Nghiên cứu sản xuất vacxin nhũ đầu phòng hội chứng giảm đẻ ở gà (egg drop syndrome eds ) tại công ty fivevet

Phương pháp nghiên cứu Đề tài đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau: Tiêm vào xoang niệu mô, phương pháp nhân vi rút trên trứng vịt có phôi 10-11 ngày tuổi, phương pháp làm HA, HI,

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN VĂN ĐỨC

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN NHŨ DẦU

PHÒNG HỘI CHỨNG GIẢM ĐẺ Ở Gà (EGG DROP SYNDROME-EDS’76) TẠI CÔNG TY FIVEVET

Người hướng dẫn khoa học: TS Trương Hà Thái

TS Trịnh Quang Đại

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 03 tháng 6 năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Văn Đức

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc tới TS Trương Hà Thái và TS Trịnh Quang Đại đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Thú Y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức công ty Cổ phần thuốc thú y Trung Ương 5 đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày 03 tháng 6 năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Văn Đức

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract xi

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Hiểu biết chung về hội chứng giảm đẻ EDS (egg drop syndrome) 3

2.1.1 Giới thiệu chung 3

2.1.2 Vi rút gây bệnh hội chứng giảm đẻ 4

2.1.3 Hội chứng giảm đẻ EDS 76 7

2.2 Hiểu biết chung về vắc xin 13

2.2.1 Khái niệm 13

2.2.2 Nguyên lý 13

2.2.3 Những đặc tính cơ bản của vắc xin 14

2.2.4 Sản xuất vắc xin bằng phương pháp vô hoạt vi rút 15

2.2.5 Chất bổ trợ 16

2.3 Hiểu biết chung về miễn dịch 17

Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

3.1 Nội dung nghiên cứu 19

3.1.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vắc xin phòng hội chứng giảm đẻ gà (EDS) 19

3.1.2 Đánh giá và kiểm tra chất lượng vắc xin phòng hội chứng giảm đẻ gà (EDS) 19

3.2 Đối tượng, nguyên liệu và địa điểm nghiên cứu 19

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 19

3.2.3 Nguyên liệu 19

3.2.4 Các loại dung dịch, môi trường 19

3.2.5 Trang thiết bị máy móc, dụng cụ trong phòng thí nghiệm 20

3.3 Phương pháp nghiên cứu 21

3.3.1 Tiêm vào xoang niệu mô 21

3.3.2 Phương pháp nhân vi rút trên trứng vịt có phôi 10-11 ngày tuổi 21

3.3.3 Phương pháp làm HA, HI 22

3.3.4 Phương pháp xác định EID50 24

3.3.5 Xác định vi rút và chuẩn độ vi rút EDS trong nước trứng thu được 25

3.3.6 Bất hoạt vi rút 25

3.3.7 Kiểm tra bất hoạt 25

3.3.8 Phương pháp nhũ hóa vắc xin 26

3.3.9 Phương pháp kiểm tra sau nhũ hóa vắc xin 26

3.3.10 Quy trình sản xuất vắc xin 27

3.3.11 Kiểm tra chất lượng vắc xin 27

3.3.12 Phương pháp tiêm vắc xin và thu thập huyết thanh 29

3.3.13 Phương pháp thu thập số liệu, xử lý thống kê sinh học 30

Phần 4 Kết quả và thảo luận 31

4.1 Nghiên cứu sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng giảm đẻ EDS’76 31

4.1.1 Xác định liều gây nhiễm vi rút EDS trên phôi trứng vịt 10-11 ngày và thời gian thu vi rút trên phôi trứng vịt 31

4.1.2 Nghiên cứu tối ưu nồng độ chất bất hoạt trong vắc xin 33

4.1.3 Nghiên cứu xác định liều vi rút sử dụng trong vắc xin 35

4.1.4 Nghiên cứu quá trình nhũ hóa, bổ sung chất bổ trợ vắc xin 36

4.2 Đánh giá và kiểm tra chất lượng vắc xin phòng hội chứng giảm đẻ gà (EDS) 37

4.2.1 Nghiên cứu sản xuất 03 lô vắc xin vô hoạt phòng hội chứng giảm đẻ gà 37

4.2.2 Kiểm nghiệm thành phẩm vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội hội chứng giảm đẻ EDS ở gà 42

4.2.3 Kiểm tra hiệu lực và độ dài miễn dịch vắc xin trên gà 4-6 tuần tuổi 46

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 50

5.1 Kết luận 50 5.1.1 Giống vi rút EDS’76 có các đặc điểm và chỉ số sau đây 50 5.1.2 Vắc xin EDS đạt các chỉ tiêu vô trùng, an toàn, hiệu lực trong quá trình

kiểm nghiệm 50 5.2 Kiến nghị 51 Tài liệu tham khảo 52

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BPL β probiolacton

ĐC Đối chứng

EDS Egg Drop Syndrome

EID50 Embryo Infective Dosage 50 (Liều gây nhiễm 50% phôi) FiveVet Central Veterinary Medicine JSC No.5

GMP Good Manufacturing Practices (Thực hành sản xuất tốt) HGKT Hiệu giá kháng thể

HI Haemagglutination inhibition

IHA Indirect Haemagglutination Assay

(Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp) PBS Phosphate Buffered Saline

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Bảng phân loại họ Adenoviridae 4

Bảng 3.1 Công thức Reed & Muench tính EID50 25

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm tại nhà nuôi động vật 29

Bảng 4.1 Xác định liều gây nhiễm và thời gian thu hoạch 32

Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu bất hoạt kháng nguyên EDS với formol ở ba nồng độ 0,05%, 0,1%, 0,2% 34

Bảng 4.3 Xác định liều vi rút sử dụng trong vắc xin 35

Bảng 4.4 Kết quả lý hóa sau nhũ hóa vắc xin bằng dầu khoáng ISA 71 VG 37

Bảng 4.5 Kết quả hiệu giá thu được 3 lô kháng nguyên liên tiếp 38

Bảng 4.6 Kết quả kiểm tra vô trùng 38

Bảng 4.7 Kết quả xác định EID50 của vi rút EDS 39

Bảng 4.8 Kết quả EID50 của 3 lô kháng nguyên 40

Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra vi rút sau vô hoạt trên phôi vịt ở nồng độ 0,1% 41

Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra vô trùng 41

Bảng 4.11 Kết quả của ba lô sản xuất 42

Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra cảm quan vắc xin EDS vô hoạt 43

Bảng 4.13 Kết quả vô trùng của 3 lô vắc xin 43

Bảng 4.14 Kiểm tra tính ổn định của vắc xin 45

Bảng 4.15 Kết quả kiểm tra an toàn của các lô vắc xin nhũ dầu trên gà 46

Bảng 4.16 Biến động hiệu giá kháng thể kháng vi rút EDS ở gà 4-6 tuổi chưa được miễn dịch cơ sở EDS 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cấu tạo hính thái 5

Hình 2.2 Trứng biến đổi 9

Hình 3.1 Tóm tắt quy trình sản xuất vắc xin EDS’76 nhũ dầu chế trên phôi vịt 27

Hình 4.4 Hình ảnh lấy máu kiểm tra kháng thể kháng vi rút EDS 47

Hình 4.5 Biểu đồ thể hiện hiệu giá HI (log2) theo dõi trong 84 ngày 48

Hình 4.6 Hình ảnh về HI 49

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Văn Đức

Tên luận văn: Nghiên cứu sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng Hội Chứng Giảm

Đẻ ở gà (EGG DROP SYNDROME-EDS’76) tại công ty FIVEVET

Phương pháp nghiên cứu

Đề tài đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau: Tiêm vào xoang niệu mô, phương pháp nhân vi rút trên trứng vịt có phôi 10-11 ngày tuổi, phương pháp làm HA,

HI, phương pháp xác định EID50, phương pháp xác định virus và chuẩn độ virus EDS

trong nước trứng thu được, phương pháp bất hoạt virus, phương pháp nhũ hóa vắc xin,

phương pháp kiểm tra sau nhũ hóa vắc xin, quy trình sản xuất vắc xin, kiểm tra chất lượng vắc xin, phương pháp tiêm vắc xin và thu thập huyết thanh, phương pháp thu thập

số liệu, xử lý thống kê sinh học

Kết quả chính và kết luận

Giống virus EDS’76 có các đặc điểm và chỉ số sau đây:

Liều gây nhiễm thích hợp nhất đối với virus hội chứng giảm đẻ EDS trên phôi vịt là 200EID50

Thời gian thu hoạch huyễn dịch virus EDS thích hợp nhất, hàm lượng virus cao,

chất lượng tốt là sau gây nhiễm virus là 96 giờ

- Bất hoạt vi rút ở nồng độ Formol 0,1% ở điều kiện 40C trong 24 giờ

Hiệu giá HA= 12-13 Log2

Hiệu giá gây nhiễm 50% phôi vịt EID50/1ml là 107,5.

Virus EDS’76 đáp ứng được yêu cầu kỹ thuật về tính an toàn và đặc tính gây miễn dịch

Vắc xin EDS đạt các chỉ tiêu vô trùng, an toàn, hiệu lực đã được thử nghiệm tại thực địa

Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng giảm đẻ ở gà đảm bảo theo tiêu chuẩn TCVN 8685-4:2011 Vắc xin vô trùng và an toàn 100% khi tiêm gấp đôi liều sử dụng

và có hiệu lực tốt

Đảm bảo an toàn trong thử nghiệm chủng 2 liều cho gà

Tạo được kháng thể EDS cho gà sau khi chủng theo tiêu chuẩn TCVN 8685-4:2011

THESIS ABSTRACT Master candidate: Nguyen Van Duc

Thesis title: Research on the production of inactivated oil emulsion vaccine for the

prevention of Egg drop syndrome-EDS’76 at Fivevet company

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives

- To research and establish the production process of the inactivated oil emulsion vaccine at laboratory scale

- To establish some basic technical criteria in the production process and quality testing methods for EDS’76 vaccine

- To evaluate the efficacy, the duration of immunity in chickens vaccinated by EDS’76 inactivated oil emulsion vaccine

Materials and Methods

This study used the following methods: production of the virus on embryonated duck eggs (10 -11 days) via allantoic sac Haemagglutination test (HA) and haemagglutination inhibition (HI) test Method to calculate egg infective dose

50 (EID 50) End point titration method to determine the titer of virus in allantoic fluid Methods of virus inactivation and inactivation testing Method of emulsification and emulsion stability test Method used in vaccine production and quality test Method

of vaccination and serum collection Data collection and statistical test

Main findings and conclusions

The EDS’76 virus used in vaccine production was purity

The optimal infectious dose on embryonated duck eggs were 200 EID50

The optimal time for harvesting EDS’76 virus with high titer was 96 hours post infection

EDS’76 was completely inactivated by 0.1% formaldehyde after 24 hours at 4o

C The haemagglutination titer were 12-13 log2

The titer of virus harvested from embryonated duck eggs were 107.5 EID50 / 1ml The EDS’76 virus used in this study met all requirment for vaccine production The produced EDS vaccine was sterility, safety and efficacy under experiments

The inactivated EDS vaccine met the standard TCVN 8685-4: 2011 Vaccine was sterile and 100% safety when doubling the dose

The inactivated EDS vaccine induced detectable antibodies in chickens post vaccination (tested according to the standard TCVN 8685-4: 2011)

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Chăn nuôi gia cầm giữ một vai trò quan trọng trong nền kinh tế nông nghiệp Việt Nam Những năm gần đây, chăn nuôi là một trong những ngành có bước phát triển mạnh, ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế, xoá đói giảm nghèo và làm giàu trong nông thôn

Nuôi gia cầm trong đó nuôi gà là một trong những nghề được quan tâm hàng đầu, vì thời gian chăn nuôi ngắn thu được sản phẩm nhanh Một trong những khâu quan trọng để đảm bảo chăn nuôi gà phát triển mạnh và có lãi là bảo

vệ cho đàn gà tránh khỏi dịch bệnh Hiện nay, chăn nuôi gà đẻ quy mô công nghiệp và bán công nghiệp đang được quan tâm và phát triển mạnh mẽ Trong những năm gần đây số lượng tổng đàn gia cầm tăng trưởng mạnh từ năm 2016 là 361.721,0 nghìn con đến năm 2017 là 385.457,0 nghìn con

Cùng với sự phát triển của chăn nuôi gà đẻ qua từng năm thì tình hình dịch bệnh trên đàn gà đẻ cũng diễn biến ngày càng phức tạp và gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi Đặc biệt là các bệnh gây ảnh hưởng đến sản lượng trứng và chất lượng trứng như: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (IB), Bệnh dịch tả (Newcastle Disease), Bệnh tụ huyết trùng, Marek…vv Trong đó có Hội chứng giảm đẻ (EDS’76) gây ra

“Hội chứng giảm trứng” là một bệnh mới được phát hiện năm 1976 do một Adenovirus trên gia cầm thuộc dòng BC 14, vi rút 127 gây ra Đặc điểm là

gà đang đẻ bình thường tự nhiên giảm đẻ đột ngột từ 10-40% và kéo dài liên tục Mặc dù gà ăn uống bình thường Cho đến nay, bệnh chưa có thuốc trị Biện pháp tốt nhất, an toàn và hiệu quả kinh tế nhất để tránh được bệnh truyền nhiễm trên là tiêm phòng bằng vắc xin

Hiện tại, các loại vắc xin phòng bệnh EDS’76 trên thị trường đã và đang được sử dụng rất rộng rãi, và rất có hiệu quả Nhưng những sản phẩm này trên thị trường chủ yếu là vắc xin ngoại đa giá giá thành cao Do đó nhằm

để giảm chi phí chăn nuôi cũng như hiệu quả kinh tế của ngàng chăn nuôi gà

đẻ tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ

dầu phòng Hội Chứng Giảm Đẻ (EGG DROP SYNDROME-EDS’76) tại

công ty FIVEVET”

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

- Nghiên cứu và xây dựng quy trình sản xuất vắc xin đơn giá vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng giảm đẻ ở gà EDS’76

- Xây dựng một số chỉ tiêu kỹ thuật cơ bản trong qui trình sản xuất và kiểm nghiệm vắc xin EDS’76 vô hoạt nhũ dầu

- Thông qua quá trình thử nghiệm đánh giá được hiệu lực, độ dài miễn dịch của vắc xin EDS’76 vô hoạt nhũ dầu

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 HIỂU BIẾT CHUNG VỀ HỘI CHỨNG GIẢM ĐẺ EDS (EGG DROP SYNDROME)

2.1.1 Giới thiệu chung

Hội chứng giảm đẻ (Egg Drop Syndrome - EDS) (hay còn được gọi là EDS’76) là một bệnh mới được phát hiện năm 1976 (Van Eck, Davelaar et al 1976) Khi người ta đã dùng tất cả các biện pháp phòng chống bệnh truyền nhiễm

có liên quan tới tỷ lệ đẻ trứng và dùng đầy đủ các chất dinh dưỡng trong khẩu phần ăn để kích thích đẻ trứng nhưng trứng vẫn giảm Theo Baxendale 1978,

Firth et al., 1981 nguyên nhân mới được tìm ra lại do một loại vi rút thuộc nhóm

Adenovirus subgroup III gây bệnh ở gà (Elneel and R.M.D.H, 2006)

Bệnh được Van ECK và cộng sự mô tả trên đàn gà đẻ năm 1976 tại Hà Lan, đồng thời các tác giả cũng đã phân lập được adenovirus có khả năng gây

ngưng kết hồng cầu từ gà bệnh (Van Eck et al.,1976) Vi rút thường truyền qua

trứng, ở dạng tiềm ẩn cho đến khi gà đạt tỷ lệ đẻ cao nhất sẽ gây bệnh Trước năm 1974, do điều kiện không có kháng thể đặc hiệu kháng adenovirus trên gà cũng như do khi nuôi cấy, vi rút không nhân lên trên môi trường tế bào động vật

có vú, nhân lên kém trên môi trường tế bào gà tây nhưng lại phát triển tốt trên môi trường tế bào chế từ vịt nên người ta cho rằng đây có thể là một adenovirus

có nguồn gốc từ vịt Giả thuyết này cũng được khẳng định nhanh chóng do người

ta đã phân lập được EDS vi rút từ vịt bình thường cũng như sự tồn tại của kháng thể kháng EDS vi rút ở nhiều đàn vịt

Phân Bố

EDS vi rút đã được phân lập tại Úc (Firth Hall et al.,1981), Bỉ (Meulemans Peeters et al.,1979), Trung Quốc, Pháp (Picault, 1978), Anh, Hungary, Ấn độ, Israel (Kumar Mohanty et al., 1992), Bắc Ailien, Nhật, Italia, Singapo, Nam Phi và Đài

Loan Ngoài ra các băng chứng huyết thanh học cho thấy sự lưu hành của Vi rút

tại Braxin (Hwang Lamas et al., 1980), Uruguay và Aghentina Tỷ lệ chết

thường là rất thấp Các bằng chứng gián tiếp cho thấy rằng đường lây lan bệnh chủ yếu là thông qua trứng (truyền dọc) tiếp theo đó là việc nhiễm âm ỉ cùng với việc bài xuất vi rút khi con vật sắp sửa trưởng thành về mặt sinh sản Sự truyền ngang từ gà này sang gà khác có thể xảy ra nhưng chậm và có thể ngăn cản được

Do vi rút chỉ gây bệnh cho gia cầm nên không gây ảnh hưởng đến sức khỏe của cộng đồng

2.1.2 Vi rút gây bệnh hội chứng giảm đẻ

2.1.2.1 Phân loại

Vi rút gây EDS (EDSV) được sắp xếp vào họ Adenovirrus dựa vào đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy cũng như các đặc tính sinh học Khi sử dụng phản ứng trung hòa vi rút hoặc phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu, vi rút EDS không có mối liên hệ nào với giống Adenovirus (gồm 11 prototyp gây bệnh

cho thủy cầm và 2 prototyp gây bệnh cho gà tây) (Raj Sivakumar et al., 2001; King Lefkowitz et al., 2011)

Kết quả cho thấy bộ gen của EDS vi rút khác rõ rệt so với các aviadenovirus subgroup I Sự khác biệt này bao gồm: Kích thước bộ gen nhỏ hơn (33.2kb so với 43.8 kb), thiếu một số gen hoặc gen không đồng nhất với các gen adenovirus protein

đã biết (Bartha Meszaros et al.,1982) Bộ gen EDS vi rút có đặc tính di truyền giống

với adenovirus gây bệnh cho cừu và một số chủng gây bệnh cho bò, nhưng khác hoàn toàn với Mastadenovirus (nhóm adenovirus gây bệnh cho động vật có vú) và hai nhóm vi rút I và II gây bệnh cho gia cầm Những sai khác trên cho ta thấy đầy đủ dẫn chứng xếp EDS vi rút vào giống mới Adenovirus

Bảng 2.1 Bảng phân loại họ Adenoviridae

Được quy ước là các adenovirus gây bệnh cho

gà, gà tây, vịt ngỗng, gồm 12 serotyp thuộc 5 loài A, B, C, D và E

Giống dự kiến (Proposed Genus):

Group II avian adenovirus

Siadenovirus

Vi rút gây viêm ruột xuất huyết gà tây Gây bệnh lách đá hoa (Marble spleen disease) ở gà lôi, chim trĩ

Giống dự kiến (Proposed Genus):

Group II avian adenovirus

là các vi rút phân lập được từ vịt của Anh Nhóm 3 là một vi rút phân lập được từ

gà của Úc Từ khi được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1976 đến nay, người ta thấy vi rút EDSV xuất hiện với các tần suất rất thay đổi ở nhiều nơi trên thế giới Tại Đức từ năm 1991-2002, tác giả Kaleta và cộng sự đã xét nghiệm 2752 huyết thanh của gà bằng phản ứng HI để tìm kháng thể kháng vi rút EDS 76 với kết quả

729 mẫu có phán ứng dương tính (26,5%) (Kaleta Khalaf et al., 1980)

2.1.2.2 Hình thái

Kích thước của vi rút EDS vào khoảng 76- 80nm Kích thước này phù hợp với kích thước của các adenovi rút trước đây theo công bố(McFerran,

McCracken et al., 1978, Yamaguchi, Imada et al., 1981) Dùng các chế phẩm vi

rút xử lý với gradient CsCl thấy hình thái điển hình của adenovi rút: gồm các mặt tam giác với 6 capsomere trên mỗi cạnh và một cấu trúc hình như quả trùy có độ dài 25nm nhô lên ở mỗi đỉnh của tam giác (Kraft, Grundet al.,1979) Về cấu tạo,

Adenovirrut là những hạt có cấu trúc 20 mặt, không có vỏ bao ngoài Cấu trúc hình quả trùy có tác dụng quan trọng tham gia vào quá trình kết gắn của hạt vi rút vào màng của tế bào vật chủ Khi quan sát dưới kính hiễn vi điện tử, có thể thấy

các câu trúc hình chùy tách rời khỏi vỏ capside (Dhinakar Raj, Sivakumar et

al.,2001; King, Lefkowitz et al., 2011)

Hình 2.1 Cấu tạo hính thái

Thành phần hóa học: Vi rút EDS 76 là một vi rút AND với trọng lượng phân tử là 22,6 x 106d Vi rút có 13 Protein cấu trúc trong đó có ít nhất là 7 protein của Adenovi rút typ của gà (Todd and McNulty, 1978)

2.1.2.3 Khả năng gây ngưng kết hồng cầu

Vi rút EDS 76 có khả năng gây ngưng kết hồng cầu nhiều loài gia cầm

như gà, vịt, gà tây, ngỗng, chim bồ câu, chim công nhưng không gây ngưng kết hồng cầu chuột, thỏ, ngựa, cừu, bò, dê hoặc lợn

Khả năng ngưng kết hồng cầu của vi rút thay đổi tùy thuộc vào nhiệt độ Sau 16 giờ ở 56°C, hiệu giá ngưng kết giảm hiệu giá xuống 4 lần nhưng ổn định ở

nhiệt độ đó trong 4 ngày và chỉ mất hắn sau 8 ngày (Adair, Curran et al., 1979, Yamaguchi Imada et al., 1981) Nhiệt độ 600C, vi rút vẫn có khả năng gây ngưng kết hồng cầu nhưng sẽ mất khả năng này sau 30 phút ở 700C Tuy nhiên, ở nhiệt độ lạnh 40C vi rút có khả năng duy trì đặc tính ngưng kết hồng cầu trong một thời gian dài Khi xử lý với trypsin, 2- mercaptoethanol, ethylenediaminetetraacetic (EDTA), parafin, ficin và formaldehyde 0,5% trong thời gian 1 giờ ở 370C, đặc tính ngưng kết hồng cầu của EDS vi rút không thay đổi nhưng giảm mạnh nếu bị xử lý với

Potasium periodate và glutaradehydde 0,5% (Takai, Higashihara et al., 1984)

2.1.2.4 Đặc tính nuôi cấy

Trong phòng thí nghiệm vi rút EDS’76 phát triển tốt trên các loại tế bào sơ phôi vịt, gan phôi vịt và thận phôi vịt phát triển ở mức độ kém hơn trên tế bào thận phôi gà và mọc rất kém trên tế bào sơ phôi gà Vi rút cũng phát triển kém trên các tế bào tiên phát chế từ phôi gà tây và hoàn toàn không phát triển trên các loại tế bào có nguồn gốc từ động vật có vú (Adair, Curran et al 1979) Vi rút phát triển với hiệu giá cao trên tế bào từ phôi ngỗng Hiệu giá của vi rút đạt cao nhất khi nuôi cấy 48-72 giờ (Yamaguchi, Imada et al 1981) Tuy nhiên, không

có bằng chứng nào cho thấy có thể dựa vào bệnh tích tế bào để chứng minh sự nhân lên của vi rút mà thường phải dựa vào các phản ứng huyết thanh để chuẩn đoán khẳng định

Theo nghiên cứu của Banani et al (2007) vi rút phát triển tốt khi tiêm truyền

vào xoang ối của phôi vịt hoặc phôi ngỗng với hiệu giá 1/16000-1/32000(Banani,

Sehat et al., 2007) Vi rút không phát triển ở phôi gà

2.1.2.5 Sức đề kháng và quá trình nhân lên của vi rút

Quá trình nhân lên của vi rút: Vi rút EDS 76 nhân lên trong nhân tương tự

như các Adenovi rút của gà typ A Có thể quan sát thấy các xâm nhập nội nhân khi nhuộm HE

Sự sao chép DNA của vi rút bắt đầu từ 5 đến 8 giờ sau khi bị nhiễm bệnh

và tiếp tục cho đến khi tế bào chủ chết (Knipe et al., 2001)

Sự sao chép DNA của Adenovi rút diễn ra trong hai giai đoạn:

Đầu tiên, quá trình tổng hợp là bắt đầu từ thời điểm cuối cùng đến đầu kia của bộ gen hai chuỗi DNA đóng vai trò là khuôn mẫu cho quá trình tổng hợp, do

đó, sản phẩm của bản sao là bao gồm con gái và cha mẹ chuỗi cộng với một chuỗi DNA di dời Trong giai đoạn thứ hai của quá trình sao chép bổ sung cho chuỗi đơn bị dịch chuyển là tổng hợp Mẫu sợi đơn vòng tròn thông qua ủ của termini tự bổ sung của nó, và song song với đó kết quả là như nhau cấu trúc như termini của vi rút duplex Cấu trúc này cho phép nó được được công nhận bởi một số máy móc khởi động hoạt động trong giai đoạn đầu tiên nhân rộng và tổng hợp chuỗi bổ sung tạo ra một giây hoàn thành song công bao gồm một sợi cha

mẹ và con gái Adenovirus là mẫu DNA đầu tiên được sao chép trong ống

nghiệm (Knipe et al., 2001)

Sức đề kháng của các tác nhân lý hóa: Vi rút EDS tương đối bền với

chloroform, chịu được độ pH dao động từ 3-10 Vi rút bị bất hoạt ở 600C trong

30 phút 3 giờ ở 560C (Adair, Curran et al., 1979; Yamaguchi Imada et al., 1981)

Tính gây bệnh của vi rút sẽ mất đi sau khi bị xử lý với formaldehyde 0,5% và

glutaradehyde 0,5% (Takai M.Higashihara et al., 1984)

2.1.3 Hội chứng giảm đẻ EDS 76

2.1.3.1 Cơ chế sinh bệnh

Bằng thực nghiệm, khi gây nhiễm cho gà bằng vi rút EDS, vi rút gây nhiễm trùng huyết, một số nhân lên trên niêm mạc mũi Sau 3-4 ngày, vi rút nhân lên tại khắp các lympho trong cơ thể, đặc biệt là lách và tuyến ức, đồng thời vòi trứng cũng bị ảnh hưởng Tại thời điểm 7 - 20 ngày sau khi gây nhiễm vi rút đã nhân lên đáng kể ở ống dẫn trứng, khiến cho ống dẫn trứng bị viêm, quá trình hình thành vỏ trứng bị ảnh hưởng làm cho trứng đẻ ra có vỏ không bình thường

Khác với adenovirus subgroup I và II, vi rút EDS không nhân lên trên niêm mạc đường tiêu hóa Hiện tượng trong phân có vi rút có thể lẫn dịch viêm của ống dẫn trứng

2.1.3.2 Loài vật mắc bệnh

Mặc dù các ổ dịch xảy ra chỉ được ghi nhận ở đàn gà đẻ nhưng vật chủ tự nhiên của vi rút có thể là vịt và ngỗng Bằng phản ứng HI, người ta đã phát hiện được kháng thể đặc hiệu kháng EDS vi rút trong huyết thanh của vịt và ngỗng nuôi; ngoài ra còn thấy ở vịt cổ khoang, vịt trời, ngỗng Canada, ngan, thiên nga, cú, diệc

(Badstue and Smidt 1978; Calnek, 1978; Bartha, Meszaros et al., 1982)

Có thể phân lập vi rút từ vịt khỏe mạnh hoặc vịt bệnh, nhưng không thể sử dụng chủng vi rút này gây bệnh thực nghiệm Do vi rút phân lập từ những vịt bệnh có hiện tượng giảm đẻ, tiêu chảy nặng (Bartha, 1984) nên đây là bằng chứng cho thấy EDS có thể gây hiện tượng giảm đẻ, trứng bị nhám, xù xì hoặc vỏ mỏng ở vịt (Liu, 1986) Vi rút có thể phân lập ở ngỗng nhưng khi gây bệnh thực nghiệm, ngỗng không có hiện tượng giảm đẻ cũng

như không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng (Zsak Szekely et al., 1982)

Chim cút được coi là loài vật tương đối mẫn cảm với vi rút gây bệnh EDS (Das and Pradhan 1992) Chim trĩ, gà tây không mắc bệnh tự nhiên nhưng có thể gây bệnh thực nghiệm Gà nhật cũng có thể bị mắc bệnh tự nhiên hoặc gây bệnh thực nghiệm, vỏ trứng đẻ ra thường rất mềm

Các giống khác nhau mẫm cảm với bệnh khác nhau, thường giống gà đẻ trứng nâu mẫm cảm hơn giống gà đẻ trứng trắng , tuy sản lượng trứng của giống

gà đẻ trứng nâu không ảnh hưởng như giống gà đẻ trứng trắng nhưng số lượng trứng có vỏ bị ảnh hưởng nhiều gấp ba lần

Gà có thể mắc bệnh ở mọi lứa tuổi Bệnh thường xảy ra xung quanh thời

kỳ gà có tỷ lệ đẻ cao nhất do sự tái kích hoạt của vi rút đang ở giai đoạn tiểm ẩn

(McFerran McCracken et al., 1978)

Mặc dù có độc lực giống với chủng vi rút EDS phân lập từ gà nhưng các chủng phân lập từ vịt tại Mỹ không có khả năng ảnh hưởng đến sản lượng cũng như chất lượng trứng gà

2.1.3.3 Phương thức truyền lây

Phương thức truyền lây Có thể chia các ổ bệnh EDS’76 ra làm 3 loại: Truyền lây qua trứng Trong dạng bệnh kinh điển mà người ta quan sát

trước đây, phương thức lây lan chủ yếu là truyền dọc (McFerran, McCracken et

al 1978) Mặc dù số lượng trứng bị nhiễm vi rút là tương đối thấp với phương thức truyền lan này nhưng việc lây lan lại rất có hiệu quả Trong nhiều trường hợp, gà bị nhiễm vi rút từ trong trứng không bài thải vi rút, không hình thành đáng kể HI trước khi sản lượng trứng đạt 50% Khi sản lượng trứng đạt 50%, vi rút phát triển và được bài thải ra ngoài dẫn đến việc lây lan nhanh chóng và tạo thành các ổ dịch mới

Lây truyền ngang: có lẽ phương thức này xuất hiện là do vi rút tồn tại lưu

cửu ở một số trại gà đẻ trứng thương phẩm Những đàn gà đẻ đã mang trùng, vi rút thải qua trứng gây nhiễm cho đàn gà được nuôi chung trong chuồng qua chất

độn chuồng đã bị nhiễm mầm bệnh Ở Ấn Độ, 32,6% trại gà bị nhiễm vi rút

EDS76 (Kumar Mohanty et al., 1992)

Nhiễm bẩn các khay đựng trứng cũng có thể đóng vai trò trong việc lây lan bệnh (Bartha 1984) Thủy cầm và côn trùng chích hút cũng có thể là nguồn truyền bệnh cơ giới Bệnh lâm sàng xuất hiện khi con vật trưởng thành Lây lan

vi rút từ nhà gà này sang nhà gà khác có thể mất 5- 10 tuần Những đàn gà không được dùng vắc xin trước mùa đẻ sẽ bị giảm sản lượng trứng Vịt và ngỗng cũng

có thể bị nhiễm vi rút nhưng không phát bệnh

2.1.3.4 Triệu chứng

Với phương pháp gây bệnh thực nghiệm, đa số các tác giả quan sát được triệu trứng lâm sàng từ 7- 9 ngày sau khi gây nhiễm (Cook and Darbyshire, 1981); tuy nhiên cũng có một số tác giả cho rằng phải 17 ngày sau khi gây nhiễm

(Meulemans Peeters et al., 1979)

Triệu trứng đầu tiên là mất màu của vỏ trứng, chuyển từ màu nâu sang màu trắng Sau đó là hiện tượng đẻ ra trứng có vỏ mỏng, vỏ sần sùi, hình dạng thay đổi ngắn lại hay không có vỏ Chất lượng trứng kém Hình 2.1

tiêu chảy và thiếu máu, mào nhợt nhạt Hiện tượng tiêu chảy có lẽ là do tăng dịch tiết xuất của buồng trứng Nếu bệnh là do sự tái hoạt của vi rút tiềm ẩn thì hiện tượng giảm đẻ sẽ xuất hiện khi sản lượng trứng đạt giữa khoảng 50% so với đỉnh cực đại Có tác giả cho rằng, trong các ô bệnh tự nhiên, kích thước trứng đẻ ra có

thể nhỏ hơn bình thường (McFerran, McCracken et al., 1978) Tuy nhiên trong

gây bệnh thực nghiệm không chứng minh được điều này mặc dù vi rút EDS76 không gây bệnh

Nếu như gà có kháng thể trước khi vi rút tiềm ẩn được hoạt hóa, có thể thấy một bệnh cận lâm sàng kiểu khác Sản lượng trứng không đạt được ở mức bình thường và giai đoạn gà bắt đầu vào mùa đẻ chậm hơn so với bình thường Người ta cho rằng khi gà có kháng thể, sự lây lan của vi rút sẽ bị chậm lại Một bệnh cảnh tương tự cũng quan sát ở những đàn gà nuôi nhốt, tại đó quá trình lây lan vi rút bị chậm lại, hội chứng giảm trứng khó quan sát thấy

Tổn thương đại thể, không có tổn thương đặc biệt bên trong cơ thể của gà Chỉ có teo nhẹ buồng trứng và ống dẫn trứng Trong trường hợp bệnh tự nhiên, buồng trứng không hoạt động và ống dẫn trứng bị teo là những bệnh tích có thể quan sát được, nhưng không thường xuyên Việc khó quan sát những biến đổi bệnh đại thể có thể là do khó chọn đúng những gà đang mắc bệnh cấp tính

Với bệnh gây thực nghiệm, có thể thấy phù nề ở các nếp gấp của tử cung

và có dịch xuất tiết xuất hiện trong vòng 9-14 ngày sau khi gây nhiễm (Taniguchi

Yamaguchi et al., 1981) Đôi khi thấy lách sưng nhẹ, trứng bị nhũn và trứng ở

các giai đoạn phát triên khác nhau

2.1.3.5 Bệnh tích

Bệnh tích đại thể:

Bệnh tích thường biểu hiện ở buồng trứng và ống dẫn trứng, các bệnh tích khác thường không rõ ràng Điều này khiến cho việc lựa chọn gia cầm bị bệnh rất khó khăn

Bằng thực nghiệm khi gây bệnh bằng vi rút EDS, toàn bộ ống dẫn trứng bị

phù thũng 9-14 ngày (Taniguchi Yamaguchi et al., 1981), đặc biệt miệng phễu ở

phần trên của ống dẫn trứng và phần tử cung Lách bị sưng to, tế bào mễm nhũn, quan sát thấy nhiều giai đoạn phát triển của trứng trong xoang bụng

Bệnh tích vi thể:

Bệnh tích chủ yếu ở ống dẫn trứng, do vi rút nhân lên trong nhân tế bào biểu

mô, hình thành tiểu thể bao hàm sau gây nhiễm 7 ngày với sự thâm nhiễm của

các tế bào đại thực bào, tương bào, tế bào lympho, bạch cầu đa nhân trung tính

(Taniguchi et al., 1981; Smyth Platten et al., 1988)

Có thể phát hiện các biến đổi thoái hóa trong các tế bào biển mô trong lòng ống dẫn trứng Biến đôi bệnh lý chủ yếu ở tuyến tạo vỏ Vi rút nhân lên bên trong nhân của tế bào biểu mô và tạo thành các thể ân nhập nội nhân xuất hiện vào thời điểm sau 7 ngày trở đi Tế bào bị nhiễm vi rút bị bong ra và rơi vào xoang tử cung Quá trình viêm xảy ra nhanh và trầm trọng với sự xuất hiện của nhiều tế bào đại thực bào, các tương bào và các tế bào lâm ba cầu Mặc dù không quan sát thấy các thể ân nhập nội nhân vào ngày thứ 3 sau khi gà đã đẻ bình thường trở lại nhưng có thê phát hiện được kháng nguyên vi rút cho tới một tuần sau(Smyth,

bị méo mó, dị hình, nhọn đầu thì không phải là dấu hiệu của bệnh Tuy nhiên, bên cạnh các triệu chứng lâm sàng đã thu nhận được, người ta thường dùng phản ứng HI để chấn đoán khẳng định

Chẩn đoán vi rút học

Việc xác định gia cầm bệnh để lấy bệnh phẩm chẩn đoán phân lập vi rút cũng như chẩn đoán huyết thanh học rất khó khăn Khi phân lập được vi rút trong trứng gà bất thường được đẻ ra từ những gia cầm mái có kháng thể kháng EDS vi rút có thể kết luận chắc chắn gà bệnh Trường hợp phân lập được vi rút từ những trứng bất thường do những gia cầm mái không có kháng thể đẻ ra, cần giết con

mẹ để lấy bệnh phẩm phân lập vi rút, đặc biệt là từ miệng phễu ở phần trên của ống dẫn trứng

Để phân lập vi rút, có thể sử dụng phôi vịt hoặc phôi ngỗng của những con

mẹ không có kháng thể kháng EDS vi rút hoặc các loại môi trường tế bà chế từ vịt, ngỗng và gà Nếu chỉ dựa vào bệnh tích của phôi và tế bào không thể khẳng định chắc chắn mà cần tiến hành phản ứng HA (với hồng cầu gà 0,8%) để kiểm tra sự có mặt của vi rút trong nước trứng hoặc trong môi trường nuôi cấy tế bào, hoặc sử dụng phản ứng miễn dịch huỳnh quang với kháng thể đã đánh dấu Do sự nhân lên chậm của vi rút trên môi trường tế bào hoặc do số lượng vi rút trong bệnh phẩm ít, nên khi nuôi cấy trên môi trường tế bào vịt cần qua 2 lần cấy chuyển và 2-5 ần cấy chuyển trên môi trường tế bào gà mới được kết luận mẫu

âm tính với EDS vi rút

Chẩn đoán huyết thanh học

Thường sử dụng các phản ứng như HI, ELISA, DID (Double immunodiffusion), SN (Serum neutralixation) để chẩn đoán; tuy nhiên, trong trường hợp gia cầm bị nhiễm với một số loại adenovirus, hiện tượng miễn dịch chéo chỉ có thể phát hiện được nhờ phản ứng HI và SN (Adair, Todd et al 1986), do vậy phản ứng HI thường được lựa chọn để chấn đoán huyết thanh học EDS Trong phản ứng, sử dụng 4 đơn vị HA, hồng cầu pha loãng 0,8% Kháng nguyên là vi rút EDS nuôi cấy trên phôi vịt hoặc môi trường nuôi cấy

tế bào Để loại bỏ các yếu tố gây ngưng kết giả, trước đó cần xử lý huyết thanh với hồng cầu gà 10%

Kháng thể kháng EDS vi rút xuất hiện sau 5-7 ngày sau nhiễm, đạt cao nhất sau 4-5 tuần Gia cầm vẫn bài thải vi rút khi hàm lượng kháng thể HI cao, trong khi đó một số còn lại không sản sinh kháng thể nếu bài thải vi rút Cần lưu ý một

số đàn gia cầm bị nhiễm EDS từ trúng không sản sinh kháng thể trong suốt quá trình sống, chỉ khi triệu chứng lâm sàng được biểu hiện mới có kháng thể Vì vậy, khi phản ứng huyết thanh học cho kết quả âm tính (lúc 20 ngày tuổi) không

có nghĩa là đảm bảo đàn gia cầm không nhiễm EDSV

2.1.3.7 Phòng bệnh

Vệ sinh phòng bệnh

Vì vi rút lây qua trứng nên có thể có thể áp dụng các biện pháp để phòng bệnh như: Chọn gà giống từ những cơ sở giống chất lượng, không bị nhiễm vi rút, gà con phải được chọn từ những đàn gà được tiêm phòng cẩn thận

Đảm bảo vệ sinh phòng bệnh trong quá trình chăn nuôi, vận chuyển trứng, quá trình tiêm phòng Vì vi rút có nguồn gốc từ vịt và ngỗng nên cần nuôi hai loài này cách xa khu nuôi gà

Nếu đàn gà bệnh và gà không có bị bệnh được nuôi chung, cần tiến hành tách riêng rẽ trong quá trình chăn nuôi, ấp nở Nếu có điều kiện nên sử dụng các máy ấp trứng riêng rẽ, hoặc nếu không phải sử dụng các khay ấp nở riêng

Phòng bệnh bằng vắc xin

Hiện nay, vắc xin vô hoạt bổ trợ dầu được sử dụng rộng rãi để phòng EDS,dùng cho gà từ 14-16 tuần tuổi Hiệu giá HI sau khi sử dụng vắc xin có thể lên 8-9log2 Nếu đàn gà đã bị nhiễm EDS vi rút, hiệu giá lên đến 12-14log2 Kháng thể sản sinh sau khi tiêm vắc xin 7 ngày, đạt tối đa 2-5 tuần Độ dài miễn dịch của vắc

xin là 1 năm (Baxendale Lutticken et al., 1980; Cook and Darbyshire, 1981)

Tại Việt Nam, một số loại vắc xin phòng EDS có bán trên thị trường gồm: Nobilis ND+EDS 0.25, Nobilis ND+EDS 0.5, Nobilis G+ND+EDS, Nobilis IB+ND+EDS, Nobilis EDS (Intervet), Mediavac ND-EDS Emulsion, Mediavac IB+ND-EDS Emulsion, Ceva ND IB EDS K, Ceva ND EDS K, Ceva ND IB IBD EDS K (Cevasante Animale)

2.2 HIỂU BIẾT CHUNG VỀ VẮC XIN

2.2.1 Khái niệm

Vắc xin là loại thuốc sinh học làm tăng cường miễn dịch chống lại một căn bệnh cụ thể Một vắc xin điển hình có chứa một số lượng nhỏ nhân tố tương đồng với mầm bệnh Nhân tố này gọi là kháng nguyên Kháng nguyên kích thích

hệ thống miễn dịch của cơ thể để nhận diện nó như một vật ngoại lai, cơ thể tiêu diệt vật ngoại lai này và cơ thể cũng “nhớ” nó để mà hệ miễn dịch có thể nhận diện nó dễ dàng hơn và tiêu diệt mầm bệnh khi gặp lần sau

Vắc xin được sản xuất từ mầm bệnh gây ra mầm bệnh mà ta muốn phòng Vắc xin có thể từ các vi sinh vật chết hoặc được làm yếu đi hoặc các sản phẩm tinh khiết từ các vi sinh vật có một số loại vắc xin đang được sử dụng hoặc chỉ mới trong giai đoạn nghiên cứu các loại vắc xin này đại diện cho những chiến lược khác nhau nhằm giảm nguy cơ nhiễm bệnh trong khi tạo được đáp ứng miễn dịch có lợi cho cơ thể Đáp ứng miễn dịch là một phản ứng của cơ thể tạo được bảo hộ chống lại mầm bệnh Đáp ứng miễn dịch tạo ra kháng thể gọi là miễn dịch dịch thể Đáp ứng miễn dịch do các tế bào có vai trò tiêu diệt mầm bệnh gọi là miễn dịch tế bào

2.2.2 Nguyên lý

Vắc xin tạo ra trong cơ thể sống một đáp ứng miễn dịch Hệ thống miễn dịch của cơ thể hoạt động, sinh ra kháng thể dịch thể đặc hiệu hoặc kháng thể tế

bào chống lại những nhóm quyết định kháng nguyên của yếu tố gây bệnh, cơ thể

sử dụng vắc xin xuất hiện trạng thái miễn dịch thu được chủ động nhân tạo có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của yếu tố gây bệnh tương ứng

2.2.3 Những đặc tính cơ bản của vắc xin

 Tính sinh miễn dịch hay tính mẫn cảm

Đó là khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch dịch thể hoặc tế bào hay cả hai Tính sinh miễn dịch phụ thuộc vào kháng nguyên và cơ thể nhận kích thích Có nghĩa là phụ thuộc vào tính lạ của kháng nguyên, đường đưa của kháng nguyên

và cơ địa của mỗi cá thể động vật

 Tính kháng nguyên hay tính sinh kháng thể

Một vắc xin khi đưa vào cơ thể phải có khả năng kích thích cơ thể sinh ra kháng thể Các yếu tố gây bệnh có thể có nhiều Epitop khác nhau Trong đó có thể có Epitop quá nhỏ (Hapten) không có tính sinh kháng thể nếu để nguyên Muốn chúng sinh kháng thể chống lại mầm bệnh cần đổi chúng thành có tính kháng nguyên, thường kết hợp chúng với một protein mang tải vô hại

 Tính hiệu lực

Tính hiệu lực nói lên khả năng bảo hộ động vật sau khi được sử dụng vắc xin Một vắc xin đưa vào cơ thể, nhiều kháng thể được tạo ra nhưng không phải loại nào cũng có hiệu lực tức là tiêu diệt được yếu tố gây bệnh Do yếu tố gây bệnh có nhiều kháng nguyên khác nhau nên trong bào chế vắc xin trước tiên phải làm sao cho đáp ứng miễn dịch chống lại những nhóm quy định kháng nguyên thiết yếu, nghĩa là nếu đánh vào đó thì yếu tố gây bệnh bị tiêu diệt hoặc chí ít cũng không còn khả năng sinh hại nữa

Vì thế, trong nghiên cứu sản xuất vắc xin hiện nay người ta đang có những

cố gắng phân lập những kháng nguyên hay nhóm quy định kháng nguyên thiết yếu để làm cho vắc xin được thuần khiết và tiến tới có thể tổng hợp được chúng

Ví dụ: vi rút Gumboro thì protein VP2 là kháng nguyên thiết yếu; với vi

rút cúm gia cầm thì kháng nguyên H và N là thiết yếu; vi rút viêm gan B thì kháng nguyên bề mặt HBS là thiết yếu

Tính hiệu lực hay khả năng bảo vệ của vắc xin được đánh giá qua thực nghiệm, nhưng chủ yếu phải là đánh giá trên thực địa sau tiêm chủng ở các cá thể và mức độ miễn dịch quần thể, có thể thông qua hàm lượng kháng thể trung bình trong huyết thanh và tỷ lệ bảo hộ trong quần thể

+ Trên động vật thí nghiệm: Đánh giá mức độ đáp ứng miễn dịch sau tiêm

chủng vắc xin và đánh giá hiệu lực bảo hộ là động vật qua thử thách cường độc + Thử nghiệm thực địa: Vắc xin được tiêm chủng cho một quần thể động vật, theo dõi thống kê các phản ứng phụ, đánh giá khả năng bảo hộ khi mùa dịch tới đồng thời tiến hành thử thách cường độc một nhóm ngẫu nhiên trong quần thể Vắc xin có hiệu lực là vắc xin gây được miễn dịch ở mức độ cao và bảo vệ

cơ thể động vật lâu bền

Tuy nhiên, hiệu lực của một vắc xin phụ thuộc vào nhiều yếu tố như bảo quản, vận chuyển và kỹ thuật tiêm phòng Vì vậy, người ta đã xây dựng một môn khoa học mới gọi là vắc xin học (vắc xinology) mà mục đích là nghiên cứu mọi biện pháp từ lúc sản xuất đến lúc tiêu dùng để tăng tính hiệu lực của vắc xin

 Tính an toàn

Đây là một đặc tính quan trọng Sau khi sản xuất vắc xin phải được cơ quan kiểm định nhà nước kiểm tra chặt chẽ về mặt vô trùng, thuần khiết và vô độc

- Vô trùng: Không được nhiễm các vi sinh vật khác

- Thuần khiết: Không được lẫn các thành phần kháng nguyên khác có thể gây ra các phản ứng phụ

- Vô độc: Liều sử dụng phải thấp hơn rất nhiều so với liều gây độc

Sau sản xuất, vắc xin phải được thử tính an toàn qua nhiều bước thử trong phòng thí nghiệm, trên thực địa, thử ở quy mô nhỏ và đại trà

Tần suất và mức độ nặng nhẹ của các phản ứng phụ nếu có phải được xác định trước khi được đem ra dùng nhưng vẫn phải được theo dõi hết sức cẩn thận (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2009)

2.2.4 Sản xuất vắc xin bằng phương pháp vô hoạt vi rút

Vắc xin là một trong những công cụ can thiệp phòng bệnh (vắc xin vô hoạt) và dập dịch (vắc xin nhược độc) Việc giám sát vi rút để có nguồn chủng và thông tin di truyền, kháng nguyên xác định tính phù hợp giữa chủng vắc xin và chủng lưu hành là điều kiện tiên quyết đảm bảo cho sự thành công của giải pháp can thiệp bằng vắc xin Phát triển vắc xin vô hoạt chế từ chủng mới nhất phân lập tại thực địa có thể cung cấp công cụ cho giải pháp vắc xin

Vắc xin vô hoạt thường được sử dụng nhằm phòng hội chứng giảm đẻ ở gia cầm ở những vùng/khu vực chưa từng xuất hiện hội chứng giảm đẻ (vùng an toàn dịch) Việc sản xuất vắc xin vô hoạt được thực hiện bằng cách phân lập và nuôi cấy các chủng EDSV thực địa trong môi trường tế bào và tiến hành vô hoạt chúng bằng một số chất vô hoạt như formaline theo nghiên cứu của (Nyoman and

Syamsidar) bất hoạt vắc xin EDS bằng formaline 0,12% trong 48 giờ nhiệt độ

370C (Nyoman and Syamsidar) Hiệu quả của vắc xin vô hoạt có liên quan đến phương pháp vô hoạt cũng như nồng độ của vi rút trong liều vắc xin Vắc xin vô hoạt có ưu điểm lớn nhất là an toàn do chúng không có khả năng truyền lây sang các đàn lợn khác và không có khả năng phục hồi độc lực

2.2.5 Chất bổ trợ

Chất bổ trợ là những hợp chất hóa học được thêm vào trong vắc xin nhằm tăng khả năng kích thích miễn dịch và tăng hiệu lực của vắc xin.(Nguyen Ba Hien and Tran Thi Lan Huong, 2010)

Trong quá trình chế tạo, sử dụng thấy rằng nếu vắc xin chỉ chứa kháng nguyên khi dùng tiêm phòng tạo hiệu lực bảo hộ thấp, không kéo dài, phản ứng xảy ra với tỷ lệ cao, nhưng khi cho thêm những chất không phải là kháng nguyên vào vắc xin sẽ làm cho hiệu lực và thời gian bảo hộ của vắc xin tăng lên Các chất đưa vào vắc xin sẽ được gọi là chất bổ trợ Vậy chất bổ trợ vắc xin là những chất có hoạt tính kích thích miễn dịch không đặc hiệu dùng bổ sung vào vắc xin nhằm nâng cao hiệu lực và độ dài miễn dịch (Nguyen Ba Hien and Tran Thi Lan Huong 2010)

Chất bổ trợ vắc xin có ba tác dụng: Hấp thu và lưu giữ kháng nguyên trong cơ thể lâu hơn, không bài thải nhanh chóng kháng nguyên

Tạo kích thích đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể

Giảm kích thích phản ứng của độc tố (nếu có) trong vắc xin đối với cơ thể

Chất bổ trợ hữu cơ: bao gồm các loại dầu thực vật, dầu hướng dương, dầu lạc, dầu oliu, các loại mỡ động vật, các sản phẩm dầu khoáng hoặc montanide

50… Các chất bổ trợ hữu cơ khi hỗn hợp với kháng nguyên sẽ tạo thành dạng nhũ tương nước trong dầu Ở dạng nhũ tương kháng nguyên sẽ nằm trong dung dịch dầu Để khắc phục những nhược điểm của vắc xin nhũ nước trong dầu như

dễ phân lớp, rít kim khi tiêm, về sau người ta đã nghiên cứu chế tạo ra loại vắc xin dạng nhũ tương kép: nước trong dầu trong nước

Tác dụng của chất bổ trợ dầu trong vắc xin cũng tương tự như tác dụng của chất bổ trợ vô cơ Nhờ các phức hợp nhũ kháng nguyên - dầu - nước mà kháng nguyên tự do được giải phóng từ từ vào cơ thể để kích thích sản sinh kháng thể và tế bào miễn dịch đặc hiệu kéo dài Đồng thời các hạt nhũ cũng di chuyển từ chỗ tiêm vào các hạch lympho hoặc đến các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch để kích thích miễn dịch không đặc hiệu Kết quả là liều vắc xin giảm, hiệu lực miễn dịch tang cao, thời gian miễn dịch kéo dài

Chất bổ trợ là vi sinh vật: thường dùng là xác của một số loài vi khuẩn

như Mycobacterium tuberculosis hay Salmonella typhimurium Cũng có thể dùng

nội độc tố của các vi khuẩn lipopolysaccarid

2.3 HIỂU BIẾT CHUNG VỀ MIỄN DỊCH

Khi đưa vắc xin vào cơ thể, kháng thể chưa sinh ra ngay lập tức, mà phải sau một thời gian tiềm tàng, dài hay ngắn phụ thuộc vào kháng nguyên chứa trong vắc xin và sự xâm nhập của kháng nguyên trong vắc xin lần đầu hay lần thứ hai, thứ ba Sau đó kháng thể mới được sinh ra, lượng kháng thể tăng dần, đạt mức cao nhất rồi giảm dần và mất đi theo thời gian nhất định

Sử dụng vắc xin lần đầu đáp ứng miễn dịch được gọi là sơ cấp hay tiên phát Sử dụng vắc xin lần hai đáp ứng miễn dịch được gọi là thứ cấp hay thứ phát Trong đáp ứng miễn dịch thứ phát, thời gian tiềm tàng ngắn hơn, lượng kháng thể sinh ra nhiều hơn và thời gian xuất hiện kháng thể sớm hơn

Sự khác biệt của đáp ứng miễn dịch sơ cấp và thứ cấp là do vai trò của các

tế bào nhớ miễn dịch Trong đáp ứng miễn dịch thứ cấp, các tế bào này phát triển nhanh và mạnh, tạo ra một lớp tế bào sản xuất kháng thể nhanh và nhiều hơn nên kháng thể xuất hiện sớm, hàm lượng nhiều hơn rõ rệt Nếu cách lần dùng vắc xin đầu tiên 3-4 tuần , sử dụng tiếp lần thứ hai thì đáp ứng miễn dịch sẽ nhanh hơn, mạnh hơn, có thể gấp hàng trăm lần và thời gian miễn dịch dài hơn Đây là cơ sở khoa học cho việc tiêm phòng vắc xin nhắc lại tạo mức độ miễn dịch cao cho cơ thể Khi kiểm tra hàm lượng kháng thể trong cơ thể đã sử dụng vắc xin kết hợp với phương pháp công cường độc, người ta nhận thấy rằng: không phải kháng thể

cứ xuất hiện trong máu là con vật được bảo vệ khỏi sự tấn công của mầm bệnh cường độc mà lượng kháng thể phải đạt đến một trị số nhất định thì cơ thể mới có mức độ miễn dịch bảo vệ Trị số kháng thể này được gọi là ngưỡng bảo hộ Hàm lượng kháng thể càng cao hơn ngưỡng bảo hộ thì mức độ miễn dịch của cơ thể càng cao và ngược lại

Mỗi loại vắc xin khi đưa vào cơ thể sẽ gây ra đáp ứng miễn dịch và trạng thái miễn dịch ở động vật được duy trì một thời gian nhất định gọi là độ dài miễn dịch Tùy từng loại vắc xin mà thời gian này dài hay ngắn khác nhau, khi hết thời gian đó, cơ thể không con khả năng chống lại mầm bệnh nữa, vì vậy người ta phải tiến hành tái chủng

Như vậy để duy trì đáp ứng miễn dịch và nâng cao khả năng miễn dịch, cứ khoảng một thời gian nhất định nên tái chủng vắc xin một lần cho động vật tùy theo loại vắc xin, tùy theo động vật và tình hình dịch tễ

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.1.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vắc xin phòng hội chứng giảm đẻ gà (EDS)

- Nghiên cứu xác định liều gây nhiễm vi rút EDS trên phôi trứng vịt 10-11 ngày và thời gian thu vi rút trên phôi trứng vịt

- Nghiên cứu quy trình bất hoạt vi rút

- Nghiên cứu xác định chất bổ trợ sử dụng trong vắc xin

- Nghiên cứu xác định liều vi rút thích hợp trong vắc xin,

3.1.2 Đánh giá và kiểm tra chất lượng vắc xin phòng hội chứng giảm đẻ gà (EDS)

- Sản xuất 03 lô vắc xin phòng hội chứng giảm đẻ gà (EDS)

- Kiểm nghiệm vắc xin: Kiểm tra vô trùng, Kiểm tra chỉ tiêu vật lý, Kiểm tra an toàn, kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực

- Kiểm tra đánh giá độ dài miễn dịch

3.2 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng giảm đẻ trên gà (EDS’76) chủng EDS’76,

3.2.2 Địa điểm nghiên cứu

- Phòng thí nghiệm ATSH tại Công Ty CP Thuốc Thú Y Trung Ương 5

- Phòng nuôi động vật ATSH tại Công Ty CP Thuốc Thú Y Trung Ương 5,

3.2.3 Nguyên liệu

- Chủng vi rút EDS’76 thuộc sở hữu Công ty CP Thuốc Thú Y Trung Ương 5

- Phôi vịt 10-11 ngày tuổi khỏe mạnh từ trứng của đàn vịt bố mẹ khỏe mạnh chưa tiêm phòng vắc xin EDS,

- Động vật thí nghiệm: Gà chưa sử dụng vắc xin phòng bệnh EDS’76,

3.2.4 Các loại dung dịch, môi trường

Bộ 4 ống môi trường dùng để kiểm tra vô trùng: môi trường thạch máu,

môi trường thạch nấm, môi trường nước thịt, môi trường nước thịt gan yếm khí

Các dung dịch, hóa chất: NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, citrate natri 5%, nước cất hai lần, PBS, dung dịch formol 37 - 40%

Chất bổ trợ dầu Montanide ISA 71 VG của hãng SEPPIC Pháp

Hồng cầu gà 0,8%: Máu được lấy ở gà trống khỏe mạnh, không mắc bệnh

truyền nhiễm và ký sinh trùng, chưa được dùng vắc xin EDS’76 Dùng syringe

vô trùng lấy dung dịch Citrat natri 5%, tiếp theo chọc vào tĩnh mạch cánh của gà

để lấy lượng máu cần dùng ( tỷ lệ citrat natri : máu gà là 1:1) Chú ý hút từ từ cho khỏi vỡ hồng cầu, sau đó lắc đều nhẹ nhàng và chuyển qua ống nghiệm Hồng cầu được rửa ít nhất 3 lần với nước sinh lý bằng cách ly tâm với tốc độ 1500 vòng/phút trong 15 phút Sau khi ly tâm lần 3 thì đổ nước mặt ở phía trên, hút hồng cầu pha với nước sinh lý để có huyễn dịch hồng cầu 0,8%

Dép phòng thí nghiệm, găng tay, khẩu trang, mũ phòng thí nghiệm, quần

áo bảo hộ, ủng cao su, túi nilon, kính bảo hộ

Các loại dụng cụ:

Đĩa 96 giếng đáy chữ U, tip 50ul, 100ul, 200ul, và pipette tương ứng, ống facol 15, 50, khay đựng ống fancol, eppendorf, khay đựng eppendorf, hộp bảo quản mẫu, máng nhựa, cốc xả đầu tip, bơm tiêm, kim tiêm G18, bông cồn

3.2.5 Trang thiết bị máy móc, dụng cụ trong phòng thí nghiệm

- Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2, máy ly tâm lạnh, tủ lạnh âm sâu 800C,

tủ lạnh âm 300C, nồi hấp ướt, tủ sấy, máy gây nhũ, máy ấp trứng, tủ ấm lắc