Xác định tỉ lệ nhiễm vi khuẩn mrsa (methicillin resistant staphylococcus aureus) ở lợn nuôi tại tỉnh bắc ninh

aureus, chúng có khả năng đề kháng với những kháng sinh nhóm β-lactam bao gồm Methicillin, Penicillin, Amoxcillin và Oxacillin, là nguyên nhân gây ra một số bệnh nhiễm trùng khó điều tr

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGÔ THỊ THỦY

XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VI KHUẨN MRSA

(METHICILLIN RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS)

Ở LỢN NUÔI TẠI TỈNH BẮC NINH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong quyển luận văn là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Ngô Thị Thuỷ

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện thú y, tập thể cán bộ và nhân viên công tác tại Bộ môn Vệ sinh thú y - Viện thú y đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Ngô Thị Thuỷ

MỤC LỤC

Lời cam đoan I Lời cảm ơn II Mục lục III Danh mục chữ viết tắt V Danh mục bảng VI Danh mục hình, sơ đồ VII Trích yếu luận văn VIII Thesis abstract X

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Hiểu biết chung về vi khuẩn Staphylococcus aureus 3

2.1.1 Giới thiêụ chung 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái, cấu trúc 3

2.1.3 Tính chất nuôi cấy 4

2.1.4 Các yếu tố độc lực 5

2.1.5 Đặc tính gây bệnh 8

2.2 Hiểu biết chung về vi khuẩn Methicillin resisstant Staphylococcus aureus (MRSA) 10

2.3 Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn 11

2.3.1 Thuốc kháng sinh 11

2.3.2 Hiện tượng kháng thuốc 14

2.3.3 Sự kháng thuốc của Staphylococcus aureus 18

2.3.4 Sự kháng thuốc của Staphylococus aureus kháng Methicillin 19

2.3.5 Tình hình đề kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus và Staphylococcus aureus kháng Methicillin trên thế giới và Việt Nam hiện nay 20

2.3.6 Phương pháp xác định độ mẫn cảm của vi khuẩn gây bệnh đối với một số thuốc kháng sinh 23

Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 25

Thời gian nghiên cứu 25

3.2 Địa điểm nghiên cứu 25

3.3 Nguyên vật liệu, đối tượng sử dụng trong nghiên cứu 25

3.3.1 Đối tượng, vật liệu 25

3.3.2 Môi trường và hoá chất 25

3.3.3 Trang thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm 27

3.4 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 27

3.4.1 Nội dung 27

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 27

Phần 4 Kết quả và thảo luận 34

4.1 Kết quả điều tra tình hình sử dụng kháng sinh cho lợn tại Bắc Ninh 34

4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus và vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin 39

4.2.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus 39

4.2.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin 42

4.3 Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn Staphylococcus aureus và Staphylococcus aureus kháng Methicillin 44

4.3.1 Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn Staphylococcus aureus 44

4.3.2 Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin 46

Phần 5 Kết quả và kiến nghị 50

5.1 Kết luận 50

5.1.1 Kết quả điều tra tình hình sử dụng kháng sinh cho lợn tại Bắc Ninh 50

5.1.2 Kết quả phân lập vi khuẩn S aureus và MRSA 50

5.1.3 Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm của S aureus và MRSA 50

5.2 Kiến nghị 50

Tài liệu tham khảo 52

Phụ lục 56

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus

SCCmec Staphylococcus cassette chromosome mec

VRSA Vancomycin resistant Staphylococus aureus

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mồi được sử dụng trong Multiplex - PCR 26

Bảng 3.2 Bảng đánh giá đường kính vòng vô khuẩn của một số kháng sinh dùng trong nghiên cứu 32

Bảng 4.1 Kết quả tỷ lệ sử dụng thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh cho lợn 34

Bảng 4.2 Các loại kháng sinh được sử dụng trong thời gian điều tra 35

Bảng 4.3 Sự tuân thủ theo hướng dẫn sử dụng kháng sinh cho đàn lợn 36

Bảng 4.4 Kết quả phân lập S aureus trên môi trường thạch Baird Parker 39

Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh học của một số chủng Staphylococcus spp phân lập được 40

Bảng 4.6 Kết quả phân lập MRSA trên môi trường Chromagar MRSA 42

Bảng 4.7 Kết quả kiểm tra MRSA bằng kỹ thuật Multiplex PCR 42

Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của các chủng S aureus phân lập được tại Bắc Ninh 44

Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của các chủng MRSA phân lập được tại Bắc Ninh 47

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ

Hình 2.1 Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi điện tử 20,000x 4

Sơ đồ 3.1 Phân lập Staphylococcus aureus 29

Sơ đồ 3.2 Quy trình phân lập Staphylococcus aureus kháng Methicillin 31

Sơ đồ 3.3 Quy trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh

giấy kháng sinh 32

Hình 4.1 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus ở hộ chăn nuôi tại Bắc

Ninh 40 Hình 4.2 Kết quả kiểm tra bằng phản ứng multiplex PCR một số chủng MRSA

phân lập được tại tỉnh Bắc Ninh 43 Hình 4.3 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn MRSA ở hộ chăn nuôi tại Bắc Ninh 43

Hình 4.4 Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng S aureus phân lập

được tại Bắc Ninh 45 Hình 4.5 Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng MRSA phân lập

được tại Bắc Ninh 47

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Ngô Thị Thuỷ

Tên luận văn: Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn MRSA (Methicillin Resistant

Staphylococcus aureus) ở lợn nuôi tại tỉnh Bắc Ninh

Chuyên ngành: Thú y

Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích của nghiên cứu

- Đánh giá thực trạng ô nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus và Staphylococcus

aureus kháng Methicillin trên lợn tại Bắc Ninh

- Từng bước xây dựng hệ thống dữ liệu về kháng kháng sinh của vi khuẩn S

aureus và MRSA theo các tiêu chuẩn quốc tế về kiểm soát vi khuẩn kháng thuốc tại

Việt Nam

Phương pháp nghiên cứu

- Khảo sát hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh cho lợn theo sổ ghi chép nhật kí

sử dụng kháng sinh tại hộ chăn nuôi lợn

- Phương pháp lấy mẫu theo QCVN 01-83:2011/BNNPTNT

- Phương pháp phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus theo tiêu chuẩn

6888-1:1999

- Phương pháp phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin

bằng nuôi cấy cho ̣n lo ̣c trên môi trường đă ̣c hiê ̣u CHROMagar MRSA và kiểm tra xác nhâ ̣n vi khuẩn bẳng kỹ thuật Multiplex PCR

- Phương pháp kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng

Staphylococcus aureus và Staphylococcus aureus kháng Methicillin theo phương pháp

khoanh giấy kháng sinh của Kirby - Bauer

- Phương pháp xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft excel

Kết quả nghiên cứu

1 Kết quả điều tra tình hình sử dụng kháng sinh cho lợn tại Bắc Ninh

- Kết quả cho thấy trong 110 hộ được khảo sát trong thời gian điều tra thì có 85

hộ chiếm 77.3% có lợn bị ốm và trong số đó có 77 hộ chiếm 70% đã sử dụng thuốc kháng sinh để điều trị cho lợn ốm

- 54,6% các hộ chăn nuôi lợn được điều tra sử dụng phối hợp nhiều loại kháng sinh để điều trị bệnh cho lợn, kháng sinh đơn được sử dụng rất ít 53.6% hộ chăn nuôi

đã dùng liều theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất, bên cạnh đó có 44.3% đã dùng tăng hơn so với hướng dẫn và chủ yếu là tăng từ 1 - 2 lần (86.04%) Trong các hộ mua thuốc kháng sinh về sử dụng thì có tới 51.5% hộ không sử dụng hết lượng thuốc đã mua

2 Kết quả phân lập vi khuẩn S aureus và MRSA

Vi khuẩn S aureus được phát hiện ở 11 trong tổng số 82 mẫu thu thập được,

chiếm tỷ lệ 13,41% Vi khuẩn MRSA được phát hiện ở 5/82 mẫu, chiếm 6.1%

3 Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm của S aureus và MRSA

Vi khuẩn S aureus phân lập được mẫn cảm hoàn toàn (100%) với 3 loại kháng sinh, bao gồm: Linezolid, Rifampin, Fusidic acid Tuy vậy, S aureus kháng với 7 loại

kháng sinh trong đó có tới 4 loại đã kháng tuyệt đối (100%) bao gồm: Penicillin G, Erythromycin, Clindamycin và Kanamycin 3 loại kháng với tỷ lệ cao là Norfoxacin (54,55%), Tetracyclin (81,82%) và Trimethoprim - Sulfamethoxazole (72,73%)

Vi khuẩn MRSA phân lập được mẫn cảm hoàn toàn (100%) với kháng sinh: Linezolide, Rifampin và Fusidic acid MRSA kháng tuyệt đối với: Penicillin, Erythromycin, Clindamycin và Kanamycin Với các kháng sinh còn lại thì tỷ lệ kháng cũng khá cao: Norflorxacin đã kháng 60%,Trimethoprim-Sulfamethoxazole kháng 60%

và với Tetracyclin tỷ lệ kháng lên đến 80%

THESIS SUMMARY

Master student: Ngo Thi Thuy

Thesis title: Prevalence of MRSA among pigs raising in Bac Ninh province

Major: Veterinary Medicine

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research objectives

- To evaluate prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and

Staphylococcus aureus among pigs raising in Bac Ninh, Vietnam

- To develop a database on antibiotic resistance of MRSA and S aureus according to

international standards for controlling drug-resistant bacteria in Vietnam

Materials and Methods

- Collecting AMU information in pig farm by AMU record-book

- Sample collection following the QCVN 01-83:2011/BNNPTNT

- Staphylococcus aureus detection following ISO 6888-1:1999

- Methicillin resistant Staphylococcus aureus detection using CHROMagar MRSA and multiplex PCR

- Antibiotic susceptibility testing by Disk diffusion method (Kirby-Bauer)

Data analysis by Microsoft excel

Main findings and conclusions

- The results showed that in 110 surveyed pig farms, 85 farms were accounted for 77.3% of sick pigs, of which 77 (70%) farms had used antibiotics to disease treatment

- Most of surveyed pig farms (54.6%) use a combination of antibiotics to treat the sick pig Total of 53.6% pig farms used the dose according to the manufacturer's instructions, and 44.3% of them used the dose more than the recommendation dose and mainly increased 1-2 times (86.04%) Among households who buy antibiotics for using, 51.5% households do not use up all the purchased drugs

- All S aureus isolates was completely susceptible (100%) to 3 antibiotics,

including: Linezolid, Rifampin, Fusidic acid However, all the isolates were completely resistant (100%) to 4 antibiotic types including: Penicillin G, Erythromycin, Clindamycin and Kanamycin Three other antibiotics were high resistant to antibiotics such as Norfloxacin (54.55%), Tetracycline (81.82%) and Trimethoprim - Sulfamethoxazole (72.73%)

- All of the MRSA isolates were completely susceptible (100%) to Linezolid, Rifampin and Fusidic acid In addition, all the isolates were completely resistant (100%) to 4 antibiotics: Penicillin, Erythromycin, Clindamycin, and Kanamycin The MRSA isolates were highly resistant to the remaining antibiotics with Norfloxacin (60%), Trimethoprim-Sulfamethoxazole (60%), and Tetracycline (80%)

Research funding

The study was funded by VIDAPIG project (Danida): ”Health and Antibiotics

in Vietnamese Pig Production” (No.17 - M06 - KU)

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Staphylococcus aureus (Tụ cầu vàng - S aureus) và Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) là tụ cầu khuẩn gram (+), không di động, không

sinh nha bào, phân bố rộng rãi trong tự nhiên S aureus là một trong số các vi khuẩn kí sinh ở trên da và niêm mạc, vị trí cư trú thường gặp của S aureus là lỗ mũi trước Có khoảng 10 - 40% người khoẻ mạnh mang S aureus, nó có thể cư

trú thường xuyên, không thường xuyên

S aureus là một trong những vi khuẩn gây bệnh cơ hội hay gặp nhất vì có

mặt rộng rãi và thường xuyên Khi có những tổn thương ở da và niêm mạc kèm

theo những rối loạn về chức năng thì các nhiễm trùng do S aureus dễ dàng xuất hiện Staphylococcus aureus gây ra nhiều bệnh khác nhau: các bệnh trên da, làm

loét phỏng da hoặc các sự nhiễm trùng trong máu, phổi hoặc các mô khác,

S aureus là căn nguyên hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam, độc tố

ruột là yếu tố quyết định trong bệnh sinh của ngộ độc thực phẩm do S aureus

Hầu hết các chủng tụ cầu vàng đều sản xuất được men pelicillinasa , men này phá huỷ vòng beta-lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như Penicillin

G, Ampicillin, và Ureidopenicillin làm cho các kháng sinh này mất tác dụng

Methicillin resistant Staphyloccus aureus (MRSA) là một nhóm vi khuẩn

có khác biệt về mặt di truyền so với các chủng thuộc S aureus, chúng có khả

năng đề kháng với những kháng sinh nhóm β-lactam bao gồm Methicillin, Penicillin, Amoxcillin và Oxacillin, là nguyên nhân gây ra một số bệnh nhiễm

trùng khó điều trị ở người MRSA đôi khi còn được gọi là “siêu vi khuẩn” vì nó

không đáp ứng với nhiều loại kháng sinh

Vi khuẩn MRSA gây khó khăn trong quá trình điều trị và nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong Ngày 27/2/2017 tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã đưa ra danh sách 12 loại vi khuẩn nguy hiểm trên thế giới vì tình trạng kháng thuốc của chúng MRSA được xếp vào nhóm 2 mức nguy hiểm cao Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn này, ở Việt Nam các nghiên cứu tập chung chủ yếu tại các bệnh viện dành ngành y tế Chính vì

vậy tôi tiến hành nghiên cứu để tài: “Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn MRSA

(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) ở lợn nuôi tại tỉnh Bắc Ninh”

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Đánh giá thực trạng ô nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus và

Staphylococcus aureus kháng Methicillin trên lợn tại Bắc Ninh

- Từng bước xây dựng hệ thống dữ liệu về kháng kháng sinh của vi

khuẩn S aureus và MRSA theo các tiêu chuẩn quốc tế về kiểm soát vi khuẩn

kháng thuốc tại Việt Nam

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 HIỂU BIẾT CHUNG VỀ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS

2.1.1 Giới thiêụ chung

Staphylococcus aureus do Robert Koch phát hiện năm 1878 sau khi thực

hiện phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kì đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học

Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) thuộc giống tụ cầu khuẩn

(Staphylococcus) là những vi khuẩn hình cầu, tụ lại từng đám giống hình chùm nho

Staphylococcus aureus có vai trò và ý nghĩa đối với y học và thú y,

khoảng 30% người khỏe mạnh mang Staphylococcus aureus ở trên da và trên niêm mạc (Uwe Wollina, 2017), S aureus là một phần của hệ vi sinh vật có trong đường hô hấp trên (Schenck et al., 2016) , khi có những tổn thương ở da và niêm mạc hoặc những rối loạn về chức năng thì các nhiễm trùng do Staphylococcus

aureus dễ dàng xuất hiện (Nguyễn Như Thanh và cs., 1997)

Staphylococcus aureus cũng gây nên các nhiễm trùng ở các loài gia súc,

nhất là trong các cơ sở chăn nuôi tập trung có mật độ đàn gia súc lớn gây nhiều thiệt hại về kinh tế đáng kể (Nguyễn Như Thanh và cs., 1997)

Những nhiễm trùng do Staphylococcus aureus gây nên có nhiều biểu hiện

khác nhau, như các nhiễm trùng của da, của tổ chức dưới da hoặc trong các cơ quan nội tạng, gây mưng mủ điển hình, một số trường hợp chuyển sang chứng

nhiễm trùng huyết, bại huyết Staphylococcus aureus còn có khả năng hình thành

độc tố ruột trong thực phẩm, do đó có thể gây nên chứng nhiễm độc (Nguyễn Như Thanh và cs., 1997)

2.1.2 Đặc điểm hình thái, cấu trúc

Staphylococcus aureus là những cầu khuẩn được sắp xếp thành từng đám,

từng khối trông giống như chùm nho có đường kính mỗi đơn vị cầu khuẩn từ 0,8

- 1,0 µm Tuỳ vào tính chất của môi trường nuôi cấy, tụ cầu có thể xếp thành từng đôi Chúng không di động, không hình thành nha bào và thường không có

vỏ (Kiều Khắc Đôn và Nguyễn Lệ Phi, 1999)

Khi nhuộm theo phương pháp Gram, vi khuẩn bắt màu Gram dương Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy cảm với lysotaphin, một chất

có thể phá huỷ cầu nối pentaglycin của tụ cầu (Nguyễn Đỗ Phúc, 2013)

Hình 2.1 Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi điện tử 20,000x

- Môi trường thạch máu: vi khuẩn mọc rất tốt, sau khi nuôi cấy 24 giờ, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc dạng S (Nguyễn Như Thanh và cs., 1997)

Một số dòng S aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch máu, vòng

tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan máu nhỏ hơn so

với đường kính khuẩn lạc Hầu hết các dòng S aureus đều tạo sắc tố vàng,

nhưng các sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà thường thấy rõ sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng Sắc tố được tạo ra nhiều hơn trong môi trường có hiện diện lactose hay các nguồn hidrocacbon khác mà vi sinh vật này

có thể bẻ gãy và sử dụng

- S aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase Đây được xem là tính chất đặc trưng của S aureus, là tiêu chuẩn để phân biệt S aureus với các tụ câù khác Có hai dạng coagulase:

coagulase “cố định” (“bound” coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase “tự do” (“free” coagulase) được phóng thích khỏi thành tế bào Có hai phương pháp để thực hiện thử nghiệm coagulase là thực hiện trên lam kính và trong ống nghiệm Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase “cố định” bằng cách phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm phát hiện những coagulase

“tự do” bằng phản ứng gián tiếp với fibrinogen qua cộng hợp với những yếu tố khác trong huyết tương tạo thành từng khối hay cục (Collins, 1995)

Ngoài ra, chúng còn cho phản ứng DNAse, phosphatase dương tính, có khản năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose Tất cả các dòng

S aureus đều nhạy cảm với Novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi

trường chứa đến 15% muối NaCl (Trần Linh Thước, 2002)

- Môi trường thạch Sapman: Vi khuẩn lên men đường Mannit làm pH thay đổi, môi trường chuyển màu vàng

- Môi trường Gelatin: cấy vi khuẩn theo đường cấy trích sâu, nuôi ở nhiệt

độ 200

C, sau 2 - 3 ngày gelatin bị tan chảy giống hình dạng phễu

Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 150C, nhiều nhất là khi tăng trưởng ở 35 - 370C (Nguyễn Như Thanh và cs., 1997)

- Trên môi trường BP (Baird - Parker) khuẩn lạc đặc trưng của S aureus

có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1 - 1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2 - 5mm (do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thuỷ phân lòng đỏ trứng của lethinase) (Mary and John, 2002)

- Trên môi trường MSA (Manitol salt agar): hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn (do lên men đường manitol) (Mary and John, 2002)

2.1.4 Các yếu tố độc lực

2.1.4.1 Các yếu tố độc lực bên ngoài

Laminin và fibrolectin tạo thành mạng lưới dày đặc trên bề mặt biểu mô

và nội mạc của tế bào kí chủ

Fibrin được tạo ra từ tiền chất thúc đẩy quá trình đông máu và tổn thương mô

Adhesion tương tác với collagen giúp vi khuẩn bám lên tế bào mô bị hư hỏng, được tìm thấy ở các chủng gây bệnh viêm xương tuỷ và viêm khớp

Vỏ polysaccharide: một số chủng S aureus có thể tạo vỏ polysaccharide

Vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào

Thành vi khuẩn có teichoid acid (TE), lypoteichoid acid (LTA),

peptidoglycan (PGN), protein A S aureus còn có các protein giúp cho việc gắn

vào da dễ dàng Đó là các Clumping protein, Pindin protein

Sự kháng kháng sinh của S aureus: đa số S aureus kháng lại penicillin G,

kháng lại do vi khuẩn này sản xuất được men penicillin A nhờ gen của R.plasmid Một số còn lại kháng được Methicillin gọi là Methicillin resistent

Staphylococcus aureus (MRSA), do nó tạo được các protein gắn vào các vị trí tác

động của kháng sinh

2.1.4.2 Các loại độc tố

- Hemolysis: gồm bốn loại (alpha, beta, gamma, delta), mang bản chất protein gây tan máu beta, tác động khác nhau lên các hồng cầu khác nhau Có khả năng sinh kháng, gây hoại tử da tại chỗ và giết chết súc vật thí nghiệm

Alpha-hemolysis: làm hư hỏng màng tế bào mạnh nhất, có khả năng ức

chế thẩm thấu của màng, liên kết với các tế bào nhạy cảm như tiểu cầu, bạch cầu

có khả năng phân hủy hồng cầu tổn thương hồng cầu Alpha-hemolysin tiết ra sẽ gắn vào màng của tế bào nhạy cảm, sự gắn kết đó tạo thành một màng đầy nước tạo điều kiện thấm nước không kiểm soát được các ion và các phân tử hữu cơ nhỏ Khi các phân tử quan trọng đi qua như ATP, ion thì không thể đảo ngược thẩm thấu dẫn đến phá vỡ thành tế bào gây ra cái chết cho tế bào chủ

Beta-hemolysis: là một trong những exotoxins được sản xuất bởi hầu hết

các chủng S aureus, là protein có khả năng gây thoái hóa sphingomyelin gây ngộ

độc cho nhiều tế bào kể cả hồng cầu người

Delta-hemolysis: là một peptide rất nhỏ sản xuất bởi hầu hết các chủng S aureus, là một protein hoạt động bề mặt và có thể dễ dàng chèn thêm chính nó

vào cấu trúc màng kỵ nước và các kênh ion

Gamma-hemolysis: nhạy cảm với các loại hồng cầu của thỏ, cừu, người,

chuột, bò, ngựa Gây ra hoại tử nhẹ ở da thỏ, chuột, có thể gây chết thỏ

- Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc TSST (toxic shack syndrome toxin): thường gặp ở những phụ nữ có kinh dùng bông băng dày, bẩn hoặc những người nhiễm trùng vết thương Khó phân biệt độc tố này với enterotoxin F TSST kích thích giải phóng TNF (Tumor neerosis factor, yếu tố hoại tử u) và các interleukin I, II Cơ chế gây sốc của nó giống như độc tố ruột

- Độc tố exfoliatin hay epidermolitic: Là các men phá hủy thượng bì Men này gây tổn thương da tạo các bọng nước, Gây hội chứng phồng rộp và chốc lở

da ở trẻ em 85% các chủng S aureus thuộc loại phage nhóm II tạo độc tố này

Nó gồm hai loại A và B, đều là polypeptide, loại A bền với nhiệt độ 100℃/20 phút, còn loại B thì không Kháng thể đặc hiệu có tác dụng trung hòa độc tố này

- Alpha toxin: bản chất là protein gây tan các bạch cầu đa nhân và tiểu cầu, từ đó gây ra ổ áp xe, hoại tử da và tan máu Độc tố có tính kháng nguyên nhưng kháng thể của nó không có tác dụng chống nhiễm khuẩn

- Độc tố bạch cầu (Leucocidin): là nhân tố giết chết bạch cầu của nhiều loại động vật, bản chất là protein, không chịu nhiệt Tụ cầu gây bệnh có thể bị thực bào như tụ cầu không gây bệnh nhưng lại có khả năng phát triển bên trong bạch cầu Gồm hai mảnh F và S có thể tách rời nhau, trọng lượng phân tử là 3200

và 38000 Dalton Nếu hai mảnh này tách rời nhau thì chúng sẽ mất khả năng gây độc Chúng gây ra nhiễm trùng da và hoại tử

- Ngoại độc tố sinh mủ (pyrogenic): độc tố này tương tự như độc tố sinh mủ của liên cầu Protein ngoại độc tố này có tác dụng sinh mủ và phân bào lymphocyte, đồng thời nó làm tăng nhạy cảm với nội độc tố như gây shock, hoại tử gan và cơ tim Gồm ba loại ký hiệu A, B, C Ba loại này khác nhau về trọng lượng phân tử và

về tính đặc hiệu kháng nguyên, giống nhau về khả năng sinh mủ và phân bào

- Dung huyết tố (hemolycin staphylolycin): phá hồng cầu (tan máu) và gây chết các tế bào hạt cũng như đại thực bào

- Catalase: có chức năng bất hoạt hydrogen peroxide và các gốc tự do hình thành do hệ thống myeloperoxidase trong thế bào chủ

- Fribrinolysin (enzyme Staphylokinase): Nhiều chủng của S aureus thể

hiện một hoạt hóa plasminogen gọi là staphylokinase Nó làm phá hủy fibrin Là một enzyme đặc trưng cho các chủng gây bệnh ở người trong các cục máu và gây

vỡ các cục máu này tạo nên tắc mạch Cơ chế này giống với Steptokinase, được

sử dụng trong y học để điều trị bệnh nhân bị huyết khối động mạch vành

- Coagulase và yếu tố gây đông: coagulase là một enzyme ngoại bào sẽ gắn với prothrombin trong tế bào chủ hình thành phức hợp staphylothrombin

Coagulase là một chỉ thị thường dùng để phát hiện S aureus ở các phòng thí

nghiệm Tuy nhiên, đa số bằng chứng cho thấy rằng đây không phải là yếu tố gây độc, mặc dù chúng có thể tự bảo vệ khỏi sự thực bào và đáp ứng miễn dịch bằng cách gây đông Có một số nhầm lẫn về mối liên quan giữa coagulase và yếu tố

gây đông là yếu tố quyết định sự gắn kết fibrinogen trên bề mặt tế bào S aureus

Một vài nghiên cứu cho thấy thật sự chỉ có một lượng nhỏ coagulase trên bề mặt

tế bào vi khuẩn và chúng phản ứng với prothrombin làm đông sợi fibrin Nhưng những nghiên cứu di truyền chỉ ra rằng không thể giải thích rõ là coagulase và yếu tố đông có tồn tại riêng biệt hay không Bởi vì những đột biến thiếu coagulase vẫn duy trì hoạt tính yếu tố gây đông và thường đột biến thiếu yếu tố gây đông vẫn biểu hiện hoạt tính coagulase bình thường (Kenneth, 2005)

- Hyaluronidase: men này có khả phá hủy chất cơ bản của tổ chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong tổ chức Thủy phân axit hyaluronic của mô liên kết

- Beta- lactamase: men này phá hủy vòng beta lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và Uredopenicilline làm cho các kháng sinh này mất tác dụng

- Độc tố ruột (enterotoxin): Trong đó có SEB (Staphylococcal enterotoxin

B) Do một số chủng tụ cầu vàng tạo thành, đặc biệt lúc phát triển ở nồng độ

CO2 lớn (30%) và môi trường đặc vừa Đây là những loại protein tương đối chịu nhiệt không bị phân hủy bởi sự đun nấu Nó đề kháng với sự đun sôi trong 30 phút cũng như tác động của enzyme ở ruột Các độc tố ruột này gây nhiễm khuẩn thức ăn và viêm ruột cấp Bao gồm sáu loại được ký hiệu từ A-F Về mặt miễn dịch sáu loại này được phân biệt rõ ràng mặc dù chúng có kháng nguyên chéo về

cơ chế gây bệnh, kích thích tạo ra một lượng lớn interleukin I và II

2.1.5 Đặc tính gây bệnh

Tụ cầu vàng thường kí sinh ở da và mũi họng Vi khuẩn này gây bệnh cho những người bị suy giảm đề kháng do chúng có nhiều yếu tố độc lực Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây nhiều bệnh khác nhau (Lê Huy Chính, 2001)

- Nhiễm khuẩn da: do tụ cầu kí sinh trên da và niêm mạc mũi, nên nó có thể xâm nhập qua lỗ chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da Sau đó gây nên các nhiễm khuẩn sinh mủ: mụn nhọt, các ổ áp xe, eczema, hậu bối Mức độc các nhiễm khuẩn này phụ thuộc vào sự đề kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn Nhiễm tụ cầu ngoài da thường gặp ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch

- Nhiễm khuẩn huyết: tụ cầu vàng là vi khuẩn thường gây nhiễm khuẩn đường huyết nhất Do chúng gây nên nhiều loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễm khuẩn ngoài da, từ đây vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn đường huyết Đây là một nhiễm trùng rất nặng Từ nhiễm khuẩn đường huyết vi khuẩn

đi đến các cơ quan khác nhau và gây nên các ổ áp xe (gan, phổi, não, tuỷ) hoặc viêm nội tâm mạc Có thể gây nên các viêm tắc tĩnh mạch Một số nhiễm trùng khu trú này trở thành viêm mãn tính như viêm xương

- Viêm phổi: viêm phổi do tụ cầu vàng rất ít gặp Nó chỉ xảy ra sau khi viêm đường hô hấp do virus hoặc sau nhiễm khuẩn huyết Tỷ lệ tử vong ở những bệnh nhân này khá cao, vì nó được coi là bệnh nguy hiểm

- Nhiễm độc thức ăn và viêm phổi cấp

Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn uống phải độc tố ruột của tụ cầu, hoặc do tụ cầu cư trú ở ruột chiếm số lượng ưu thế, nguyên nhân là do sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn bình thường của đường ruột nhạy cảm với kháng sinh bị tiêu diệt và tạo điều kiện cho tụ cầu vàng kháng kháng sinh tăng trưởng về số lượng

Triệu chứng của ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng thường rất cấp tính Sau khi ăn phải thức ăn nhiễm độc tố tụ cầu 2 - 8 giờ, bệnh nhân nôn và đi ngoài dữ dội, phân lẫn nước càng về sau phân và chất nôn chủ yếu là nước Do mất nhiều nước và điện giải nên có thể dẫn tới sốc

- Nhiễm khuẩn bệnh viện do tụ cầu: thường rất hay gặp, nhất là đối với nhiễm trùng vết mổ, vết bỏng từ đó dẫn tới nhiễm khuẩn đường huyết Các chủng

tụ cầu này có khả năng kháng kháng sinh rất mạnh

- Về mức độ cảm nhiễm: ở gia súc, ngựa cảm nhiễm nhất rồi đến chó, bò, lợn, cừu Gà, vịt ít cảm nhiễm Người dễ cảm nhiễm với tụ cầu

- Trong phòng thí nghiệm: thỏ cảm nhiễm nhất Nếu tiêm 1 - 2ml canh khuẩn tụ cầu vào tĩnh mạch tai thỏ, sau 36 - 48 giờ thỏ chết vì chứng huyết nhiễm

mủ Mổ khám thấy nhiều ổ áp xe trong phủ tạng

Nếu tiêm canh khuẩn tụ cẩu vào dưới da cho thỏ sẽ gây áp xe dưới da

2.2 HIỂU BIẾT CHUNG VỀ VI KHUẨN METHICILLIN RESISSTANT

STAPHYLOCOCCUS AUREUS (MRSA)

Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) là cầu khuẩn Gram +, sinh men coagulase MRSA là chủng tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với

những kháng sinh nhóm β-lactam bao gồm Methicillin, Penicillin, Amoxcillin và Oxachillin, được coi là một loại “siêu vi khuẩn” vì hiện nay nó có khả năng đề kháng với rất nhiều loại kháng sinh mà trước kia có thể sử dụng để tiêu diệt MRSA trong các bệnh viện, trung tâm y tế,

Tại Mỹ vào năm 2005, có khoảng 19 000 người chết vì nhiễm trùng MRSA Tại Đức ước tính số người chết do nhiễm trùng tại bệnh viện có sự chênh lệch lớn, từ khoảng 1 500 đến khoảng 40 000 người chết mỗi năm

Dựa theo một số đặc điểm, MRSA được chia thành 2 nhóm là HA-MRSA

và CA-MRSA HA-MRSA là nhóm tụ cầu vàng đa kháng kháng sinh, có khả năng gây nhiễm khuẩn nặng và lan tràn ở những bệnh nhân nằm viện Trong khi

đó, CA-MRSA lại thông thường chỉ gây nhiễm khuẩn da và mô mềm ở những người khoẻ nạnh CA-MRSA đa số vẫn nhạy cảm với kháng sinh nhóm β-lactam, tuy nhiên chúng có thể sản xuất độc tố Panton-Valentine gây hại cho các tế bào miễn dịch Tuy nhiên, do một số người có thể nhiễm tụ cầu vàng ở cộng đồng rồi biểu hiện các dấu hiệu nhiễm khuẩn tại bệnh viện và ngược lại nên ranh giới giữa

2 nhóm ngày càng mờ đi

Vào năm 1940, Penicillin được đưa vào sử dụng cho các ca nhiễm khuẩn Tuy nhiên, chỉ 2 năm sau, chủng tụ cầu vàng kháng Penicillin đã được phát hiện Sau đó vào năm1959, Methicillin bắt đầu được sử dụng và chỉ một năm sau,

chủng S aureus kháng Methicillin được phân lập Sự kháng Methicillin vẫn diễn

ra đến ngày nay với nhiều chủng MRSA xuất hiện Vì sự sử dụng rộng rãi của

Vancomycin mà chủng S aureus kháng Vancomycin ở nồng độ trung bình

(VISA) đã lộ diện vào những năm 1990s Đó cũng là khoảng thời gian đánh dấu

sự có mặt của CA-MRSA trong cộng đồng Vào năm 2002, tụ cầu vàng kháng Vancomycin (ở nồng độ cao) đã được phân lập lần đầu tiên

MRSA là nguyên nhân phổ biến gây nhiễm trùng bệnh viện Tỷ lệ nhiễm cũng tăng ở những bệnh nhân nhập viện được điều trị với Quinolones, người có miễn dịch yếu, trẻ em, người già, nhân viên y tế (MRSA infections,

Keep Kids Healthy)

Con đường lây lan MRSA: MRSA lây lan qua tiếp xúc, vì vậy bất kì ai cũng có thể bị nhiễm MRSA khi tiếp xúc với người mang tụ cầu trên da, hoặc có thể bị nhiễm khi tiếp xúc các vật dụng có chứa tụ cầu khuẩn Chủng MRSA nhiễm khoảng 1% trong dân số mặc dù hầu hết trong số họ không bị nhiễm

Nhiễm trùng MRSA rất phổ biến trong số những người có hệ thống miễn dịch yếu và đang nằm viện, nhà điều dưỡng và các trung tâm chăm sóc sức khoẻ Nhiễm trùng có thể xuất hiện xung quanh vết thương trong phẫu thuật hoặc các dụng cụ như ống thông hay qua ống xông dạ dày Tỷ lệ lây nhiễm trong các bệnh viện, đặc biệt là đơn vị chăm sóc chuyên sâu đang gia tăng trên toàn thế giới Trong các bệnh viện ở Mỹ, MRSA chiếm hơn 60% các bệnh nhiễm trùng do tụ cầu

Triệu chứng khi nhiễm MRSA: nhiễm MRSA có thể là điển hình của

nhiễm trùng S aureus trên da, thường bắt đầu bằng việc tụ cầu xâm nhập qua

da từ chỗ bị tổn thương và phát triển thành nhiễm khuẩn Các triệu chứng bao gồm: đỏ, đau, sưng và nóng khi sờ vào có thể chảy dịch; viêm mô tế bào, tạo thành áp xe, … Hầu hết tình trạng viêm da MRSA khá nhẹ nhưng chúng có thể tiến triển và trở thành vết thương sâu hơn, nghiêm trọng hơn (Bệnh nhiễm khuẩn da tụ cầu)

Sự xâm nhập của MRSA ở lợn đã được báo cáo đầu tiên ở Hà Lan

(Andreas Voss et al., 2005) trong đó lợn được coi là nguồn lây nhiễm MRSA ở

người Hiện tại MRSA đã được xác định ở lợn ở Pháp, Đan Mạch, Hà Lan và

Singapore (Andreas et al., 2005), (Luca et al., 2007), (Aj et al., 2007) và phơi

nhiễm lợn đã được xác định là yếu tố nguy cơ đáng kể đối với sự xâm nhiễm của

MRSA ở người (Vandenbroucke and Beaujean, 2006), (Rijen et al., 2007) Các

báo cáo gần đây đã ghi nhận sự lây truyền MRSA rõ ràng giữa lợn và người chăn

nuôi và các thành viên gia đình họ (Andreas et al., 2005; Huijsdens et al., 2006)

Đặc biệt lưu ý là một nghiên cứu từ Hà Lan cho biết những người chăn nuôi lợn

có khả năng bị nhiễm khuẩn MRSA cao gâp 760 lần so với những người bình thường (Uwe, 2017)

2.3 TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN

2.3.1 Thuốc kháng sinh

2.3.1.1 Khái niệm

Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hoá học bán tổng hợp, tổng hợp với nồng độ rất thấp, có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự

phát triển hoặc diệt được vi khuẩn

Kháng sinh là những chất có tác động chống lại sự sống của vi khuẩn, ngăn vi khuẩn nhân lên bằng cách tác động ở mức độ phân tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hoá cần thiết của đời sống vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hoá

Thuốc kháng sinh là những chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp, phần lớn trong

số đó lúc đầu do xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sinh ra Với nồng độ thấp đã có tác dụng ức chế, tiêu diệt sự sinh trưởng hay phát triển của vi sinh vật gây bệnh, nhưng không hay hoặc rất ít độc cho người, gia súc, gia cầm (Bùi Thị Tho, 2003)

Kháng sinh có nhiều nguồn gốc khác nhau, có thể tổng hợp bằng phương pháp hoá học, ly trích từ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật

2.3.1.2 Phân loại kháng sinh

Có nhiều cách phân loại kháng sinh tuỳ theo mục đích sử dụng Ví dụ: phân loại theo nguồn gốc kháng sinh, theo công thức kháng sinh,

Dựa theo cấu trúc hoá học và tác dụng dược lí người ta sắp xếp kháng sinh theo các nhóm sau:

a Nhóm β-lactamin: gồm phân nhóm Penicillin, phân nhóm Cephalosporin, các chất ức chế β-Lactamase

b Nhóm Aminosid (AG-Aminoglycosid): Steptomycin, Kanamycin, Tobramycin, Neomycin, Gentamycin,

c Nhóm Phenicol: Chloramphenicol, Florphenicol, Thiamphenicol,

d Nhóm Tetracyclin: tetracyclin, chlotetracyclin, oxytetracyclin

e Nhóm Marcrolid: Erythromycin, Spiramycin,

f Nhóm Polypeptid: Tyrothricin, Bacitracin, Polymicin

g Nhóm Rifamycin: Rifamycin SV, Rifamycin

h Nhóm Lincomycin

2.3.1.3 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh hiện nay

Hiện nay ngành chăn nuôi đang chuyển dần theo phương thức chăn nuôi tập trung, xu hướng này đã và đang gây ô nhiễm môi trường, làm cho diễn biến dịch bệnh trên đàn vật nuôi ngày càng phức tạp và khó kiểm soát (Lê Việt Ly, 2009) Trước tình hình đó, người sản xuất coi kháng sinh là loại thuốc thú y quan trọng không thể thiếu trong chăn nuôi Việc lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp kháng

sinh là nguyên nhân gây nên tồn dư kháng sinh trong thực phẩm (Đậu Ngọc Hào,1999; Dang, 2010), tác động không tốt đến sức khoẻ cộng đồng, ảnh hưởng xấu đến môi trường, tạo điều kiện xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc

Trong khi ở các nước phát triển, tất cả các hoạt động liên quan đến sản xuất kinh doanh và sử dụng thuốc thú y nói chung và kháng sinh nói riêng được quy định và giám sát chặt chẽ vì thế không ảnh hưởng nhiều đến sức khoẻ con người thì ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam, các hoạt động này lại quy định và kiểm soát rất lỏng lẻo Năm 2001, tổ chức Y tế thế giới đã khẳng định ở các nước đang phát triển đang thiếu một sự kiểm soát cần thiết về sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, rất khó có thể tìm thấy các thông tin chi tiết về lượng

và loại kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi

- Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi lợn:

Tại Bắc Giang: trong nghiên cứu tình hình sử dụng kháng sinh trong

chăn nuôi lợn thịt, gà thịt ở một số trại chăn nuôi trên địa bàn tỉnh Bắc Giang năm 2014, thí nghiệm được thực hiện ở 20 trại chăn nuôi lợn thịt tại địa bàn tỉnh cho thấy có trên 17 loại kháng sinh được sử dụng trong các trại chăn nuôi Trong

đó có 6 loại kháng sinh được sử dụng phổ biến là: Norfloxacin (60,0%), Tylosinh (60,0%), Gentamycin (55,0%), Colistin (45,0%), Enrofloxacin (40,0%), Streptomycin (35,0%) Kết quả phân tích các mẫu thức ăn chăn nuôi lợn thịt phát hiện thấy Oxytetracyclin 30%, Chlotetracyclin 30%, Tylosin30%, Sulfadiazin 30%, Sulfamethazin là 20%, không có mẫu vượt tiêu chuẩn cho phép (QCVN 01-12:2009/BNNPTNT) (Dương Thị Toan và Nguyễn Văn Lưu, 2015)

Tại Đồng Nai: qua kết quả khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh ở 55

trại chăn nuôi lợn tại 2 tỉnh Đồng Nai và Bình Dương (2007) có 13 loại kháng sinh được sử dụng nhiều nhất là Tylosin (16,39%), Amoxicillin (11,9%), Gentamycin (8,61%0), Enrofloxacin (6,56%), Penicillin (6,15%), Lincomycin (5,74%), Tiamulin (5,74%), Colistin (5,33%), Streptomycin (4,51%), Norfloxacin (4,51%), Tetracyclin (4,1%), Ampicillin (4,1%) và Florphenicil (3,28%) Tỉ lệ mẫu thức ăn chăn nuôi có sử dụng kháng sinh lần lượt là: Tylosin 31/60 mẫu (51,67%), Tetracyclin: 25/60 mẫu (41,16%), Oxytetracyclin: 4/60 mẫu (6,6%) và Chlotetracyclin: 15/60 mẫu (25%)

Tại Đắk Lắk: Có 15 loại kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi lợn

(2010) Trong đó Oxytetracycline và Thiamphenicol (có tỷ lệ sử dụng như nhau 33,3%) là hai loại kháng sinh được sử dụng nhiều nhất, kế đến là Tetracyclin và

Colistin (6,7%), Tylosin (6,1%) Các loại kháng sinh còn lại thì được sử dụng với

tỷ lệ thấp (0,6 - 2,4%) Người nuôi lợn tại địa bàn không dùng các loại kháng sinh cấm sử dụng, các kháng sinh hạn chế sử dụng thì cũng được dùng với tỷ lệ thấp (Norfloxacin 1,2% và Marbofloxacin 0,6%)

Tại Bình Dương: Kết quả điều tra 628 hộ chăn nuôi lợn (2001 - 2002) ở

địa bàn Bình Dương có 26 loại kháng sinh được sử dụng Trong đó, kháng sinh thường sử dụng trong chăn nuôi lợn là Chloramphenicol (17,91%), Tylosin (16,47%), Colistin (14,46%), Norfloxacin (9,56%), Ampicillin (7,99%) Kiểm tra

103 mẫu gan, thận, cơ lợn, tỷ lệ tồn dư kháng sinh quá mức quy định (so với tiêu chuẩn Malaysia) là 45,63% Các kháng sinh tồn dư là Chloramphenicol, Oxytetracylin, Chlortetracylin, Norfloxacin, Tylosin

2.3.2 Hiện tượng kháng thuốc

2.3.2.1 Lịch sử phát hiện

Ngày 3/9/1928, Alexander Fleming là thầy thuốc xứ Scotland phát hiện ra kháng sinh Penicillin từ nấm Penicillinum notatum Năm 1941, kháng sinh này xuất hiện trên thị trường Mỹ nhưng chỉ ít lâu sau y giới đã quan sát thấy các ca đầu tiên vi khuẩn kháng lại kháng sinh

Năm 1943, nhà khoa học Mỹ gốc Nga S.Waksman tìm ra Streptomycin, một loại kháng sinh mới Đáng buồn là đến năm 1944 chính Fleming lên tiếng cảnh báo về hiện tượng kháng thuốc kháng sinh Năm 1947, ở Pháp đã có mạng lưới chính thức giám sát thuốc kháng sinh bị kháng

Ngày 12/6/2000, một báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã ước tính: Trong vòng 20 năm, bệnh lao có thể trở thành bệnh nan y do thuốc kháng sinh không còn hiệu lực Cả thầy thuốc lẫn bệnh nhân hiện nay không còn ai giữ được niềm phấn khởi như Bộ trưởng Bộ Y tế Mỹ tuyên bố năm 1969 là nhân loại

đã gần đi tới việc “đóng lại cuốn sách về các bệnh nhiễm khuẩn” Đã 20 năm nay, các hiệp hội thầy thuốc tổ chức mạng lưới phát hiện vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh, hầu hết các nước châu Âu có mạng lưới này ở cấp quốc gia

Như vậy, vi khuẩn kháng thuốc đã được quan tâm từ rất sớm

2.3.2.2 Khái niệm

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1976), một cá thể hoặc một loài vi khuẩn thuộc một loài nhất định được gọi là kháng thuốc nếu có thể sống và sinh sản trong môi trường có nồng độ kháng sinh cao hơn nồng độ ức chế sự sinh sản của

phần lớn những cá thể khác trong cùng một canh khuẩn hoặc những nòi khác cùng loài

Sự xuất hiện của kháng sinh cho phép giải quyết việc điều trị những bệnh nhiễm khuẩn Nhưng hiện tượng đề kháng kháng sinh đã tăng mạnh và sau đó vấn đề kháng thuốc đã được quan tâm ở quy mô toàn cầu

Kháng kháng sinh: kháng sinh phải đủ để tác động lên đích mới có hiệu quả Muốn vậy kháng sinh phải qua được màng (bằng kênh porin), không bị bơm ngược ra và phải thoát được các men phá huỷ hay biến đổi kháng sinh Bất cứ một thay đổi nào trên các yếu tố trên đều dẫn đến kháng kháng sinh

đề kháng tự nhiên với glycopeptide vì phân tử thuốc quá lớn, không qua màng vi

khuẩn (Luca et al., 2007)

b Kháng thu được

Sự đề kháng với tác nhân kháng khuẩn có thể là do thay đổi thông tin di truyền “nội sinh” bởi biến đổi nhiễm sắc thể, hoặc là do thu nhận một vật liệu di truyển “ngoại sinh” như các plasmid hay transposon

Biến dị: một số kháng sinh có thể bị đề kháng do vị tri tác dụng (đích vi khuẩn) bị ảnh hưởng bởi biến đổi nhiễm sắc thể như: β-lactamin, Chloramphenicol, Quinolon, Erythromycin,

Plasmid: đó là những phân tử ADN mạch kép, đóng vòng, ngoài nhiễm sắc thể, có thể tự sao chép, chuyển giao ổn định qua các thể hệ và thường không thiết yếu cho những chức năng sinh tồn của vi khuẩn Chúng là nguyên nhân của

sự đề kháng với một hay nhiều kháng sinh thuộc những họ khác nhau Việc thu nhận vật liệu di truyển mới này dẫn đến việc tổng hợp các protein mới và việc đề kháng có thể là do nhiều cơ chế sinh học Cuối cùng, các cơ chế khác nhau có thể

phối hợp: nhiều plasmid khác nhau có thể trùng hợp trong cùng một vi khuẩn và phối hợp với một đề kháng nội tại, dẫn đến đa đề kháng

Transposon: các plasmid đề kháng có thể tiến triển invitro do tiếp thu hay mất đi lần lượt những đặc tính đề kháng, hệ quả của tính chất chuyển giao được của phần lớn các gen Các transposon là hệ quả của ADN có thể đổi chỗ các replicon lẫn nhau (chuyển vị nội phân tử) hay tại một nơi khác của cùng một replicon (chuyển vị ngoại phân tử), mặc dù không có sự tương đồng giữa các ADN mà chúng tác dụng (Eugénie and Pierre, 2004)

Sự kháng chéo: vi khuẩn kháng một loại thuốc nào đó cũng có thể kháng với những thuốc khác có cùng cơ chế tác động Mối liên hệ như vậy thường gặp

ở những thuốc có thành phần hoá học gần giống nhau (VD: Polymycin B-Colistin, Erythromycin-Oleandomycin, Neomycin-Kanamycin) nhưng cũng có thể thấy giữa những thuốc không liên hệ hoá học (VD: Erythromycin-Lincomycin) (Muhannad, 2007)

2.3.2.4 Cơ chế đề kháng kháng sinh

Vi khuẩn phát triển nhiều cơ chế đề kháng để tạo nên đề kháng kháng sinh Những cơ chế chính mà các vi khuẩn dùng để chống lại tác dụng của kháng sinh được chia thành các loại sau:

- Khả năng gây bất hoạt của enzyme: β-lactamin, Chloramphenicol,

- Biến đổi đích vi khuẩn của kháng sinh: β-lactamin, Rifampicin, Quinolon, Tetracyclin,

- Làm giảm hay loại trừ khả năng thấm của kháng sinh vào vi khuẩn, gọi

là tính không thấm: β-lactamin, Quinolon, Tetracyclin,

- Thải trừ tích cực ra ngoài tế bào vi khuẩn: β-lactamin, Tetracyclin,

- Vi khuẩn thay đổi đường biến dưỡng làm mất tác dụng của thuốc

- Vi khuẩn có enzyme đã bị thay đổi

a Khả năng bất hoạt của enzyme: vi khuẩn sản xuất enzyme có thể thay đổi hoặc làm giảm tác dụng của kháng sinh, bằng cách này chúng phá huỷ hoạt tính của kháng sinh Cơ chế này được biết đến nhiều nhất và sớm nhất với penicillinase phá huỷ vòng β-lactam, biến penicillin thành penicilloic, làm mất tác dụng của thuốc Kháng sinh thuộc nhóm Aminoglycosis và Marcrolides cũng

bị đề kháng bằng cơ thế này

b Biến đổi đích vi khuẩn của kháng sinh: mỗi chất kháng sinh có đích tác động, điểm gắn kết khác nhau ở vi khuẩn Các đích cho kháng sinh có thể bị thay đổi hoặc được bảo vệ bởi sự gắn kết của một protein, do đó thuốc không thể gắn vào và tác động đến vi khuẩn Cơ chế đề kháng này xảy ra với hầu hết các kháng

sinh Staphylococcus aureus đề kháng Methicillin có một yếu tố di truyền gọi là

SCCmec (Staphylococcus cassette chromosome mec) chứa gen mecA mã hoá cho

sự sản xuất một PBP biến đổi (PBP2a), không bị tác động bởi sự gắn kết của kháng sinh nhóm β-lactamin Những vi khuẩn có gen này có khả năng đề kháng nhiều kháng sinh nhóm β-lactamin, ngay cả carbapenem Kháng sinh nhóm Aminoglycosis hoạt động diệt khuẩn bằng cách gắn kết với ribosome, ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn Sự sửa đổi ribosome do đột biến ở protein S12 của tiểu đơn vị 30S dẫn đến đề kháng với nhóm kháng sinh này (Nguyễn Minh Trí, 2000)

c Làm giảm hay loại trừ khả năng thấm của kháng sinh vào vi khuẩn: đây

là một cơ chế quan trọng của sự đề kháng ở vi khuẩn G - Thuốc đi vào vi khuẩn thông qua kênh ở ngoài màng, sự đột biến dẫn tới đóng hoặc làm giảm kích thước của kênh, thường đem lại đề kháng kháng sinh ở mức độ thấp Những thay đổi ở thành tế bào vi khuẩn G - dẫn đến giảm hấp thu kháng sinh vào trong tế bào vi khuẩn cũng dẫn đến đề kháng Cơ chế này xảy ra với các kháng sinh nhóm β-lactamin, Quinolones, Aminoglycosis, Sulfamethoxazole và Trimetoprim (Nguyễn Minh Trí, 2000)

d Thải trừ tích cực ra ngoài tế bào vi khuẩn: hệ thống bơm thoát dòng có tác dụng chuyển kháng sinh ra ngoài, làm giảm nồng độ thuốc trong tế bào của vi khuẩn Trước đây cơ chế này được biết đến như là một trong những cơ chế chính của vi khuẩn đề kháng với kháng sinh nhóm Tetracyclin mã hoá bởi gen Tet (Tet-pump) Hiện nay cơ chế này được đề cập đến như là một cơ chế đề kháng nhiều nhóm kháng sinh (đa đề kháng) với các bơm được mã hoá bởi các gen MefA/E (nhóm Marcrolides), AmrAB-OprA, MexXY-OprM và AcrD (nhóm Aminoglycosides),

e Vi khuẩn thay đổi đường biến dưỡng làm mất tác dụng của thuốc: một

số vi khuẩn kháng Sulfonamides, không còn cần PABA ở ngoài tế bào nữa để tổng hợp folic acid, mà có thể sử dụng folic acid có sẵn cho quá trình biến dưỡng

f Vi khuẩn có enzyme đã bị thay đổi: enzyme bị thay đổi vẫn còn thực hiện được chức năng biến dưỡng, nhưng ít bị ảnh hưởng bởi thuốc so với enzyme ở vi

khuẩn nhạy cảm Ví dụ: ở vi khuẩn nhạy cảm Sulfonamides, Tetrahydropteroic acid synthetasa có ái lực với Sulfonamides cao hơn nhiều so với PABA, còn ở vi khuẩn kháng Sulfonamides do đột biến thì ngược lại

Một số cơ chế này có ở những vi khuẩn G- và cả vi khuẩn G+: do enzyme gây bất hoạt kháng sinh, thay đổi đích của vi khuẩn Ngược lại tính làm giảm hay loại trừ khả năng thấm của kháng sinh chỉ thuộc về vi khuẩn G- Thật vậy, các vi khuẩn G+ không có màng ngoài nên rất dễ thấm ở lớp peptidoglycan, do vậy thường cho phép kháng sinh đi qua Hiện tượng thải trừ tích cực đã được mô tả ở các vi khuẩn G+ như các tụ cầu: một hệ thống thải trừ thuộc ATP bơm Macrolid

ra khỏi tế bào vi khuẩn ở các Staphylococcus spp (Eugénie and Pierre, 2004)

2.3.3 Sự kháng thuốc của Staphylococcus aureus

Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn đã được các nhà nghiên cứu đề cập từ khá lâu Nguyên nhân của sự kháng thuốc là việc sử dụng thuốc bừa bãi, thiếu kiểm soát kết hợp với khi sử dụng người dùng tự ý kết hợp nhiều loại kháng sinh cùng một lúc với mong muốn điều trị bệnh nhanh hơn hiệu quả hơn, nhưng đôi khi sử dụng không đủ liệu trình đã gây nên hiện tượng “nhờn thuốc” Thêm vào đó người ta không chỉ sử dụng thuốc kháng sinh trong việc điều trị và còn sử dụng không kiểm soát để bổ sung thuốc vào trong thức ăn dẫn đến tồn dư kháng sinh làm gia tăng nguy cơ kháng thuốc

Hầu hết các dòng S aureus kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau

Một vài dòng kháng với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ Vancomycin, và những dòng này ngày càng tăng Trong phòng thí nghiệm, người ta đã tìm thấy

plasmid kháng vancomycin ở Enterococus faecalis có thể chuyển sang S aureus,

người ta nghĩ rằng việc chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên, trong đường tiêu

hoá chẳng hạn Ngoài ra S aureus còn kháng với chất khử trùng và chất tẩy uế

(Kenneth, 2005)

Từ khi sử dụng Penicillin vào những năm 1940, tính kháng thuốc đã hình thành trong tụ cầu trong thời gian rất ngắn Nhiều dòng hiện nay đã kháng với hầu hết kháng sinh thông thường, và sắp tới sẽ kháng cả những kháng sinh mới Thật sự là trong hai năm gần đây, việc thay thế kháng sinh cũ bằng Vancomycin

đã dẫn đến sự gia tăng các dòng kháng Vancomycin VRSA (Vancomycin

resistant Staphylococus aureus) (Kenneth, 2005)

- Cơ chế kháng thuốc: Đã có những tổng quan trình bày về cơ chế kháng

lactam Có 3 cơ chế được giả định: một là vi khuẩn sản sinh ra men lactamase có khả năng xúc tác thuỷ phân β-lactam Hai là sử dụng các men transpeptidase màng tế bào nhạy với β-lactam (PBPs) Ba là trục xuất các phân tử (Kenneth Todar, 2005) β-lactam khỏi các tế bào G- bằng con đường bơm thoát Theo cơ chế thứ hai, việc kháng thuốc kháng sinh là do một enzyme có tên là PBP2a (Penicillin-binding protein), một chủng mới được phát hiện khác hẳn với

β-các chủng PBP khác do S aureus tạo ra Enzyme này xúc tác cho việc tạo thành

màng tế bào (của vi khuẩn) và quá trình này bị ức chế bởi β-lactam làm yếu vi khuẩn và có thể giết chết nó

2.3.4 Sự kháng thuốc của Staphylococus aureus kháng Methicillin

Methicillin là một penicillin bán tổng hợp chống lại men beta-lactamlase

được giới thiệu vào năm 1959, ngay sau đó chủng Staphylococcus aureus và

Staphylococci coagulase âm tính đề kháng Methicillin đã được báo cáo Sự bùng

phát của MRSA xảy ra ở Châu Âu vào đầu những năm 1960 (Jennifer et al.,

2014) Ba dòng MRSA gây đại dịch năm 1959 phân lập ở Đan Mạch và Anh Ngoài ra, loại phân tử của chủng MRSA thu thập từ nhiều khu vực địa lí phát

hiện 5 dòng MRSA chính trên toàn thế giới vào năm 2002 (Mark et al., 2002)

Các dịch do chủng MRSA liên quan cộng đồng đầu năm 2000 xuất hiện từ chủng của đại dịch trước đó

- Vi khuẩn MRSA kháng kháng sinh dựa trên di truyền, đề kháng thu được bởi sự thu nhận các yếu tố di truyền ngoại bào có chứa gen kháng thuốc Bao gồm plasmid, các yếu tố di truyền có thể thay thế vào đảo gen, được chuyển giữa các vi khuẩn thông qua chuyển gen ngang (Jensen and Lyon, 2009) Một đặc điểm xác định của MRSA là khả năng phát triển mạnh khi có kháng sinh nhóm penicillin - thường ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn bằng cách ức chế

tổng hợp thành tế bào Điều này là do một gen kháng, mecA, ngăn chặn kháng

sinh β-lactam làm bất hoạt các enzyme (transpeptidase) quan trọng cho sự tổng hợp thành tế bào (Chambers, 2001)

Các β-lactam gắn với các protein gắn Penicilin (PBP) cần thiết cho sinh tổng hợp màng tế bào và ngăn hình thành liên kết chéo peptidoglycan, dẫn đến ly giải tế bào vi khuẩn Đề kháng với β-lactam của MRSA được tạo ra do mắc phải một yếu tố di truyền di động, các nhiễm sắc thể băng tụ cầu (SCCmec) mang gen mec A mã hóa PBP biến đổi - PBP2a / PBP 20 - mà giảm ái lực với kháng sinh beta-

lactam Kết quả là sinh tổng hợp màng tế bào của MRSA tiếp tục ngay cả khi có sự

hiện diện của kháng sinh beta-lactam Mặc dù hiếm, kháng Methicillin của S

aureus có thể xảy ra bởi các cơ chế khác mecA Các cơ chế này gồm tăng sản xuất

β-lactamase và biểu hiện chất đồng đẳng mecA, gọi là mec C (Jennifer Dien Bard,

Janet A Hindler et al., 2014)

mecA: mecA là một gen biomarket chịu trách nhiệm kháng Methicillin và

các kháng sinh β-lactam khác Sau khi có được mecA, gen phải được tích hợp và

định vị trong nhiễm sắc thể S aureus (Franklin, 2003) mecA mã hoá protein gắn

với Penicillin 2a (PBP2a), khác với các protein gắn Penicillin khác vì vị trí hoạt động của nó không liên kết với Methicillin hoặc các kháng sinh β-lactam khác (Franklin, 2003) Như vậy, PBP2a có thể tiếp tục xúc tác phản ứng transpeptid hoá cần thiết cho liên kết ngang peptidoglycan, cho phép tổng hợp thành tế bào với sự hiện diện của kháng sinh Hậu quả của việc PBP2a không có khả năng tương tác với các gốc β-lactam, thu nhận mecA chống lại tất cả các kháng sinh nhóm

antibiotic-lactam ngoài Methicillin (Franklin, 2003), (Sahebnasagh et al., 2011)

mecA thuộc thẩm quyền của 2 gen quy định MECI và mecR1 MecI

thường được liên kết với trình khởi động mecA và hoạt động như một bộ đàn áp

(Jensen and Lyon, 2009), (Annalisa et al., 2007) Với sự hiện diện của một loại

kháng sinh β-lactam, mecR1 khởi tạo một tầng tải tín hiệu dẫn đến sự kich hoạt

phiên mã mecA (Pantosti et al., 2007, (Annalisa et al., 2007, Jensen and Lyon,

2009) Điều này đạt được nhờ sự phân tách qua trung gian MecR1 của Mecl, giúp giảm bớt sự đàn áp Mecl mecA được kiểm soát thêm bởi hai đồng ức chế Blal và BlaR1, bla1 và blaR1 tương đồng với mecl và mecR1 tương ứng và thường hoạt động như các chất điều chỉnh của blaZ, chịu trách nhiệm kháng Penicillin Trình tự DNA bị ràng buộc bởi Mecl và Blal giống hệt nhau (Franklin

D Lowy, 2003), do đó Blal cũng có thể liên kết toán tử mecA để áp chế sao chép mecA (Bächi, 1999)

2.3.5 Tình hình đề kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus và

Staphylococcus aureus kháng Methicillin trên thế giới và Việt Nam hiện nay 2.3.5.1 Tình hình đề kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus và Staphylococcus aureus kháng Methicillin trên thế giới

Năm 1941, Penicillin bắt đầu được đưa vào điều trị các bệnh nhiễm khuẩn

do Staphylococci thì năm 1943 đã xuất hiện chủng S aureus kháng penicillin

Ngay từ năm 1946 ở London, Barber và Garrod phân lập được 14% các

Staphylococcus aureus đề kháng với Penicillin do tiết ra men penicillinase tiêu

hủy kháng sinh Tỷ lệ này dã tăng lên nhanh chóng từ 38% năm 1947 đến 59% năm 1948 Tại Mỹ, sự đề kháng này hiếm thấy trước năm 1980, hiện nay đã phát triển với tỷ lệ đáng báo động (Eugénie and Pierre, 2004)

Tại Pháp từ năm 1948 hiện tượng này được Chabbert ghi nhận đến năm

2005 có 1629 ca tử vong, năm 2006 có 1652 ca tử vong liên quan đến MRSA chiếm 50%

Từ đầu những năm 1980, Vancomycin đã được đưa vào điều trị các nhiễm khuẩn do MRSA, đặc biệt là những ca nhiễm khuẩn bệnh viện Tuy nhiên chủng

S aureus giảm nhạy cảm với Vancomycin đã được tìm thấy ở Nhật Bản đầu tiên

vào năm 1997, sau đó ở một số nước khác như Úc, Đức,… gần đây 2 chủng

S aureus đề kháng hoàn toàn với Vancomycin đã được tìm thấy tại Mỹ năm 2002

Trong một nghiên cứu về Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng

Methicillin ở lợn và người chăn nuôi lợn nhằm đánh giá tỷ lệ nhiễm khuẩn MRSA ở lợn và người chăn nuôi lợn ở Ontario, Canada năm 2007, trong 285 mẫu gạc mũi và trực tràng thu thập được ở 285 con lợn từ 3 nhóm tuổi khác nhau

từ 20 trang trại lợn thì tỉ lệ nhiễm khuẩn MRSA tại các trang trại là 45% (9/20) trong khi tỷ lệ lưu hành tại lợn là 24,9% (71/285) Không có sự khác biệt trong

việc nhiễm MRSA ở các nhóm tuổi (Khanna et al., 2008)

2.3.5.2 Tình hình đề kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus và Staphylococcus aureus kháng Methicillin tại Việt Nam

Trong báo cáo “Hội nghị tổng kết công tác hội đồng thuốc và điều trị, hoạt động theo dõi sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thường gặp năm 2005”

nghiên cứu tại 5 bệnh viện cho kết quả S aureus (10,7%), Acinetobacter spp (10,3%), E coli (10,7%)

Khảo sát tại thành phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy các chủng S

aureus phân lập từ bệnh phẩm cho thấy có đến 94,1% chủng kháng Penicillin,

52,9% kháng Ciproflorxacin, 52% kháng Amoxcillin và 12,5% kháng Gentamycin (Nguyễn Thị Kê và cs., 2006)

Báo cáo “khảo sát tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện tại bệnh viện Thống Nhất từ 15/10/2004 - 30/6/2005” (Vũ Thị

Kim Cương, 2007) cho thấy Staphylocuccus spp kháng trên 65% với hầu hết các

kháng sinh, thậm chí đến 97,7% với Penicillin

Theo kết quả khảo sát tỉ lệ kháng kháng sinh và gen quy định độc tố

exfoliative toxins của các chủng Staphylococus aureus phân lâp tại viện Pasteur TP.HCM năm 2015 các chủng S aureus nghiên cứu được phân lập từ tháng 12

năm 2012 đến tháng 2 năm 2015 từ các mẫu bệnh phẩm: đờm, mủ, máu, nước tiểu, phân, dịch âm đạo, dịch niệu đạo tại khoa sinh học lâm sang - Viện Pasteur

TP.HCM thì trong tổng số 293 chủng S aureus được kiểm tra có 145/293 chủng

S aureus kháng Methicillin chiếm 49,7% và 147/293 chủng S aureus nhạy cảm

Methicillin chiếm 50,05% S aureus kháng với gần như tất cả các loại kháng

sinh được khảo sát Kháng sinh có tỉ lệ thấp nhất là Pristinamycin (2,4%) và cao nhất là Penicillin (86%) Tỷ lệ kháng Oxacilline tăng cao 49,7% Tất cả các

chủng còn nhạy cảm với kháng sinh Vancomycin (Ám et al., 2012)

Báo cáo “tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn Staphylococcus aureus”

kết quả nghiên cứu trên 235 chủng vi khuẩn của Phạm Hùng Vân năm 2005 Các

chủng S aureus từ 7 bệnh viện ở Đà Nẵng, Cần Thơ và thành phố Hồ Chí Minh cho thấy S aureus tỷ lệ kháng Methicillin 47%, Gentamycin 42%, Erythromycin

63%, Azithromycin 68%, Ciprofloxacin 39%, Cefuroxime 38%, clavulanic 30%, Cefepime 34%, Ticarcillin clavulanic acid 28%, Chloramphenicol 38%, Cotrimoxazol 25%, Levofloxacine 17% và chỉ 8% đối với Pifampicine

Amoxicillin-Nghiên cứu cho thấy vi khuẩn S aureus kháng Methicillin có tỷ lệ đề kháng các

kháng sinh cao hơn rất rỗ rệt so với vi khuẩn nhạy cảm Methicillin

Trong báo cáo sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại bệnh viện Thống Nhất trong năm 2006 của Cao Minh Nga đã phân lập được 1884

chủng vi khuẩn từ các bệnh phẩm Trong đó S aureus kháng kháng sinh chiếm 7,27%, xuất hiện chủng S aureus kháng ở mức trung gian với Vancomycin

chiểm 0,76%

Trần Thị Ngọc Ánh năm 2008 trong nghiên cứu sự đề kháng kháng sinh

của vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại bệnh viện nhi đồng tháng 2 năm 2007 đã phân lập được 2738 chủng vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm Trong đó có 311

chủng S aureus kháng Methicillin chiếm 33,5%

Theo Vũ Ngọc Hiếu, Phạm Hồng Nhung trong nghiên cứu mức độ kháng kháng sinh của một số vi khuẩn thường gặp gây nhiễm trùng da và mô mềm ở bệnh nhân đái tháo đường phân lập tại bệnh viện Bạch Mai, trên 487 bệnh nhân đái tháo đường có bệnh phẩm nhiễm trùng da và mô mềm dương tính với vi khuẩn từ ngày 1/1/2013 - 31/1/2017 tại khoa vi sinh, bệnh viện Bạch Mai tác

nhân hàng đầu phân lập được là Staphylococcus aureus chiếm 32.4% Tỷ lệ

Staphylococcus aureus kháng Methicillin là 53,7%

Trong báo cáo “Chọn lựa kháng sinh ban đầu trong điều trị nhiễm khuẩn tại một số bệnh viện ở thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 8/2009 đến tháng 8/2010” của GS.TS Nguyễn Thanh Bảo và PGS.TS Cao Minh Nga năm 2011, cho thấy có 6 loại vi khuẩn thường gặp nhất trong các loại nhiễm khuẩn bệnh

viện Trong đó S aureus chiếm 7,66%

2.3.6 Phương pháp xác định độ mẫn cảm của vi khuẩn gây bệnh đối với một

số thuốc kháng sinh

Thực tế không chỉ ở Việt Nam mà tại nhiều nước việc sử dụng kháng sinh không theo chỉ dẫn đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng phát triển, gây khó khăn cho công tác điều trị lâm sàng trong nhân y cũng như trong thú y Trong lâm sàng để lựa chọn thuốc điều trị thích hợp ngày càng khó khăn Một trong những hướng lựa chọn thuốc là xét nghiệm xác định độ mẫn cẩm của vi khuẩn gây bệnh với một số thuốc kháng sinh hay còn gọi là kỹ thuật kháng sinh đồ

Kháng sinh đồ là kỹ thuật tìm hiểu và đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với các loại kháng sinh, qua đó định hướng cho thầy thuốc sử dụng kháng sinh một cách khoa học, nhằm nâng cao hiệu quả điều trị, hạn chế hiện tượng nhờn thuốc, kháng thuốc của vi khuẩn

Có nhiều cách để đánh giá độ mẫn cảm của vi khuẩn với thuốc kháng sinh như phương pháp đặt ống trụ, khuếch tán trên thạch,… Trong đó, phổ biến nhất

là kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán dựa trên nguyên lý của Kirby-Bauer (Nguyễn Xuân Thành và cs.,2005) Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán có thể áp dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm vi sinh, trong các bệnh viện và cho các

trung tâm y tế Ưu điểm của kỹ thuật này là có thể cùng một lúc thử tác dụng của nhiều loại kháng sinh trên cùng một loại vi khuẩn Kỹ thuật này dựa trên nguyên

lý kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Mueler-Hinton có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm Mức độ khuếch tán phụ thuộc vào phân tử lượng của từng loại kháng sinh và vào độ dày của thạch trên đĩa petri Do đó, nồng độ kháng sinh càng gần khoanh giấy thì càng cao, càng xa khoanh giấy thì càng thấp Và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh Những vùng xung quanh khoanh giấy là vùng ức chế Đường kính của vòng vô khuẩn càng lớn thì chứng tỏ khả năng mẫn cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh đó càng cao, vi khuẩn đó nhạy cảm với kháng sinh Ngược lại, nếu đường kính nhỏ hay vi khuẩn mọc sát vào mép kháng sinh chứng tỏ vi khuẩn đó không nhạy cảm (kháng) với kháng sinh trong tẩm giấy

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 8/2018 đến tháng 6/2019

3.2 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Mẫu thí nghiệm được thu thập tại một số huyện thuộc tỉnh Bắc Ninh Thí nghiệm được thực hiện tại bộ môn Vệ sinh thú y, Viện thú y

3.3 NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 3.3.1 Đối tượng, vật liệu

Các chủng Staphylococcus aureus và Staphylococcus aureus kháng

Methicillin phân lập được từ mẫu tăm bông ngoáy mũi lợn

3.3.2 Môi trường và hoá chất

a Phân lập Staphylococcus aureus

- Môi trường tăng sinh Pepton Buffered Water (PBW) (Merck, Đức)

- Baird Parker agar (Merck, Đức)

- Thạch máu cừu 5% (Merck, Đức)

- Nutrient broth (Merck, Đức)

- Nutrient agar (Merck, Đức)

- Bộ thuốc nhuộm Gram (Merck, Đức)

- Huyết tương thỏ đông khô (Merck, Đức)

- H2O2 3% (Merck, Đức)

- Manitol salt phenol agar (Merck, Đức)

- BHI broth (Merck, Đức)

- Môi trường giữ giống vi khuẩn BHI glycerol 10%

b Phân lập MRSA

- Môi trường tăng sinh Pepton Buffered Water (PBW) (Merck, Đức)

- CHROMagar MRSA (CHROMagar, Pháp)

- Nutrient agar (Merck, Đức)

- Các mồi chạy Multiplex PCR (Bảng 3.1)