.3.5 Thay đổi men biến dưỡng làm mất tác dụng của thuốc

Các men biến dưỡng vẫn thực hiện được chức năng nhưng ít bị ảnh hưởng bởi

KS so với men ở VK nhạy cảm Ví dụ như ở VK nhạy cảm với sulfonamide, mentetrahydropteroic acid synthetase có ái lực với sulfonamide cao hơn nhiều so vớiPABA, còn ở VK kháng với sulfonamide do đột biến thì ngược lại

Bảng 1.1 Cơ chế đề kháng KS ở một số VK quan trọng trong lâm sàng [2]

Staphylococcus

spp.

resistant penicillin

Penicillinase-Protein gắn kết-PNC bị thay đổi

Ranh giới: Protein gắn kết-PNC

bị thay đổi; sự thay đổi của protein bình thường; sản xuất quá nhiều β-lactamase

gyrase bị thay đổi

Enterococcus spp β-lactam Protein gắn kết-PNC có ái

Enterobacteriaceae β-lactam Khuếch tán kém hoặc porin

bị thay đổi

Protein gắn kết-PNC bị thay đổi; động lực proton thấp; β- lactamase phổ rộng

bị thay đổi; men biến đổi aminoglycoside

Đích men bị thay đổi

Pseudomonas β-lactam Khuếch tán kém hoặc porin

bị thay đổi

Protein gắn kết-PNC bị thay đổi; động lực proton thấp; β- lactamase phổ rộng

bị thay đổi; men biến đổi aminoglycoside

đổi

Vận chuyển xuyên màng ngoài

bị thay đổi

1.2.4 Tình hình đề kháng kháng sinh hiện nay của trực khuẩn Gram âm

1.2.4.1 Trên thế giới

Các báo cáo trong giai đoạn 2003-2014 ở Mỹ và châu Âu cho thấy sau mộtthập niên có tỷ lệ tăng cao, tỷ lệ kháng cephalosporin thế hệ III của

Enterobacteriaceae hiện trên 10%, ở một số nơi có thể lên đến 70% Đó là hậu quả

do sự lan truyền nhanh chóng của các VK tiết ESBL Hiện nay, sự gia tăng của

Enterobacteriaceae kháng carbapenem đang gây ra mối bận tâm lớn, tỷ lệ này khoảng 2-7% ở các Đơn vị Hồi sức tích cực ở Mỹ và châu Âu Tỷ lệ Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem trên 25% ở một số nước Nam Âu như Ý và Hy Lạp.

Tỷ lệ P aeruginosa kháng ceftazidime và carbapenem hiện khoảng 20-40%, tỷ lệ P aeruginosa đa kháng và kháng mở rộng lần lượt là 13% và 4% Tỷ lệ kháng KS ở A baumannii cũng tăng cao, khoảng 40-70% kháng carbapenem ở các Đơn vị Hồi sức

tích cực[66]

Tại châu Á, mạng lưới giám sát KS của Trung Quốc báo cáo năm 2018 cho

thấy E coli vẫn còn nhạy cảm với carbapenem với tỷ lệ kháng dưới 5% Tỷ lệ Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem, đặc biệt là chủng phân lập từ dịch não tủy, gia tăng nhanh chóng từ 18,6 lên 64,1% Tỷ lệ Pseudomonas aeruginosa kháng

carbapenem gần 30% ở máu, nước tiểu và bệnh phẩm đường hô hấp dưới nhưng lênđến 60% ở dịch não tủy[43]

Bảng 1.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh của trực khuẩn Gram âm gây nhiễm khuẩn bệnh viện[66]

Nghiên cứu INICC a SENTRY b ANSRPRG c EARS-NET d Khu vực địa lý Đa quốc gia (36

Khoa hồi sức tích cực và khoa khác

Khoa hồi sức tích cực và khoa khác

Loại nhiễm khuẩn bệnh

viện

Viêm phổi thở máy và nhiễm khuẩn liên quan đến catheter

Tất cả Viêm phổi Nhiễm khuẩn huyết

a: International Nosocomial Infection Control Consortium (INICC)

b: Antimicrobial susceptibility of Gram-negative organisms isolated from patients hospitalized in intensive care units in United States and European hospitals (SENTRY)

c: High prevalence of multidrug-resistant nonfermenters in hospital-acquired pneumonia in Asia (ANSRPRG) d: European Antimicrobial Resistance Surveillance (EARS-Net)

1.2.4.2 Tại Việt Nam

Đông Á và Đông Nam Á được coi là khu vực có tỷ lệ trực khuẩn Gram âmkháng KS cao nhất trên thế giới Trong đó, Việt Nam là quốc gia có tỷ lệ VK kháng

KS cao, tỷ lệ A baumannii kháng carbapenem từ 40-50%, K pneumoniae kháng

carbapenem từ 5-10%[42]

Ở miền Bắc, nghiên cứu của Đinh Vạn Trung tại BV Trung Ương Quân đội

108 năm 2017 cho tỷ lệ E coli kháng cephalosporin thế hệ III từ 60-68%, kháng

piperaciliin/tazobactam 7,7%, kháng meropenem 1,8%[29]

Ở miền Nam, nghiên cứu của Đinh Thị Xuân Mai tại BV Đa khoa Khu vực Củ

Chi năm 2017 cho kết quả E coli kháng cephalosporin thế hệ III từ 68-73%, kháng

levofloxacin 67%, kháng amikacin 8%, kháng cefoperaxone-sulbactam 5%, khángpiperaciliin/tazobactam 2%, kháng meropenem 3% K pneumoniae kháng

cephalosporin thế hệ III từ 39-50%, kháng levofloxacin 34%, kháng amikacin 6%,kháng cefoperaxone-sulbactam 7%, kháng piperaciliin/tazobactam 12%, khángmeropenem 4%[16]

Nghiên cứu của Chu Thị Hải Yến tại BV Cấp cứu Trưng Vương năm 2014

cho thấy tỷ lệ kháng của P aeruginosa: kháng ceftazidime 34%, kháng amikacin 72%, kháng cefoperaxone-sulbactam 19% Tỷ lệ kháng của A baumannii: kháng trên

80% đối với nhóm cephalosporin thế hệ III, kháng 81% với piperacillin-tazobactam,kháng 74% đối với amikacin Kháng thấp nhất đối với cefoperaxone-sulbactam (6%)[30]

1.3 Kháng sinh -lactam và men kháng -lactam

Các kháng sinh -lactam tác động vào quá trình tổng hợp vách tế bào VK dẫnđến tiêu diệt VK Quá trình này bắt đầu khi KS có tính ưa nước đi qua lớp màngngoài nhờ sự vận chuyển của các kênh porin, gắn vào các PBP như transpeptidase vàcarboxypeptidase, các men chịu trách nhiệm chuyển nhóm peptide trong quá trìnhtổng hợp peptidoglycan Khi đó, quá trình tổng hợp peptidoglycan bị xáo trộn, sựphân chia tế bào ngừng lại làm tế bào bị ly giải hoặc biến dạng, VK chết do khác biệt

áp suất thẩm thấu Tương tác giữa PBP với KS -lactam nhờ vào ái lực của cấu trúcvòng -lactam với vị trí hoạt động của PBP Vì vậy, sự hiện diện của vòng -lactam

là điều kiện cần thiết cho hoạt tính kháng khuẩn của các KS này[4],[21]

1.3.1.2 Phân loại β-lactam

Bảng 1.3 Phân loại β-lactam[37]

Penicillin Penicillin bị

thủy phân bởi penicillinase

Ampicillin Carboxypenicillin Carbenicillin

Ticarcillin

Mezlocillin

Piperacillin Penicillin không bị thủy phân bởi

penicillinase

Cloxacillin Dicloxacillin Methicillin

Nafcillin Oxacillin

-lactam phối

hợp

Amoxicillin-clavulanate Ampicillin-sulbactam Aztreonam-avibactam Cefepime-tazobactam Cefepime-zidebactam Ceftaroline-avibactam

Ceftazidime-avibactam Ceftolozane-tazobactam Imipenem-relebactam Meropenem-vaborbactam Piperacillin-tazobactam Ticarcillin-clavulanate

Ceftizoxime Ceftriaxone

Cefpodoxime Cefprozil Ceftibuten Cefuroxime Cephalexin Cephradine

Doripenem Ertapenem

Imipenem Meropenem Razupenem

Sulopenem

1.3.2 Sơ lược về men β-lactamase

Việc tiết ra các men lactamase là cơ chế đề kháng chủ yếu với KS họ lactam của trực khuẩn Gram âm Các men này bất hoạt KS β-lactam bằng cách mởvòng β-lactam, làm thủy phân KS Gien mã hóa cho các -lactamase có thể nằm trênnhiễm sắc thể hoặc trên plasmid Trong đó, các gien nằm trên plasmid được xem lànguyên nhân chính làm lan truyền tính kháng KS ở VK Đến cuối năm 2009, đã cótrên 890 loại β-lactamase được tìm ra[32],[63]

β-Hai hệ thống phân loại β-lactamase được sử dụng hiện nay là phân loại theochức năng của Bush-Jacoby-Medeiros và phân loại theo cấu trúc của Ambler

Phân loại theo cấu trúc được Ambler đề nghị vào năm 1980, dựa trên trình tựamino acid của phân tử protein, chia các β-lactamase thành 4 lớp A, B, C, D[32],[31]

- Các β-lactamase lớp A, C, D gồm những β-lactamase cần có serine ở vị tríhoạt động để thủy phân các KS penicillin, cephalosporin và monobactam

- Các β-lactamase lớp B gọi là metallo-β-lactamase vì cần có một kim loại hóatrị 2, thường là kẽm, ở vị trí hoạt động để phản ứng với nhóm carbonyl trongliên kết amide của hầu hết các penicillin, cephalosporin và carbapenem,nhưng không có tác động đối với monobactam

Phân loại theo chức năng do Bush-Jacoby đề nghị năm 1995 và chỉnh sửa năm

2009, dựa trên khả năng thủy phân các loại β-lactam tương ứng và đặc tính sinh hóacủa men, chia các β-lactamase thành 4 nhóm 1, 2, 3, 4 (năm 1995) hoặc 3 nhóm 1, 2,

3 (năm 2009), trong nhóm chia thành các phân nhóm[35],[63]

- Nhóm 1 là các cephalosporinase, tương ứng với lớp C trong phân loại củaAmbler Phần lớn các men này có gien mã hóa nằm trên nhiễm sắc thể, cácmen có gien mã hóa nằm trên plasmid ít phổ biến hơn Các men này thủyphân cephalosporin mạnh hơn benzylpenicillin, thủy phân cephamycin vàaztreonam nhưng không bị ức chế bởi acid clavulanic; thường gặp là các menAmpC: FOX, MOX, CMY, Phân nhóm 1e là những biến thể của các mennhóm 1, tác động mạnh hơn trên ceftazidime và các oxyimino-β-lactam khác

- Nhóm 2 là các penicillinase hoặc cephalosporinase, tương ứng với lớp A và

D trong phân loại của Ambler, là nhóm β-lactamase lớn nhất với sự xuất hiện

và ngày càng gia tăng của các men ESBL

 Phân nhóm 2a là các penicillinase có phổ tác động hẹp, thường gặp ở

VK Gram dương như Staphylococci và Enterococci.

 Phân nhóm 2b là các β-lactamase phổ rộng (broad-spectrum), có khảnăng thủy phân penicillin và các cephalosporin thế hệ đầu nhưcephalothin và cephradine Phân nhóm này bao gồm TEM-1, TEM-2,SHV-1, các men có gien mã hóa nằm trên plasmid được phát hiệnnhiều nhất trong những năm 1970 và đầu những năm 1980

 Phân nhóm 2be là các β-lactamase phổ mở rộng (extended-spectrum),

có khả năng thủy phân penicillin, cephalosporin thế hệ đầu, β-lactam như cefotaxime, ceftazidime và aztreonam Phân nhóm nàyrất lớn, bao gồm các biến thể của TEM-1, TEM-2, SHV-1 và các β-lactamase mới xuất hiện như CTX-M, PER, VEB, Các men này bị

oxyimino-ức chế bởi acid clavulanic, một đặc tính được sử dụng để phát hiệncác men trong phân nhóm 2be

 Phân nhóm 2br gồm các biến thể khác của TEM và SHV, kháng vớicác chất ức chế β-lactamase như acid clavulanic và sulbactam nhưngnhạy với tazobactam, phổ tác động tương tự phân nhóm 2b

 Phân nhóm 2ber gồm các men TEM, là phối hợp giữa phổ tác động mởrộng của phân nhóm 2be và tính kháng acid clavulanic

 Phân nhóm 2c là các penicillinase, có khả năng thủy phân carbenicillinmạnh hơn benzylpenicillin, bị ức chế bởi acid clavulanic vàtazobactam

 Phân nhóm 2ce là carbenicillinase phổ mở rộng, có phổ tác động mởrộng đối với cefepime và cefpirome

 Phân nhóm 2d là các oxacillinase (OXA), bất hoạt cloxacillin vàoxacillin mạnh hơn benzylpenicillin Hiện tại, OXA là họ lớn thứ haicủa β-lactamase, chỉ sau TEM

 Phân nhóm 2de là các men thủy phân cloxacillin và oxacillin, mở rộngphổ tác động với các oxyimino-β-lactam, nhưng không thủy phânđược carbapenem

 Phân nhóm 2df là các men OXA có hoạt tính thủy phân carbapenem.Gien mã hóa cho các men này được tìm thấy trên nhiễm sắc thể của

Acinetobacter baumannii, các gien OXA-23 và OXA-48 được tìm thấy trên plasmid của Enterobacteriaceae Các men carbapenemase

loại OXA thủy phân yếu carbapenem, tác động đối với imipenemnhanh và hiệu quả hơn đối với meropenem, thường không bị ức chếbởi acid clavulanic

 Phân nhóm 2e là các cephalosporinase thủy phân được cáccephalosporin phổ mở rộng và monobactam, bị ức chế bởi acidclavulanic và tazobactam

 Phân nhóm 2f là các carbapenemase hoạt động phụ thuộc serine, tươngứng với lớp A trong phân loại của Ambler, bị ức chế bởi tazobactamnhiều hơn acid clavulanic Các men SME và IMI-1 thủy phân yếucephalosporin phổ mở rộng như ceftazidime, thủy phân mạnhaztreonam Các men họ SME, IMI-1 và NMC-1 có gien mã hóa nằmtrên nhiễm sắc thể Các men KPC và một số men GES (trước đây gọi

là IBC) có gien mã hóa nằm trên plasmid

- Nhóm 3 là các metallo-β-lactamase (MBL) lớp B theo phân loại của Ambler.Khác với các serin β-lactamase, các metallo-β-lactamase không thủy phânmonobactam, không bị ức chế bởi acid clavulanic, nhưng bị ức chế bởiEDTA Những men này được chia thành các phân lớp B1, B2, B3 và cácphân nhóm 3a, 3b

 Phân nhóm 3a bao gồm các MBL có gien mã hóa nằm trên plasmid nhưIMP, VIM, được tìm thấy khắp nơi trên thế giới, chủ yếu ở các trực

khuẩn Gram âm không lên men đường và Enterobacteriaceae Các

men này thủy phân mạnh carbapenem, penicillin và cephalosporin

 Phân nhóm 3b là một nhóm nhỏ của MBL với các men thủy phâncarbapenem mạnh hơn penicillin và cephalosporin

- Nhóm 4 trước đây, là các penicillinase không thuộc lớp nào trong phân loạicủa Ambler

Bảng 1.4 Phân loại -lactamase theo cấu trúc và chức năng [35]

Lớp Ambler

CA hoặc TZB

EDTA

1 1 C Cephalosporin Không Không E coli AmpC,

P99, ACT-1,CMY-2, FOX-1,MIR-1

1e Không có C Cephalosporin Không Không GC1, CMY-37

Có Không TEM-3, SHV-2,

CTX-M-15,PER-1, VEB-12br 2br A Penicillin Không Không TEM-30, SHV-

102ber Không có A Cephalosporin

phổ mở rộng,monobactam

Không Không TEM-50

2c 2c A Carbenicillin Có Không PSE-1, CARB-32ce Không có A Carbenicillin,

cefepime

Có Không RTG-4

đổi

Không OXA-1, OXA-10

2de Không có D Cephalosporin

phổ mở rộng

Thayđổi

Không 11,

OXA-152df Không có D Carbapenem Thay

CcrA, IND-1

GOB-1, FEZ-13b 3 B (B2) Carbapenem Không Có CphA, Sfh-1Không

1.3.3 Men -lactamase phổ rộng (ESBL)

1.3.3.1 Định nghĩa

ESBL là những men thủy phân hầu hết các penicillin và cephalosporin, baogồm các hợp chất oxyimino-β-lactam (cefuroxime, cephalosporin thế hệ III và IV,aztreonam) nhưng không thủy phân được các cephamycin và carbapenem Phần lớncác ESBL thuộc lớp A β-lactamase và bị bất hoạt bởi các chất ức chế β-lactamase(acid clavulanic, sulbactam, tazobactam) cũng như bởi các diazabicyclooctanone(avibactam)[69]

1.3.3.2 Đặc điểm

Các men ESBL thuộc nhóm 2 theo Bush và cộng sự; phần lớn thuộc lớp A,một số ít thuộc lớp D theo Ambler; thường gặp nhất là các men loại TEM, SHV vàCTX-M Gien mã hóa các men này thường nằm trên plasmid và thường đi kèm vớicác gien kháng aminoglycoside, cotrimoxazole [34],[70],[59],[39]

ESBL loại TEM: TEM-1 được báo cáo đầu tiên vào năm 1965 ở vi khuẩn E.

coli phân lập từ người bệnh tên Temoneira tại Hy Lạp Các plasmid chứa TEM-1

được tìm thấy ở Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, TEM-1 có đặc tính thủy phân mạnh penicillin

và cephalosporin thế hệ I Các biến thể của TEM-1 như TEM-2 và TEM-13 có cùngđặc tính đề kháng, nên TEM-1, TEM-2 và TEM-13 chỉ là các -lactamase phổ rộng(broad-spectrum), không phải là ESBL Năm 1984 tại Pháp, gien CTX-1 nằm trên

nhiễm sắc thể của Klebsiella pneumoniae kháng cefotaxime được tìm thấy, sau này

được đặt tên là TEM-3 Năm 1982 tại Anh, gien TEM-12 nằm trên plasmid của

Klebsiella oxytoca kháng ceftazidime được tìm thấy Cho đến hiện tại, đã có hơn 100

biến thể của loại men này được mô tả và vẫn đang được cập nhật, các ESBL loạiTEM đều bắt nguồn từ TEM-1 và TEM-2 Các ESBL loại TEM thường gặp nhất ở

E coli và K pneumoniae, nhưng cũng có thể được phát hiện ở các VK Gram âm khác như Enterobacteriaceae (Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cancerogenus, Morganella morganii, Salmonella spp.) và Pseudomonas aeruginosa [59],[39].

ESBL loại SHV: β-lactamase loại SHV (Sulfhydryl reagent variable) xuất

hiện sau loại TEM SHV-2 với tính kháng ceftazidime và cefotaxime được phát hiện

ở Klebsiella ozaenae tại Đức năm 1983 là ESBL loại SHV đầu tiên được tìm ra; đây

là thể đột biến của SHV-1, β-lactamase chịu trách nhiệm cho sự đề kháng với

ampicillin qua trung gian plasmid ở Klebsiella pneumoniae Cho đến hiện tại, đã có

hơn 100 biến thể của loại men này được phát hiện khắp nơi trên thế giới Các ESBL

loại SHV được tìm thấy chủ yếu ở Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp.[39],[59].

ESBL loại CTX-M: Các gien mã hóa CTX-M được xác định có nguồn gốc từ

nhiễm sắc thể của một số loài thuộc giống Kluyvera, là các VK phân lập từ môi

trường và hiếm khi gây bệnh trên người CTX-1 là β-lactamase có khả năng thủy

phân cefotaxime, lần đầu tiên được phát hiện tại Munich (Đức) năm 1989 ở VK E coli Đó là loại ESBL không TEM, không SHV có sự tương đồng với TEM và SHV

dưới 40% Hiện tại, đã phát hiện được hơn 90 loại CTX-M, chia thành 5 phân nhómCTX-M1, CTX-M2, CTX-M8, CTX-M9 và CTX-M25 khác nhau ở một hoặc một

vài đột biến Các ESBL loại CTX được tìm thấy chủ yếu ở Salmonella enterica Typhimurium và E coli, nhưng cũng được phát hiện ở nhiều loài Enterobacteriaceae

khác[39],[34]

ESBL loại OXA (lớp D): Có khoảng 12 loại ESBL có nguồn gốc từ OXA-10,OXA-1 hoặc OXA-2 qua đột biến thay thế các amino acid Các ESBL này thường

gặp ở Pháp và Thổ Nhĩ Kỳ, chủ yếu được phát hiện ở Pseudomonas aeruginosa Hầu

hết các loại OXA đều giảm ức chế với acid clavulanic, đa số kháng ceftazidime,riêng OXA-17 kháng nhiều hơn với cefotaxime và cefepime[34],[59]

ESBL loại khác (lớp A): Các ESBL loại khác thuộc lớp A không phổ biến, chỉ

xuất hiện rải rác như PER-1 được phân lập ở Pseudomonas aeruginosa tại Thổ Nhĩ

Kỳ, Pháp và Ý; VER-1 và VER-2 được tìm thấy ở Đông Nam Á; VER-1 được phân

lập ở Acinetobacter spp tại Hàn Quốc và Thổ Nhĩ Kỳ; GES-1, GES-2 và IBC-2 được

tìm thấy ở Nam Phi, Pháp và Hy Lạp Một số khác hiếm gặp hơn chỉ phát hiện ở

Enterobacteriaceae như BES-1, IBC-1, SFO-1 và TLA-1[59].

1.3.3.3 Phương pháp phát hiện

Hiện tại, nhiều phòng xét nghiệm vi sinh đang áp dụng khuyến cáo của CLSI

để phát hiện VK sinh ESBL Tuy nhiên, CLSI chỉ có tiêu chuẩn xác định ESBL đối

với các VK Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca và Proteus

mirabilis Nhưng các gien mã hóa ESBL có khả năng lan truyền cao nên cũng cần

quan tâm đến việc phát hiện ESBL ở những VK khác[70]

Phát hiện kiểu hình ESBL theo khuyến cáo của CLSI[37]:

CLSI khuyến cáo phát hiện VK Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca và Proteus mirabilis tiết ESBL bằng 2 bước sàng lọc và xác định.

Xét nghiệm sàng lọc có mục đích khảo sát sự giảm nhạy cảm của VK với cáccephalosporin chỉ điểm như cefpodoxime, ceftazidime, aztreonam, cefotaxime vàceftriaxone bằng phương pháp khuếch tán trên thạch hoặc pha loãng kháng sinh Nếuđường kính vòng vô khuẩn nhỏ hơn hoặc bằng điểm gãy (BP: breakpoint) hay nồng

độ ức chế tối thiểu (MIC) lớn hơn hoặc bằng điểm gãy của một trong số các KS nàythì nghi ngờ VK có tiết ESBL và thực hiện xét nghiệm xác định

Xét nghiệm xác định ESBL dựa trên nguyên tắc là acid clavulanic có khả năng

ức chế các men ESBL, do đó sẽ làm cộng hưởng hoạt tính của các KS cephalosporin nếu có sự hiện diện của ESBL Nếu đường kính vòng vô khuẩn củamột hoặc hai đĩa kháng sinh có kết hợp với acid clavulanic ≥5 mm so với đĩa chỉchứa KS ceftazidime, cefotaxime hoặc MIC của một hoặc hai kháng sinh có kết hợpvới acid clavulanic ≥3 lần so với KS ceftazidime, cefotaxime thì xác định VK có tiếtESBL

oxyimino-b Một số phương pháp phát hiện kiểu hình ESBL khác[34],[59]:

- Phương pháp đĩa đôi quan sát hiện tượng mở rộng vòng vô khuẩn củaoxyimino-cephalosporin với acid clavulanic

- Sử dụng băng giấy E-test

- Sử dụng các hệ thống máy tự động

c Phương pháp phát hiện kiểu gien ESBL: Dùng các phương pháp sinh

học phân tử để phát hiện các kiểu gien ESBL

1.3.4 Men β-lactamase AmpC

1.3.4.1 Định nghĩa

Các men β-lactamase AmpC thuộc lớp C trong phân loại theo cấu trúc phân tửcủa Ambler, thuộc nhóm 1 trong phân loại theo chức năng của Bush Chúng thủyphân penicillin, cephalosporin (bao gồm cephalosporin thế hệ III nhưng thường

không thủy phân cephalosporin thế hệ IV) và monobactam Các men này ít bị bấthoạt bởi các chất ức chế β-lactamase, đặc biệt là acid clavulanic[69].

1.3.4.2 Đặc điểm

Men β-lactamase AmpC được phát hiện lần đầu tiên ở E coli năm 1940,

nhưng chưa được gọi là AmpC mà chỉ ghi nhận men này thủy phân được penicillin.Năm 1980, hệ thống phân loại của Ambler ra đời, các men này được xếp vào lớp C.Năm 1995, hệ thống phân loại của Bush và cộng sự ra đời, các men này được xếpvào nhóm 1, lúc này các men AmpC được phát hiện có gien mã hóa nằm trên nhiễm

sắc thể của Enterobacteriaceae và một số ít các VK họ khác Từ đó đến nay, số

lượng và trình tự gien được phát hiện tăng lên nhanh chóng[44]

Một số trực khuẩn Gram âm đường ruột như Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Hafnia alvei, Morganella morganii và Aeromonas spp có mang

gien AmpC có khả năng cảm ứng trên nhiễm sắc thể (inducible chromosomal AmpCgene) nên bình thường biểu hiện AmpC ở mức độ thấp; khi VK tiếp xúc với các chấtcảm ứng sẽ bị kích thích tiết ra AmpC với số lượng nhiều gây nên tính kháng thuốc

VK E coli cũng có gien AmpC trên nhiễm sắc thể nhưng không có khả năng cảm ứng; do đó E coli tiết ra AmpC với mức độ thấp và vẫn nhạy với cephalosporin

nhưng khi đột biến xảy ra ở vùng điều hòa hoặc vùng ức chế phiên mã làm tăng biểu

hiện gien, tăng tiết AmpC, E coli sẽ kháng cephalosporin[62].

Đối với Pseudomonas aeruginosa và Acinetobacter spp., cơ chế điều hòa biểu

hiện gien phức tạp hơn AmpC là gien có sẵn trên nhiễm sắc thể, bình thường bị ứcchế, chỉ mã hóa tiết AmpC ở nồng độ thấp nên VK vẫn nhạy với KS Khi bộ gien của

Acinetobacter spp có đoạn chèn ISAba1 hoặc Pseudomonas aeruginosa có đột biến

dịch mã mới biểu hiện AmpC ở nồng độ cao, làm VK biểu hiện tính kháng KS[44]

Các gien AmpC trên nhiễm sắc thể có thể truyền qua plasmid AmpC quatrung gian plasmid được phát hiện từ năm 1989, thuộc các họ: CMY, FOX và DHA,phân bố khắp nơi trên thế giới nhưng tần suất ít hơn so với ESBL Plasmid mang gienAmpC thường mang đồng thời các gien kháng KS khác như TEM-1, PSE-1, CTX-M-

3, SHV và VIM-1, làm VK kháng cả các KS aminoglycoside, chloramphenicol,quinolone, sulfonamide, tetracycline, trimethoprim[44, 62, 70]

1.3.4.3 Phương pháp phát hiện

Hiện tại CLSI chưa có hướng dẫn về các xét nghiệm phát hiện AmpC bằngkiểu hình Tiêu chuẩn vàng để phát hiện AmpC là xác định kiểu gien Các xét nghiệmkiểu hình dựa trên 2 nguyên tắc: phát hiện hoạt tính thủy phân của AmpC và đánh giá

sự giảm hoạt tính với các chất ức chế AmpC như cloxacillin, boronic acid vàmonobactam (boronic acid không ức chế đặc hiệu AmpC vì cũng có thể ức chế

Klebsiella pneumoniae carbapenemase-KPC)[41].

Xét nghiệm sàng lọc:

VK kháng cefoxitin và nhạy với cefotaxime, ceftazidime (căn cứ theo điểmgãy đối với từng loại KS khi thực hiện phương pháp khuếch tán trên thạch tìm đườngkính vòng vô khuẩn hoặc phương pháp pha loãng tìm MIC) Tính kháng cefoxitinkhông đặc hiệu vì cefoxitin có thể bị kháng do các cơ chế khác như giảm tính thấm

do giảm porin hoặc bị phân hủy bởi carbapenemase hay β-lactamase lớp A[41],[70].Ngoài ra, men AmpC type ACC-1 không bị thủy phân bởi cefoxitin[33]

Xét nghiệm xác định bằng kiểu hình: có nhiều phương pháp khác nhau với

độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau:

- Thử nghiệm ba chiều (three-dimensional test): là modified Hodge test

được mô tả bởi Coudon và cộng sự VK E coli ATCC 25922 được nuôi

cấy trên thạch MHA, đặt đĩa giấy cefoxitin ở trung tâm đĩa petri, chohuyền dịch VK cần xét nghiệm vào các khe hở hướng về đĩa cefoxitin trênthạch Sự tăng sinh của VK bề mặt dọc theo khe hở trong vòng vô khuẩncủa cefoxitin là bằng chứng cho sự hiện diện của men AmpC[41],[44]

- AmpC test: VK E coli ATCC 25922 được nuôi cấy trên thạch MHA, đặt

đĩa giấy có tẩm 100x Tris-EDTA và VK úp xuống mặt thạch và tiếp xúcvới đĩa giấy cefoxitin Nếu vòng vô khuẩn của cefoxitin bị lõm hay mất

độ cong thì có thể xác định sự hiện diện của men AmpC[41],[44]

- Thử nghiệm cộng hưởng với cloxacillin (Cloxa test): sử dụng cloxacillinlàm chất ức chế men AmpC Nuôi cấy VK cần xét nghiệm trên thạchMHA với đĩa giấy cloxacillin nằm giữa đĩa giấy cefotaxime vàceftazidime Sự cộng hưởng làm mở rộng vòng vô khuẩn chứng tỏ VK cótiết men AmpC[41],[44]

- Cefotetan/cefotetan-cloxacillin test: là một dạng của E-test, sử dụngcefotetan và cefotetan-cloxacillin MIC của cefotetan-cloxacillin giảm ítnhất 3 lần cho thấy VK tiết men AmpC[41],[44].

Hình 1.2 Phương pháp kiểu hình phát hiện AmpC

1.3.5 Men carbapenemase

1.3.5.1 Định nghĩa

Carbapenemase là những β-lactamase thủy phân các penicillin, hầu hếtcephalosporin, thủy phân carbapenem và monobactam với nhiều mức độ khác nhau(monobactam không bị thủy phân bởi metallo-β-lactamase)[69]

Carbapenemase là nhóm men có hoạt tính phân hủy KS mạnh nhất trong sốcác β-lactamase

và tazobactam Lớp A gồm các men: not metalloenzyme carbapenemase

(NMC)/imipenem-hydrolyzing β-lactamase (IMI), Serratia marcescens enzyme (SME), Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) and Guiana extended spectrum

(GES) với các gien mã hóa của SME, NMC/IMI nằm trên nhiễm sắc thể và gien mã

hóa của KPC, GES nằm trên plasmid Carbapenemase lớp A chủ yếu được tiết bởi

VK thuộc họ đường ruột và gần đây là Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp.[63] Trong đó, men KPC với gien mã hóa bla KPC nằm trên plasmid có thể dễdàng lan truyền cho các VK cùng loài và cả các VK khác loài đang gây ra mối bậntâm lớn cho việc điều trị các bệnh nhân nặng cũng như việc hạn chế lan truyền VK

kháng thuốc Nhiều nghiên cứu cho thấy các VK K pneumoniae tiết men KPC có

khả năng đa kháng KS do trên plasmid thường có thêm các gien mã hóa các menkháng β-lactam khác như AmpC, -lactamase phổ rộng và gien kháng KS họquinolone, aminoglycoside[49]

Carbapenemase lớp B là các metallo-β-lactamase (MBL) với khả năng thủyphân carbapenem ở nhiều mức độ khác nhau, thủy phân các penicillin, cephalosporinnhưng không thủy phân aztreonam, kháng các chất ức chế β-lactamase (sulbactam,clavulanate và tazobactam) nhưng bị ức chế bởi EDTA Các carbapenemase thuộclớp B như imipenemase (IMP), Verone integron-encoded metallo-β-lactamase (VIM)

và New Delhi metallo-β-lactamase (NDM) được lan truyền rộng rãi nhất, trong khiGerman imipenemase (GIM), Sao Paulo metallo-β-lactamase (SPM) và Seoulimipenemase (SIM) ít phổ biến hơn Tỷ lệ phân lập được VK có tiết men MBL ngày

càng tăng trong những năm gần đây, chủ yếu ở các vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Enterobacteriaceae New Delhi metallo-beta-

lactamase (NDM-1) là nhóm metallo-β-lactamase mới, được phát hiện lần đầu tiên ở

Klebsiella pneumoniae năm 2009, đến nay đã được phân lập ở hầu hết các nước trên

thế giới NDM được phát hiện gần đây ở lục địa Ấn Độ có khả năng thủy phân tất cảcác β-lactam (trừ aztreonam) kể cả các carbapenem phổ rộng Gien mã hoá NDMnằm trên nhiều plasmid khác nhau và có thể lan truyền dễ dàng từ VK này sang VKkhác[51]

Carbapenemase lớp D gồm các men thuộc họ OXA, có khả năng thủy phânoxacillin và cloxacillin, thủy phân yếu carbapenem, ít bị ức chế bởi clavulanate vàEDTA Tính đến năm 2007, đã tìm được 102 loại OXA khác nhau về trình tự acidamin trong cấu trúc protein, trong đó 9 loại là -lactamase phổ rộng (ESBL) và ítnhất 37 loại carbapenemase, phổ biến là OXA-23-like, OXA-24-like, OXA-58 và

OXA-48 Các carbapenemase lớp D hầu hết được phát hiện ở Acinetobacter spp.,

Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae Trong đó, Acinetobacter baumannii

kháng carbapenem có mang gien OXA được xác định là tác nhân gây ra nhiều vụdịch nhiễm khuẩn bệnh viện với tỷ lệ tử vong cao (tỷ lệ tử vong >30%) Men OXA-

48 với gien mã hóa bla OXA-48-like nằm trên transposon Tn1999 hoặc Tn199.2 của

plasmid có thể chuyển từ môi trường sang VK, làm lan truyền các chủng trực khuẩnGram âm kháng carbapenem khắp nơi trên thế giới[49],[63]

Hình 1.3 Phân bố các loại carbapenemase thường gặp theo khu vực địa lý [49]

1.3.5.3 Phương pháp phát hiện

Việc phát hiện các VK tiết carbapenemase rất quan trọng vì chúng kháng gầnnhư toàn bộ KS -lactam và quan trọng hơn, chúng có thể truyền gien kháng nàysang các VK khác một cách dễ dàng Tuy nhiên, những hiểu biết về carbapenemasecòn chưa đầy đủ do mới được quan tâm rộng rãi trong những năm gần đây Các xétnghiệm phát hiện carbapenemase gặp khó khăn do hoạt tính thủy phân của men khácnhau đối với các loại carbapenem và khác nhau trong các chủng VK, dẫn đến việc

VK nhạy cảm với carbapenem ở nhiều mức độ khác nhau Ví dụ như đã có nhiều báocáo tính kháng carbapenem không ổn định ở KPC-2 làm MIC của imipenem và

meropenem thấp hơn điểm gãy để phát hiện tính kháng thuốc, một số loại men OXAnhư OXA-48, OXA-54 có mức độ thủy phân carbapenem thấp [63].

a Phát hiện kiểu hình carbapenemase theo khuyến cáo của CLSI

Xét nghiệm sàng lọc: Các VK tiết men carbapenemase sẽ biểu hiện bằng sự

kháng hay trung gian với một hoặc nhiều carbapenem Meropenem có độ nhạy và đặchiệu cao, ertapenem có độ nhạy cao nhất nhưng độ đặc hiệu thấp, đặc biệt ở các loài

Enterobacter spp do KS này không bền vững với men ESBL và AmpC khi đi kèm

với cơ chế giảm các kênh porin hoặc bơm đẩy KS ra khỏi tế bào[69]

Xét nghiệm xác định bằng kiểu hình: Hiện tại vẫn còn nhiều tranh cãi về

việc xét nghiệm nào là phù hợp nhất để phát hiện các loại carbapenemase cho cácchủng VK khác nhau CLSI 2018 khuyến cáo sử dụng phương pháp CarbaNP vàphương pháp bất hoạt carbapenem cải tiến (mCIM : modified CarbapenemInactivation Method) để phát hiện carbapenemase ở trực khuẩn đường ruột và

Pseudomonas aeruginosa[37].

Phương pháp CarbaNP (Carbapenemase Nordmann-Poirel) là một xét nghiệmnhanh (<2h) để phát hiện hoạt tính thủy phân của carbapenemase, biểu hiện bằng sựthay đổi pH làm chất chỉ thị màu phenol red chuyển từ màu đỏ sang màu vàng Nhiềunghiên cứu cho thấy CarbaNP có độ nhạy và đặc hiệu cao ở trực khuẩn Gram âm

đường ruột và Pseudomonas spp nhưng cũng có những nghiên cứu cho thấy độ nhạy

thấp khi phát hiện men thuộc type OXA-48, nên được đề nghị phương pháp cải tiến

là CarbAcineto để tăng độ nhạy khi phát hiện carbapenemase ở Acinetobacter

spp.[69],[54],[67]

Phương pháp bất hoạt carbapenem cải tiến (modified carbapenem inactivationmethod, mCIM) dựa trên nguyên tắc là men carbapenemase trong huyền dịch VKđược thử nghiệm sẽ thủy phân đĩa giấy KS carbapenem (CLSI khuyến cáo sử dụngmeropenem) Đĩa giấy KS này sau đó được thử tính nhạy cảm trên đĩa thạch được

cấy VK E coli ATCC 25922-chủng VK nhạy cảm với meropenem Men carbapenemase được phát hiện khi đường kính vòng vô khuẩn đối với E coli nằm

trong giới hạn quy định, biểu thị rằng meropenem đã bị bất hoạt, không ức chế được

E coli ATCC 25922 Phương pháp này được nghiên cứu có độ nhạy và đặc hiệu cao

trong phát hiện các loại carbapenemase khác nhau ở trực khuẩn đường ruột và

Pseudomonas aeruginosa; tuy nhiên, đối với Acinetobacter spp., kết quả về độ nhạy

và đặc hiệu thay đổi khác nhau giữa các nghiên cứu[72],[61],[67],[71] Thực hiệntiếp eCIM sau khi thực hiện mCIM có thể phân biệt 2 nhóm metallo-β-lactamase vàkhông phải metallo-β-lactamase[37]

b Một số phương pháp phát hiện kiểu hình khác[68]

- Modified Hodge test (MHT): nguyên tắc tương tự như phương pháp bất hoạt

carbapenem cải tiến, phát hiện tính kháng của VK trên môi trường có sự hiện diệncủa KS

- Phương pháp khối phổ (matrix-assisted laser desorption–ionization time offlight mass spectrometry, MALDI-TOF MS): nguyên tắc tương tự như phương phápCarbaNP, phát hiện các sản phẩm khi men carbapenemase thủy phân KS

- Phương pháp sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát hiện carbapenemase.

c Phương pháp phát hiện kiểu gien carbapenemase: Dùng các phương

pháp sinh học phân tử để phát hiện các kiểu gien carbapenemase

1.3.6 Tình hình nhiễm trực khuẩn Gram âm tiết men β-lactamase phổ rộng, β-lactamase AmpC, carbapenemase hiện nay

1.3.6.1 Trên thế giới

Nghiên cứu SMART (Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends)

về phân bố các men ESBL, AmpC, carbapenemase ở trực khuẩn Gram âm đườngruột gây nhiễm khuẩn ổ bụng và nhiễm khuẩn niệu tại 12 quốc gia/khu vực Châu Á-Thái Bình Dương giai đoạn 2008-2014 phân lập được 2728 chủng trực khuẩn Gram

âm đường ruột tiết men β-lactamase Trong đó, tỷ lệ tiết β-lactamase ở E coli, K pneumoniae và E cloacae lần lượt là 63,7%; 26,2% và 7,3% Tỷ lệ VK giảm nhạy

cảm với imipenem trung bình ở các nước là 7,9%, ngoại trừ ở 2 nước Việt Nam(10,2%) và Philippines (17,7%) Tỷ lệ tiết carbapenemase gia tăng qua các năm,0,07% vào năm 2008 tăng lên 1,1% năm 2013; các gien KPC-2, NDM-1, NDM-4 vàNDM-5 được tìm thấy ở Việt Nam trong giai đoạn 2010-2014; gien OXA-48 đượctìm thấy ở Việt Nam năm 2011-2014 Về ESBL, CTX-M-15, CTX-M-14 và CTX-M-

27 phổ biến ở E coli; CTX-M-15 phổ biến ở K pneumoniae Về AmpC có gien trên plasmid, CMY-2 chiếm tỷ lệ cao ở Escherichia coli, DHA-1 chiếm tỷ lệ cao ở Klebsiella pneumoniae, ACT và MIR chiếm tỷ lệ cao ở E cloacae[48].