Tuyển chọn, định danh vi khuẩn có khả năng phân giải histamine phân lập từ quá trình sản xuất nước mắm và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối

Một số nghiên cứu mới đây đã phân lập được một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine trong các sản phẩm lên men từ cá cũng như trong nước mắm như: Staphylococcus xylosus, Sta

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ HỒNG

TUYỂN CHỌN, ĐỊNH DANH VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI HISTAMINE PHÂN LẬP TỪ QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC MẮM VÀ TỐI ƯU HOÁ ĐIỀU KIỆN

NUÔI CẤY ĐỂ THU SINH KHỐI

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS Nguyễn Thị Lâm Đoàn

2 PGS.TS Nguyễn Hoàng Anh

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình khoa học của tôi cùng nhóm nghiên cứu, số liệu và các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hồng

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, ngoài sự nỗ lực học hỏi của bản thân, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo,

sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng

và biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Lâm Đoàn, PGS.TS Nguyễn Hoàng Anh và TS Trần Thị Thu Hằng đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn chuyên môn và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, cùng quý Thầy/Cô trong Bộ môn Quản lý chất lượng và An toàn thực phẩm, Phòng Thí nghiệm Trung tâm khoa học và công nghệ thực phẩm, Khoa Công nghệ Thực phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thành viên tham gia nhóm nghiên cứu vì sự cộng tác, chia sẻ kiến thức, tìm kiếm phương pháp, tiến hành thí nghiệm cùng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, động viên, khuyến khích và giúp tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hồng

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract x

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích – yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Nước mắm 4

2.1.1 Giới thiệu về nước mắm 4

2.1.2 Quy trình sản xuất 4

2.2 Histamine 9

2.2.1 Giới thiệu chung về histamine 9

2.2.2 Sự hình thành histamine trong thực phẩm 9

2.2.3 Phương pháp làm giảm hàm lượng histamine trong thực phẩm 14

2.2.4 Một số nghiên cứu về vi sinh vật phân giải histamine 16

Phần 3 Đối tượng – nội dung và phương pháp nghiên cứu 20

3.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 20

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

3.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 21

3.1.3 Dụng cụ 21

3.1.4 Môi trường nuôi cấy 21

3.2 Nội dung nghiên cứu 21

3.3 Phương pháp nghiên cứu 21

3.3.1 Bố trí thí nghiệm 21

3.3.2 Phương pháp phân tích 23

Phần 4 Kết quả và thảo luận 30

4.1 Xác định khả năng phân giải histamine 30

4.2 Định danh chủng được tuyển chọn bằng phương pháp xác định định trình tự gene 16S rRNA 33

4.3 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp của chủng vi khuẩn đã được lựa chọn 35

4.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ muối 35

4.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 37

4.3.3 Ảnh hưởng của pH 39

4.4 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng vi khuẩn 41

4.4.1 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum CH2.1 41

4.4.2 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis TT8.5 46

4.4.3 Đường cong sinh trưởng của 2 chủng CH2.1 và TT8.5 với các điều kiện tối ưu 50

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 50

5.1 Kết luận 51

5.2 Kiến nghị 51

Tài liệu tham khảo 53

Phụ lục 61

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

High Pressure Liquid Chromatography

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Khả năng phân giải histamine của chủng vi khuẩn chịu mặn 30 Bảng 4.2 Kết quả định tên loài các chủng bằng giải trình tự gene 16S rRNA 34 Bảng 4.3 Một số đặc điểm của sáu chủng tuyển chọn 34 Bảng 4.4 Bảng mã hóa và khoảng biến thiên của các yếu tố nghiên cứu của

chủng CH2.1 42 Bảng 4.5 Bảng ma trận mã hóa theo mô hình thiết kế thí nghiệm Box-Behnken

và kết quả thực nghiệm của chủng CH2.1 42 Bảng 4.6 Kết quả phân tích ANOVA cho mật độ đo quang của chủng vi khuẩn

Exiguobacterium profundum CH2.1 44

Bảng 4.7 Bảng mã hóa và khoảng biến thiên của các yếu tố nghiên cứu của

chủng TT8.5 46 Bảng 4.8 Bảng ma trận mã hóa theo mô hình thiết kế thí nghiệm Box-Behnken

và kết quả thực nghiệm của chủng TT8.5 47 Bảng 4.9 Kết quả phân tích ANOVA cho mật độ đo quang của chủng vi khuẩn

Virgibacillus campisalis TT8.5 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Công thức cấu tạo 9

Hình 2.2 Cấu trúc không gian 9

Hình 2.3 Sự hình thành histamine từ histidine 11

Hình 2.4 Phản ứng xúc tác bởi enzyme diamine oxidase 17

Hình 2.5 Phản ứng xúc tác bởi enzyme histamine dehydrogenase 17

Hình 3.1 Sắc kí đồ chuẩn histamine 25

Hình 3.2 Đồ thị đường chuẩn histamine 25

Hình 4.1 Sắc kí đồ histamine của chủng vi khuẩn Nh6.2 ở thời điểm 0 ngày 32

Hình 4.2 Sắc kí đồ histamine của chủng vi khuẩn Nh6.2 ở thời điểm 4 ngày 32

Hình 4.3 Sắc kí đồ histamine của chủng vi khuẩn Nh6.2 ở thời điểm 7 ngày 33

Hình 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum CH2.1 35

Hình 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis.TT8.5 36

Hình 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum CH2.1 37

Hình 4.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis.TT8.5 38

Hình 4.8 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum CH2.1 40

Hình 4.9 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis.TT8.5 40

Hình 4.10 Điều kiện nuôi cấy tối ưu của chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum CH2.1 45

Hình 4.11 Điều kiện nuôi cấy tối ưu của chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis TT8.5 49

Hình 4.12 Đường cong sinh trưởng của 2 chủng CH2.1 và TT8.5 với các điều kiện tối ưu 50

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên Tác giả: Nguyễn Thị Hồng

Tên Luận văn: Tuyển chọn, định danh vi khuẩn có khả năng phân giải histamine phân

lập từ quá trình sản xuất nước mắm và tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối

Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện được đề tài chúng tôi đã sử dụng các phương pháp sau:

1 Tuyển chọn chủng có khả năng phân giải histamine được tiến hành theo

Tapingkae et al., 2010

2 Định danh chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine bằng phương pháp

xác định trình tự gen 16S rRNA được tiến hành theo phương pháp của Yi-Lin

- Từ 6 chủng đó CH2.1, CH3.3, LT9.2, TT8.5, CT13.1, Nh6.2 được mang đi xác

định trình tự gene 16S rRNA được kết quả tương ứng là Exiguobacterium profundum,

Virgibacillus halodenitrificans, Staphylococcus arlettae, Virgibacillus campisalis, Chromohalobacter salexigens, Staphylococcus cohnii subsp urealyticus

- Điều kiện thích hợp cho chủng Exiguobacterium profundum CH2.1: Nồng độ

muối 5-12%, pH = 6-7, nhiệt độ: 27-370C

Điều kiện thích hợp cho chủng Virgibacillus campisalis TT8.5: Nồng độ muối:

2-8%, pH =7.5- 8.5, nhiệt độ: 32-420C

- Điều kiện phát triển tối ưu của chủng Exiguobacterium profundum CH2.1: Nồng độ

muối 7.84%, pH = 6.75, nhiệt độ 32.840C với giá trị Abs 620nm tại thời điểm 96h đạt 3,8328

- Điều kiện phát triển tối ưu của chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis

TT8.5: Nồng độ muối 2.6%, pH = 8.5, nhiệt độ 320C với giá trị Abs 620nm tại thời điểm 96h đạt 7,2425

- Khi khảo sát nuôi 2 chủng CH 2.1 và TT8.5 ở điều kiện tối ưu thì tại thời điểm

96h giá trị Abs 620nm đạt 3,4477 với chủng CH2.1 và 6,1922 đối với chủng TT.8.5

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Nguyen Thi Hong

The thesis title: Screening, identifying and optimizing of culturing conditions of

histamine degrading bacteria isolated from fish sauce fermentation

Educational organization:Vietnam National University and Agriculture (VNUA) Research objectives

The aim of this study is to select, identify and optimize culturing conditions of 1-2 bacterial strains with high salt tolerant and histamine degradation from fish sauce natural fermentation

Materials and Methods

- Determination of histamine content by HPLC (following Yoshida T et al.,

2012 and TCVN 8352:2010; with some modifications)

- Bacterial identification was carried out based on morphological observation

and molecular method (sequencing of the gene coded 16s DNA)

- Data analysis was performed using Excel

The following methods were used in the conduct of this research

1 Selection of bacterial strains have histamine degrading ability in cutural

medium according to Tapingkae et al., 2010

2 Bacterial identification with high histamine degrading ability by 16S rRNA

gene sequencing method was carried out based on the method of Yi-Lin Chen et

al., 2015

3 Determination of histamine content by HPLC following Saeed Tahmouzi

et al (2011)

with some modifications

4 Optimize culture conditions with Box-Behnken model

- Data analysis was performed using Excel

Main findings and conclusions

- 6/28 strains with highest histamine resolution after 7 days of culture in histamine supplemented medium were Nh6.2, LT9.2, TT8.5, CH2.1, CT13.1, CH3.3 billion histamine resolution ratio is 44.66%, 44.31%, 43.11%, 43.09%, 42.94%, 42.94%, respectively

- From these 6 strains CH2.1, CH3.3, LT9.2, TT8.5, CT13.1, Nh6.2 were carried

out to determine the gen 16S rRNA sequence, resulting Exiguobacterium profundum,

Virgibacillus halodenitrificans, Staphylococcus arlettae, Virgibacillus campisalis, Chromohalobacter salexigens, Staphylococcus cohnii subsp urealyticus respectively

- Suitable conditions for Exiguobacterium profundum CH2.1 strain: Salt

concentration 5-12%, pH = 6-7, temperature: 27-370C

Suitable conditions for Virgibacillus campisalis strains TT8.5: Salt

concentration: 2-8%, pH = 7.5 - 8.5, temperature: 32-420C

- Optimum growing condition of Exiguobacterium profundum CH2.1: Salt

concentration of 7.84%, pH = 6.75, temperature of 32.840C with Abs 620nm value at 96h reaches 3,8328

- Optimum growing condition of Virgibacillus campisalis strain TT8.5: Salinity

of 2.6%, pH = 8.5, temperature 320C with Abs 620nm at 96h reaches 7.2425

- When surveyed to raise 2 strains CH 2.1 and TT8.5 in optimal conditions, at 96h, Abs 620nm value reached 3,4477 with CH2.1 and 6,1922 strains for TT.8.5

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Nước mắm từ lâu đã là gia vị đặc trưng không thể thiếu trong các bữa ăn của người Việt Nam cũng như hầu hết các nước Đông Nam Á Khoảng 86% hàm lượng nitơ tổng số là các nitơ hữu cơ và 49% là nitơ của các amino acid tự do Hàm lượng các amino acid đạt khoảng 4g/l với sự có mặt gần như đầy đủ của các amino acid thiết yếu như valin, leucine, isoleucine, lysine, threonine, không phải

amino acid thiết yếu, methionine, phenylalanine, tryptophane,… (Lopetcharat et

al., 2002)

Những năm gần đây một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy nước mắm đến từ châu Á chứa hàm lượng histamine cao Mức histamine cao trong thực phẩm nó gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kì (FDA) đã cho thấy hàm lượng 50 ppm là mức gây ngộ độc

và 500ppm là mức gây nguy hiểm đến sức khỏe của người sử dụng của các sản phẩm chứa histamine (Lehane and Olley, 2000)

Hiện nay, việc ứng dụng các vi khuẩn phân giải histamine là một phương pháp hữu hiệu trong việc giảm lượng histamine trong thực phẩm lên men Một

số nghiên cứu mới đây đã phân lập được một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine trong các sản phẩm lên men từ cá cũng như trong nước mắm như:

Staphylococcus xylosus, Staphylococcus carnosus, Bacillus amyloliquefaciens, Arthrobacter crystallopoietes, và Brevibacterium linens,… (Zaman et al., 2010,

2011; Lee et al., 2016; Tapingkae et al., 2010) Trong nghiên cứu của Lee et al (2015, 2016), chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine là Bacillus

polymyxa D05-1 được phân lập từ cá mòi muối (salted sardine) hàm lượng

histamine trong sản phẩm giảm 34% so với mẫu đối chứng Nghiên cứu của

Zaman et al (2010) đã chỉ ra Staphylococcus carnosus phân lập từ nước mắm

có khả năng phân giải được 29,1% histamine so với lượng ban đầu

Trên thế giới đã có những nghiên cứu về vi khuẩn phân giải histamine và tối

ưu điều kiện nuôi cấy của chúng Nghiên cứu của Lee et al (2012) cho thấy

Virgibacillus campisalis sp điều kiện tối ưu cho chủng vi khuẩn này ở pH 7,5-8;

nhiệt độ ở 37ºC và nồng độ muối từ 4-5% Theo nghiên cứu của Lee et al (2015, 2016), chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine là Bacillus polymyxa

D05-1 và điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu sinh khối là 24h, nhiệt độ 25-37ºC, pH 7-9 và nồng độ NaCl 0,5-5% Sinh khối này sẽ được bổ sung trực tiếp vào cá trước khi lên men Tuy nhiên ở Việt Nam mới chỉ dừng lại ở một số nghiên cứu

về khả năng sinh histamine của vi khuẩn (Dang Thao Yen Linh et al., 2018) cũng

có nghiên cứu về phân lập tuyển chọn những vi khuẩn có khả năng sinh histamine được phân lập từ quá trình sản xuất nước mắm ở Cát Hải; cũng như nhóm nghiên cứu của Đại học Nha Trang đã nghiên cứu xác định khả năng sinh histamine của một số vi khuẩn phân lập từ chượp cá cơm trong quá trình sản xuất nước mắm truyền thống) tuy nhiên nghiên cứu về khả năng phân giải histamine

từ vi khuẩn còn nhiều hạn chế

Trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ vi sinh để giảm hàm lượng histamine trong nước mắm truyền thống” với Bộ Công Thương nhóm nghiên cứu đã phân lập và tuyển chọn được 28 chủng vi khuẩn chịu mặn từ chượp mắm ở Hải Phòng và Nam Định Để tìm ra các chủng có khả năng phân giải histamine và tiến hành tối ưu hóa điều kiện tăng sinh khối, nhằm tạo ra chế phẩm vi sinh vật bước đầu ứng dụng vào quá trình sản xuất nước mắm

Chính vì vậy nghiên cứu này đã tiến hành “Tuyển chọn, định danh vi khuẩn

có khả năng phân giải histamine phân lập từ quá trình sản xuất nước mắm

và tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối”

1.2 MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU

1.2.1 Mục đích

Tuyển chọn, định danh vi khuẩn có khả năng phân giải histamine phân lập từ quá trình sản xuất nước mắm và tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối

+ Ảnh hưởng điều kiện đơn yếu tố (pH, nhiệt độ, nồng độ muối) đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn;

+ Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng vi khuẩn theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm đa yếu tố

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 NƯỚC MẮM

2.1.1 Giới thiệu về nước mắm

Nước mắm theo cách hiểu thông thường là chất nước rỉ từ cá, tôm và một

số động vật nước khác được ướp muối lâu ngày, nó được sử dụng rộng rãi trong

ẩm thực của các quốc gia Đông Nam Á như Việt Nam và Thái Lan để làm nước chấm hoặc gia vị chế biến các món ăn

Trên phương diện khoa học, nước mắm là hỗn hợp muối với các amino acid được tạo ra từ quá trình thủy phân protein trong thịt cá nhờ tác dụng các hệ enzyme có sẵn trong ruột cá cùng với một số loại vi khuẩn kỵ khí chịu mặn

Nước mắm là mặt hàng chính của ngành đánh bắt thủy sản nước ta, tiêu thụ 40-60% tổng số cá đánh bắt được, và được sản xuất trên cả nước Với lợi thế

có đường bờ biển dài, được thiên nhiên ưu đãi hiện nay nước ta có khoảng 600 nhà máy chế biến nước mắm phân bố trong cả nước, với nhiều thương hiệu nổi tiếng như nước mắm Phú Quốc, Phan Thiết, Khánh Hòa, Cát Hải, Ninh Cơ,… (Lương Đức Phẩm, 2012) Trong đó, nguồn nguyên liệu cũng như phương pháp sản xuất ở mỗi vùng miền có những đặc điểm, công thức riêng tạo ra sản phẩm

có hương vị đặc trưng cho mỗi nơi

2.1.2 Quy trình sản xuất

2.1.2.1 Nguyên liệu sản xuất nước mắm

Nguyên liệu chính để sản xuất nước mắm là cá và muối

 Cá

Nguyên liệu chính để sản xuất nước mắm được người dân lựa chọn là cá nục, cá nhâm, cá lâm, rồi cá quẩn, cá trích,… Cá là nguyên liệu chính dùng để sản xuất nước mắm, do vậy chất lượng của cá sẽ quyết định chất lượng của nước mắm Nước mắm chủ yếu được sản xuất từ các loại cá biển nhỏ và có giá trị kinh

tế thấp Ở mỗi nơi, tuỳ thuộc vào điều kiện tự nhiên mà cá nguyên liệu đánh bắt được để sản xuất nước mắm là khác nhau vì vậy mà mỗi vùng miền mang một hương vị nước mắm riêng

- Thành phần hóa học của cơ thịt cá gồm: nước, lipid, protein, glucid, muối

vô cơ, vitamin Thành phần hóa học của từng loại cá là khác nhau, tùy thuộc vào

giống, loài, trạng thái sinh lí, giới tính, mùa vụ, thời tiết,… Sự khác nhau về thành phần hóa học, độ tươi của nguyên liệu và sự biến đổi của chúng làm ảnh hưởng đến mùi vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990)

- Cá được phân ra làm ba loại:

+ Cá gầy (lipid <1%) như cá cơm, cá tuyết,

+ Cá béo vừa (lipid <10%) như cá mập, cá nhồng,

+ Cá béo (lipid >10%) như cá hồi, cá trích,

Và loại cá được sử dụng thích hợp ở đây là cá nhỏ, gầy bởi chúng có hàm lượng lipid thấp Cá nhỏ để đỡ tốn công nhân phải xử lí nguyên liệu trước khi sản xuất, đồng thời diện tích tiếp xúc của cá với muối cũng tăng thúc đẩy quá trình thuỷ phân diễn ra nhanh chóng

- Cá được đưa và sản xuất chế biến thành nước mắm tuyệt đối không được

sử dụng các loại cá có chứa chất độc như cá nóc chứa độc tố tetrodotoxin không

bị phân huỷ trong quá trình lên men

- Không sử dụng nhưng loại cá ươn, cá ôi thiu vì trong các loại cá này có hàm lượng histamine cao và các loại cá có chứa tỉ lệ cơ thịt đỏ như: cá ngừ, cá thu, vì trong phần cơ thịt đỏ có nhiều histidin dễ dàng chuyển hoá tạo thành Histamine gây ngộ độc cho con người vì thịt cá có độ bền cơ học kém vi sinh vật rất dễ phát triển

- Sau khi đánh bắt cần bảo quả một cách hợp lí ở nhiệt độ thấp và đưa đi chế biến, sản xuất trong càng sớm càng tốt để hạn chế sự chuyển hoá từ histidin thành histamine

 Muối

Cũng giống như cá, muối là nguyên liệu thứ hai không thể thiếu trong quá trình lên men nước mắm Dùng muối ăn để ướp muối cá là một phương thức bảo quản hiệu quả Là phương pháp chế biến và bảo quả dễ dàng, rẻ tiền, nhanh chóng giải quyết kịp thời một khối lượng nguyên liệu lớn

Tác dụng của muối ăn trong sản xuất nước mắm (Nguyễn Trọng Cẩn và

Đỗ Minh Phụng, 1990):

+ Bảo quản nguyên liệu, kéo dài thời gian sử dụng;

+ Có tác dụng phòng thối khi bảo quản các sản phẩm thuỷ sản bằng cách ướp muối;

+ Muối ăn thẩm thấu vào nguyên liệu làm cho nước thoát ra, vi khuẩn thiếu nước không thể phát triển được như vậy chượp cá không bị hỏng, bị thối;

+ Thúc đẩy quá trình thuỷ phân diễn ra nhanh hơn trong sản xuất nước mắm; + Nồng độ muối quá cao có tác dụng ức chế, làm giảm hoạt tính của enzyme, quá trình thủy phân chậm lại, thời gian thủy phân kéo dài Vì vậy, để chế biến chượp nhanh cần xác định lượng muối cho vào trong chượp là bao nhiêu

và lượng muối này vừa đủ ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối, vừa tránh kìm hãm hoạt động của enzyme Thông thường ở nước ta, lượng muối ăn tinh khiết cho vào khoảng 20-25% so với khối lượng cá

2.1.2.2 Các phương pháp chế biến chượp

Theo Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng (1990) thì có 3 phương pháp chế biến chượp cổ truyền:

Phương pháp đánh khuấy:

-Trộn cá và muối: Cá được trộn với muối lần đầu tiên theo tỉ lệ 10-15% muối trên tổng khối lượng cá Hỗn hợp cá trộn với muối được gọi là chượp

-Bổ sung nước và muối

+ Sau khi trộn muối với cá được 2 – 3 ngày thì đổ thêm nước lã sạch theo

tỷ lệ 25 - 30% so với khối lượng cá ban đầu, dùng cào gỗ đánh đảo cho thật kĩ làm cho muối đều và tan hết

+ Khi thấy hiện tượng “cá đòi muối” thì bổ sung muối lần 2, lượng muối

bổ sung từ 10 -12% so với lượng cá ban đầu

+ Sau ngày cho muối lần 2 được 3 ngày (về mùa hè) hoặc 6 ngày (về mùa đông) thì cho thêm 10 -12% muối nữa so với lượng cá ban đầu và đánh trộn cho muối tan hết vào chượp

+ Việc bổ sung muối các lần sau có thể thực hiện 3 - 4 lần, kiểm tra nước bổi đạt 25 độ bô mê (độ mặn), không còn hiện tượng “cá đòi muối” nữa là cá đã

đủ muối

- Chăm sóc chượp

+ Bắt đầu từ khi bổ sung nước trong giai đoạn muối cá là đã bắt đầu việc chăm sóc chượp bằng cách phơi nắng kết hợp với đánh khuấy;

+ Trong ba tháng đầu, hằng ngày, chượp được phơi nắng và đánh khuấy 2 lần/ngày;

+ Đến tháng thứ tư, thứ năm thì trong một tuần đánh khuấy 1 lần;

+ Đến tháng thứ sáu, nước trên bề mặt chượp trong, có hương thơm, màu sắc đỏ là chượp đã chín;

+ Cho muối nhiều lần đã lợi dụng được khả năng phân giải của enzyme và

vi sinh vật tới mức đô cao, rút ngắn thời gian chế biến chượp Cho muối nhiều lần là tạo điều kiện để phòng thối, tiêu diệt các vi khuẩn gây thối thông thường

và không kìm hãm nhiều quá khả năng hoạt động của men;

+ Cho thêm nước lã là cung cấp cho môi trường phân giải một lượng vi sinh vật đáng kể, tạo môi trường lỏng giúp cho men và vi sinh vật hoạt động được dễ dàng, làm cho tế bào thịt cá chóng được phân giải;

+ Lượng nước cho thêm vào nên vừa phải, nếu ít quá thì tác dụng phân giải của men kém nhưng nếu nhiều quá thì không khống chế được quá trình thối rữa đồng thời làm giảm độ đạm trong nước mắm Vì vậy, lượng nước cho vào còn tùy thuộc đặc điểm của nguyên liệu, thường từ 20 – 30% so với cá;

+ Thời gian từ 6-8 tháng thì chượp chín

Phương pháp này được Cát Hải - Hải Phòng sử dụng để sản xuất

+ Đây là phương pháp của vùng khu 4 cũ hoặc của các tỉnh phía Nam; + Khoảng thời gian từ 6 tháng cho đến 1 năm thì chượp chín

Phương pháp này được nước mắm Phú Quốc sử dụng để sản xuất

Phương pháp chế biến hỗn hợp (kết hợp hai phương pháp gài nén và

đánh khuấy):

+ Phương pháp này rút kinh nghiệm từ hai phương pháp trên;

+ Lúc đầu, thực hiện phương pháp gài nén;

+ Sau đó thực hiện phương pháp đánh khuấy

Ở miền Nam, chế biến chượp theo phương pháp gài nén thì thời gian dài nhất nhưng nói chung đạm thối ít hơn nên đạm hữu ít trong nước mắm cao hơn

và tổng lượng đạm cũng cao hơn so với phương pháp đánh khuấy

Khi đã cho đủ muối thì thân cá đã ngấm muối, nát đều và chìm xuống, không còn hiện tượng trương và nổi lên nữa Lúc đó, người ta nói cá đã “đứng cá” Nhờ nén chặt, nhiệt nội có trong cá làm cho men hoạt động tăng lên, trung tâm tích tụ dần khí NH3, CO2, H2S làm cho cá trương lên, thịt cá bị xé nát nhưng xương và da vẫn còn nguyên Muối thẩm thấu vào cá nước tiết ra gọi là nước bổi Khoảng 1 tháng sau thì cá chìm xuống hẳn, nước nổi lên có màu vàng, trong và xuất hiện mùi nước mắm rõ rệt, lúc đó cá đã “đứng mặt dầu” Màu sắc của nước mắm chuyển từ màu vàng nhạt sang hẳn màu vàng đậm, nước mắm trong

Sau 6 – 12 tháng, chượp đã chín hoàn toàn, có thể chiết rút

Đặc điểm của phương pháp này là chượp chín cá vẫn còn nguyên con, xương không nát nên thuận lợi cho việc kéo rút

2.1.2.3 Các hệ enzyme tham gia vào quá trình phân giải protein

Theo Phan Thị Thanh Quế, 2005 lượng chất đạm tăng cao nhất ở tháng thứ 3 sau đó không tăng hoặc hơi giảm, lượng peptide và amino acid tăng đến khi chượp chín Men phân giải bao gồm ba hệ, mỗi hệ có tính chất và giữ vai trò quan trọng khác nhau:

- Hệ men metalo – protease: có nhiều trong nội tạng cá, chịu được nồng

độ muối cao nên ngay từ đầu đã hoạt động rất mạnh, sang tháng thứ 2 thì giảm dần tới tháng thứ 3 Có hoạt tính mạnh, thuỷ phân rộng rãi đối với các loại peptid, đại diện cho nhóm men thuỷ phân trung tính, môi trường thích hợp pH=

5 – 7, điểm đẳng điện pI= 4 – 5, ổn định với Mn++ và Mg++, dễ mất hoạt tính với Zn++, Ni++, Pb++, Hg++

- Hệ men serin – protease: tồn tại nhiều trong nội tạng cá, có tồn tại trong

nước bổi nhưng hoạt động yếu ớt Hoạt tính tăng dần từ tháng thứ 2 và đạt cực đại ở tháng thứ 3 rồi giảm dần đến tháng thứ 9 Theo Koide, 2010 hệ men này bị

ức chế bởi chuỗi acid amine nằm trong cấu trúc của enzyme Khi phân giải tế bào thì Cathepsin B có nhiệm vụ tháo gỡ chuỗi ức chế ra khỏi cấu trúc và hệ men này hoạt động mạnh và đóng vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình thuỷ phân còn lại Môi trường hoạt động pH=5 – 10 và hoạt động tốt pH= 9

- Hệ men acid protease: được tìm thấy nhiều trong nội tạng, thịt cá Hệ

men này tồn tại trong giai đoạn ngắn của đầu thời kì thuỷ phân, người ta thấy nó tồn tại trong nước bổi, sau 24h thì hoạt tính của chúng mất hẳn do không chịu được mặn Hệ men này thuỷ phân protein mạnh nhưng bị ức chế bởi nồng độ muối cao

2.2 HISTAMINE

2.2.1 Giới thiệu chung về histamine

Histamine là một amine sinh học, công thức phân tử là C5H9N3, danh pháp hóa học là 2-(3H-imidazol-4-yl) ethanamine Nó là một hợp chất dị vòng, có hai nhóm amine (diamine), dạng tinh thể, dễ hút ẩm, nhiệt độ nóng chảy 83.5oC, nhiệt độ sôi 209.5oC, dễ hòa tan trong nước và ethanol, tan rất ít trong diethyl ether

Hình 2.1 Công thức cấu tạo Hình 2.2 Cấu trúc không gian

Histamine là một hợp chất không mùi, không thể phát hiện ngay cả bởi các

nhà nghiên cứu đã được đào tạo (Tapingkae et al., 2010) Histamine có đặc tính chịu nhiệt, thậm chí khi được nấu chín histamine vẫn không bị phá hủy (Luten et

al., 1992)

Trong cơ thể người, histamine là một chất nội sinh được tạo ra một cách tự nhiên qua quá trình decarboxyl hóa amino acid histidine với sự xúc tác của histidine decarboxylase Enzyme này chỉ được tổng hợp khi cần thiết và bị phân hủy ngay khi lượng histamine nội sinh được sinh tổng hợp đủ (FAO, 2013) Histamine được tìm thấy trong các tế bào mast (dưỡng bào), tập trung nhiều ở mũi, miệng, thành mạch máu… Nó có vai trò chính trong phản ứng dị ứng, làm giãn mạch máu và tăng tính thấm của thành mạch Bên cạnh đó, nó hoạt động như một chất dẫn truyền thần kinh hoặc chất trao đổi chất mang tín hiệu từ một dây thần kinh này đến dây thần kinh khác, cũng như thực hiện một số chức năng

quan trọng khác trong các mô cơ thể khác nhau Hợp chất này tham gia vào khoảng 23 chức năng sinh lý như điều chỉnh nhiệt độ và trọng lượng cơ thể, kiểm soát giấc ngủ và sự tỉnh táo, tiết acid ở dạ dày, làm lành vết thương, làm giảm huyết áp… (Noszal, 2004)

Hàm lượng histamine bị suy giảm thông qua quá trình oxy hóa, được xúc tác bởi histamine oxidase hoặc histamine dehydrogenase Histamine oxidase xúc tác chuyển đổi của histamine, với sự hiện diện của nước và oxy đến imidazole

acetaldehyde, amoniac và hydrogen peroxide (Sekiguchi et al., 2004) Các amine

sinh học bị phân hủy thông qua quá trình oxy hóa xúc tác bởi histamine oxidase qua phản ứng: R-CH2-NH-R '+ O2 + H2O → R-CHO + H2N-R' + H2O2 (Murooka

et al., 1979) Các nghiên cứu đã chứng minh sự có mặt của histamine oxidase

trong nhiều loại vi khuẩn (Martuscelli et al., 2000; Murooka et al., 1979; Zama et

al., 2010) Monoamine oxidase đã được tìm thấy trong một số dòng họ Enterobacteriaceae như Klebsiella, Enterobacter, Eschericia, Salmonella, Serratia và Proteus (Murooka et al., 1979) Ngoài ra, một số vi khuẩn cũng sử

dụng histamine dehydrogenase làm giảm histamine (Hacisalihoglu et al., 1997)

Tuy nhiên, một số sản phẩm thực phẩm gây ra những hạn chế đối với hoạt động này trong các điều kiện tăng trưởng vi khuẩn và hoạt động enzyme ở pH thấp, nhiệt độ cao hoặc độ mặn cao Những hạn chế này nên được loại bỏ để đảm bảo hiệu quả của hoạt động này trong thực phẩm có nồng độ muối cao, chẳng hạn như nước mắm và nước sốt tôm

2.2.2 Sự hình thành histamine trong thực phẩm

2.2.2.1 Sự hình thành histamine

Các amine sinh học phổ biến như histamine, putrescine, cadaverine, và

tyramine… có mặt trong nhiều các sản phẩm cá sống (Kim et al., 2001a,b) và

trong các sản phẩm lên men như nước mắm, pho mat, rượu, bia và dưa bắp cải,

thịt lên men (Halasz et al., 1994; Shalaby, 1996; Jairath et al., 2015)

Các amine sinh học trong thực phẩm nói chung được hình thành chủ yếu

do sự loại nhóm α-carboxyl của các amino acid tương ứng Histamine được hình thành bởi sự tách nhóm α-carboxyl ra khỏi amino acid histidine (Hình 1) Histidine là một trong các amino acid không thay thế mà cơ thể người không tự tổng hợp, được cung cấp từ thức ăn Histidine thường được tìm thấy trong thực phẩm như cá, thịt, trứng và các sản phẩm từ sữa (Wickham, 2011)

triển của vi khuẩn và h

các amine sinh học tron

2011; FAO-WHO, 2013

Trong các sản ph

lượng lớn Nguyên nhân

cần thiết cho sự sinh am

diện của vi khuẩn sinh e

triển của vi khuẩn này (

đối với các loại nước m

n và hoạt động của enzyme decarboxylase Do

c trong cá tươi thấp hơn rất nhiều so với trong , 2013)

n phẩm lên men từ cá, các amine được hìnhnhân có thể là do điều kiện lên men đã đáp inh amine như mức độ sẵn có của các amino ac sinh enzyme decarboxylase, và các điều kiện c này (Köse, 2010) Hàm lượng histamine rất ca

c mắm khác nhau, như 200-600 mg/L trong

ớc mắm Hàn Quốc (Brillantes and Samoso

ật 383-1172 mg/L (Kuda et al., 2012) Như

c hình thành các amine sinh học gồm chất lư

u (Komprda et al., 2001), quy trình sản xu

t sinh enzyme decarboxylase (Santos, 1996)

ủa các giống vi khuẩn Bacillus, Citrobact

siella, Listeria, Photobacterium, Proteus, nella, Shigella, Plesiomonas và vi khuẩn lac

ủa một hay nhiều amino acid để tạo ra các

95; Kim et al., 2003; Bjornsdottir et al., 20

có mặt trong các sản phẩm lên men như rượ

1994), pho mát (Stratton et al., 1991) và nước m

c hình thành với hàm đáp ứng các yêu cầu ino acid tự do, sự hiện

n cho phép sự phát

t cao được ghi nhận trong nước mắm Thái, amosorn, 2001), nước Như vậy, các yếu tố

t lượng và điều kiện

n xuất (Rivas et al.,

1996) và sự sẵn có của

bacter, Clostridium, teus, Pseudomonas,

n lactic có khả năng

ra các amine sinh học 2009; Hungerford,

ợu vang

(Lonvaud-c mắm (Kimura et

al., 2001; Hungerford, 2010), được tạo ra chủ yếu bởi vi khuẩn gram dương như

vi khuẩn lactic (Leuconostoc oenos, Tetragenococcus muriaticus…) Trong khi

đó, histamine trong các sản phẩm cá sống chủ yếu do vi khuẩn gram âm như

Morganella morganii, Klebsiella spp Raoultella planticola, và Enterobacter aerogenes, Photobacterium damselae… (Kim et al., 2000; Lo´pez-Sabater et al.,

1994; Kim et al., 2001b; Hungerford, 2010) Gần đây, một số loài khác sinh histamine cũng được phát hiện trong sản phẩm cá sống như Photobacterium

phosphoreum và Morganella psychrotolerans (Emborg et al., 2006; Kanki et al.,

2004) Sự phát triển và sinh histamine của những vi khuẩn này có thể là vấn đề rất khó kiểm soát ở các quy trình chế biến thông thường, ngay cả khi nguyên liệu

cá được bảo quản lạnh (Bjornsdottir et al., 2009)

Histamine được tạo thành từ amino acid histidine nên thực phẩm chứa nhiều đạm bảo quản càng lâu thì lượng histamine càng tăng Các loại cá biển, đặc biệt cá có chứa tỉ lệ cơ thịt đỏ cao như cá ngừ, cá thu, cá song… có hàm lượng histamine cao So với thịt gia súc, gia cầm, thịt cá có độ bền cơ học kém hơn nên

vi sinh vật (Enterobacteriaceae, Morganella morganii…) rất dễ phát triển và

sinh ra histidine decarboxylase chuyển hóa histidine thành histamine Các vi khuẩn này có thể tồn tại tự nhiên trên mang cá, trên các bề mặt bên ngoài và trong ruột cá nước mặn và không gây hại khi cá còn sống Nhưng khi cá chết, các

cơ chế phòng vệ của cá không còn khiến chúng phát triển và sinh ra histidine decarboxylase (Đào Thị Ngà, 2016) Một khi histidine decarboxylase đã có mặt trong cá, chúng có thể tiếp tục sản sinh histamine ngay cả khi vi khuẩn không hoạt động Ngoài ra, sự hình thành và tích tụ histamine chịu ảnh hưởng bởi sự kết hợp giữa thời gian và nhiệt độ bảo quản cá sau thu hoạch Một nghiên cứu cho thấy sau 24h bảo quản cá ngừ vây vàng ở 20oC, histamine hình thành nhanh

chóng và nồng độ cao gấp 10 lần so với ban đầu (Guizani et al., 2005) Nogues et al (1997) đã chỉ ra rằng hàm lượng histamine tăng lên trong mẫu cá

Veciana-bảo quản ở nhiệt độ thấp chậm hơn so với mẫu được Veciana-bảo quản ở nhiệt độ của môi trường và histamine khó bị phân hủy bằng đun nóng hoặc đông lạnh

2.2.2.2 Các yếu tố môi trường tác động đến sự hình thành histamine trong thực phẩm

Các yếu tố môi trường chính ảnh hưởng đến hoạt động của vi khuẩn trong thực phẩm là nhiệt độ, nồng độ muối và pH Chúng có thể ảnh hưởng đến việc hình thành các amine sinh học nói chung và histamine nói riêng Bởi vì, chúng

không chỉ tác động đến sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào vi khuẩn có khả năng sinh ra enzyme decarboxylase mà còn tác động đến hoạt tính của enzyme này Bên cạnh đó, giá trị tối ưu của các yếu tố môi trường cho hai vấn đề

này có thể khác nhau (Bargossi et al., 2015a)

Nhiệt độ: nhiệt độ gần với nhiệt độ tối ưu để vi sinh vật sinh trưởng tốt

nhất, thúc đẩy quá trình trao đổi chất và tăng sinh tế bào cũng chính là nhiệt độ thích hợp cho việc hình thành amine (Fausto, 2016) Theo nghiên cứu của Calles-

Enriquez et al (2010), chủng Streptococcus thermophilus khi được nuôi cấy ở

nhiệt độ 4oC sản sinh histamine thấp hơn so với khi được nuôi cấy ở 42oC Nói chung khả năng sản sinh các amine sinh học bị hạn chế bởi sự giảm nhiệt độ Điều này có nghĩa là để tránh sự tích tụ các sản phẩm không mong muốn sau sản xuất, đặc biệt là trong các thực phẩm không lên men như các sản phẩm thủy sản thì chúng cần được bảo quản lạnh trong quá trình lưu trữ và thương mại hóa

(Knope et al., 2014) Một số tác giả nghiên cứu tác động quan trọng của nhiệt độ

bảo quản đối với sự hình thành histamine trong cá ngừ (Emborg và Dalgaard,

2006; Kanki et al., 2007) và cá cơm (Visciano et al., 2007)

Nồng độ muối: việc tăng nồng độ muối sẽ ảnh hưởng đến quá trình trao

đổi chất của vi khuẩn có khả năng sinh enzyme decarboxylase, từ đó làm giảm sự tích lũy các amine sinh học trong thực phẩm Đặc biệt, khi tăng nồng độ muối, vi khuẩn Gram âm bị ức chế nhiều hơn so với vi khuẩn Gram dương Tuy nhiên, con người có xu hướng tránh sử dụng thực phẩm có hàm lượng muối cao do chúng ảnh hưởng đến sức khỏe (Fausto, 2016) Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt động

của enzyme histidine decarboxylase đối với loài S thermophiles đã được nghiên cứu Kết quả cho thấy việc sản sinh histamine bị hạn chế trong tế bào sống của S

thermophiles tại nồng độ muối 2,5% (Tabanelli et al., 2012) Một số loài thuộc vi

khuẩn lactic được phân lập từ nước mắm như Tetragenococcus muriaticus có khả

năng sinh histamine trong suốt quá trình sinh trưởng, phát triển, và sản sinh histamine nhiều nhất tại nồng độ muối 5- 7%, và hoạt động của histidine

decarboxylase có thể duy trì tại nồng độ muối 20% (Kimura et al., 2001)

pH: một số nghiên cứu đã tập trung vào mối quan hệ giữa pH và sự tích

tụ các amine sinh học Nhiều trường hợp đã chứng minh rằng sự sản sinh

decarboxylase diễn ra tốt hơn tại pH thấp (Romano et al., 2014; Perez et al.,

2015) Tác động của pH thấp trong việc tăng cường sự sản sinh histidine

decarboxylase của Lactococcus lactis đã được quan sát bởi Trip et al (2012) và ở

Lactobacillus brevis của Marcobal et al (2006) Bên cạnh đo, enzyme histidine

decarboxylase của S thermophilus có giá trị pH tối ưu là 4,5 (Tabanelli et al., 2012) Histidine decarboxylase từ một số vi khuẩn gram âm như P phosphoreum

có giá trị pH tối ưu là 7, đối với P damselase là 6, và là 6,5 đối với M morganii

và R planticola (Kanki et al., 2007)

2.2.3 Phương pháp làm giảm hàm lượng histamine trong thực phẩm

Để làm giảm hàm lượng histamine trong thực phẩm, trên thế giới đã có

nhiều phương pháp được áp dụng Renes et al (2014) tổng kết và đưa ra 2

phương pháp chính:

- Thứ nhất là kiểm soát chất lượng nguyên liệu, đảm bảo vệ sinh trong quá trình sản xuất;

- Thứ hai là thực hiện các tác động công nghệ trong quá trình sản xuất

2.2.3.1 Kiểm soát chất lượng nguyên liệu, đảm bảo vệ sinh trong quá trình sản xuất

Các phương án kiểm soát tập trung vào việc xử lý và bảo quản nguyên liệu

(Renes et al., 2014) Tiếp đó là việc duy trì chất lượng vệ sinh của nguyên liệu,

đảm bảo điều kiện vệ sinh trong toàn bộ quá trình sản xuất, và áp dụng các điều kiện ức chế sự phát triển của các vi sinh vật có khả năng sinh enzyme amino acid decarboxylase Áp dụng thực hiện hiệu quả kế hoạch HACCP, GHP (Good Hygiene Practices), GMP có thể giải quyết các vấn đề trên

Tuy nhiên, một khi các enzyme decarboxylase đã được sinh ra, chúng có thể tiếp tục chuyển hóa amino acid thành các amine nếu như không áp dụng biện pháp công nghệ để kìm hãm chúng Bên cạnh đó nếu chỉ đảm bảo vệ sinh đơn thuần, trong khi các biến đổi vật lý và hóa học của nguyên liệu vẫn diễn ra, sẽ góp phần

thúc đẩy sự tấn công của các vi sinh vật và làm tăng hoạt tính sinh amine

Chính vì vậy, đối với việc kiểm soát phải bao gồm cả việc ngăn ngừa các biến đổi vật lý, hóa học của nguyên liệu trước khi chế biến Tại Mỹ, Cục Thực phẩm và Dược phẩm đã thường xuyên cung cấp các hướng dẫn việc vận chuyển

và bảo quản các sản phẩm thủy sản nhằm phòng tránh các nguy cơ liên quan đến

sức khỏe, trong đó bao gồm có nguy cơ về histamine (FDA, 2001)

2.2.3.2 Các tác động công nghệ ngăn ngừa sự hình thành, tích tụ histamine

Histamine là một hợp chất bền nhiệt, rất khó để loại bỏ amine khỏi các sản

phẩm thực phẩm ngay khi chúng được hình thành, thậm chí với việc xử lý nhiệt

như hấp tiệt trùng (Luten et al., 1992) Ngoài ra, không thể phát hiện histamine

bằng phương pháp cảm quan Rất nhiều các hướng nghiên cứu đã được tiến hành nhằm giảm hàm lượng histamine cũng như các amine sinh học khác trong thực phẩm Các phương pháp chủ yếu được sử dụng bao gồm phương pháp vật lý,

phương pháp hóa học, và phương pháp vi sinh vật

- Phương pháp vật lí: Sử dụng phương pháp chiếu xạ, áp suất thủy tĩnh cao hoặc thay đổi thành phần khí trong bao gói sản phẩm đã được nghiên cứu sử

dụng để làm giảm hàm lượng histamine trong thực phẩm (Naila et al., 2010)

Dựa trên ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt các vi khuẩn sinh amine và ức chế hoạt tính của enzyme decarboxylase các amino acid Phương pháp này có hiệu quả và độ chắc chắn cao nhưng nó lại gây ra các nguy cơ có hại cho sức khỏe do

có thể tạo ra các hợp chất mang gốc tự do (Naila et al., 2010; Kim et al., 2004)

Ngoài ra chi phí cho phương pháp này lớn

- Phương pháp hóa học: Mối liên hệ giữa chất bảo quản và phụ gia thực phẩm tới hàm lượng của các amine sinh học trong thực phẩm cũng đã được nghiên cứu Việc sử dụng các hóa chất có đặc tính kháng khuẩn có thể thay đổi thành phần và hàm lượng các amine trong thực phẩm bằng cách tác động vào sự cân bằng của hệ vi khuẩn trong thực phẩm đó, hơn là khả năng tác động trực tiếp

đến hoạt tính decarboxylase của vi khuẩn (Gardini et al., 2016) Tuy nhiên, vai

trò của các chất bảo quản (kháng khuẩn) đối với việc hạn chế sự hình thành histamine trong thực phẩm vẫn còn chưa rõ ràng và liều lượng sử dụng hạn chế,

giá thành cao

- Phương pháp vi sinh vật: Việc sử dụng vi khuẩn trong sản xuất thực phẩm nhằm hạn chế sự tích tụ histamine trong thực phẩm gồm 2 hướng: Sử dụng các chủng khởi động (starter culture) trong sản phẩm lên men và bổ sung các chủng

vi khuẩn có khả năng chuyển hóa, phân giải histamine Hiện nay, việc ứng dụng các vi khuẩn có chứa các enzyme phân giải histamine là một phương pháp hữu hiệu trong việc giảm hàm lượng histamine trong thực phẩm lên men, qua các nghiên cứu có thể nhận thấy sử dụng vi sinh vật trong quá trình làm giảm histamine là hướng đi có tính khả thi cao, với tỷ lệ phân giải histamine đạt khoảng trên 30%, mặt khác sử dụng vi sinh vật thường có chi phí thấp, không

cần trang thiết bị đặc biệt

2.2.3.3 Một số nghiên cứu về vi sinh vật phân giải histamine

Histamine được phân giải thông qua quá trình oxy hóa tách nhóm amine được xúc tác bởi enzyme histamine oxidase hoặc histamine dehydrogenase được sinh ra từ một số vi sinh vật Hiện nay, việc ứng dụng các vi khuẩn có chứa các enzyme phân giải histamine đang nổi lên như là một phương pháp hữu hiệu trong việc giảm hàm lượng histamine trong thực phẩm lên men

 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong một đề tài nghiên cứu rất mới đây, các nhà nghiên cứu thuộc Đại học Nha Trang đã nghiên cứu xác định khả năng sinh histamine của một số vi khuẩn phân lập từ chượp cá cơm trong quá trình sản xuất nước mắm truyền thống Bởi theo các tác giả này, thực trạng hàm lượng histamine trong nước mắm truyền thống dao động từ 1000 – 3000 mg/l, cao gấp nhiều lần so với tiêu chuẩn Codex 302-2011 là 400 mg/L mà hiện nay thì chưa có giải pháp hữu hiệu nào được đưa

ra nhằm giải tỏa tình hình này (Đào Thị Ngà, 2016)

Có một nghiên cứu của Dang Thao Yen Linh et al (2018) cũng chỉ nghiên

cứu về những vi khuẩn có khả năng sinh histamine từ quá trình lên men của nước mắm Cát Hải

Tuy nhiên, nghiên cứu tuyển chọncác chủng có khả năng phân giải histamin

ở trong nước còn rất hạn chế Vì vậy mà việc nghiên cứu khả năng phân giải histamine trong nước mắm truyền thống trở nên vô cùng cấp thiết

 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

 Trong thực phẩm

Renes et al (2014) đã tìm thấy sự giảm hàm lượng amine hữu cơ giảm đáng

kể khi sử dụng Lactococcus lactis trong quá trình ủ chín pho mát được làm từ

sữa cừu Kết quả này cũng đã khẳng định quan sát của Novella-Rodríguez

(2002) trong pho mát làm từ sữa dê Latorre-Moratalla et al (2012) cũng cho thấy khi sử dụng L sakei và L curvatus phân lập từ thịt lên men đã đáp ứng

tốt đối với xúc xích lên men Việc sử dụng hỗn hợp chủng có tác dụng tốt hơn

so với sử dụng đơn lẻ một chủng (Latorre-Moratalla et al., 2010b; Naila et al.,

2010) Đặc biệt là trong xúc xích lên men, các chủng tự nhiên thể hiện khả năng làm giảm các amine cao hơn so với các chủng thương mại (Latorre-

Moratalla et al., 2010)

khuẩn lactic, rất nhiều lo

thể hiện khả năng này tr

tính này cũng được q

et al (2016), việc sử dụng các chủng lactic s

uan trọng và tiềm năng trong việc hạn chế sự hêm những nghiên cứu để làm rõ tiềm năng 2014) đã chứng minh việc sử dụng các chủng snăng hạn chế sự tạo ra histamine bởi chủng

ecaliss

c phân giải thông qua quá trình oxy hóa tánation) được xúc tác bởi enzyme histaminogenase được sinh ra từ một số vi sinh vật (hình

Phản ứng xúc tác bởi enzyme diamine ox

n ứng xúc tác bởi enzyme histamine dehyd

(1998) đã tìm thấy các enzyme này trong

c đây là Micrococcus) Ngoài ra, họ cũng ph

ium linens sinh enzyme amine oxidase, sau

amine hữu cơ trong sản xuất pho mát Munster

amine oxidase cũng được tìm thấy

Bacillus subtilis (Zaman et al., 2010, 2011)

u loài của giống Lactobacillus, Pediococcus này trong môi trường nuôi cấy (García-Ruiz et

c quan sát in vitro ở Lactobacillus case

lactic sinh bacteriocins tích tụ amine sinh năng này Trước đó,

ng sinh bacteriocins

ng S thermophilus

hóa tách nhóm amine stamine oxidase hoặc

y trong Bacillus

1) Trong nhóm vi

ccus, và Oenococcus

et al., 2011) Hoạt casei, Lactobacillus

plantarum (Fadda et al., 2001; Herrero-Fresno et al., 2012), và ở L sakei trong

dịch cá lên men (Dapkevicius et al., 2000) Bên cạnh đó, Herrero-Fresno et al

(2012) đã chứng minh việc sử dụng hai chủng của loài L casei có tốc độ phân

giải histamine và tyramine cao làm giảm đáng kể hàm lượng các chất này trong pho mát

Martuscelli et al (2000) đã xác định được tới 40 chủng trong 50 chủng

phân lập được từ xúc xích lên men có khả năng phân giải histamine, trong đó, các chủng S81, S206, S79, và S90 thể hiện khả năng oxy hóa histamine cao nhất với khả năng phân giải lần lượt là 100%, 93%, 68% và 53%

cá mòi trước khi lên men với tỷ lệ 10% (107cfu/ml) Sau khi lên men ở 35⁰C trong 120 ngày ở điều kiện nồng độ muối cao 17,5-17,8%, hàm lượng histamine trong sản phẩm giảm 34% so với mẫu đối chứng Trong dung dịch đệm

phosphate 0,05M pha 100ppm histamine, sau 24 ở 37ºC, Staphylococcus

carnosus phân lập từ nước mắm phân giải được 29,1% histamine so với lượng

ban đầu (Zaman et al., 2010)

Năm 2011, các nhà khoa học Malaysia đã công bố những kết quả khả quan trong việc bổ sung các chủng vi khuẩn có hoạt tính amine oxidase trong quá trình lên men nước mắm nhằm giảm hàm lượng histamine cũng như một số amine sinh

học khác Hai chủng vi khuẩn Staphylococcus carnosus FS19 và Bacillus

amyloliquefaciens FS05 được phân lập từ nước mắm, có hoạt tính amine oxidase,

được bổ sung riêng rẽ vào hỗn hợp cá cơm + 15% muối với tỷ lệ chủng chiếm 10% so với nguyên liệu (1 ml dịch vi khuẩn chứa 107 tế bào) trước khi lên men Trong quá trình lên men ở 35ºC trong 120 ngày, các mẫu được lấy định kỳ sau 5 ngày và sau đó là 20 ngày để phân tích thành phần hóa học và vi sinh Kết quả nghiên cứu cho thấy trong tất cả các mẫu nước mắm, pH tăng dần trong quá trình lên men (từ khoảng 5,5 đến 7,3), trong khi hàm lượng muối gần như không thay đổi (15-16%) Số lượng vi khuẩn hiếu khi giảm do bị ức chế phát triển bởi nồng

độ muối cao trong suốt quá trình lên men Số lượng vi khuẩn sinh histamine ở mẫu bổ sung chủng tương tự so với mẫu đối chứng Cùng với đó là hàm lượng histamine tăng dần trong quá trình lên men và tăng nhanh nhất sau 5 ngày đầu tiên lên men ở cả 3 mẫu Tuy nhiên, hàm lượng histamine trong 2 mẫu bổ sung

chủng Staphylococcus carnosus FS19 và Bacillus amyloliquefaciens FS05 thấp

hơn lần lượt là 27,7% và 15,4% so với mẫu đối chứng

Trong nghiên cứu của Lee et al (2012), Virgibacillus campisalis sp được

phân lập từ ruộng muối ở Hàn Quốc có điều kiện tối ưu cho chủng vi khuẩn này phát triển ở pH 7,5 – 8, nhiệt độ ở 37ºC và nồng độ muối từ 4-5%

Trong nghiên của Ramesh & Pandey (2016), chủng Exiguobacterium có

điều kiện tối ưu cho chủng này phát triển ở pH 7 – 8, nhiệt độ ở 35-40ºC và nồng

độ muối từ 1-9%

Vậy với những nghiên cứu tổng quan ở trên, đề tài tiếp theo sẽ sử dụng các ngưỡng nghiên cứu đơn yếu tố cho vi khuẩn lựa chọn để tăng sinh khối với điều kiện: pH từ 6,5 – 8,5; nhiệt độ từ 32-47ºC và nồng độ muối từ 2-15% (theo Lee

et al., 2015, 2016)

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

28 chủng vi khuẩn chịu mặn được phân lập từ chượp mắm tại Hải Phòng và

3.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

- Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Trung tâm khoa học và Công nghệ thực phẩm, khoa Công nghệ thực phẩm – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

- Thời gian thực hiện đề tài: 3/2019 – 10/2019

3.1.3 Dụng cụ

- Dụng cụ: pipet các loại, pipet man 1ml, pipet man 0,1 ml; bình tam giác các loại, đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghiệm, phễu chiết, bình định mức các loại, lam kính, ống fancol, ống eppendorf, bút viết kính, túi bóng kính, màng bọc thực phẩm, đèn cồn, que cấy chang, que cấy ria,…

3.1.4 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường halophilic (HA): môi trường dinh dưỡng phân lập và nuôi cấy vi khuẩn chịu mặn (g/l): NaCl (250), cao nấm men (5), KCl (2), sodium glutamate (1), trisodium citrate (3), MgSO2.7H2O (20), FeCl3 (0.036), MnCl2.4H2O (0.00036), Agar (20), pH = 7.2 ± 0.2, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút

- Môi trường lỏng halophilic: thành phần như môi trường halophilic nhưng không có agar dùng để nuôi vi khuẩn

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Tuyển chọn chủng có khả năng phân giải histamine cao từ 28 chủng vi khuẩn chịu mặn được phân lập từ chượp mắm Hải Phòng và Nam Định;

- Định danh chủng vi khuẩn phân giải histamine cao đã tuyển chọn trên bằng sinh học phân tử;

- Ảnh hưởng của điều kiện đơn yếu tố và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn:

+ Ảnh hưởng điều kiện đơn yếu tố (pH, nhiệt độ, nồng độ muối) đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn;

+ Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng vi khuẩn theo phương pháp

quy hoạch thực nghiệm đa yếu tố

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Bố trí thí nghiệm

Ảnh hưởng của các đơn yếu tố đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn tuyển chọn theo Ramesh & Pandey (2016), và Lee et al (2015, 2016)

Bố trí các thí nghiệm một nhân tố

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng của vi khuẩn

 Yếu tố phi thí nghiệm:

- Môi trường nuôi cấy: HA;

- pH: 7;

- Nhiệt độ: 37oC;

- Tốc độ vòng: 200v/p

 Yếu tố thí nghiệm: Mức nồng độ muối 2%; 5%; 8%; 12%; 15%;

 Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá khả năng tăng sinh khối của vi khuẩn qua mật

độ quang của tế bào ở bước sóng 620nm tại các thời điểm 0, 24, 48, 72,

96, 120, 144, 168 (h)

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trưởng của vi khuẩn

 Yếu tố phi thí nghiệm:

- Môi trường nuôi cấy: HA;

- pH: 7;

- Tốc độ vòng: 200v/p;

- Nồng độ muối: từ thí nghiệm 1

 Yếu tố thí nghiệm: Mức nhiệt độ 32oC, 37oC, 42oC, 47oC;

 Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá khả năng tăng sinh khối của vi khuẩn qua mật

độ quang của tế bào ở bước sóng 620nm tại các thời điểm 0, 24, 48, 72,

96, 120, 144, 168 (h)

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của vi khuẩn

 Yếu tố phi thí nghiệm:

- Môi trường nuôi cấy: HA;

- Nhiệt độ: từ thí nghiệm 2;

- Tốc độ vòng: 200v/p;

- Nồng độ muối: từ thí nghiệm 1

 Yếu tố thí nghiệm: Mức pH 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5;

 Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá khả năng tăng sinh khối của vi khuẩn qua mật

độ quang của tế bào ở bước sóng 620nm tại các thời điểm 0, 24, 48, 72,

96, 120, 144, 168 (h)

Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối dựa vào kết quả của 3 thí nghiệm trên

Thí nghiệm 4: Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối

tế bào vi khuẩn

Công thức

3.3.2 Phương pháp phân tích

3.3.2.1 Tuyển chọn chủng có khả năng phân giải histamine

Phương pháp được tiến hành theo Tapingkae et al (2010) và các bước tiến

hành như sau:

Bổ sung 250µl dịch nuôi cấy của 28 các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặnđã được tuyển chọn vào 5ml môi trường HA lỏng tương ứng đã được hấp khử trùng và nuôi cấy trong tủ nuôi có lắc với tốc độ vòng 200 vòng/phút ở 37oC trong khoảng từ 3 – 4 ngày Tiếp theo, lấy 250µl dịch nuôi cấy trước đó chuyển sang 5ml môi trường mới có bổ sung 5% histamine 5mM so với tổng thể tích và tiếp tục nuôi trong tủ nuôi lắc với các thông số không thay đổi trong vòng 7 ngày Dịch nuôi cấy được li tâm thu dịch sau 4 ngày và 7 ngày xác định hàm lượng

histamine bị mất đi Dịch ly tâm được sử dụng để đo hàm lượng histamine còn lại bằng phương pháp HPLC Hoạt tính phân giải histamine của vi khuẩn được xác định bằng phần trăm histamine bị phân giải trong dịch ly tâm

3.3.2.2 Định danh chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine bằng phương pháp xác định trình tự gene 16S rRNA

Phương pháp được tiến hành theo Yi-Lin Chen et al (2015) gồm 2 bước

và được mô tả như sau:

- Tách chiết

DNA tổng số được tách chiết như sau: Sinh khối vi sinh vật được thu lại bằng cách ly tâm sau đó trộn trong 0,5 ml đệm (Tris-HCl, EDTA, NaCl, SDS) Ủ phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Bổ sung 0,15 ml

CH3COOK Ly tâm 10000 rpm, thu dịch trong, tủa DNA bằng isopropanol

tỉ lệ 1:1, tiếp tục ly tâm ở 13000 vòng trong 10 phút ở 40C thu tủa Rửa tủa bằng etanol 70% Làm khô tủa, hòa tan lại DNA với 50μl H2O PCR

- Xác định trình tự gene và xác định loài: Sau khi tinh sạch, sản phẩm

PCR được đọc trình tự trên hệ thống 3730xl DNA Analyzer (Thermo Scienctific,

Mỹ) theo phương pháp Sanger Trình tự gen 16S rARN được so sánh với các trình tự đã công bố sử dụng cơ sở dữ liệu của EzBioCloud

3.3.2.3 Phân tích hàm lượng histamine bằng HPLC

Phân tích hàm lượng histamine được tiến hành theo phương pháp của

Tahmouzi S et al (2011) có cải tiến

a Nguyên lí

Histamine có trong mẫu nước mắm được tách chiết bằng metanol Dịch chiết được làm sạch trên cột trao đổi anion, sau đó được tạo dẫn xuất huỳnh

quang với OPA (phtha

(phthaldialdehyde) Hàm lượng dẫn xuất hista

ng HPLC với detector huỳnh quang theo phư

ết được dẫn xuất hoá sau đó được bơm vào

or huỳnh quang bước sóng sử dụng là Ex 230nm

: cột C18 (5µm, 4.6 × 250mm) : 40oC

: Hỗn hợp gồm CH3COONH4 0,02M, 100%, pH=3

: 1 ml/min ích thích: 230 nm hát xạ : 450nm : 5 µl

Hình 3.1 Sắc kí đồ chuẩn histamine

Hình 3.2 Đồ thị đường chuẩn histamine

y = 2195.x - 46 R² = 0.998

,02M, pH=5;

46.27 998

3.3.2.4 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bằng mô hình Box-Behnken

Để tối ưu hóa khả năng sinh trưởng tốt nhất của chủng có khả năng phân giải histamine được tuyển chọn theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm nhiều yếu tố, sử dụng kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đơn lẻ (kết qủa của thí nghiệm trước) Trong bài toán tốt ưu, các yếu tố được khảo sát đồng thời ở các khoảng biến thiên nhất định, gồm: pH môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ muối Hàm mục tiêu là khả năng sinh trưởng của chủng tuyển chọn trong quá trình nuôi cấy Ma trận thực nghiệm được bố trí theo Box-Behnken

Với mô hình thiết kế thí nghiệm Box-Behnken ở trên, thực hiện 15 thí nghiệm để lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng nhằm thu được sinh khối lớn nhất

Để xác định miền tối ưu cho ba yếu tố thí nghiệm, kết quả phân tích mật độ quang (Abs620nm) tại mỗi thời điểm nuôi cấy được khớp với phương trình đa thức bậc 2 (phương trình 1) bao gồm phần tuyến tính bậc 1, bậc 2, tương tác 2 yếu tố bậc 1 bằng phương pháp hồi quy đa biến

2 0

Derringer được sử dụng (Derringer and Suich, 1980; Bezerra et al., 2008) Hàm

kỳ vọng này biến đổi giá trị đầu ra (OD) thành điểm mong muốn (d), dao động từ

0 (hoàn toàn không mong muốn) đến 1 (hoàn toàn mong muốn) Hàm kỳ vọng có nhiều dạng phụ thuộc vào tiêu chí tối ưu hóa: tối thiểu, tối đa, hay phù hợp với tiêu chuẩn nhất định Hàm kỳ vọng có dạng như phương trình 2

Trong đó yi, min and yi, max là mức mong muốn tối đa hoặc tối thiểu của mỗi biến số đầu ra i, tương ứng với giá trị Abs mong muốn chúng tối đa hay tối thiểu (wi) là hệ số trọng lượng Giá trị đầu ra Abs mong muốn là tối đa Việc tối

ưu hóa đa biến được thực hiện nhờ phần mềm JMP, phiên bản 13.0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA)

3.3.2.5 Phương pháp xác định một số đặc điểm của chủng vi khuẩn

- Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Chuẩn bị 5 ml môi trường HA trong ống fancol, hấp tiệt trùng ở 121oC, 15 phút, sau đó dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên đĩa đã được ria thuần cho vào môi trường đã chuẩn bị, nuôi cấy chủng vi khuẩn trong 4 ngày ở tủ nuôi lắc 200 vòng/phút, 37oC

Pha loãng dịch nuôi cấy rồi tiến hành trang đều trên mặt đĩa thạch đã chuẩn

bị, tiến hành với 2 đĩa

Đặt vào tủ nuôi 37oC sau 4 ngày đem ra quan sát hình thái khuẩn lạc

- Xác định khả năng di động

Phương pháp xác định khả năng di dộng được mô tả theo Nguyễn Lân Dũng và cs., 2006:

Cơ chế: một số vi khuẩn có tiêm mao (lagella) nên có khả năng di dộng

trong môi trường bán lỏng và làm đục môi trường hay mọc giống như rễ cây xung quanh đường cấy

Môi trường: HA bán lỏng, để đứng

Thao tác:

Dùng que cấy thẳng lấy khuẩn lạc trong đĩa thạch HA đã ria thuần chuyển sang ống nghiệm thạch bán lỏng, trích thẳng từ trên xuống dưới ngay giữa ống môi trường Sau đó nuôi ở 37oC, trong vòng 24-48 giờ

Kết quả:

Vi khuẩn phản ứng di động dương (+): vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy,

xa hay gần tùy theo khả năng di động của vi khuẩn mạnh hay yếu

Phản ứng di động âm (-): vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy

- Xác định hoạt tính catalase

Mục đích: kiểm tra khả năng phân hủy H2O2 tạo ra O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh ra enzyme catalase

Phương pháp thử nghiệm catalase được tiến hành theo mô tả bởi Nguyễn Đức Lượng và Cao Cường, 2003 như sau;

Cơ chế: enzyme catalase thường gặp ở vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tùy

tiện Catalase có khả năng phân giải peroxide tạo O2 và nước

Vi khuẩn

H2O2 Enzyme catalase H2O + [O2]

Thao tác: Dùng que cấy vòng, lấy đầy 1 vòng cấy vi khuẩn hòa vào giọt

H2O2 quan sát

Phản ứng Catalase âm tính: Giọt H2O2 không sủi bọt

Phản ứng Catalase dương tính: Giọt H2O2 sủi bọt

- Nhuộm Gram và quan sát hình thái tế bào

Cơ chế: Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày, có khả năng giữ phức

hợp tím tinh thể iot, trong khi đó lớp thành tế bào của vi khuẩn Gram âm thì mỏng, sau khi nhuộm với phức hợp tím và qua các bước khử màu Vi khuẩn Gram âm có thành tế mỏng, không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể iot bên trong

tế bào vì vậy chúng bị khử màu Ngược lại, đối với vi khuẩn Gram dương, thành

tế bào dày nên giữ lại được phức hợp tím tinh thể-iot

Quy trình nhuộm gồm các bước sau:

+ Bước 1: làm tiêu bản vết bôi vi sinh vật bằng cách nhỏ một giọt nước cất hoặc nước muối sinh lí lên lam kính, dùng que cấy đã vô trùng hơ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi nóng đỏ và để nguội Khi que cấy nguội, lấy một ít vi sinh vật hoà vào giọt nước cất hoặc nước muối sinh lí

+ Bước 2: cố định vết bôi, thường cố định bằng cách hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn, đưa vết bôi qua nhanh ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần Tránh hơ nóng quá sẽ làm biến dạng hình thái và cấu trúc của tế bào vi sinh vật

+ Bước 3: Nhuộm tiêu bản bằng tím tinh thểhay tím gentian,nhuộm mẫu trong 1phút, dùng pipet nhỏ lên vết bôi một giọt thuốc nhuộm, giữ trong 1 – 2 phút rồi rửa nước

+ Bước 4: Nhuộm bằng dung dịch lugol và giữ trong 1 phút sau đó rửa lại với nước