Hoàn thiện quy trình sản xuất quy mô công nghiệp vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại công ty tnhh mtv avac việt nam

Hiện nay, tại Việt Nam có 7 loại vắc xin PRRS nhập ngoại và 3 loại vắc xin PRRS sản xuất trong nước đã và đang được phép lưu hành nhưng chỉ có 01 vắc xin PRRS vô hoạt nhập khẩu vắc xin v

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ THỊ XIÊM

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT QUY MÔ

CÔNG NGHIỆP VẮC XIN VÔ HOẠT NHŨ DẦU PHÒNG

HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN

TẠI CÔNG TY TNHH MTV AVAC VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày … tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Lê Thị Xiêm

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Bá Hiên đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian

và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám Đốc, Ban Quản lý đào tạo,

Bộ môn Vi sinh Vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ công nhân viên tại công ty TNHH một thành viên Avac Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./

Hà Nội, ngày … tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Lê Thị Xiêm

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract xi

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thıết của đề tàı 1

1.2 Mục tıêu nghıên cứu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Hội chứng rối loạn sınh sản và hô hấp ở lợn 3

2.1.1 Lịch sử hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp 3

2.1.2 Tình hình phân bố và lưu hành hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp tại tại Việt Nam 4

2.2 Vırus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 6

2.2.1 Hình thái và cấu trúc virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 7

2.2.2 Sức đề kháng của virus và đặc tính nuôi cấy 8

2.3 Bệnh học hộı chứng rốı loạn sınh sản và hô hấp ở lợn 8

2.3.1 Triệu chứng lâm sàng và bệnh lý 8

2.3.2 Bệnh do virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn Type II thể độc lực cao 9

2.4 Miễn dịch đối với virus hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 10

2.5 Vắc xın phòng hộı chứng rốı loạn sınh sản và hô hấp 12

2.5.1 Hiểu biết chung về vắc xin 12

2.5.2 Những nguyên tắc chính để đảm bảo chất lượng trong sản xuất vắc xin,

chế phẩm sinh học ở quy mô công nghiệp 13

2.5.3 Sản xuất vắc xin bằng phương pháp vô hoạt virus 15

2.5.4 Sản xuất vắc xin bằng phương pháp nhược độc virus trên môi trường tế bào 16

2.5.5 Phương pháp sản xuất vắc xin thế hệ mới 17

2.6 Chất bổ trợ 21

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 23

3.1 Thời gian nghiên cứu 23

3.2 Địa điểm nghiên cứu 23

3.3 Nguyên vật liệu, đối tượng sử dụng trong nghiên cứu 23

3.3.1 Đối tượng, vật liệu 23

3.3.2 Hóa chất bất hoạt 23

3.3.3 Chất bổ trợ 23

3.3.4 Các loại dung dịch, môi trường 23

3.3.3 Trang thiết bị, dụng cụ 25

3.4 Nội dung nghiên cứu 26

3.4.1 Nghiên cứu sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn quy mô công nghiệp 26

3.4.2 Kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn ở quy mô công nghiệp 26

3.5 Phương pháp nghiên cứu 26

3.5.1 Quy trình tóm tắt sản xuất vắc xin PRRS trên quy mô công nghiệp 26

3.5.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào 27

3.5.3 Phương pháp gây nhiễm, thu hoạch và chuẩn độ virus PRRS 29

3.5.4 Phương pháp cô đặc, vô hoạt, nhũ hóa và kiểm tra sau nhũ hóa vắc xin 30

3.5.5 Kiểm tra thành phẩm vắc xin 32

3.5.6 Phương pháp IPMA (Immunoperoxidase monolayer assay): Phương pháp miễn dịch có gắn enzyme trên thảm tế bào một lớp 35

3.5.7 Phương pháp Elisa phát hiện kháng thể hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (theo TCVN 8400-21:2014) 37

3.5.8 Phương pháp phân lập virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (theo TCVN 8400-21:2014) 38

3.6 Xử lý số liệu 39

Phần 4 Kết quả và thảo luận 40

4.1 Tối Ưu quá trình sản xuất kháng nguyên VIRUS PRRS trên hệ thống chai roller 40

4.1.1 Tối ưu hóa quy trình nuôi tế bào Marc – 145 trên chai roller 40

4.1.2 Tối ưu hóa quy trình gây nhiễm, thu hoạch virus PRRS trên hệ thống chai roller 45

4.2 Tối ưu quá trình bất hoạt kháng nguyên sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu 48

4.2.1 Nghiên cứu quá trình cô đặc kháng nguyên 48

4.2.2 Nghiên cứu quá trình bất hoạt kháng nguyên 50

4.2.3 Xác nhận quá trình nhũ hóa, bổ sung chất bổ trợ vắc xin 52

4.2.4 Kiểm soát trong quá trình sản xuất vắc xin PRRS vô hoạt 54

4.3 Kiểm nghiệm thành phẩm vắc xin 58

4.3.1 Kiểm tra cảm quan 58

4.3.2 Kiểm tra vô trùng 59

4.3.3 Kiểm tra an toàn 60

4.3.4 Kiểm tra hiệu lực 62

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 69

5.1 Kết luận 69

5.2 Kiến nghị 69

Tài liệu tham khảo 70

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

BEI Binary Ethylenimine

CPE Cytophathogenic Effect

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium

DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid

ĐC Đối chứng

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

FBS Fetal Bovine Serum

FTM Fruit Thioglycolate Agar

GMP Good Manufacturing Practices

IPC In Process control

IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay

NBCS Newborn Calf Serum

NSP Non structural protein

OD Optical Density

OIE Office International des Epizooties

PBS Photphat Buffer Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome S/P Sample/Positive

SD Sabouraud dextrose agar

SP Structural protein

TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

TN Thí nghiệm

TRS Technical Report Series

TSA Trypticase Soy Agar

TSB Trypticase Soy Broth

WHO World Health Organization

XLD Xylose Lysine Deoxycholate

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Một số tên thường gặp trong các tài liệu 3

Bảng 2.2 Tổng hợp các ổ dịch PRRS xảy ra ở Việt Nam từ 2007-2016 6

Bảng 2.3 Các vắc xin đã thử nghiệm sản xuất 18

Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra khả năng phát triển tế bào Marc – 145 trong điều kiện có 5% CO2 và không có CO2 40

Bảng 4.2 Kết quả xác định lượng tế bào Marc-145 ra chai thích hợp 41

Bảng 4.3 Kết quả xác định tốc độ lăn phù hợp 42

Bảng 4.4 Khả năng sinh trưởng tế bào Marc – 145 trên chai roller 2X 44

Bảng 4.5 Kết quả xác định liều gây nhiễm thích hợp của virus PRRS chủng KTY-PRRS1 trên môi trường nuôi cấy tế bào 46

Bảng 4.6 Kết quả xác định thời gian thu hoạch thích hợp của virus PRRS chủng KTY-PRRS-01 trên môi trường nuôi cấy tế bào 48

Bảng 4.7 Hiệu giá virus sau khi cô đặc bằng phương pháp lọc tiếp tuyến 49

Bảng 4.8 Kiểm tra sản phẩm sau bất hoạt (bằng formaldehyde và BEI) 50

Bảng 4.9 Xác nhận quy trình bất hoạt bằng BEI 52

Bảng 4.10 Kết quả nhũ hóa vắc xin bằng dầu khoáng ISA 201VG 53

Bảng 4.11 Kết quả kiểm tra vô trùng vắc xin trước khi bất hoạt 54

Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra hiệu giá virus trước khi bất hoạt 55

Bảng 4.13 Kết quả kiểm tra quá trình vô hoạt virus vắc xin bằng BEI 56

Bảng 4.14 Kết quả kiểm tra vô trùng virus vắc xin sau khi bất hoạt 56

Bảng 4.15 Kết quả kiểm tra vắc xin sau khi nhũ hóa 57

Bảng 4.16 Kết quả kiểm tra vô trùng sau khi nhũ hóa 57

Bảng 4.17 Kết quả sản xuất thử nghiệm vắc xin PRRS 58

Bảng 4.18 Kết quả kiểm tra cảm quan vắc xin PRRS vô hoạt 59

Bảng 4.19 Kết quả kiểm tra vô trùng vắc xin 59

Bảng 4.20 Kết quả kiểm tra an toàn vắc xin PRRS ở lợn thí nghiệm 60

Bảng 4.21 Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp ELISA 63

Bảng 4.22 Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp IPMA 64

Bảng 4.23 Kết quả đánh giá công cường độc 66

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Bản đồ dịch tễ phân bố của PRRS tại Việt Nam từ 2007-2013 5

Hình 2.2 Hình ảnh về hình thái, cấu trúc của virus PRRS 7

Hình 2.3 Hình ảnh về cấu trúc bộ gen của virus PRRS 7

Hình 2.4 Gen từ các chủng virus khác nhau 19

Hình 3.1 Sơ đồ sản xuất vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp theo quy mô công nghiệp 27

Hình 4.1 Hình ảnh nuôi cấy tế bào trên chai roller 2X 43

Hình 4.2 Tế bào Marc-145 qua các thời điểm 45

Hình 4.3 CPE virus PRRS và đối chứng 47

Hình 4.4 Hiệu giá kháng thể (bằng ELISA, chỉ số S/P, tiêm vắc xin thời điểm D0, D21 và thử thách cường độc thời điểm D49) 51

Hình 4.5 Hiệu giá kháng thể (bằng phương pháp IPMA, tiêm vắc xin thời điểm D0, D21 và thử thách cường độc thời điểm D49) 51

Hình 4.6 Hình ảnh kiểm tra hạt nhũ hóa dưới kính hiển vi 53

Hình 4.7 Vắc xin PRRS vô hoạt sau chia liều 58

Hình 4.8 Một số hình ảnh kiểm tra vô trùng sản phẩm 60

Hình 4.9 Thân nhiệt lợn kiểm tra an toàn 61

Hình 4.10 Kiểm tra an toàn vắc xin 61

Hình 4.11 Ảnh lấy máu kiểm tra kháng thể kháng VIRUS PRRS 62

Hình 4.12 Hình ảnh kiểm tra IPMA 65

Hình 4.13 Lợn trước và sau khi công cường độc 67

Hình 4.14 Biến đổi thân nhiệt của lợn sau khi công cường độc 68

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Lê Thị Xiêm

Tên luận văn: Hoàn thiện quy trình sản xuất quy mô công nghiệp vắc xin vô hoạt nhũ

dầu phòng Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại công ty TNHH MTV Avac Việt Nam

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Chúng tôi áp dụng các kết quả đã thu được từ đề tài cấp nhà nước KC.04.15/11-15

do PGS.TS Nguyễn Bá Hiên chủ nhiệm đề tại và Học viện Nông nghiệp Việt Nam chủ

trì “Nghiên cứu công nghệ sản xuất vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh

sản và hô hấp ở lợn”, Tiến hành sản xuất vắc xin trên quy mô công nghiệp tại nhà máy

sản xuất vắc xin Avac nhằm hoàn thiện quy trình sản xuất quy mô công nghiệp để tạo ra

được sản phẩm vắc xin thương mại phục vụ cho công tác phòng bệnh

Phương pháp nghiên cứu

Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng:

Phương pháp sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu trên môi trường tế bào như: Nuôi cấy tế bào trên hệ thống chai roller, gây nhiễm, thu hoạch, cô đặc kháng nguyên, vô hoạt virus, nhũ hóa vắc xin

Phương pháp kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và

hô hấp ở lợn: kiểm tra cảm quan, vô trùng, thuần khiết, kiểm tra chỉ tiêu an toàn và hiệu lực theo TCVN 8685-13:2014

Kết quả chính và kết luận

Hoàn thiện quy trình sản xuất kháng nguyên virus PRRS trên hệ thống chai roller với quy mô 100 lít kháng nguyên/mẻ

- Nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống chai roller tối ưu trong điều kiện không

CO2 với lượng tế bào ra ban đầu là 1x105 Cells/ml, sau 72h cấy chuyển tế bào 1 lần và tốc độ lăn 0,2 đến 0,3 rpm.Liều gây nhiễm thích hợp nhất đối với virus hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp chủng KTY - PRRS - 01 trên môi trường nuôi cấy tế bào Marc -

145 là 104 TCID50. Thời gian thu hoạch huyễn dịch virus PRRS thích hợp nhất, hàm

lượng virus cao, chất lượng tốt là sau gây nhiễm virus 72 giờ

- Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp được bất hoạt theo

quy trình thích hợp bằng BEI tại nồng độ 1mM trong 24h tại 370C, hiệu giá virus trước

khi bất hoạt 108 TCID50/liều và nhũ hóa bằng dầu khoáng kép ISA 201 VG sản xuất thành công 03 lô liên tiếp quy mô tối thiểu 20.000 liều/mẻ

- Đã đánh giá vắc xin phòng hội chứng rối loạn sinh và hô hấp ở lợn quy mô công nghiệp, vắc xin sản xuất ra đảm bảo theo tiêu chuẩn TCVN 8685-13:2014 thuần khiết

và an toàn khi tiêm gấp đôi liều sử dụng và có tỷ lệ bảo hộ cao

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Le Thi Xiem

Thesis title: Optimizing the industrial scale production process of inactivated emulsion

vaccine for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome in AVAC Vietnam Limited Company

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives

We apply the results obtained from the study "Research on inactivation vaccine

production technology of the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome in pigs” in production line at the factory, optimizing the production process to develop

commercial vaccine products on the industrial scale

Materials and Methods

Methods were applied in this study: traditional methods for studying virus including Cell culture, virus culture, determination of virus titer on cell line and virus inactivation Methods for testing PRRS inactivated vaccine including sterilization, purification tests, and safety tests and potency tests follow Vietnamese National Standards 8685-13:2014

Main findings and conclusions

Completing the industrial scale production process of antigen for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome in roller bottle, scale of 100 liters antigen/lot Marc-145 cell is cultured by roller bottle system at 37oC without CO2 and rolling speed is 0.2 - 0.3 rpm The cell density started 1x 105 cells/ml and scaled up every 72 hours Marc - 145 cells have infected by 104 TCID50/ml of PRRS virus strain KTY-PRRS-01 and virus have harvested after 72 hours

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus is inactivated by BEI at a concentration of 1mM in 24 hours at 37 0C with titer of virus before inactivated is 108TCID50 per dose The Vaccine emulsified using Montanide ISA 201 VG

In this study, we have produced 3 batches of PRRS inactivated vaccine in the industrial scale with 20.000 doses/lot

The vaccine has met requirements of sterility tests, safety and potency tests in the industrial scale

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Chăn nuôi lợn Việt Nam có một vai trò kinh tế quan trọng, là nguồn thực

phẩm thịt lớn nhất Theo thống kê kết quả sản xuất chăn nuôi Việt Nam trong năm 2018 tổng đàn lợn nước ta 28.151.948 con cung cấp 3.816.414 tấn thị ra

ngoài thị trường (Trang Chăn nuôi Việt Nam, 2018)

Người chăn nuôi lợn gặp nhiều khó khăn về dịch bệnh, hội chứng Rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) bùng phát lần đầu tiên ở nước ta ngày 12/03/2007, sau đó lây lan rộng khắp các tỉnh miền bắc gây chết 70.577 con

và tiêu hủy 20.366 con trong vùng dịch Năm 2010, sau đợt dịch lớn thứ hai bao phủ 49 tỉnh thành, số lợn chết và tiêu hủy là 1.291.349 con (Nguyễn Ngọc Tiến, 2011)

Bệnh gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi nhưng hiện tại chưa có công

cụ phòng chống hữu hiệu có thể áp dụng như quy trình chuẩn, do vậy mỗi tập đoàn, vùng hay cơ quan có thẩm quyền của mỗi quốc gia có những quy định phòng chống khác nhau Ở những vùng đã có dịch, đa số các tập đoàn cũng như người chăn nuôi chọn giải pháp vắc xin Các nhà chăn nuôi và thú y thực địa tin tưởng là tiêm vắc xin thường xuyên, thay vắc xin phù hợp chủng khi có biến chủng là biện pháp hữu hiệu nhất để kiểm soát và khống chế thiệt hại do PRRS gây ra

Hiện nay, tại Việt Nam có 7 loại vắc xin PRRS nhập ngoại và 3 loại vắc xin PRRS sản xuất trong nước đã và đang được phép lưu hành nhưng chỉ có 01 vắc xin PRRS vô hoạt nhập khẩu (vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn hô hấp, sinh sản lợn của Công ty Chengdu- Trung Quốc, chủng NVDC-JXA1 thuộc dòng Bắc Mỹ) Trong nước hiện nay chưa có công ty nào sản xuất được vắc xin vô hoạt phòng PRRS Với mục tiêu đa dạng các sản phẩm vắc xin thương mại trên thị trường để phục vụ việc lựa chọn vắc xin phù hợp cho từng đối tượng lợn trong phòng chống bệnh PRRS, nên ngoài vắc xin nhược độc thì việc chủ động trong công nghệ sản xuất vắc xin vô hoạt từ các chủng virus PRRS phân lập được tại Việt Nam cũng là việc làm hết sức cần thiết Vắc xin vô hoạt được đánh giá cao với các ưu điểm về tính an toàn, hiệu quả phòng bệnh cao nên được người dân ưu tiên sử dụng trong chăn nuôi

Trên cơ sở thành công của đề tài cấp Nhà nước KC.04.15/11-15 do

PGS.TS Nguyễn Bá Hiên làm chủ nhiệm “Nghiên cứu công nghệ sản xuất vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn” đã nghiên cứu

thành công vắc xin vô hoạt phòng hôi chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong phòng thí nghiệm (Phạm Văn Sơn 2018), từ đó đặt ra yêu cầu hoàn thiện quy trình sản xuất để tạo ra được sản phẩm vắc xin thương mại trên quy mô công nghiệp để phục vụ cho công tác phòng bệnh Từ thực tế đó chúng tôi nghiên cứu

đề tài “Hoàn thiện quy trình sản xuất quy mô công nghiệp vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại công ty TNHH MTV Avac Việt Nam”

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu hoàn thiện quy trình vắc xin Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRS) trên hệ thống chai roller với quy mô

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN

2.1.1 Lịch sử hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp

Theo nghiên cứu của Keffaber K(1989), hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lần đầu tiên được mô tả vào cuối những năm 1980 ở Bắc mỹ Với tên là

"bệnh bí hiểm" (Mystery swine disease) bởi tính tự nhiên khó hiểu của bệnh nguyên Bệnh được phát hiện trên đàn lợn nái ở phía Bắc California, Iowa, và Minnesota Đáng ngạc nhiên là bệnh này đã không được xác định cho đến khi có các báo cáo về một vài dịch bệnh trên đàn lợn nái ở Ấn Độ "Bệnh bí hiểm" đặc trưng bởi các biểu hiện rối loạn sinh sản (sảy thai, đẻ non, chết non, xác cứng, sức sống yếu, tỷ lệ chết của lợn con cao và rối loạn hô hấp trên đàn lợn choai (Keffaber K, 1989, Loula, 1991) Bệnh lưu hành rộng rãi ở Mỹ sau đó lan sang Canada vào năm 1988 Ở châu Âu, cuối tháng 11 năm 1900 bệnh mới ở lợn nái

và lợn con được ghi nhận lần đầu tiên tại vùng Munster Đức (EC, 1991), sau đó bệnh làn lượt được ghi nhận tại Hà Lan, Pháp, Bỉ, Anh và Đan Mạch theo các

báo cáo của Paton, Goyal (Paton et al., 1991, Paton et al., 1991, 1992, Goyal,

1993) Đến năm 1994, PRRS được chính thức công bố xuất hiện ở 16 nước thuộc

3 châu lục (châu Mỹ, châu Á và châu Âu) (Shimizu, Yamada et al., 1994)

Bảng 2.1 Một số tên thường gặp trong các tài liệu

lâm sàng

Bệnh bí hiểm ở lợn Mystery swine disease (MSD) Khi chưa phát hiện ra

nguyên nhân Bệnh tai xanh Blue-eared pig disease Tai một số lợn có

màu xanh Hội chứng hô hấp

sinh sản và hô hấp ở

lợn

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS)

Rối loạn sinh sản và bệnh

syndrome" (PEARS) (Terpstra et al 1991), "Bệnh lợn tai xanh" (White, 1991)

Hội nghị quốc tế về PRRS này được tổ chức tại St Paul, Minnesota đã nhất trí dùng tên PRRS và đã được Tổ chức Thú y thế giới công nhận, chính thức gọi là

"Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên lợn" (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome-PRRS), căn nguyên bệnh được gọi là virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

virus – virus PRRS)(Morrison et al., 1992)

PPRS được xếp vào nhóm B trong danh mục các bệnh của Tổ chức Sức khỏe Động vật Thế giới Theo nghiên cứu của Collin ( 1991) và Murtaught (1995) dựa theo cấu trúc gen của virus, người ta đã xác định được hai nhóm virus: nhóm I gồm những virus thuộc dòng châu Âu mà đại diện là virus Lelystad

và nhóm II gồm những virus thuộc dòng Bắc Mỹ mà tiêu biểu cho nhóm này là chủng virus VR-2332

Từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ trên hầu hết các châu lục đều đã báo cáo về sự lưu hành của virus PRRS Đặc biệt, kể từ năm 2006, một biến chủng mới của virus PRRS xuất hiện ở Trung Quốc và nhanh chóng lan

rộng ra nhiều nước ở Đông Nam Á như Việt Nam (Feng et al., 2008), Ấn Độ,

thời gian đó Nguyễn Lương Hiền và Ngô Thành Long., 2001) Tuy nhiên, trong

những năm tiếp theo, các nghiên cứu về bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với PRRS rất khác nhau từ 1,3% cho tới 68,29% (Cục Thú y, 2007)

Điều tra huyết thanh học của các tác giả Akemi Kamakawa et al., (2006) từ

năm 1999-2003 cho thấy tỷ lệ lợn có kháng thể kháng virus PRRS tại Cần Thơ là 7,7% (37/478 mẫu dương tính với virus PRRS) Như vậy có thể thấy kháng thể kháng virus PRRS đã xuất hiện và lưu hành tại nước ta trong một thời gian dài Tuy nhiên, kể từ khi xác định được lợn có kháng thể kháng virus PRRS ở đàn lợn giống nhập từ Mỹ, tại Việt Nam chưa từng có vụ dịch PRRS nào xảy ra

Ổ dịch đầu tiên xảy ra năm 2007 tại 4 tỉnh Hưng Yên, Hải Dương, Hải Phòng và Thái Nguyên (Nguyễn Ngọc Tiến, 2011) Sau đó dịch PRRS xuất hiện khắp 3 miền Bắc, Trung, Nam Đến năm 2008, dịch PRRS gây hậu quả nghiêm trọng trên địa bàn các tỉnh thành trong cả nước và từ đó tới nay không năm nào dịch PRRS không xảy ra, đe dọa tổn thất cho ngành chăn nuôi lợn Dưới đây là những dẫn liệu sơ bộ về không gian và thời gian các ổ dịch PRRS đã xảy ra tại Việt Nam từ 2007-2016

Hình 2.1 Bản đồ dịch tễ phân bố của PRRS tại Việt Nam từ 2007-2013

Nguồn: Đỗ Hữu Dũng (2015)

Bảng 2.2 Tổng hợp các ổ dịch PRRS xảy ra ở Việt Nam từ 2007-2016

Năm Tỉnh Quận/Huyện Xã/Phường Số lợn mắc Số con bị tiêu hủy

Nguồn: Phạm Văn Sơn (2018)

Theo báo cáo dịch bệnh của cục Thú y, trong năm 2017 và 2018, cả nước không xảy ra dịch PRRS trên lợn Tuy nhiên, dịch bệnh PRRS vẫn tiềm ẩn và nguy

cơ phát sinh trong thời gian tới là rất cao , do virus PRRS còn tồn tại trong môi trường chăn nuôi, thời tiết đang có những diễn biến phức tạp, vận chuyển, buôn bán, giết mổ, tiêu thụ sản phẩm thịt lợn ngày càng gia tăng (Cục Thú y, 2018)

2.2 VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN

Theo nhiều nghiên cứu khác nhau đều thống nhất virus gây ra PRRS ở lợn thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales, chứa duy nhất hệ gen ARN sợi đơn

dương (Wensvoort et al., 1991, White, 1991, Collins et al., 1992) Các thành viên

khác trong họ này còn có Virus Viêm động mạch ngựa (EAV), Virus nâng mức khử hi-dro Lactate (LDV) của chuột lang và Virus Sốt xuất huyết khỉ (SHFV) có nhiều đặc điểm chung và gộp thành một nhóm virus sợi đơn dương ARN mới

(Plagemann and Moennig, 1992), hiện nay đã mô tả đến 14 loài (Gulyaeva et al.,

2017) với điểm đặc biệt của các Arterivirus là mỗi loài chỉ gây nhiễm một loài gia súc

2.2.1 Hình thái và cấu trúc virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp

ở lợn

PRRS virus có cấu trúc hình cầu, gồm 20 mặt đối xứng, đường kính hạt virion của virus vào khoảng 45- 55 nm, thậm chí lên đến 80 nm Nhân Nucleocapsid có đường kính 25- 35 nm, trên bề mặt có nhiều gai nhô ra rất rõ

trích theo William T.Christianson và Han Soo Joo (Wiliam et al., 2001)

Hình 2.2 Hình ảnh về hình thái, cấu trúc của virus PRRS

Hình 2.3 Hình ảnh về cấu trúc bộ gen của virus PRRS

Sợi ARN của virus có kích thước 15- 15,5 Kb và gồm ít nhất 8 khung đọc

mở ORF- Open reading frame (ORF 1a, ORF 1b, ORF 2- 7), có chức năng mã hoá cho 20 loại protein thành thục, trong đó có 6 protein chính có khả năng trung hoà kháng thể, bao gồm 4 phân tử glycoprotein màng, 1 protein xuyên màng (M),

1 protein Nucleocapsit (N), kháng thể đơn dòng kháng protein N là chủ yếu

(Feng et al., 2009)

Protein không cấu trúc số 2 (Nsp2) và glycoprotein 5 (được mã hoá bởi ORF5) được coi là 2 vùng có tính đồng nhất cao và là những vùng đóng vai trò quyết định tính gây bệnh của các chủng virus PRRS Đây là hai đoạn có khả năng biến đổi rất lớn, quyết định độc lực của virus Người ta dựa vào đây để định type

virus (Tô Long Thành và cs, 2007)

Cũng dựa vào protein không cấu trúc này mà từ 2 dòng virus ban đầu là dòng Châu Âu và dòng Bắc Mỹ, hiện nay virus PRRS đã biến đổi thành nhiều chủng khác nhau Dòng Bắc Mỹ có chủng P129, MN184, 2 chủng này có nhiều đoạn đứt trên protein Nsp2, dòng Bắc Mỹ khi lan sang Trung Quốc, Việt Nam đã tạo ra 1 chủng mới có sự đứt đoạn 30 aa trong protein Nsp2 ở vị trí aa thứ 481 và

532- 560 (Feng et al., 2009)

2.2.2 Sức đề kháng của virus và đặc tính nuôi cấy

Vì có vỏ bọc lipoprotein nên khả năng tồn tại của virus PRRS bên ngoài cơ thể vật chủ bị chi phối bởi nhiệt độ, độ pH, và các chất tẩy rửa Virus PRRS không bền với nhiệt độ nhưng khá ổn định ở nhiệt độ giữa 4°C và - 70°C Các chất sát trùng như Chloroform và Ether có thể làm vỡ vỏ lipoprotein, khả năng gây nhiễm của virus ổn định trong khoảng pH 6,5-7,5 nhưng giảm thấp ngoài

khoảng pH này (Bloemraad et al., 1994)

Virus PRRS tính hướng tế bào rất hạn chế cả in vivo và in vitro Trong điều

kiện phòng thí nghiệm, virus PRRS chỉ nhân lên bên trong các đại thực bào ở hệ

thống hô hấp và hệ thống lympho của lợn (Halbur et al., 1995, Halbur et al.,

1996, Duan et al, 1997) Virus PRRS xâm nhập vào tế bào vật chủ endocytosis

do receptor điều khiển Ban đầu virus PRRS bám vào tế bào vật chủ thông qua các phản ứng với Heparan sulphate glycosaminoglycans (GAGs)

Virus PRRS có khả năng nhân lên trong tế bào đại thực bào (PAM) và tế bào đơn nhân lypmho Hai môi trường tế bào không xuất xứ từ lợn là môi trường

tế bào Marc-145 và CL-2621, đều chế từ dòng tế bào thận khỉ xanh châu Phi MA-104, là những môi trường thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm để

nuôi cấy virus PRRS (Wensvoort et al., 1991, Bautistal et al., 1993)

2.3 BỆNH HỌC HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN 2.3.1 Triệu chứng lâm sàng và bệnh lý

PRRS có các mức độ biểu hiện triệu chứng lâm sàng rất khác nhau, tùy từng đàn Hai triệu chứng thường gặp nhất là: bệnh ở đường sinh sản và hô hấp

(Wensvoort et al., 1991) Biểu hiện lâm sàng của lợn khi nhiễm virus PRRS tùy

thuộc vào lứa tuổi lợn, vào giai đoạn mang thai và lần chửa đẻ của lợn nái/hậu bị nhiễm virus (Rossow, 1998) Các nghiên cứu gây nhiễm lợn bằng 9 chủng virus thuộc Type II cũng cho thấy biểu hiện triệu chứng rất khác nhau, nhiệt độ trực tràng và các biến đổi bệnh tích đại thể và bệnh lý phổi cũng rất khác nhau (Silva

et al., 2015, Pileri and Mateu, 2016) Lợn nhiễm các chủng độc lực nhẹ hoặc

chủng LV có biểu hiện sốt nhẹ, khó thở nhẹ và thở hơi nhanh, trong khi đó nhiễm trùng các chủng độc lực cao gây ra các triệu chứng khó thở nặng, sốt, hôn mê và biếng ăn

Trên lợn nái, biểu hiện lâm sàng đặc trưng bởi kém ăn, bỏ ăn, bệnh sinh sản như sảy thai, đẻ non, chết yểu, lợn con sơ sinh yếu, thai chết hoặc lưu thai

Triệu chứng tai xanh thường ít gặp (Terpstrat et al., 1991) Ở lợn cai sữa,

nhiễm virus PRRS đặc trưng bởi triệu chứng sốt, viêm phổi, mệt mỏi và chậm lớn (Rossow, 1998)

Bệnh tích đại thể sau nhiễm virus PRRS rất khác nhau, tùy thuộc vào chủng virus, đặc tính di truyền của lợn nhiễm bệnh và các tác nhân gây stress (hiện trạng môi trường và sức khỏe của đàn lợn) Bệnh tích phổi khác nhau từ không

có bệnh tích đến chắc đặc và thường phức tạp vì bệnh tích do các bệnh virus/vi khuẩn kế phát gây ra (Rossow, 1998)

Tại Việt Nam, đặc điểm bệnh lý của PRRS đã được công bố Nguyễn Thị Lan (2012), cho thấy biến đổi đại thể chủ yếu ở lợn sau cai sữa và lợn choai mắc PRRS là xảy ra trên phổi: phổi viêm hoại tử, chắc đặc, có màu xám, mặt cắt lồi

và khô Biến đổi còn thấy ở một số cơ quan khác: ruột viêm, xuất huyết, hạch lâm ba xuất huyết, cơ tim nhão, gan sưng Bệnh tích vi thể chủ yếu ở phổi là thâm nhiễm tế bào viêm, trong lòng phế nang chứa đầy dịch rỉ viêm, thận tập trung nhiều hồng cầu và bạch cầu, vách ngăn của lách đứt nát, thâm nhiễm hồng cầu lan tràn trong nhu mô lách, niêm mạc ruột bong tróc, lông nhung đứt nát (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2013)

2.3.2 Bệnh do virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn Type II thể độc lực cao

Ở nhiều nước, người ta quan sát thấy chủng virus PRRS độc lực cao nhiều lần xuất hiện lặp lại, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng Tại Trung Quốc, công bố của Tian và cộng sự năm 2006 xảy ra một bệnh lúc đó được gọi là “bệnh sốt cao”

xảy ra ở nhiều trại lợn và sau đó lan tràn khắp gần nửa quốc gia này (Tian et al.,

2007) Các triệu chứng lâm sàng bao gồm: xung huyết da, các vệt tụ máu, đốm

xuất huyết, ban đỏ, mụn đỏ ở tai, mõm, mũi, lưng và phía trong đùi Các triệu chứng thường thấy là sốt cao (40-42°C), mệt mỏi, khó thở, ho, hen, què chân, run rẩy và bệnh đường hô hấp, tiêu chảy, sau cùng là chết Ban đầu, “bệnh sốt cao” bị nghi là Dịch tả lợn cổ điển hoặc Dịch tả lợn Châu Phi và khi đó người ta không nghi ngờ rằng virus PRRS là căn nguyên gây bệnh vì có nhiều lợn trưởng thành

chết (thường ít thấy ở PRRS thông thường) (Tian et al., 2007)

Bệnh diễn tiến trong 5 đến 20 ngày và lợn bệnh có khả năng lây lan nhanh cho những lợn khác trong đàn trong vòng 3-5 ngày Dịch kéo dài trong nhiều

tháng chủ yếu là không biết nguyên nhân gây bệnh (Tian et al., 2007) Theo

Trung tâm Kiểm soát bệnh động vật Trung Quốc (CADC), đợt dịch này ảnh hưởng đến hơn 2 triệu con lợn với hơn 400.000 con chết chỉ trong 4 tháng (Tian

et al., 2007) Qua điều tra sâu rộng bằng xét nghiệm PCR và hóa miễn dịch, tác nhân gây „bệnh sốt cao‟ được xác định là virus PRRS (Tian et al., 2007) Hiện

nay, chủng virus PRRS này được gọi tên là virus PRRS độc lực cao PRRSV) Ngay sau khi gây dịch ở Trung Quốc, virus này lây lan nhanh chóng

(HP-sang các nước khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam (An et al., 2011)

2.4 MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI VIRUS HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN

VÀ HÔ HẤP Ở LỢN

Bất luận đường xâm nhiễm (cho hít, tiêm vắc xin, thụ tinh …) virus bắt đầu nhân lên ở tế bào đại thực bào phế nang Khác với hầu hết các loại virus, virus PRRS lúc đầu không kích thích động vật chủ sản sinh interferon bẩm sinh và đáp ứng cytokine Tác động này thường kéo dài và lợn nhiễm virus thường cho đáp

ứng miễn dịch thấp (Murtaugh et al., 2002)

Miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào được tạo ra trong quá trình nhiễm virus có tác dụng loại trừ virus lưu hành trong máu, nhưng với virus PRRS, hệ thống miễn dịch không được loại trừ được những virus tại hệ lympho Hệ quả là

virus PRRS có khả năng tồn tại lâu dài ở tổ chức này (Murtaugh et al., 2002)

Miễn dịch học trong nhiễm virus PRRS ở lợn có đặc điểm hai mặt: một mặt virus có tính hướng tế bào miễn dịch, xâm nhập và nhân lên ở những tế bào này, làm thay đổi đáp ứng miễn dịch của ký chủ, đặc biệt là gây suy giảm miễn dịch làm cho lợn dễ mắc nhiễm trùng kế phát Mặt khác, virus kích thích hệ thống

miễn dịch chống tái nhiễm (Murtaugh et al., 2002) Bất kể virus PRRS xâm nhập

bằng đường mũi, miệng, qua tinh dịch hay tiêm bắp, chúng cũng bắt đầu nhân lên

ở tế bào đại thực bào phế nang (Murtaugh et al., 2002) Lợn nhiễm virus PRRS

không thải tiết hoặc ở mức rất thấp các cytokine gây viêm, interferon loại 1 a/ß), interleukin (IL)-1, và TNF-α Interferon loại 1 là rất quan trọng trong kích

(IFN-hoạt đáp ứng miễn dịch tiên phát (Kimman et al., 2009) Sự giảm tiết của INF-a

có thể có tác động quan trọng đến quá trình sinh bệnh học của virus PRRS vì INF-a có thể hạn chế sự nhân lên của virus PRRS, khi đáp ứng miễn dịch tiên phát yếu, virus PRRS nhân lên thuận lợi và có cơ hội tồn tại lâu hơn ở động vật

cảm nhiễm (Kimman et al., 2009) Virus PRRS có khả năng trốn thoát hệ thống

phòng thủ kháng virus bẩm sinh do chúng có khả năng sản sinh những protein không kích thích hệ thống thải tiết interferons loại 1 Những protein có tác dụng này bao gồm protein N và 3 protein phi cấu trúc Nsp1 (Nsp-alpha và Nsp-beta),

Nsp2 và Nsp11 (Yoo et al., 2010)

Đáp ứng miễn dịch thứ cấp của lợn nhiễm virus PRRS rất đa dạng, các lớp kháng thể xuất hiện ở những thời điểm khác nhau, kháng những polypeptide khác nhau của virus, miễn dịch tế bào diễn ra cũng đa chiều vừa theo hướng thuận lợi

cho PRRS phát triển nhưng cũng đồng thời theo hướng kháng bệnh (Murtaugh et al., 2002) Sau nhiễm virus, kháng thể kháng protein N xuất hiện sớm (ngày thứ 5- 9) và ở mức cao nhất (Kimman et al., 2009) Kháng thể kháng hai protein phi cấu

trúc nsp1 và nsp2 được phát hiện ở ngày thứ 14 và đạt đỉnh cao nhất ở 28-35 ngày

sau gây nhiễm (De Lima et al., 2006) Tất cả những kháng thể pha sớm này đều

không có khả năng trung hòa virus, ngược lại, kháng thể trung hòa xuất hiện rất muộn, 4 tuần sau nhiễm virus, thậm chí muộn hơn (Lopez and Osorio, 2004) Đáp ứng kháng thể trung hòa đối với epitope ở GP5 thường ở mức yếu và chậm, thậm

chí không xuất hiện ở một số cá thể (Chand et al., 2012) Đáp ứng miễn dịch

kháng GP5 yếu và chậm là do mức N-glycosyl hóa bao quanh epitope trung hòa,

một hiện tượng gọi là rào chắn N-glycan (Chand et al., 2012) Hơn nữa, epitope tại

vị trí aa27-30 trên GP5 của virus PRRS Type II không bị tác động trung hòa mà ngược lại, có chức năng làm giảm đáp ứng miễn dịch dịch thể, dẫn đến việc làm

chậm sản sinh kháng thể trung hòa chống virus PRRS (Ostrowski et al., 2002)

Đáp ứng miễn dịch thích ứng của lợn đối với virus PRRS có đặc điểm đặc

trưng là đáp ứng chậm và trí nhớ miễn dịch kém (Beura et al., 2010), ở mức thấp,

đôi khi không đủ ngăn ngừa tái nhiễm và dễ dàng bị nhiễm bởi virus PRRS không

tương đồng về kháng nguyên (Beura et al., 2010) Sau khi phơi nhiễm virus lần

thứ hai, đáp ứng miễn dịch của lợn đủ để kháng tái nhiễm, tuy nhiên hiện còn chưa

rõ kháng thể hay miễn dịch tế bào hay phải phối hợp cả hai loại miễn dịch thì mới

có hiệu quả bảo hộ (Murtaugh et al., 2002) Cả miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế

bào khi đạt đến ngưỡng nhất định có thể loại trừ được virus khỏi máu nhưng

không loại trừ được virus ở hệ thống lympho (Murtaugh et al., 2002)

Hiện nay, tại Việt Nam có 10 loại vắc xin PRRS đã và đang được phép lưu hành, bao gồm:

1 Vắc xin nhược độc BSL-PS 100 của Công ty Bestar – Singapore, chủng virus vắc xin JKL 100 thuộc dòng Bắc Mỹ Một liều chứa ít nhất 105 TCID50, có

6 Vắc xin nhược độc chủng độc lực cao (live JXA1-R Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome vắc xin) của Công ty Đại Hoa Nông - Trung Quốc, chủng JXA1-R thuộc dòng Bắc Mỹ

7 Vắc xin Porcilis PRRS của Công ty Intervet Hà Lan

8 Vắc xin nhược độc đông khô PRRS do công ty Hanvet sản xuất

9 Vắc xin nhược độc đông khô PRRS do công ty TNHH MTV Avac Việt Nam sản xuất

10 Vắc xin nhược độc đông khô PPRS do công ty Marphavet sản xuất

2.5 VẮC XIN PHÒNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP 2.5.1 Hiểu biết chung về vắc xin

Vắc xin là một chế phẩm sinh học có chứa kháng nguyên có thể tạo cho

cơ thể một đáp ứng miễn dịch và được dùng với mục đích phòng bệnh hoặc với mục đích khác (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010) Thuật ngữ vắc

xin được xuất phát từ “vacca”có nghĩa là bò cái để ghi nhận công lao của Jenner

đã dùng mụn đậu ở bò để chữa đậu cho người

Hiện nay theo Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, vắc xin được chia thành 4 loại sau:

+ Vắc xin chết (vắc xin vô hoạt)

+ Vắc xin sống

+ Vắc xin dưới đơn vị

+ Vắc xin thế hệ mới sản xuất bằng công nghệ gen

Một vắc xin cần đảm bảo tính thuần khiết, an toàn và hiệu lực (Nguyễn Bá

sử dụng trong sản xuất vắc xin và chế phẩm sinh học cần được thiết kế và xây dựng bằng những nguyên liệu đạt tiêu chuẩn cao nhất để đảm bảo về độ sạch, không sinh bụi, ngăn ngừa được côn trùng, sâu bọ và có thể bảo dưỡng được (WHO, 2014)

Bề mặt phía trong (tường, trần, nền) phải nhẵn, không có vết rạn nứt, bong, dễ làm sạch và tẩy trùng Các rãnh thoát cần hạn chế đến mức có thể mọi nơi, trừ khi cần thiết, không được thiết kế trong khu vực sạch (khu vực phân cấp

độ sạch từ cấp B trở lên theo GMP – WHO) Lắp đặt rãnh thoát phải đạt hiệu quả, dễ dàng làm sạch các bẫy và chỗ vỡ phòng tránh chảy ngược Các bẫy có thể

sử dụng các thiết bị làm nóng bằng điện hoặc cách khác để tiệt trùng Các rãnh ở nền cần thiết kế nông và hở để dễ dàng làm sạch và thông với rãnh thoát bên ngoài sao cho tránh được lây nhiễm xâm nhập (WHO, 2014)

Không để các bồn rửa trong khu vực vô khuẩn (các khu vực xử lý tới hạn ARA hoặc phòng sạch cấp độ B trở lên) Các bồn rửa ở các khu vực sạch cần làm bằng các nguyên liệu thích hợp như thép không gỉ, không để tràn, nguồn nước cung cấp có chất lượng tối thiểu ở mức có thể uống được Đề phòng các lây nhiễm từ hệ thống cống rãnh Ngăn ngừa các hạt bụi chứa các vi sinh vật gây bệnh, cần tránh lây nhiễm các virus dùng trong sản xuất và lây nhiễm bởi các virus khác hoặc từ chế

phẩm khác cũng như từ các nhân viên sản xuất (WHO, 2011)

Ánh sáng, hệ thống thông khí và điều hoà nhiệt độ (hệ thống HVAC - Heating, Ventilation and Air Conditioning) cần được thiết kế để duy trì nhiệt độ

và độ ẩm phù hợp, giảm thiểu lây nhiễm và tính toán phù hợp, thuận lợi cho nhân viên làm việc có quần áo bảo vệ Tình trạng của các nhà xưởng cần được xem xét đều đặn và tiến hành sửa chữa khi cần thiết, luôn trong tình trạng tốt Đặc biệt cần thực hiện sao cho khi bảo dưỡng hoặc sửa chữa không ảnh hưởng đến sản phẩm Nhà xưởng phải đủ không gian cho các hoạt động tiến hành thích hợp, cho phép các dòng/luồng công việc, thông tin liên lạc và giám sát được hiệu quả Tất các nhà/ các phòng/ khu vực luôn được làm sạch và vệ sinh Nếu các phòng sản xuất đó sử dụng cho mục đích khác, chúng cần được làm sạch triệt để và vệ sinh trước khi trở lại sản xuất chế phẩm sinh học Các khu vực sử dụng để xử lý các nguyên liệu từ mô động vật và vi sinh vật không phục vụ cho qui trình sản xuất hiện tại và các test có sử dụng động vật hoặc vi sinh vật cần tách riêng với khu vực sản xuất sinh phẩm vô khuẩn và có hệ thống thông khí tách biệt, các nhân viên thì cũng cần được tách biệt hoàn toàn (WHO, 2014)

Nếu sản xuất theo chiến dịch, cần thiết kế và bố trí nhà xưởng và trang thiết bị để chống lây nhiễm hiệu quả bằng cách tiệt trùng nhà xưởng (bằng formaldehyde hoặc chất tiệt trùng thích hợp) cũng như làm sạch và vệ sinh sau mỗi chiến dịch sản xuất (WHO, 1992; WHO, 2014)

Lô giống và ngân hàng tế bào (ngân hàng tế bào và ngân hàng giống) dùng cho sản xuất sinh phẩm cần bảo quản tách riêng với nguyên liệu khác Hạn chế chỉ những nhân viên có nhiệm vụ được tiếp cận (WHO, 1992)

Các vi sinh vật sống cần được lưu giữ, xử lý trong các thiết bị để đảm bảo tiếp tục nuôi cấy, thuần khiết và không bị lây nhiễm trong qui trình (WHO, 1992)

Các sản phẩm như vắc xin chết, bao gồm những vắc xin tạo ra từ kỹ thuật DNA tái tổ hợp, giải độc tố, các chiết xuất từ vi khuẩn sau khi bất hoạt có thể đóng vào các lọ ở trong cùng 1 nhà như các sinh phẩm vô khuẩn khác, với điều kiện là cần có đầy đủ các biện pháp chống lây nhiễm sau khi đóng ống,nếu cần,

có thêm cả việc tẩy trùng và rửa sạch (WHO, 1992; WHO, 2011)

Các vi sinh vật tạo nha bào cần được lưu giữ trong các nhà chuyên dụng với từng nhóm sản phẩm cho đến khi qui trình bất hoạt được hoàn thành Ðối với Bacillus anthracis, Clostridium botulinum và Clostridium tetani, cần có nhà xưởng riêng cho từng sản phẩm Khi tiến hành chiến dịch sản xuất vi sinh vật

sinh nha bào trong một nhà xưởng nào đó, thì chỉ duy nhất một sản phẩm được sản xuất/xử lý tại thời gian đó (WHO, 1992; Bộ Y Tế, 2018)

Tất cả các chai lọ đựng chế phẩm của bất kỳ giai đoạn sản xuất nào cũng phải xác định rõ danh tính trên nhãn (WHO, 2014)

Để phòng lây nhiễm chéo bằng một số hoặc tất cả các biện pháp sau: Phân cách khu vực chế biến/xử lý và đóng ống (ở những khu vực riêng biệt, được kiểm soát một cách chặt chẽ), với những sản phẩm vô trùng phải được đóng trong cấp độ sạch cao nhất (cấp A) hoặc trong các hệ thống kín (WHO, 2011)

Ưu tiên sử dụng các thùng/hệ thống kín trong sản xuất

Sử dụng các chai đã được tiệt trùng và chứng minh được nguy cơ lây nhiễm do bẩn sinh học (bioburden) là thấp

Khu vực có áp suất dương được sử dụng để xử lý các sản phẩm vô khuẩn, nhưng áp suất âm được chấp nhận trong các khu vực như khu vực xử lý mầm bệnh Nói chung, bất kỳ vi sinh vật nào có khả năng gây bệnh được bảo quản trong các khu vực được thiết kế áp suất âm, phù hợp với qui định kín đối với sản phẩm Các bộ phận luân chuyển không khí được thiết kế chuyên dụng cho từng khu vực liên quan Khí từ khu vực vận hành có thể có mầm bệnh không được tái tuần hoàn, trong trường hợp vi sinh vật thuộc nhóm nguy cơ 2, 3 ở trên thì cần hút bỏ không khí qua màng lọc vô khuẩn hiệu năng cao (tối thiểu màng lọc H13)

và kiểm tra đều đặn việc thực hiện (WHO 2011, Bộ Y Tế, 2018)

Ống dẫn, van, màng lọc cần được thiết kế thích hợp để dễ dàng làm sạch, tiệt trùng Van trên thùng lên men cần được tiệt trùng hoàn toàn bằng hơi Màng lọc thông khí phải là khô/kỵ nước và được thẩm định chức năng hoạt động trước khi vận hành và định kỳ trong quá trình hoạt động (Bộ Y Tế, 2018)

2.5.3 Sản xuất vắc xin bằng phương pháp vô hoạt virus

Vắc xin là một trong những công cụ can thiệp phòng bệnh (vắc xin vô hoạt) và dập dịch (vắc xin nhược độc) Việc giám sát virus để có nguồn chủng và thông tin di truyền, kháng nguyên xác định tính phù hợp giữa chủng vắc xin và chủng lưu hành là điều kiện tiên quyết đảm bảo cho sự thành công của giải pháp can thiệp bằng vắc xin Phát triển vắc xin vô hoạt chế từ chủng mới nhất phân lập tại thực địa có thể cung cấp công cụ cho giải pháp vắc xin

Vắc xin vô hoạt thường được sử dụng nhằm phòng chống PRRS ở các đàn lợn nái, hoặc ở các trại lợn ở những vùng/khu vực chưa từng xuất hiện PRRS

(vùng an toàn dịch) Việc sản xuất vắc xin vô hoạt được thực hiện bằng cách phân lập và nuôi cấy các chủng virus PRRS thực địa trong môi trường tế bào và tiến hành vô hoạt chúng bằng một số chất vô hoạt như BEI, formaline hoặc β

propiolactone (Kim et al., 2011) Hiệu quả của vắc xin vô hoạt có liên quan đến

phương pháp vô hoạt cũng như nồng độ của virus trong liều vắc xin Vắc xin vô hoạt có ưu điểm lớn nhất là an toàn do chúng không có khả năng truyền lây sang các đàn lợn khác và không có khả năng phục hồi độc lực Bên cạnh đó, vắc xin

vô hoạt không gây các phản ứng phụ như rối loạn sinh sản ở các đàn lợn nái Tuy nhiên, do virus đã bị vô hoạt nên nồng độ virus sử dụng trước khi bất hoạt thường yêu cầu cao Bên cạnh đó, tính sinh miễn dịch của chúng đối với các

chủng virus thực địa còn có nhiều tranh cãi Kết quả nghiên cứu của (Kim et al.,

2011) cho thấy, vắc xin có nồng độ virus 106 PFU/ml không gây đáp ứng miễn dịch khi phát hiện bằng Elisa, tuy nhiên có thể kích thích sinh kháng thể trung hòa Tuy nhiên, Charerntantanakul cho rằng, việc tiêm phòng vắc xin vô hoạt không tạo đủ lượng kháng thể trong ngưỡng phát hiện bằng phương pháp Elisa cũng như trung hòa (Charerntantanakul, 2012) Tuy nhiên, vắc xin vô hoạt có thể tăng hiệu quả đáp ứng miễn dịch đối với lợn đang bị nhiễm virus Điều này gợi

mở hướng điều trị bằng vắc xin đối với các trại lợn đang dương tính với virus PRRS cũng như việc tiêm nhắc lại để tăng hiệu quả bảo hộ

Vắc xin vô hoạt thường ít làm giảm các triệu chứng của bệnh gây ra bởi virus PRRS như các triệu chứng rối loạn hô hấp hoặc ngăn chặn sự rối loạn sinh sản Bên cạnh đó, vắc xin vô hoạt cũng không giúp phòng chống hiện tượng virus huyết: thời gian duy trì cũng như nồng độ virus, khi tiến hành công cường độc bằng các chủng PRRS thực địa sau khi tiêm vắc xin (Charerntantanakul, 2012) Nhưng vắc xin vô hoạt lại có hiệu quả cao trong việc tăng cường khả năng sinh sản như tăng số lứa đẻ, tăng tình trạng sức khỏe và số lượng lợn con sau cai sữa ở những đàn lợn đã bị phơi nhiễm virus PRRS

2.5.4 Sản xuất vắc xin bằng phương pháp nhược độc virus trên môi trường

tế bào

Để phòng chống PRRS có hiệu quả, một số loại vắc xin nhược độc đã được sản xuất thành công trên thế giới và cho thấy hiệu quả cao trong phòng

chống dịch bệnh PRRS xảy ra ngoài thực địa (Allende et al., 2000) Về nguyên lý

chung, để tạo được chủng virus PRRS nhược độc dùng làm vắc xin, các chủng virus PRRS cường độc được cấy truyền (passage) nhiều đời trên môi trường tế bào Cụ thể để làm chủng virus PRRS cường độc thành chủng virus PRRS nhược

độc, công ty Boehringer–Ingelheim Corp đã cấy truyền 37 đời (Allende et al., 2000), công ty Hipra Corp đã cấy truyền 20 đời (Burch et al., 1999) Một ưu

điểm của vắc xin nhược độc là hàm lượng kháng nguyên trong mỗi liều thấp hơn

so với các phương pháp tạo vắc xin khác, vào khoảng 105

TCID50/liều Việc nhược độc hóa virus đã đem lại thành công đáng kể trong công tác phòng chống PRRS, lợn được tiêm phòng vắc xin nhược độc giảm đáng kể các triệu chứng lâm sàng so với lợn không được tiêm vắc xin trong trường hợp thử thách gây nhiễm với chủng độc lực cao Tuy nhiên, các chủng vắc xin nhược độc chỉ có khả năng bảo hộ cao đối với chủng có mối quan hệ gần gũi, trong khi đó, hiệu quả bảo hộ đối với các chủng virus có mối quan hệ di truyền xa hơn thì rất đa dạng, phụ thuộc nhiều vào mức độ tương đồng giữa các trình tự protein của virus

(Labarquet et al., 2003) Điều này có thể do sự sai khác về mức độ di truyền dẫn

đến sự sai khác về đặc tính kháng nguyên của các virus ngoài thực địa so với các chủng virus vắc xin Điều này dẫn đến việc làm giảm mức độ bảo hộ của vắc

xin đối với các chủng ngoài thực địa

2.5.5 Phương pháp sản xuất vắc xin thế hệ mới

Vắc xin DNA, sử dụng các khung đọc mở, từ ORF1 cho đến ORF7 để chế tạo vắc xin

Vắc xin dưới đơn vị (subunit): dùng protein của virus để chế vắc xin, ví dụ

Dùng vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) chủng BCG tái tổ hợp

biểu hiện GP5 và protein M của virus PRRS, vắc xin này khi tiêm cho lợn và công cường độc cũng chỉ tác dụng bảo vệ được một phần như các vắc xin trên

Bảng 2.3 Các vắc xin đã thử nghiệm sản xuất

Gây miễn dịch Tính bảo vệ

Kháng thể

Miễn dịch tế bào

Đồng chủng Dị chủng

Vắc xin DNA ORF1 đến

ORF7

+ + + không xác

định được Vắc xin subunit GP5 yếu yếu - không xác

định được Vắc xin peptide tổng

+ + không xác

định được

không xác định được Vắc xin dùng virus giả

dại làm vector

GP5, M + + + không xác

định được Vắc xin dùng virus đậu

viêm đường ruột làm

vector

GP5, M + không

xác định được

+ không xác định được

E.coli làm vector

GP5, M + - + không xác

định được Vắc xin dùng dẫn xuất

tế bào côn trùng mang

kháng nguyên

ORF3,5,7

+

không xác định được +

không xác định được

sống đã cắt bỏ gen ở

epitop nps2

GP5 +

Không xác định được

không xác định được

không xác định được

Ghi chú: + có đáp ứng; - không có đáp ứng

Nguồn: Tong et al., (2007)

Với vắc xin sống có đánh dấu virus để phân biệt được động vật được tiêm virus vắc xin và động vật bị nhiễm virus hoang dại, De Lina và cộng sự đã tạo một chủng vắc xin tai xanh nhược độc có nsp2 đã cắt bỏ epitop 15- mer và mang một epitop của dòng tế bào B có miễn dịch trội, đã không gây ảnh hưởng đến tính miễn dịch, sinh trưởng hay độc lực của virus đột biến Những lợn được tiêm vắc xin này

đã không sinh ra kháng thể với epitop đã chọn và bảo tồn gen kém, nsp2 có sự biến đổi cao ngay cả ở vị trí đánh dấu Hình như với virus tai xanh đánh dấu ở nsp2 là không tối ưu, mà có thể đánh dấu ở miền bảo tồn M của virus sẽ tối ưu hơn

Hình 2.4 Gen từ các chủng virus khác nhau

Với các số liệu đã biết, người ta giả thiết rằng, tất cả các protein cấu trúc của virus PRRS đều là cần thiết cho sự gây bệnh của nó Cho nên chiến lược của

ta cắt bỏ gen để tạo ra virus nhược độc, sẽ bị hạn chế bởi virus nhược độc bị

Gen tráo đổi

Dòng hóa đoạn gen đã tráo đổi vào plasmid DNA chứa bộ gen của virus PRRSV ở dạng DNA (infectious clone = clone truyền nhiễm)

Khuếch đại bằng PCR với mồi đặc hiệu Tái phối hợp bằng PCR mà không dùng mồi

Phân đoạn ngẫu nhiên bằng DNase I

thiếu gen (phải bổ sung gen đó bằng gen của dòng tế bào mà ta dùng nuôi virus) Khi tiêm vắc xin chủng nhược độc vào lợn thì virus vắc xin lại sinh sản trong tế bào không có gen bổ sung, gọi vắc xin đó là vắc xin "1 chu kỳ" Phương pháp này đã làm và tạo ra chủng ORF2 và ORF4, virus này có gây ra kháng thể trung hòa, làm giảm được số lượng virus công độc nhưng không giảm triệu chứng lâm

sàng, thậm chí lại tăng cường sự gây bệnh (Martelli et al., 2007)

Đã thử nghiệm chế tạo vắc xin niêm mạc, nhằm gây miễn dịch niêm mạc

để bảo vệ, phòng bệnh ngay ở cửa vào của virus PRRS như ở đường hô hấp, đường âm đạo, như kiểu đã dùng ở một số virus khác (Poliovirrus, Influenza virus, ở người) Đã dùng GP5 và protein N của virus PRRS cho cộng hợp với độc tố Cholera (một yếu tố gây miễn dịch niêm mạc mạnh) để chế tạo vắc xin cho uống, khi uống vắc xin này đã tăng cường được đáp ứng kháng thể trên bề mặt niêm mạc đường ruột, đường sinh dục; nhưng hiệu quả bảo vệ chưa được đánh giá; vắc xin này sau khi tiêm bắp thì không bảo vệ được lợn (không chống

được virus máu và bệnh ở đường hô hấp) (Tong et al., 2007)

Đã khảo sát vắc xin cùng với nhiều loại chất bổ trợ (adjuvant) khác nhau cho vắc xin vô hoạt và cả vắc xin sống, chỉ có IL - 12 làm chất bổ trợ có thể tăng cường được đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào của vắc xin nhược độc Nhưng nếu dùng IL-4 thêm vào làm bổ trợ thì lại có tác dụng ức chế Tóm lại không có chất bổ trợ nào có tác động tốt hơn so với tiêm vắc xin nhược độc một mình

(Charerntantanakul et al., 2006, Martelli et al., 2007)

Đã khảo sát vai trò của đường sử dụng vắc xin PRRS khác nữa như tiêm trong da, so với tiêm bắp và tiêm dưới da cũng không có gì khác biệt lớn

(Martelli et al., 2007)

Ngày 7/9/2016, tại Hội nghị thường niên lần thứ 19 của Hiệp Hội Thú y Châu Á (FAVA), giáo sư Fernando đại học Nebraska-Lincoln cho biết, một chủng virus PRRS tổng hợp nhân tạo đã được tạo ra dựa trên một số lượng lớn các trình tự bộ gen virus PRRS đã biết Virus trung tâm này có thông tin di truyền tương đồng cao nhất với tất cả các chủng thực địa đã biết Kết quả là virus tổng hợp này đã tạo ra được đáp ứng miễn dịch bảo hộ chéo cao nhất, chưa từng thấy cho đến nay Virus PRRS-CON có thể là một kháng nguyên tốt để tạo vắc xin tai xanh có độ bảo hộ rộng trên nhiều chủng, nhiều kiểu gen khác nhau

2.6 CHẤT BỔ TRỢ

Chất bổ trợ là những hợp chất hóa học được thêm vào trong vắc xin nhằm tăng khả năng kích thích miễn dịch và tăng hiệu lực của vắc xin (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010)

Trong quá trình chế tạo, sử dụng thấy rằng nếu vắc xin chỉ chứa kháng nguyên khi dùng tiêm phòng tạo hiệu lực bảo hộ thấp, không kéo dài, phản ứng xảy ra với tỷ lệ cao, nhưng khi cho thêm những chất không phải là kháng nguyên vào vắc xin sẽ làm cho hiệu lực và thời gian bảo hộ của vắc xin tăng lên Các chất đưa vào vắc xin sẽ được gọi là chất bổ trợ Vậy chất bổ trợ vắc xin là những chất có hoạt tính kích thích miễn dịch không đặc hiệu dùng bổ sung vào vắc xin nhằm nâng cao hiệu lực và độ dài miễn dịch (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010)

Chất bổ trợ vắc xin có ba tác dụng: Hấp thu và lưu giữ kháng nguyên trong cơ thể lâu hơn, không bài thải nhanh chóng kháng nguyên

Tạo kích thích đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể

Giảm kích thích phản ứng của độc tố (nếu có) trong vắc xin đối với cơ thể Phân loại chất bổ trợ: căn cứ vào bản chất, thành phần cấu tạo của chất bổ trợ, người ta chia chất bổ trợ đang được dùng trong chế bạo vắc xin hiện nay thành các nhóm sau:

Chất bổ trợ vô cơ: bao gồm các các loại muối nhôm, than hoạt tính, alumin hydroxit, … các chất bổ trợ vô cơ thường hấp phụ kháng nguyên lên

bề mặt để tăng cường ấp ứng miễn dịch của cơ thể, đồng thời giải phóng kháng nguyên từ từ vào hệ bạch huyết để kéo dài thời gian kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể Với mầm bệnh có sản sinh độc tố, sau khi đã được vô hoạt (giải độc tố) cũng được chất bổ trợ hấp thu và giải phóng từ từ để hạn chế tác động gây phản ứng cục bộ và toàn thân Trong thú y người ta hay dùng Aluminium Hydroxide hay AlK(SO4)2.12H2O (gọi là keo phèn) trong các vắc xin vi khuẩn vô hoạt

Chất bổ trợ hữu cơ: bao gồm các loại dầu thực vật, dầu hướng dương, dầu lạc, dầu oliu, ……Các chất bổ trợ hữu cơ khi hỗn hợp với kháng nguyên sẽ tạo thành dạng nhũ tương nước trong dầu Ở dạng nhũ tương kháng nguyên sẽ nằm trong dung dịch dầu Để khắc phục những nhược điểm của vắc xin nhũ nước

trong dầu như dễ phân lớp, rít kim khi tiêm, về sau người ta đã nghiên cứu chế tạo ra loại vắc xin dạng nhũ tương kép như dầu khoáng kép MONTANIDETM ISA 201 VG, MONTANIDETM ISA 206 VG, MONTANIDETM ISA 207 VG

Tác dụng của chất bổ trợ dầu trong vắc xin cũng tương tự như tác dụng của chất bổ trợ vô cơ Nhờ các phức hợp nhũ kháng nguyên - dầu - nước mà kháng nguyên tự do được giải phóng từ từ vào cơ thể để kích thích sản sinh kháng thể và tế bào miễn dịch đặc hiệu kéo dài Đồng thời các hạt nhũ cũng di chuyển từ chỗ tiêm vào các hạch lympho hoặc đến các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch để kích thích miễn dịch không đặc hiệu Kết quả là liều vắc xin giảm, hiệu lực miễn dịch tang cao, thời gian miễn dịch kéo dài

Chất bổ trợ là vi sinh vật: thường dùng là xác của một số loài vi khuẩn

như Mycobacterium tuberculosis hay Salmonella typhimurium Cũng có thể dùng

nội độc tố của các vi khuẩn lipopolysaccarid

PHầN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 10/2018 đến tháng 05/2019

3.2 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được thực hiện tại công ty TNHH MTV Avac Việt Nam

3.3 NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 3.3.1 Đối tượng, vật liệu

- Giống vắc xin phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được cung

cấp từ đề tài KC.04.15/11-15 chủng KTY-PRRS-01, hiệu giá virus giống gốc đạt 3.03x106 TCID50 /ml (Phạm Văn Sơn và cs., 2017)

3.3.2 Hóa chất bất hoạt

- BEI (Binary Ethylenimine)

3.3.3 Chất bổ trợ

- Nhũ dầu khoáng kép MONTANIDETM ISA 201 VG

3.3.4 Các loại dung dịch, môi trường

3.3.4.1 Môi trường cho quá trình nuôi tế bào Marc – 145 và nhân virus PRRS

- PBS 1X (Phosphate Buffered Saline)

- TSA (trypticase soy agar)

- SD ( sabouraud dextrose agar)

- Canh thang PPLO

Deoxycholate)

- FTM (fruit thioglycolate agar)

- Thạch máu

3.3.4.3 Môi trường, hóa chất cho thử nghiệm IPMA

- FBS (Fetal Bovin serum)

- Acetyl Ethyl Carbazole (AEC)

- Skim milk powder

- Thuốc khử trùng: Virkon 1% hoặc Chloramine 2-3%, Chloroform

- Tế bào Marc - 145

- Huyết thanh đối chứng dương

- Huyết thanh đối chứng âm

- Conjugate: Goat PAb to Pig IgG (HRP) ab102135 1mg/1ml (Ab cam)

3.3.4.4 Môi trường thực hiện phản ứng Elisa phát hiện kháng thể PRRS

- Nước cất hoặc nước đã khử khoáng

- Môi trường phát triển tế

bào DMEM có chứa FBS (huyết

thanh bào thai bê)

3.3.4.5 Môi trường sử dụng kiểm tra vô hoạt virus trong sản xuất vắc xin

- Môi trường DMEM đã bổ sung 2% FBS, 100 UI penicillin và 100µg streptomycin/1ml

- Dung dịch PBS 1X (Photphat Buffer Saline), Trypsin-EDTA

- Huyết thanh bào thai bê FBS (Fetal bovine serum)

- Tế bào dòng Marc-145

3.3.5 Trang thiết bị, dụng cụ

3.3.5.1 Trang thiết bị

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Máy ly tâm lạnh

- Tủ lạnh âm sâu 800C, tủ lạnh âm 400C

- Hệ thống chai lăn tế bào

- Phòng ấm có hệ thống cung cấp CO2

- Tủ ấm 37, tủ ấm CO2

- Water bath

- Máy bơm hút chân không

- Tank bất hoạt vắc xin

- Tank nhũ hóa vắc xin

- Hệ thống chia liều – Viền nắp tự

động

- Máy cất tế bào

- Cân phân tích

- Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave)

- Máy đọc ELISA Elx800 đọc được bước sóng từ 605nm-630 nm

- Máy Voltex

- Máy phá vỡ tế bào

- Bể ổn nhiệt (water bath)

- Kính hiển vi soi ngược

- Kính hiển vi thường

- Pipette điện tự động

- Máy lọc tiếp tuyến TFF

- Pipettes: 10-100µl, 100-1000 µl, Multi Pipettes 10-100 µl 50-200 µl

3.3.5.2 Dụng cụ

- Chai roller, T75, T225 nuôi tế bào

- Chai thủy tinh trung tính dung tích

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.4.1 Nghiên cứu sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn quy mô công nghiệp

3.4.1.1 Nghiên cứu quy trình sản xuất kháng nguyên virus PRRS trên hệ thống chai roller

3.4.1.2 Nghiên cứu quy trình bất hoạt kháng nguyên, sản xuất bán thành phẩm vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 3.4.1.3 Kiểm tra trong quá trình sản xuất (IPC)

3.4.2 Kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn ở quy mô công nghiệp

3.4.2.1 Kiểm tra cảm quan

3.4.2.2 Kiểm tra thuần khiết

3.4.2.3 Kiểm tra an toàn

3.4.2.4 Kiểm tra hiệu lực

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Quy trình tóm tắt sản xuất vắc xin PRRS trên quy mô công nghiệp

Quy trình sản xuất vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loại sinh sản và hô hấp ở lợn là quy trình khép kín, toàn bộ quá trình sản xuất, kiểm tra trong quá trình và kiểm nghiệm đều được kiểm soát nghiêm ngặt, tuân thủ chặt chẽ các yêu cầu của tiêu chuẩn GMP-WHO về sản xuất chế phẩm sinh học vô trùng trong đó đặc biệt là chỉ tiêu vô trùng và an toàn Vì vậy, các nguyên liệu đưa vào để phục

vụ sản xuất vắc xin phải được lựa chọn kỹ lưỡng, đúng tiêu chuẩn, đồng thời tỷ

lệ của các chất đưa vào vắc xin cũng phải thích hợp Trên cơ sở đó, vắc xin sản xuất ra mới đảm bảo chất lượng

Nhân giống sản xuất

Hình 3.1 Sơ đồ sản xuất vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản

và hô hấp theo quy mô công nghiệp 3.5.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào

3.5.2.1 Hồi phục tế bào từ nguồn giống bảo quản ở lạnh sâu

- Chuẩn bị 5ml môi trường DMEM 5% FBS, làm ấm trong tủ ấm 37oC 30 phút

trước khi mở giống, cốc nước ấm và dụng cụ kèm theo

- + Bước 1 Đông tan: lấy 1 ống tế bào ra khỏi nitơ lỏng, đặt vào cốc nước sạch

370C, chuyển vào phòng làm tế bào, chờ tan đông

Ra chai, hoàn thiện sản phẩm

Cô đặc kháng nguyên (hiệu giá tối

thiểu 108 TCID50/ml) Bất hoạt virus (trên tank bất hoạt)

Nhũ hóa, bổ sung chất bổ trợ (trên tank

nhũ hóa – phối trộn

Gây nhiễm virus (20 ml/chai roller 2X)

Giống gốc vắc xin chủng KTY-PRRS-

vụ sản xuất (300-500 chai roller 2X)

Thu hoạch huyễn dịch virus (100 lít kháng nguyên/mẻ)

Kiểm nghiệm thành phẩm (cảm quan,

an toàn, vô trùng, hiệu lực)

- + Bước 2 Cân bằng môi trường: dùng pipette hút 5ml môi trường DMEM 5% FBS vào ống li tâm Sau đó hút chuyển huyễn dịch tế bào từ ống tế bào đã giải đông sang ống li tâm đã có 5ml DMEM 5% FBS rồi trộn đều

- + Bước 3 Ly tâm loại bỏ dung dịch bảo quản: ly tâm 700 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ phẩn dung dịch ở trên (giữ lại cặn tế bào màu trắng)

- + Bước 4 Hòa tan trong môi trường nuôi cấy tế bào: thêm vào ống ly tâm môi trường DMEM 5% FBS, dùng pipette nhẹ nhàng hút lên xuống nhiều lần để hòa tan tế bào

- + Bước 5 Cấy tế bào vào chai nuôi: ghi thông tin trên chai (Ngày mở giống, đời tế bào, lô) Hút môi trường DMEM 5% FBS vào chai tế bào (cho vào phía đáy chai nuôi tế bào) Chuyển tế bào vào chai tế bào, lắc nhẹ chai

- Quan sát trên kính hiển vi

- + Bước 6 Theo dõi tế bào phát triển và thay môi trường nuôi cấy tế bào: nuôi ở

37oC, 5% CO2 (hoặc môi trường DMEM có bổ sung chất ổn định pH) Theo dõi

sự phát triển của tế bào trên kính hiển vi (thay môi trường 3 ngày 1 lần nếu thấy cần thiết) cho đến khi tế bào phủ kín bề mặt đáy chai nuôi

3.5.2.2 Nuôi cấy tế bào MARC- 145

- Xác định số chai tế bào cần nhân, lượng môi trường đầy đủ và không đầy đủ, lượng PBS, trypsin, và cân bằng ở 37oC trước khi tiến hành thí nghiệm

- Khi bình nuôi tế bào đã có độ phủ kín hơn 90% bề mặt, tách tế bào và cấy chuyển như sau:

- + Bước 1 Loại bỏ môi trường đang nuôi: lắc nhẹ chai nuôi tế bào để làm sạch tế bào chết Dùng pipette/máy hút chân không hút bỏ môi trường trong chai nuôi

tế bào Rửa tế bào đang nuôi 2 lần với PBS: Thêm vào chai nuôi tế bào PBS, lắc nhẹ chai, hút bỏ PBS

- + Bước 2 Trypsin hóa tách tế bào: hút trypsin vào chai nuôi tế bào, sau đó lắc nhẹ nhàng để trypsin bám đều mặt tế bào Đặt vào tủ 37oC, ủ vừa đủ 10-15 phút

để làm các tế bào tách khỏi thành đáy chai

- + Bước 3 Trung hòa trypsin bằng DMEM 5% FBS: sau khi tế bào đã tách nhau hoàn toàn, trung hòa trypsin bằng DMEM 5% FBS Thêm vào chai môi trường DMEM 5% FBS (bằng lượng trypsin sử dụng) để dừng quá trình trypsin hóa, trộn đều, chuyển sang ống li tâm tương ứng