Nghiên cứu chủng xạ khuẩn VN08A12 - Streptomyces toxytricini có tiềm năng ứng dụng trong xử lý bệnh bạc lá lúa và thân thiện với môi trường

Nghiên cứu chủng xạ khuẩn VN08A12 - Streptomyces toxytricini có tiềm năng ứng dụng trong xử lý bệnh bạc lá lúa và thân thiện với môi trường Nguyễn Đình Hải Trường Đại học Công nghệ Luận văn ThS. ngành: Công nghệ Nanô sinh học (Chuyên ngành đào tạo thí điểm) Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Đức Quang Năm bảo vệ: 2012

Nghiên cứu chủng xạ khuẩn VN08A12 - Streptomyces toxytricini có tiềm năng ứng dụng trong xử lý bệnh bạc lá lúa và thân thiện

với môi trường Nguyễn Đình Hải

Trường Đại học Công nghệ Luận văn ThS ngành: Công nghệ Nanô sinh học

(Chuyên ngành đào tạo thí điểm) Người hướng dẫn: TS Nguyễn Đức Quang

Năm bảo vệ: 2012

Abstract Tiến hành phân loại đến cấp độ loài của chủng xạ khuẩn có tiềm năng

được sử dụng trong việc phòng chống dịch bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam Đã phối hợp các phương pháp phân loại khác nhau như phân loại hình thái, phân loại hóa sinh và

di truyền học phân tử Tiến hành thử nghiệm tác động của chủng xạ khuẩn nghiên cứu trên động vật nuôi thí nghiệm (chuột bạch) và một loài cây nông nghiệp quan trọng (cây đậu xanh) và cho thấy chủng xạ khuẩn không gây hại cho các sinh vật

trong môi trường sống

Keywords Công nghệ sinh học; Bệnh bạc lá lúa; Sinh học; Công nghệ Nano

Content

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây ra là một trong những

bệnh gây hại chính ở Việt Nam cũng như ở các vùng trồng lúa trên thế giới Bệnh đã gây giảm năng suất lúa gạo ở Châu Á lên tới 60% tổng năng suất lúa hàng năm [4,8] Có rất nhiều biện pháp ngăn chă ̣n sự bùng phát dịch bệnh như: chọn lọc và phát triển các dòng lúa mang các gene kháng bệnh, dùng chất hóa học để diệt trừ vi khuẩn gây bệnh, phòng trừ dịch hại tổng hợp [17] Tuy nhiên, các biện pháp này vẫn chưa đem lại hiệu quả cao

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi sinh vật nhân sơ thuộc vào giới các vi khuẩn gram dương Xạ khuẩn có những đặc điểm quý riêng biệt; đó là nguồn sản xuất tự nhiên các chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học [20] Gần đây người ta ước tính rằng cứ

10000 chất kháng sinh được khám phá ra từ các vi sinh vật, thì 2/3 các chất đó được sản xuất từ

xạ khuẩn; và nhiều chất trong số đó là các thuốc kháng sinh đang được ứng dụng và sản xuất rộng rãi ngày nay Các nghiên nhà cứu chỉ ra rằng: cứ 1000 chủng xạ khuẩn được phân lập một cách ngẫu nhiên, thì khoảng 10 chủng sẽ sinh streptomycin và 4 chủng sẽ sinh tetracycline [2,3] Bộ sưu tập hơn 3000 chủng xạ khuẩn {những chủng này được phân lập ngẫu nhiên từ các mẫu đất của Việt Nam [14]} tại Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam (Viện Vi Sinh và công nghệ

sinh học, ĐHQGHN) hứa hẹn tiềm năng tìm ra các chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh

học mới dùng cho việc khống chế và tiêu diệt vi khuẩn X oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá lúa

ở Việt Nam hiện nay

Vì thế, việc sử dụng xạ khuẩn và các chất có hoạt tính sinh học do chúng sinh ra để khống chế sinh học (sử dụng cân bằng các vi sinh vật và các sản phẩm tự nhiên của chúng để kìm hãm, ức chế vi sinh vật gây bệnh do đó thúc đẩy cây trồng phát triển tốt hơn) và kiểm soát bệnh bạc lá lúa có triển vọng là một phương pháp hiệu quả và thân thiện về mặt sinh thái

và môi trường Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu chủng xạ

khuẩn VN08A12 – Streptomyces toxytricini có tiềm năng ứng dụng trong xử lý dịch bệnh

bạc lá lúa và thân thiện với môi trường”

1.2 Mục đích của đề tài

 Phân loại đến cấp độ loài của chủng xạ khuẩn có tiềm năng được sử dụng

trong việc phòng chống dịch bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam

 Tiến hành thử nghiệm tác động của chủng xạ khuẩn nghiên cứu trên động vật

nuôi thí nghiệm (chuột bạch) và một loài cây nông nghiệp quan trọng (cây đậu xanh) để kiểm tra sự tương tác của chủng xạ khuẩn với các sinh vật trong môi trường sống

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan chung về xạ khuẩn

2.1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

2.1.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

2.1.3 Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

2.1.4 Cấu tạo của xạ khuẩn

2.2 Các phương pháp phân loại xạ khuẩn

2.2.1 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

2.2.4 Phân loại số (Numerical taxonomy)

2.2.6 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces

2.3 Các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn

2.4 Bệnh bạc lá lúa và các biện pháp phòng trừ

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Chủng xạ khuẩn VN08A12 và sản phẩm lên men

3.1.2 Vi sinh vật kiểm định

3.1.3 Các chủng Xoo

3.1.5 Chuột thí nghiệm

3.1.6 Môi trường nghiên cứu

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Định loại chủng xạ khuẩn

3.2.1.1 Đi ̣nh loại bằng đặc điểm sinh học

3.2.1.2 Đi ̣nh loại bằng các đặc tính hóa sinh

3.2.1.3 Phương pháp phân loa ̣i dựa trên trình tự 16S - rRNA

3.2.2 Chọn lọc môi trường nuôi cấy phù hợp nhất cho khả năng sinh kháng sinh của VN08A12

3.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của dịch lên men xạ khuẩn lên cây đậu xanh

3.2.4 Phương pháp thử nghiệm ảnh hưởng của dịch lên men xạ khuẩn lên chuột

nuôi thí nghiệm

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Phân loại chủng xạ khuẩn VN08A12

4.1.1 Đặc điểm sinh học

Chủng xạ khuẩn VN08A12 sinh trưởng tốt tạo khuẩn lạc chắc, xù xì màu nâu vàng và

có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ và ăn sâu vào thạch Trên bề mặt khuẩn lạc quan sát thấy các giọt tiết nhỏ (hình 4.1.1.A)

Sau khi cài lamel rồi soi dưới kính hiển vi quan sát, kết quả như hình 4.1.1B chủng VN08A12 có các chuỗi bào tử dài, có cả dạng thẳng và dạng xoắn (mỗi chuối xoắn có từ 2-7 vòng xoắn) Bào tử có khả năng di động

Hình 4.1.1 Hình thái học của chủng xạ khuẩn VN08A12 4.1.2 Đặc tính hóa sinh

4.1.2.1 Khả năng đồng hoá và sử dụng các nguồn carbon khác nhau

Theo Shirling & Gottlieb (1966), khả năng đồng hóa và sử dụng các nguồn carbon khác nhau được đánh giá theo 4 mức:

- Sử dụng mạnh nguồn carbon (++) khi xạ khuẩn phát triển trên môi trường carbon kiểm tra bằng hoặc mạnh hơn trên môi trường đối chứng (+) chứa glucose

C Chuỗi sợi nấm và bào tử

Ảnh SEM ở 15KV x 3.500 thành 5μm

D Bề mặt bào tử

Ảnh SEM ở 30 kv x 3.500 thành

1μm

A Khuẩn lạc VN08A12 B Tế bào VN08A12

C

- Có thể sử dụng nguồn carbon (+) khi xạ khuẩn phát triển trên môi trường carbon kiểm tra mạnh hơn rõ rệt so với môi trường đối chứng (-) nhưng mà yếu hơn khi phát triển trên môi trường đối chứng (+)

- Không xác định về khả năng sử dụng nguồn carbon (±) khi trên môi trường kiểm tra

xạ khuẩn chỉ phát triển mạnh hơn môi trường đối chứng (-) một chút, không rõ ràng và kém hơn hẳn so với môi trường đối chứng (+)

- Không sử dụng nguồn carbon (-) khi sự phát triển của xạ khuẩn trên môi trường kiểm tra ngang bằng hoặc kém hơn so với sự phát triển trên môi trường đối chứng (-) Kết quả được trình bày ở bảng 4.1.2 và hình 4.1.2A

Bảng 4.1.2 Khả năng sử dụng các nguồn đường khác nhau của VN08A12

D-xylose

- D-fructose

++

Cellobiose

- L-arabinose

+ I-inositol

± Rhamnose

+ Sucrose

- D-mannitol

+

Ghi chú: ++: Sử dụng mạnh nguồn cacbon; +: Có thể sử dụng nguồn cacbon

±: Không xác định khả năng sử dụng nguồn cacbon; - : Không sử dụng nguồn cacbon

Môi trường chứa Cellobiose Môi trường chứa arabinose

Môi trường chứa xylose Môi trường chứa fructose

Đ.c (-) Đ.c (+) chứa glucose

Môi trường chứa innositol Môi trường chứa Rhamnose

Hình 4.1.2A Khả năng đồng hóa các nguồn carbon khác nhau

Ngoài ra các nguồn carbon: α-D-lactose, β-methyl D-glucoside, D-tagatose, lactamide, alaninamide, adenosine, -cyclodextrin, D-arabitol, lactulose,α-methyl D-mannoside,D-trehalose, D-lactic acid methyl ester, D-alanine, 2’-deoxy adenosine, β-cyclodextrin, arbutin, maltose, palatinose, turanose, L-lactic acid, L-alanine, inosine, cellobiose, maltotriose, D-psicose, xylitol, D-malic acid, L-alanyl-glycine, thymidine, glycogen, D-fructose, D-mannitol, D-raffinose, L-malic acid, L-asparagine, uridine, inuline, L-fucose, D-mannose, L-rhamnose,

acetic acid, methyl pyruvate, L-glutamic acid, adenosine-5’- monophosphate, mannan, D-galactose, D-melezitose, α-hydroxybutyric acid, glycyl-L- glutamic acid, thymidine-5’-onophosphate, tween 40, D- galacturonic acid, D-melibiose, salicin, β- hydroxybutyric acid, propionic acid, L- pyroglutamic acid, uridine-5’- monophoshate, gentiobiose, α-methyl D-galactoside, sedoheptulosan, γ- hydroxybutyric acid, pyruvic acid, L-serine, fructose-6- phosphate, N-acetyl-D- glucosamine, D- gluconic acod, β-methyl D-galactoside, D-sorbitol, p-hydroxyphenyl acetic acid, succinamic acid, putrescine, glucose-1- phosphate, N-acetyl-D- mannosamine, α-D-glucose, 3-methyl glucose, stachyose, α-keto glutaric acid, succinic acid, 2,3-butanediol, glucose-6- phosphate, amygdalin, m-inositol, α-methyl D-glucoside, sucrose, α-keto valeric acid, N-acetyl L-glutamic acid, glycerol, D-L-α-glycerol phosphate, VN08A12 không thể sử dụng được

Do đó, có thể thấy rằng chủng VN08A12 có thể sử dụng D-fructose, Cellobiose, L-arabinose, Rhamnose, mannitol làm nguồn carbon chủ yếu; trong đó, khả năng sử dụng D-fructose là tốt nhất (gần bằng khả năng sử dụng D-glucose)

4.1.2.2 Khả năng đồng hóa Melanin và khả năng chịu muối

Hình 4.1.2B Khả năng chịu muối và khả năng đồng hóa

Melanin của VN08A12

Các thử nghiệm về khả năng đồng hóa Melanin và khả năng chịu muối của chủng VN08A12 (theo hình 4.1.2B) cho thấy chủng này không có khả năng đồng hóa Melanin và

có thể chịu được nồng độ muối đến 4% Từ các kết quả phân loại về hình thái, sinh lí và sinh

hóa đó, có thể xếp loại chủng VN08A12 thuộc vào chi Streptomyces sp

Hình 4.1.3A Ảnh điện di DNA

tổng số

Hình 4.1.3B.Ảnh điện di sản phẩm PCR

M Marker 10kb 1,2 gen 16s -rRNA

Hình 4.1.3 Trình tƣ̣ 16S-rRNA của chủng VN08A12

Kết quả điê ̣n di DNA tổng s ố hình 4.1.3A cho thấy ch ỉ có một băng duy nhất, rõ nét

đã chứng tỏ DNA không bị đứt gãy trong quá trình tách chiết Hàm lượng DNA thu được là tương đối lớn và sạch để tiến hành phản ứng PCR

Tiến hành phản ứng PCR với că ̣p mồi 27F và 1525R, chúng tôi đã thu được đoạn DNA có kích thước khoảng 1.5kb (hình 4.1.3B) theo đúng kích thước lí thuyết că ̣p mồi có thể nhân đươ ̣c Chứng tỏ đoa ̣n DNA nhân được chính là gen 16s-rRNA của xa ̣ khuẩn Chúng tôi, tiến hành thôi gel và tinh sa ̣ch DNA để giải trình tự bằng bô ̣ kit tinh sa ̣ch sản phẩm PCR của QIAgen

1.5kb 1kb

- Kết quả giải trình tự của gen 16S rRNA chúng tôi đã giải được mô ̣t đoa ̣n gen dài 1387

Nu, có trình tự như sau:

TGCAAGTCGAACGATGAACCTCCTTCGGGAGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAG TAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTA ATACCGGATACGACTGCGGAAGGCATCTTCCGCGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGA AGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGA CGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGC CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCT GATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAG CAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGT GCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGT AAAGAGCTCGTAGGCGGCCAGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGAGGCTTAACCT CGGGTCTGCATTCGATACGGGCTGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCC TGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGG ATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATT CCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGC CGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCAT GTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGA AAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGT CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTG TCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGG GGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTT GGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTG GAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCC ATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTC CCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCC GGTGGCCCAACCCTTGTGGAGG

Trình tự này được sử dụng để Search blast trên GenBank để xác định các trình tự tương đồng, kết quả được thể hiê ̣n ở bảng 4.1.3

Bảng 4.1.3 Kết quả Search Blast trình tƣ̣ gen 16s – rRNA trên GenBank

Kết quả Blast search trên GenBank kết quả cho thấy chủng VN 08A12 có trình tự 16S

rRNA hoàn toàn tương đồng với loài Streptomyces toxytricini với tỉ lê ̣ 100% Chúng tôi cũng

vẽ hình cây phân loại chủng VN 08A12 dựa trên công cu ̣ Tree view trên GenBank Kết quả thể hiê ̣n ở hình 4.1.4 cho thấy chủng nghiên cứu nằm trong cùng nhóm với nhóm chủng

Streptomyces toxytricini

Hình 4.1.4 Cây phân loại chủng VN08A12 dựa trên

trình tự gen 16S –rRNA

4.2 Kết quả chọn lọc môi trường sinh kháng sinh phù hợp cho VN08A12

Kết quả được tóm tắt ở bảng 4.2 và hình 4.2

Bảng 4.2 Vòng ức chế của chủng VN08A12 đối với 10 nòi Xoo (D-d, cm)

Nòi

Xoo

Môi

trường

YS

Môi trường 2M

Môi trường

301

Môi trường A-16

Môi trường

No 8

Môi trường A-3M

0.1

1.6 ± 0.2

1.0 ± 0.1

0.9 ± 0.3 1.0 ±

0.1

2.0 ± 0.2 2.4 ± 0.1

0.3

1.1 ± 0.1

0.6 ± 0.2

0.7 ± 0.2

1.2 ± 0.2 1.3 ± 0.3 1.8 ± 0.2

0.1

1.6 ± 0.1

1.4 ± 0.1

1.9 ± 0.1

2.0 ± 0.1

2.0 ± 0.1 2.2 ± 0.3

0.1

2.0 ± 0.3

1.6 ± 0.1

1.6 ± 0.1

1.4 ± 0.2

1.7 ± 0.4 2.0 ± 0.1

0.2

2.2 ± 0.1

1.6 ± 0.1

1.8 ± 0.2

1.6 ± 0.3

2.2 ± 0.1 2.4 ± 0.3

0.3

0.8 ± 0.2

0.5 ± 0.1

0.8 ± 0.1

1.0 ± 0.1

0.6 ± 0.2 1.0 ± 0.1

0.1

0.7 ± 0.1

0.8 ± 0.3

1.5 ± 0.3

0.7 ± 0.1

0.5 ± 0.1 2.0 ± 0.1

0.1

1.0 ± 0.1

1.2 ± 0.1

1.4 ± 0.1

1.1 ± 0.3

1.6 ± 0.3 2.2 ± 0.1

0.2

1.3 ± 0.2

0.7 ± 0.2

0.5 ± 0.2

1.3 ± 0.2

1.0 ± 0.1 1.2 ± 0.2

0.1

1.6 ± 0.4

1.2 ± 0.1

1.2 ± 0.1

1.0 ± 0.3

1.8 ± 0.2 1.8 ± 0.2

*: Chỉ ra giá trị P có ý nghĩa về mặt thống kê (YS 2M, 301, A-16, No 8, A-3M và APM <

MAPM) Kết quả cho thấy môi trường cải tiến, thay thế thành phần khô dậu tương bằng bã đậu

là phù hợp nhất cho VN08A12 Vì thế, môi trường MAPM được chọn để lên men VN08A12 cho các thí nghiệm tiếp theo

APM; MAPM Hình 4.2 Vòng kháng khuẩn của VN08A12 trên các môi trường

khác nhau

Từ kết quả trên cho thấy, môi trường sinh kháng sinh thay thế khô đậu tương bằng bã đậu tương cho kết quả khá tốt Như vậy có thể dùng môi trường cải tiến này cho việc lên men VN08A12 cho các thí nghiệm tiếp theo

A

Hình 4.2A Trên môi trường YS Hình 4.2B Trên môi trường

APM; MAPM

A

B

MAPM 4

MAPM1

4.3 Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sự sinh trưởng và phát triển của cây đỗ xanh

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của sản phẩm lên men chủng VN08A12 đến sự sinh trưởng và phát triển của đỗ xanh

`±1.41

15.23

±1.45 ±1.38 15.93 ±1.42 16.33 ±1.40 16.73 ±1.38 17.10 17.38 ±1.42 ±1.47 17.53 ±1.34 17.93 ±1.46 18.03 ±1.58 18.35 ±1.50 18.53 ±1.56 18.63 ±1.73 19.60 ±1.72 20.78

±1.98

15.05

±2.09

16.73

±2.12

17.48

±2.12

18.08

±2.06

18.55

±2.10

19.05

±2.06

19.11

±1.98

19.34

±2.03

19.55

±2.05

19.92

±2.12

20.16

±2.09

20.39

±2.13

20.50

±2.13

21.00

±2.13

21.97

±2.16