Sản xuất rượu vang từ chanh dây và dâu tằm

Hóa chất này ñược các tổ chức quốc tế sản xuất rượu vang cho phép sử dụng với liều lượng qui ñịnh là 30-120mg/l dịch quả.. Trong tất cả các quá trình chuyển hóa glucid do vi sinh vật gây

ðẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA

-

HUỲNH PHAN PHƯƠNG TRANG

SẢN XUẤT RƯỢU VANG TỪ CHANH DÂY

VÀ DÂU TẰM

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2010

CÔNG TRÌNH ðƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA

ðẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS TS Nguyễn ðức Lượng

TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM KHOA ……… ðộc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

- -oOo -

Tp HCM, ngày 31 tháng 07 năm 2010

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: Huỳnh Phan Phương Trang Phái: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 24/09/1984 Nơi sinh: TP Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

MSHV: 03108148

TÊN ðỀ TÀI : Sản xuất rượu vang từ chanh dây và dâu tằm

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

Xác ñịnh tỉ lệ phối trộn hợp lí giữa chanh dây và dâu tằm chuẩn bị dịch quả cho quá trình lên men rượu vang

Khảo sát khả năng sử dụng bã mía làm chất mang ñể cố ñịnh tế bào nấm men

ứng dụng trong lên men rượu vang

Xây dựng qui trình công nghệ sản xuất rượu vang hỗn hợp chanh dây dâu tằm sử dụng tế bào nấm men tự do

Xây dựng qui trình công nghệ sản xuất rượu vang hỗn hợp chanh dây dâu tằm sử dụng tế bào nấm men cố ñịnh

So sánh hai qui trình và kết luận ñưa ra qui trình công nghệ hợp lý

NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 01/03/2010

NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 31/07/2010

HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi ñầy ñủ học hàm, học vị): PGS TS Nguyễn ðức Lượng

Nội dung và ñề cương Luận văn thạc sĩ ñã ñược Hội ðồng Chuyên Ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN KHOA QUẢN LÝ

QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

LỜI CẢM ƠN

ầu tiên, em xin chân thành cám ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học,

trường ðại học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh, ñã hết lòng trong công tác giảng dạy, ñã tận tình truyền ñạt kho tàng kiến thức cho em trong những năm ngồi trên ghế giảng ñường ñể em vững bước trong tương lai

ðặc biệt, em chân thành cám ơn thầy Nguyễn ðức Lượng ñã tận tình hướng

Huỳnh Phan Phương Trang

ð

TÓM TẮT

Chanh dây là loại trái cây có hương vị thơm ngon và giàu vitamin Dâu tằm là loại trái cây có chứa hợp chất anthocyanin tạo màu tự nhiên cho thực phẩm Sự kết hợp giữa hai loại trái cây này hứa hẹn mang ñến một loại rượu vang mới về hương

vị và có màu sắc ñẹp Do ñó ñề tài “Sản xuất rượu vang từ chanh dây và dâu tằm”

ñược thực hiện trên cơ sở xác ñịnh tỉ lệ phối trộn hợp lí giữa hai loại quả ñể tạo

rượu vang ñạt tiêu chuẩn về màu sắc và mùi vị ðề tài ñã khảo sát khả năng sử dụng

bã mía là chất mang ñể cố ñịnh tế bào nấm men và ứng dụng chế phẩm cố ñịnh này vào qui trình sản xuất rượu vang chanh dây dâu tằm Kết quả thu ñược là sản phẩm rượu trái cây hỗn hợp ñược ñánh giá cảm quan tốt

ABSTRACT

Passion fruits have a delicious taste and rich in vitamins Mulberry fruit contains

a compound of natural anthocyanin color for food The combination of these two kinds of fruit that promises to make a new wine about flavor and beautiful color Therefore, the thesis "Production of wine from the passion and mulberry" was made

on the basis of determining a reasonable rate of mixing between two types of fruit to make wine standards of color and flavor Thesis surveys ability of using bagasse as carrier for fixing yeast cells and applys this preparations into processes of passion fruit and mulberry wine production The result is a fruit wine products evaluated well

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ xii

DANH MỤC CÁC BẢNG xiv

MỞ ðẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu [19] 4

1.2 Qui trình chung sản xuất rượu vang [19] 5

1.2.1 Nguyên liệu và chế biến nguyên liệu 5

1.2.2 Quá trình lên men tạo rượu vang 7

1.2.3 Phân loại rượu vang [14] 9

1.3 Bản chất quá trình lên men rượu[17] 10

1.3.1 Cơ chế của quá trình 10

1.3.2 Các sản phẩm của quá trình lên men rượu trong các ñiều kiện môi trường khác nhau 11

1.3.3 Tác nhân vi sinh vật 13

1.3.4 Các ñiều kiện chính của quá trình lên men rượu 14

1.4 Nấm men 16

1.4.1 Hình dạng và kích thước [4] 16

1.4.2 Cấu tạo tế bào nấm men [5] 16

1.4.3 Sự sinh sản của nấm men [4] 17

1.4.4 Phân loại nấm men [5] 17

1.4.5 Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men [5] 18

1.4.6 Một số loài nấm men thường gặp trong sản xuất rượu vang [5] 21

1.4.7 Yêu cầu ñối với chọn nấm men thuần chủng [5] 23

1.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 23

1.5.1 Các nghiên cứu trong nước 23

1.5.2 Các nghiên cứu ngoài nước 24

1.6 Nguyên liệu chanh dây dâu tằm 25

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU 28

2.1 Giống vi sinh vật 28

2.2 Nguyên liệu 28

2.3 Hóa chất – thiết bị - dụng cụ 28

2.3.1 Hóa chất 28

2.3.2 Thiết bị 28

-2.3.3 Dụng cụ 29

-2.4 Các loại môi trường 29

-2.4.1 Môi trường nhân giống [10] 29

-2.4.2 Môi trường giữ giống [10] 29

-2.5 Nguyên liệu chanh dây dâu tằm 30

-2.5.1 Khảo sát thành phần nguyên liệu chanh dây và dâu tằm 30

-2.5.2 Lựa chọn nguyên liệu và tạo dịch ép quả 32

-2.5.3 Xử lý dịch ép quả 35

-CHƯƠNG 3 GIỐNG SACCHAROMYCES CEREVISIAE 41

-3.1 Giống Saccharomyces cerevisiae 41

-3.2 Qui trình nhân giống 42

-3.2.1 Hoạt hóa giống 42

-3.2.2 Kiểm tra giống 43

-3.2.3 Bảo quản giống 43

-3.2.4 Nhân giống 44

-3.2.5 Xây dựng ñường cong sinh trưởng của tế bào 48

-CHƯƠNG 4 LÊN MEN 50

-4.1 Khảo sát các ñiều kiện tối ưu cho quá trình lên men rượu 50

-4.1.1 Thời gian tối ưu cho quá trình lên men rượu 52

-4.1.2 Tỷ lệ giống tối ưu cho quá trình lên men rượu 53

-4.1.3 ðộ pH tối ưu cho quá trình lên men rượu 53

-4.1.4 Nồng ñộ chất khô tối ưu cho quá trình lên men rượu 53

-4.2 Khảo sát quá trình cố ñịnh tế bào nấm men 54

-4.2.1 Khảo sát ựặc tắnh của bã mắa trong vai trò là chất mang ựể cố ựịnh tế

bào nấm men Saccharomyces cerevisiae 54

-4.2.2 Phương pháp cố ựịnh vi sinh vật trên chất mang là bã mắa 55

-4.2.3 Thực hiện cố ựịnh tế bào nấm men trên bã mắa 56

-4.2.4 động học tối ưu quá trình lên men rượu bằng tế bào nấm men tự do -

57 -4.2.5 động học tối ưu quá trình lên men rượu bằng tế bào nấm men cố ựịnh 57 -4.2.6 So sánh ựộng học tối ưu quá trình lên men rượu vang sử dụng tế bào nấm men tự do với quá trình lên men rượu vang sử dụng tế bào nấm men cố ựịnh trên bã mắa 58

-4.2.7 đánh giá cảm quan sản phẩm rượu vang chanh dây dâu tằm [16] 58 -CHƯƠNG 5 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 59

-5.1 Khảo sát dịch quả chanh dây dâu tằm ở các tỷ lệ phối trộn khác nhau 59 -5.2 Giống nấm men Saccharomyces cerevisiae 61

-5.2.1 Kiểm tra giống 61

-5.2.2 đường tương quan OD600nm và mật ựộ tế bào của chủng Saccharomyces cerevisiae 62

-5.2.3 đường cong sinh trưởng của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae 63

-5.3 Khảo sát các ựiều kiện tối ưu cho quá trình lên men rượu 65

-5.3.1 Thời gian tối ưu cho quá trình lên men rượu 65

-5.3.2 Tỷ lệ giống tối ưu cho quá trình lên men rượu 72

-5.3.3 độ pH tối ưu cho quá trình lên men rượu 74

-5.3.4 Nồng ựộ chất khô tối ưu cho quá trình lên men rượu 76

-5.3.5 Khảo sát quá trình cố ựịnh tế bào nấm men trên bã mắa 78

-5.3.6 động học tối ưu quá trình lên men rượu vang chanh dây dâu tằm bằng tế bào nấm men tự do 80

-5.3.7 động học tối ưu quá trình lên men rượu vang chanh dây dâu tằm bằng

tế bào nấm men cố ựịnh trên bã mắa 81

-5.3.8 So sánh ựộng học tối ưu quá trình lên men rượu vang sử dụng tế bào nấm men tự do với quá trình lên men rượu vang sử dụng tế bào nấm men cố ựịnh trên bã mắa 83

-5.3.9 đánh giá cảm quan sản phẩm rượu vang chanh dây dâu tằm 84

KẾT LUẬN 86

TÀI LIỆU THAM KHẢO 87

-DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1-1 ðường cong biểu diễn quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm

men theo thời gian 21

Hình 1-2 Trái chanh dây 26

Hình 1-3 Trái dâu tằm 27

Hình 21 Quả chanh dây bổ dọc 30

Hình 22 Trái dâu tằm 31

Hình 23 Dịch quả chanh dây dâu tằm ở những tỷ lệ phối trộn khác nhau 35

Hình 31 Qui trình nhân giống 42

Hình 32 Ống giống gốc 44

Hình 33 Nhân giống cấp 1 45

Hình 34 Nhân giống cấp 2 45

Hình 35 Tế bào nấm men trên buồng ñếm hồng cầu 46

Hình 41 Bã mía phơi khô và bã mía ñã ñược hấp khử trùng 56

Hình 51 Hình thái khuẩn lạc nấm men trên môi trường Hansen rắn 61

Hình 52 Tiêu bản nhuộm xanh methylen của tế bào nấm men 62

-Hình 5-3 ðường tương quan OD600nm và log (tế bào/ml) 62

Hình 54 ðường cong sinh trưởng của tế bào nấm men 63

-Hình 5-5 Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình lên men rượu ở tỷ lệ dịch chanh dây dâu tằm là 5:5 66

-Hình 5-6 Ảnh hưởng của thời gian ñến quá trình lên men rượu ở tỷ lệ dịch chanh dây dâu tằm là 6:4 66

-Hình 5-7 Ảnh hưởng của thời gian ñến quá trình lên men rượu ở tỷ lệ dịch chanh dây dâu tằm là 7:3 67

-Hình 5-8 Ảnh hưởng của thời gian ñến quá trình lên men rượu ở tỷ lệ dịch chanh dây dâu tằm là 8:2 68

Hình 59 Ngày lên men thứ 1 68

Hình 510 Ngày lên men thứ 2 69

Hình 511 Ngày lên men thứ 3 69

Hình 512 Ngày lên men thứ 4 70

Hình 513 Ngày lên men thứ 5 70

Hình 514 Ngày lên men thứ 6 72

Hình 515 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống ñến quá trình lên men 73

Hình 516 Ảnh hưởng của pH ñến quá trình lên men 75

Hình 517 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khô ñến quá trình lên men 77

-Hình 5-18 Biểu ñồ biểu diễn ñộng học tối ưu quá trình lên men rượu vang chanh dây dâu tằm với tế bào nấm men tự do 81

-Hình 5-19 Biểu ñồ biểu diễn ñộng học tối ưu quá trình lên men rượu vang chanh dây dâu tằm bằng tế bào nấm men cố ñịnh trên bã mía 82

Hình 520 Qui trình sản xuất rượu vang chanh dây dâu tằm 84

Hình 521 Sản phẩm rượu vang chanh dây dâu tằm 85

-DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1-1 Thành phần hóa học của nấm men 18

Bảng 21 Thành phần của dịch chiết chanh dây 30

Bảng 22 Thành phần quả dâu tằm [6] 31

Bảng 23 Thành phần vitamin của dâu như sau (tính trong 100g) 31

Bảng 24 So sánh nguyên liệu dịch ép chanh dây và dâu tằm với dịch ép nho 32 Bảng 25 Tỷ lệ phối trộn dịch chanh dây dâu tằm 36

Bảng 41 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình lên men 51

Bảng 51 Chỉ số hóa lý của dịch quả chanh dây dâu tằm ở 4 tỷ lệ phối trộn 59

-Bảng 5-2 Ảnh hưởng của thời gian ñến quá trình lên men rượu ở tỷ lệ dịch chanh dây dâu tằm là 5:5 65

-Bảng 5-3 Ảnh hưởng của thời gian ñến quá trình lên men rượu ở tỷ lệ dịch chanh dây dâu tằm là 6:4 66

-Bảng 5-4 Ảnh hưởng của thời gian ñến quá trình lên men rượu ở tỷ lệ dịch chanh dây dâu tằm là 7:3 67

-Bảng 5-5 Ảnh hưởng của thời gian ñến quá trình lên men rượu ở tỷ lệ dịch chanh dây dâu tằm là 8:2 67

Bảng 56 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống ñến quá trình lên men 73

Bảng 57 Ảnh hưởng của pH ñến quá trình lên men 75

Bảng 58 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khô ñến quá trình lên men 77

-Bảng 5-9 Ảnh hưởng của chế ñộ lắc ñến quá trình cố ñịnh tế bào nấm men trên bã mía 79

-Bảng 5-10 Ảnh hưởng của thời gian ủ ñến quá trình cố ñịnh tế bào nấm men trên bã mía 79

-Bảng 5-11 ðộng học tối ưu quá trình lên men rượu vang chanh dây dâu tằm với tế bào nấm men tự do 81

-Bảng 5-12 ðộng học tối ưu quá trình lên men rượu vang chanh dây dâu tằm bằng tế bào nấm men cố ñịnh trên bã mía 82

-Bảng 5-13 -Bảng so sánh ựộng học tối ưu của quá trình lên men rượu vang chanh dây dâu tằm sử dụng tế bào nấm men tự do và tế bào nấm men cố ựịnh trên bã mắa -

83

Bảng 514 đánh giá cảm quan sản phẩm rượu vang chanh dây dâu tằm 85

-MỞ ðẦU

Vang là một loại rượu nhẹ ñược chiết xuất từ trái cây tươi do ñó rượu vang chứa nhiều loại axit amin, khoáng chất và vitamin là các thành phần dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể Mỗi loại trái cây sau khi lên men ñều có hương vị thơm ngon riêng biệt tạo cho con người cảm giác sảng khoái Rượu vang trái cây ñược xem

là những thức uống tự nhiên có lợi cho sức khỏe vì thực chất là nước trái cây lên men, có thể dùng làm thức uống hoặc pha chế tạo thành các dạng cocktail Vang giúp tiêu hóa tốt hơn ăn ngon miệng hơn và giảm nguy cơ bệnh tim nếu ñược con người sử dụng một lượng vừa phải và ñiều ñộ

Rượu vang trái cây là sản phẩm ñược ưa chuộng nhiều trên thế gíới vì hầu hết trong tất cả các buổi lễ hội, các buổi tiệc gia ñình, nó là một trong những ñồ uống không thể thiếu ñược Rượu vang trái cây với ñộ cồn khoảng 9-15o ñã trở thành thức uống truyền thống từ xa xưa của người Âu - Mỹ Hiện nay, người châu Á cũng ñã làm quen với rượu vang trái cây trong mỗi bữa ăn ða số các loại trái cây

có ñường ñều là nguyên liệu ñược sử dụng trong sản xuất rượu vang Nếu như trước ñây chỉ sử dụng nho thì ngày nay rượu vang ñược chế biến từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau : rượu vang từ me, thanh long, bưởi , nước dừa, dâu tằm, táo … Tuy nhiên rượu vang hỗn hợp nguyên liệu trái cây vẫn chưa ñược quan tâm nhiều

Trái chanh dây có hình dạng như quả trứng, da trơn hoặc nhăn nhẹ, màu vàng hoặc nâu tím tùy loại Chanh dây chứa nhiều nước vị chua chua ngọt ngọt, thơm nhẹ nhàng, với vô số hạt nhỏ Nhờ hương vị phong phú, chanh dây thường ñược

ép lấy nước ñể làm sirô giải khát hoặc chế biến các loại thực phẩm, thức uống… Chanh dây có hàm lượng ñường vừa phải (8,5g glucide/100g), thấp hơn một số loại trái cây thông thường khác (trung bình là 9-12g/100g), nhưng phần lớn lượng ñường này là fructose có ñộ ngọt cao (so với ñường saccharose), vì vậy chanh dây vẫn có vị ngọt, mặc dù nó còn chứa các loại axit hữu cơ, chủ yếu là

axit citrique (3,9g/100g, ắt chua hơn trái chanh) Ngoài ra, trong chanh dây còn

có một tỷ lệ nhất ựịnh protein, lipide, các chất khoáng và chất vi lượng như sắt, phốtpho, kẽm, magnesium,Ầ nhiều loại vitamin ựặc biệt là vitamin C và nhất là chất xơ (fibre); về năng lượng cung cấp chanh dây tương ựương với xoài, xơri, về magnesium tương ựương với chuốiẦ Thêm nước chanh dây vào nước giải khát, làm kem thì hương vị thật thơm mát Do ựó nước ép chanh dây lên men là sản phẩm ựược ưa chuộng ở thị trường đà Lạt vì có hương nhẹ dễ chịu và chứa

ựựng nhiều vitamin, tuy nhiên phương pháp sản xuất thủ công và thời gian bảo

quản tối ựa chỉ có bảy ngày Ngoài ra, thị trường đà Lạt còn sản phẩm nước cốt dâu tằm có màu nâu ựỏ rất ựẹp thường ựược sử dụng làm nước giải khát và ựược nhiều người ưa chuộng

Việc sản xuất các loại nước trên tận dụng nguồn nguyên liệu phong phú, tận dụng tối ựa nguồn trái cây tươi chưa tiêu thụ kịp và chuyển ựổi chúng sang một dạng sản phẩm có giá trị kinh tế cao hơn nhờ công nghệ lên men Trái cây tươi không những là sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, mà còn là thực phẩm tươi phục vụ trực tiếp trong ựời sống hàng ngày như cung cấp vitamin, axit hữu cơ, muối khoáng cho con người Do nước ta có khắ hậu nhiệt ựới ẩm nên việc bảo quản trái cây tươi là rất khó, trái cây dễ bị thối, hỏng sau khi thu hoạch và vận chuyển làm giảm phẩm chất ban ựầu của chúng Do ựó bên cạnh việc bảo quản trái cây tươi thì việc chế biến các loại trái cây cũng có ý nghĩa hết sức quan trọng nhằm nâng cao giá trị sử dụng của các loại trái cây và phù hợp với nhu cầu, thị hiếu của người tiêu dùng, ựồng thời tạo ra ngành sản xuất mới góp phần tạo việc làm ổn ựịnh và tăng thu nhập cho người dân

Sự kết hợp giữa 2 nguyên liệu chanh dây và dâu tằm hứa hẹn cung cấp cho thị trường một loại vang mới với màu sắc ựẹp và hương vị mới lạ làm phong phú thêm thị trường rượu vang Do ựó sản xuất rượu vang từ chanh dây và dâu tằm là một ựề tài có tắnh thiết thực

2 Bố cục của ñề tài

Luận văn ñược trình bày trong 6 chương Chương 1 giới thiệu chung về quy trình sản xuất rượu vang Chương 2 giới thiệu về nguồn nguyên liệu chanh dây dâu tằm

ñược sử dụng trong nghiên cứu của ñề tài Chương 3 trình bày quá trình xử lí, nhân

giống nấm men chuẩn bị dịch giống cho sản xuất Chương 4 thực hiện quá trình lên men rượu vang với tế bào tự do và tế bào cố ñịnh Kết quả thực nghiệm qui trình lên men rượu vang chanh dây dâu tằm ñược mô tả chi tiết trong chương 5 Phần kết luận trình bày kết luận chung về qui trình sản xuất rượu vang chanh dây dâu tằm hiệu quả Cuối cùng, phần tham khảo trình bày các bài báo, sách ñược tham khảo, trích dẫn trong luận văn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu [19]

Danh từ rượu vang quả ñược dùng ñể chỉ loại rượu lên men từ dịch ép trái cây (nho, dâu, thơm (dứa), táo, lê…) của một số chủng nấm men Rượu vang thu ñược không qua chưng cất, có hương vị thơm ngon của trái cây tự nhiên, có ñộ cồn nhẹ (10-15%) là loại nước giải khát thơm ngon giàu chất bổ dưỡng, ñặc biệt rất thích hợp với phụ nữ Rượu vang quả có thành phần rất phức tạp, ñến nay ngay cả ở các nước có công nghệ sản xuất rượu vang lâu ñời cũng chưa biết hết các chất cấu thành của rượu vang Thành phần chủ yếu của rượu vang bao gồm:

Thành phần ñầu tiên phải kể ñến là cồn etanol, là một trong những thành phần quan trọng nhất của rượu vang Cồn etanol có ñược do lên men tự nhiên từ dịch trái cây, do ñó nó là thứ cồn tinh khiết, không lẫn aldehyde, ester ðộ cồn của rượu vang

từ 10o-12o; nếu dưới 10o rượu sẽ hơi lạt; 12o trở lên là ñộ cồn hơi cao, uống mau say Có thể nói rượu vang chứa một lượng cồn trung bình, không nhẹ quá như bia, không nặng quá như rượu trắng Do vậy nhiều người uống ñược, kể cả phụ nữ và người cao tuổi

Cùng với cồn etanol, rượu vang còn chứa nhiều các chất bổ dưỡng khác ðường trong rượu vang vào khoảng 62-132g/l, chủ yếu là ñường fructose, glucose và một ít galactose Khi cho thêm ñường saccharose vào dịch quả trước khi lên men, thì toàn

bộ số ñường này sẽ bị phân huỷ thành ñường khử ðiều này cho thấy, nếu phát hiện

ñược saccharose trong rượu vang thành phẩm, thì ta hiểu ngay là ñường này ñược

pha thêm vào sau lên men Tuỳ theo lượng ñường khử còn lại trong rượu vang sau khi ñã lên men xong, người ta phân biệt : rượu vang khô (dưới 10g ñường/l), nửa khô (20-30g ñường/l), nửa ngọt (45g ñường/l) và rượu ngọt (80-110g ñường/l) Người ta nhận thấy rằng lượng ñường khử càng cao, lượng cồn càng phải cao ñể cân ñối giữa ñộ cồn và ñộ ngọt, gây cảm giác ngon hơn cho người uống

Trong rượu vang còn chứa một lượng các acid vô cơ và hữu cơ như acid tatric, acid malic, acid citric, acid oxalic… Có thể nói rượu vang là thức uống có ñộ chua cao, với hàm lượng acid tổng số 4-7g/l (quy ra acid malic) ðộ pH của rượu vang 2,9-3,9 Ở các nước phương Tây, ñộ chua của rượu vang là thành phần quan trọng ngang với ñộ cồn Tuy có ñộ chua cao, nhưng rượu vang vẫn dễ uống, vì vị chua của acid ñược cân ñối với vị ngọt của ñường, cồn, glycerin, vị chát của pholyphenol

Trong rượu vang chứa một lượng phong phú các loại muối, tuy với hàm lượng rất thấp ñó là muối các nguyên tố : P, S, K, Na, Ca, Fe, Cu, Mn… Khi phân tích, một lít rượu vang chỉ có 1,5-3g tro, nhưng chất muối trong rượu vang giữ vai trò rất quan trọng là làm tăng hương vị của rượu và làm tăng giá trị dinh dưỡng cung cấp nguồn vi lượng cho cơ thể

Một giá trị dinh dưỡng ñáng kể của rượu vang là giàu vitamin các loại Ai cũng biết nước quả giàu vitamin Thực tế cho thấy, lên men trong làm rượu vang là một quá trình ñiều chỉnh lại thành phần vitamin của nước quả và là kĩ thuật tốt ñể giữ lại các vitamin trong nước quả

1.2 Qui trình chung sản xuất rượu vang [19]

1.2.1 Nguyên liệu và chế biến nguyên liệu

Nói ñến rượu vang trái cây thì nguyên liệu chính dùng trong sản xuất là trái cây các loại Tất cả các loại quả nếu có chứa ñường, protein, muối khoáng và không chứa các chất ñộc hại ñối với nấm men ñều có thể sử dụng ñể chế biến lên men tạo rượu vang Các loại quả như nho, táo, dâu, cam, xoài thậm chí cả cóc, bưởi, mận

ñều có thể dùng làm nguyên liệu cho lên men rượu vang Tuy vậy, trong số ñó có

những loại quả có chất lượng nước quả thích hợp hơn ñể lên men rượu vang, lí tưởng nhất là nho Nho là nguyên liệu thích hợp nhất vì nho cho chất lượng rượu tốt nhất, hương vị ñậm ñà, có vị ngọt, nồng của cồn etanol, cân ñối với vị chua, chát của acid và tannin Sau nho, các loại quả dâu, thơm cũng cho nước quả rất thích hợp với lên men tạo rượu vang

Phương pháp chế biến nguyên liệu, ở ñây ñề cập ñến các biện pháp xử lí ñối với nguyên liệu là quả nho Quả hái về không ñể dập nát khi vận chuyển cũng như lúc bảo quản Loại bỏ quả hư, dập, rửa ñể ráo Cũng có trường hợp chỉ loại bỏ quả hư, xấu, không cần rửa, quả ñược ñem sử dụng ép lấy nước ngay sau khi thu hoạch Lí

do của việc làm trên là do người sản xuất muốn sử dụng ngay những tế bào nấm men trên vỏ quả làm men giống trong lên men sau này không cần cấy giống nấm men thuần khiết

Bước xử lí tiếp theo sẽ khác nhau tùy qui mô sản xuất, trong sản xuất nhỏ quả

ñem giã dập bằng cối sành, cối ñá hay cối gỗ Tuyệt ñối không dùng dụng cụ bằng

sắt, ñồng (vì nước quả chua sẽ công phá sắt, ñồng làm các ion này tan trong dịch quả, sau này gây kết tủa rượu, gây mất màu tự nhiên của rượu) Sau ñó, vắt lấy nước quả bằng tay hay qua túi lọc bằng vải Trường hợp lên men cả vỏ quả thì không cần lọc bỏ vỏ quả Quá trình xử lí trên ñược tiến hành khẩn trương vì thời gian xử lí kéo dài nước quả bị oxy hóa, dễ bị nhiễm tạp khuẩn, dẫn ñến giảm chất lượng Trong sản xuất ở qui mô công nghiệp quả ñược ép bằng máy ép rồi lọc trong phòng chứa

CO2 với mục ñích ngăn chặn dịch quả bị oxy hóa do tiếp xúc với O2 ðể chống dịch quả bị oxy hóa và tiêu diệt vi khuẩn tạp nhiễm (vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic), người ta cho SO2 vào dịch quả Hóa chất này ñược các tổ chức quốc tế sản xuất rượu vang cho phép sử dụng với liều lượng qui ñịnh là 30-120mg/l dịch quả

Pha loãng dịch quả, thường thì không ñược pha loãng dịch quả bằng nước, nhưng nếu sử dụng nhiều loại quả khác nhau, thành phần của dịch quả có loại chưa ñủ lượng nước cần cho quá trình lên men, vì vậy có thể linh ñộng bổ sung lượng nước

ñảm bảo cho quá trình lên men ñược thực hiện tốt Việc bổ sung cũng phải tuân thủ

theo những qui ñịnh cụ thể như sau, không cho thêm nước vào dịch quả ñối với nho, dâu, cam, dứa…Pha loãng với 15-20% nước tính theo khối lượng của phần quả

ăn ñược (ñối với mãng cầu, xoài) Pha thêm 30% nước ñối với mơ, mận, ñào

Thêm ñường, ñường là thành phần quan trọng nhất trong dịch quả vì từ ñường qua chuyển hóa của vi sinh vật sẽ tạo rượu Tùy theo loại quả mà ta sẽ bổ sung thêm

ñường ðiều này theo qui ñịnh chung của Tổ chức các nước Sản xuất Rượu vang

cũng có những chỉ ñịnh cụ thể rất chặt chẽ Cùng một loại quả thu hoạch ở các vùng

ñịa lí khác nhau, vào những mùa khác nhau cũng sẽ bổ sung lượng ñường khác

nhau

ðiều chỉnh ñộ chua, acid hữu cơ là thành phần quan trọng của nước quả Hàm

lượng acid không chỉ ảnh hưởng ñến chất lượng nước quả mà quan trọng hơn là làm thay ñổi pH của dịch nước quả, từ ñó ảnh hưởng ñến hoạt ñộng của vi sinh vật và các enzyme Người ta nhận thấy các vi sinh vật gây hỏng rượu hoạt ñộng tốt ở

pH>3.5 Trong khi ñó Saccharomyces lại phát triển bình thường ở pH 3-3.5 Vì vậy

giữ pH của dịch quả 3-3.5 là cần thiết ñể nấm men phát triển tốt và ức chế sự phát triển của vi sinh vật có hại Do vậy phải ñiều chỉnh dịch quả ñến pH thích hợp bằng CaCO3, acid tatric, acid citric Phương pháp giản tiện hơn là trộn nước quả chín và nước quả của trái còn xanh ñể có ñược dịch quả có ñộ chua theo yêu cầu

ðiều chỉnh một số chỉ tiêu khác, có thể bổ sung thêm nguồn N bằng muối

ammonium, thêm nguồn vitamin bằng vitamin B1 Sau khi thực hiện các bước ñiều chỉnh nói trên, nước quả ñược khẩn trương cho lên men Trong trường hợp nước quả thu ñược không ñảm bảo ñộ tinh sạch cần thiết, dịch quả sẽ ñược tiệt trùng bằng nhiệt ở 65-70oC trong 10 phút

1.2.2 Quá trình lên men tạo rượu vang

ðể lên men tạo rượu vang, người ta có thể sử dụng hai nguồn giống như sau:

Dịch men giống: cấy từ ống giống thuần khiết qua khâu nhân giống các cấp, cấy vào dịch lên men với tỉ lệ giống cấy từ 3-10% Dịch ñang lên men ở giai ñoạn lên men mạnh, tỉ lệ 1/3-1/5 thể tích nồi lên men (lấy từ lần lên men trước) Người ta hay

sử dụng nguồn giống này ñối với các chủng nấm men : Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces oviformis

Dùng nấm men dính trên vỏ, rơi vào dịch quả một cách tự nhiên ñể lên men Tuy vậy, phương pháp lên men tự nhiên này thường cho ñộ cồn thấp, dễ bị tạp nhiễm Hiện nay ñể ổn ñịnh quá trình lên men ở qui mô công nghiệp, người ta phải sử dụng

chủng nấm men thuần khiết ñược nuôi cấy nhân giống qua các cấp, cấy vào dịch lên men

Giai ñoạn hình thành rượu: là giai ñoạn từ lúc cấy men giống vào, cho lên men

ñến khi dịch lên men hết sủi bọt mạnh Nếu giữ ñược nhiệt ñộ ổn ñịnh, thời gian lên

men này kéo dài từ 4-5 ngày Kết quả của giai ñoạn này ta ñược “rượu non” Trong thời gian này nấm men hoạt ñộng mạnh nhất, tiêu thụ nguyên liệu (ñường, ñạm, vitamin) mạnh, biến ñường thành rượu, giải phóng CO2 Kết thúc giai ñoạn này thành phần nước quả thay ñổi rất lớn

Giai ñoạn phát triển: khi kết thúc lên men ở giai ñoạn một, người ta tiến hành gạn cặn, tách xác quả bằng biện pháp lọc ðây là lần gạn thứ nhất Khi ñược “rượu non”, ta tiếp tục cho lên men, nhưng ở giai ñoạn này quá trình lên men xảy ra không

ồ ạt, người ta còn gọi là lên men phụ, phân hủy những gam ñường cuối cùng có

trong dịch lên men ðồng thời ở giai ñoạn này có quá trình lên men malolactic Kết quả quá trình này, acid malic ñược chuyển thành acid lactic, làm cho rượu chuyển

từ vị chua gắt sang chua nhẹ dễ chịu (của acid lactic), CO2 còn ñược tiếp tục giải phóng nhưng có xu hướng ít dần Dung dịch lên men ở trạng thái tĩnh lặng, xác men lắng xuống ñáy bình Tiếp theo thực hiện gạn cặn lần 2 (sau lần 1 khoảng từ 20-30 ngày), lần 3 (sau lần 2 hơn 30 ngày) Nếu rượu có ñục lại gạn tiếp ñể có dung dịch trong suốt Sau lần gạn cuối cùng rượu cơ bản ổn ñịnh về thành phần Ở giai ñoạn này, nếu nếm thử thấy rượu chưa thể uống ñược vì có vị cay, ñắng, hơi chua gọi là

“rượu sống”

Lưu ý: sau mỗi lần gạn cặn, các dụng cụ ñựng dung dịch lên men như chai, bình, nồi lên men ñược ñổ dịch lên men ñầy hơn, tạo ñiều kiện lên men yếm khí nghiêm ngặt hơn ðến lần cuối cùng ñậy kín hoàn toàn, tạo sự cách li nghiêm ngặt với O2 Giai ñoạn vang chín: sau giai ñoạn 2, “rượu non” ñã ổn ñịnh thành phần nhưng rượu vẫn còn sống, người ta phải áp dụng một số biện pháp kỹ thuật ñể làm tăng chất lượng rượu, ñể rượu ñược chín Những biện pháp này rất ñơn giản nhưng lại

quyết ñịnh chất lượng của rượu thành phẩm Cụ thế cách tiến hành, nút chai, bình

ñựng “rượu non” thật chặt Hạ thổ ở ñộ sâu 50-60cm ở vùng ñất cao, mát, không bị

ngập nước Vị trí tốt nhất là dưới hầm ở trong nhà nơi nhiệt ñộ ít dao ñộng Nếu không có ñiều kiện chôn sâu thì có thể ñể ở trong thùng ñổ cát vùi kín Hạ thổ với thời gian từ 4-5 tháng, rượu có thể uống ñược tuy chất lượng chưa hoàn hảo Nếu ñể qua hai năm trở lên ta có chất lượng hoàn hảo gọi là “rượu chín” Trong thời gian chuyển từ rượu vang sống sang rượu vang chín ñã xảy ra rất nhiều biến ñổi sinh hóa phức tạp ñể chuyển từ rượu ít ngọt, ít thơm có vị chua lấn át, có vị ñắng của CO2, của aldehyde sang rượu chín trong vắt, có màu ñỏ hoặc vàng, có vị chua ngọt cân

ñối của cồn-ñường, vị ñắng nhẹ của glycerin, vị chát của polyphenol Khi có ñầy ñủ

những tính chất như vậy ta ñược rượu thành phẩm

1.2.3 Phân loại rượu vang [14]

Hiện nay có nhiều khóa phân loại rượu vang, dưới ñây là một khóa phân loại phổ biến Rượu vang ñược chia thành hai nhóm vang không có gas và vang có gas (khí

CO2)

Nhóm rượu vang không có gas bao gồm những sản phẩm sau:

Vang phổ thông (table wine) hàm lượng cồn trong sản phẩm là do quá trình lên men tạo ra và thường dao ñộng trong khoảng 10-13%v/v Dựa vào hàm lượng

ñường sót, người ta phân loại tiếp thành vang khô (không quá 0.3% ñường), bán

khô ( 1-3% ñường) và bán ngọt (5-8% ñường)

Vang nặng: hàm lượng cồn trong sản phẩm có thể lên ñến 16-18% Một phần cồn trong sản phẩm là do quá trình lên men etanol từ nước trái cây, một phần cồn

ñược bổ sung vào dưới dạng cồn tinh luyện

Vang hương: sản phẩm này tương tự như rượu mùi (liquor) với hàm lượng cồn 14-18%, hàm lượng ñường có thể lên ñến 25%

Nhóm rượu vang có gas ñược chia làm hai loại dựa vào nguồn gốc CO2 trong sản phẩm: Rượu vang phổ thông ñược ñem ñi bão hòa CO2 ; Rượu vang phổ thông

ñược bổ sung syrup và cấy giống nấm men ñể thực hiện quá trình lên men lần hai

1.3 Bản chất quá trình lên men rượu [17]

Quá trình lên men rượu là quá trình phân giải yếm khí ñường thành rượu dưới tác

ñộng của vi sinh vật Trong tất cả các quá trình chuyển hóa glucid do vi sinh vật gây

ra, sự lên men rượu ñược ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, ứng dụng này

ñã có từ thời xa xưa sơ bộ ñể sản xuất rượu vang, bia và các nước uống giải khát lên

men khác

Nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới ñã dày công nghiên cứu thực chất của quá trình lên men rượu, ñó là những công trình nghiên cứu kiệt xuất của Pasteur về nhu cầu năng lượng cho hoạt ñộng sống của vi sinh vật, năng lượng này ñược giải phóng

từ quá trình hô hấp yếm khí ñã là cơ sở cho những hiểu biết về sự lên men rượu

1.3.1 Cơ chế của quá trình

Phương trình phản ứng tổng quát:

C6H12O6 + 2ADP + 2H3PO4 = 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 2H2O

ðường cùng với chất dinh dưỡng khác của môi trường lên men, trước tiên ñược

hấp thụ trên bề mặt và sau ñó khếch tán qua màng bán thấm vào bên trong tế bào nấm men, sự phân hủy ñường thành rượu trong tế bào nấm men xảy ra bằng hàng loạt các phản ứng với sự tham gia rất phức tạp của nhiều loại enzym khác nhau, bước cuối cùng của quá trình lên men là sự chuyển hóa acid piruvic thành rượu etylic và CO2 Do ảnh hưởng của enzym cacboxilaza, acid piruvic bị khử cacboxil tạo thành khí CO2 và andehyt acetic, sau ñó hợp chất này bị khử thành rượu etylic dưới tác dụng xúc tác của enzym alcoholdehydrogenaza của nấm men Ở ñây NAD-

H2 tạo thành trong phản ứng oxy hoá gliceraldehyd 3-phophat của quá trình ñường phân ñóng vai trò chất cho hidro, còn acetaldehyd là chất nhận

CH3CHO + NADH+ + H+ CH3CH2OH + NAD+

Trong ñiều kiện thoáng khí, quá trình lên men bị ức chế, trong khi ñó hidro tách

ra ñược chuyển qua chuỗi hô hấp tới oxy và acid piruvic, sản phẩm của quá trình

ñường phân sẽ tiếp tục bị oxy hóa qua nhiều bước trong chu trình Kreps, các cặp

hidro tách ra ñược chuyển tới oxy Quá trình này liên hợp với quá trình tạo ATP Tùy ñiều kiện của môi trường, sự lên men rượu có thể tiến hành theo các kiểu khác nhau

Thực tế cho ta thấy rằng khi dùng ñường lên men rượu ta thu ñược gần 50% là rượu etylic, 45% CO2, 4% sản phẩm phụ như glyxerin, aldehyd, dầu khét, … và 1%

là ñường còn lại làm thức ăn xây dựng tế bào cho nấm men

1.3.2 Các sản phẩm của quá trình lên men rượu trong các ñiều kiện môi trường khác nhau

Sự lên men rượu có thể tiến hành theo nhiều kiểu khác nhau tạo ra sản phẩm khác nhau tùy thuộc vào ñiều kiện môi trường và ñặc ñiểm sinh lý của nấm men

ñiều kiện yếm khí

Sự lên men rượu tiến hành theo cơ chế thông thường và theo 2 thời kỳ:

Thời kỳ cảm ứng: aldehyd acetic ñược tạo thành còn ít, chưa ñược dùng làm chất nhận H2 nên H2 ñược chuyển cho aldehyd gliceric ñể tạo glycerin, như vậy trong môi trường sẽ hình thành glycerin, aldehyt acetic và CO2

C 6 H 12 O 6

CH 2 O CHOH CH=O

CH 2 O

-CHOH

CH 2 OH

CH 2 OH CHOH

CH 2 OH Phosphat glicerin

Thời kỳ tĩnh: khi aldehyt acetic ñã ñạt tới một lượng nào ñó trong môi trường,

phản ứng sử dụng aldehyt acetic làm chất nhận H2 bị ñình chỉ và aldehyt acetic

ñược chuyển thành rượu etylic Chính vì glycerin chỉ ñược hình thành trong thời kỳ

cảm ứng nên nó chỉ là sản phẩm phụ khi lên men rượu ở môi trường acid

CH 2 CHOH

O-CH 2 OH

CH 2 CHOH CH=O

Neiberg ñã cho ta biết rằng khi ñưa Natribisufit hoặc hydrozin thế (thuốc thử tác dụng lên nhóm cacbonyl) vào dịch lên men thì các chất này sẽ kết hợp với acetaldehyt tạo thành hợp chất khó tan Nói cách khác khi ñó mất acetaldehyt nên coenzym khử NAD-H2 bắt buộc phải khử aldehyt phosphatglicerinic ñể tạo glycerin

Trong môi trường có chứa NaHSO3:

C6H12O6 = C3H8O3 + CO2 + CH3-CH-OH-SO3Na Glucid glycerin Acetaldehy bisulfatNatri Ngoài ra glycerin khi thêm vào dung dịch lên men NaHCO3 hoặc Na2HPO4, nghĩa

là khi kiềm hóa nhẹ môi trường lên men thì acetaldehyt vừa bị oxy hóa vừa bị khử nên chất nhận H2 ở ñây cũng là aldehyt phosphate glycerinic:

2C 6 H 12 O 6 + H 2 O = CH 3 CH 2 OH + CH 3 COOH + 2C 3 H 8 O 3 + 2CO 2

Glucid Rượu etylic acid acetic glycerin

1.3.2.3 Sự tạo thành các rượu cao trong ñiều kiện thành phần dinh dưỡng của môi trường lên men có chứa nhiều acid amin khác nhau

Nấm men là tác nhân cung cấp phức hệ enzym “Zimaza” ñể gây men dịch lên men

Sự trao ñổi chất và nấm men có vai trò chủ ñạo tạo nên các sản phẩm chính cũng như sản phẩm phụ của sự lên men rượu Quá trình tạo thành rượu cao phụ thuộc vào nhiều nhân tố: ñặc ñiểm sinh lý của chủng nấm men, mức ñộ thoáng khí, thành phần nitơ và pH môi trường, nhiệt ñộ lên men … theo I M Griachova, rượu cao phân tử

có thể ñược sinh tổng hợp theo hai ñường hướng:

Thứ nhất là do phản ứng chuyển amin giữa các acid amin của môi trường và của tế bào với acid piruvic ñược sinh ra khi lên men rượu, ta có thể biểu diễn bằng

mẽ sự sinh tổng hợp tất cả các cấu tử của rượu cao Hiện nay người ta biết trước các sản phẩm của sự lên men có khoảng 50 rượu cao phân tử, chiếm gần 90-95% dầu fusel Nhưng nhiều hơn cả là rượu izoamylic, izobutylic và propylic (chiếm 85-93% tổng lượng rượu cao)

1.3.3 Tác nhân vi sinh vật

Tác nhân chính của quá trình lên men rượu là nấm men Saccharomyces cerevisiae, ngoài ra nấm mốc Mucor và một số vi khuẩn cũng có khả năng này Trong công

nghiệp sản xuất rượu, bia, bánh mì mỗi ngành sử dụng những chủng nấm men này khác nhau Trong ñiều kiện yếm khí, nấm men có khả năng chuyển ñường thành etanol và CO2 một cách hợp thức Ngoài ra, nấm men còn có khả năng tạo ra các enzyme nội bào (endofermen) tiến hành xúc tác bên trong tế bào Như vậy sự phân giải ñường xảy ra bên trong tế bào nấm men, còn rượu etylic và CO2 ñược tạo thành

thì ñi ra khỏi tế bào và tích tụ ở trong môi trường Dựa vào ñặc tính của quá trình lên men mà nấm men ñược chia làm 2 nhóm chính: nấm men nổi và nấm men chìm

Nấm men nổi: Gây ra sự lên men nổi, tức là lên men ở nhiệt ñộ cao từ

20-28oC Quá trình lên men nhanh, tạo thành nhiều bọt, do tác dụng thoát CO2 mạnh

mẽ nên trong thời gian lên men nấm men nổi trên mặt hoặc lơ lửng trong dịch lên men và chỉ lắng xuống ñáy thành một lớp xốp khi quá trình lên men kết thúc Loại nấm men này thường ñược dùng trong sản xuất xuất rượu trắng, bánh mì

Nấm men chìm: Gây ra sự lên men lặng lẽ chậm chạp ở nhiệt ñộ tương ñối

thấp từ 5-10oC, CO2 thoát ra ít, trong quá trình lên men, nấm men ở ñáy thùng lên men Loại này thường ñược dùng trong sản xuất bia, rượu vang Có khả năng lên men ñường rafinoza

1.3.4 Các ñiều kiện chính của quá trình lên men rượu

Nấm men ñòi hỏi phải có những ñiều kiện nhất ñịnh mới có thể lên men Trong sản xuất ngoài việc chựa chọn chủng nấm men, còn phải nghiên cứu cách tạo ñiều kiện thích hợp nhất ñể ñạt hiệu suất lên men cao Các ñiều kiện chính ñể lên men bao gồm:

Nồng ñộ ñường: Nấm men chỉ có khả năng lên men các ñường ñơn giản như

mono-disaccharid, ñặc biệt là maltoza và saccharoza Sự chuyển hóa các disaccharid này thành glucoza và fructoza ñược thực hiện dưới tác dụng của enzym

maltoza và saccharoza mà tế bào mà nấm men có Nấm men Saccharomyces cerevisiae hoàn toàn không có khả năng thủy phân tinh bột Trong dịch lên men

rượu ngoài ñường ra , phải cho thêm một số thức ăn cần thiết cho nấm men như các muối amon, các mối phosphate và chủ yếu là ñạm như urê Nồng ñộ ñường có ảnh

hưởng lớn ñến năng lực lên men (Năng lực lên men là khả năng của một lượng nấm men nhất ñịnh, lên men sau một thời gian nhất ñịnh ñược một lượng ñường nào ñó) Nồng ñộ ñường thích hợp nhất là 10-18%, nếu cao hơn thì năng lực lên men giảm

và ngược lại nếu nồng ñộ ñường thấp sẽ không tạo ñiều kiện cho quá trình lên men Trong thực tế, ở nồng ñộ ñường 30-35% thì sự lên men bị ñình chỉ cho dù có loại nấm men có khả năng lên men ñược ở nồng ñộ ñường lên ñến 60%

Oxy: nấm men là loại vi sinh vật hô hấp tùy tiện và chỉ trong ñiều kiện yếm khí

nó mới tiến hành lên men rượu, nếu trong môi trường chứa nhiều oxy nó sẽ oxy hóa

ñường thành CO2 + H2O ñồng thời sinh sản rất mạnh, do vậy trong sản xuất rượu giai ñoạn ñầu cần tạo ñiều kiện hiếu khí ñể nấm men sinh sản, phát triển ñủ lượng tế bào cần thiết cho quá trình lên men rượu, sau ñó tạo ñiều kiện yếm khí tuyệt ñối ñể nấm men chuyển hóa ñường thành rượu Tuy vậy, trong trường hợp ñầy ñủ oxy vẫn

có một lượng rượu ñược tạo thành

pH môi trường: pH môi trường có ý nghĩa quan trọng trong quá trình lên men

rượu, bình thường lên men rượu ñược thực hiện ở pH=4-4,5 Trong môi trường kiềm sự lên men cho glycerin là chủ yếu ðể acid hóa ta thường dùng H2SO4 hoặc acid lactic

Nhiệt ñộ: lên men rượu thích ứng ở nhiệt ñộ 28-30oC Khoảng 50oC và dưới 0oC

sự lên men bị ñình chỉ Trong thực tế, tùy theo nhu cầu mà người ta cho lên men ở khoảng nhiệt ñộ 4-28oC

Nồng ñộ rượu và khí CO 2: có tác dụng kìm hãm sự sinh sản cũng như khả năng lên men của nấm men Sự sinh sản của nấm men bị chậm lại khi nồng ñộ rượu có trong môi trường là 2% và sẽ bị ngừng lại ở nồng ñộ rượu 5% ða số nấm men chỉ lên men ñược tới nồng ñộ rượu 12-14%, chỉ có một số ít lên men ở nồng ñộ rượu 17-20%, khí cacbonic ức chế sự lên men nhưng việc thoát khí CO2 lại có tác dụng tốt ñến quá trình lên men Sự thoát khí CO2 sẽ làm cho môi trường lên men luôn luôn bị khấy ñộng, kéo dài ñược trạng thái lơ lửng của nấm men do ñó làm tăng nhanh sự lên men Qua ñó ta thấy một ñiều phổ biến là chính sản phẩm của sự trao

ñổi chất khi ñạt tới một nồng ñộ nào ñó sẽ có tác dụng ức chế ñối với bản thân vi

sinh vật ñó

Nấm men là loài vi sinh vật ñơn bào, có khả năng sống trong môi trường dinh dưỡng chứa ñường, nitơ, photpho và các chất hữu cơ, vô cơ khác Chúng là các vi sinh vật dị dưỡng có khả năng sống cả trong ñiều kiện hiếu khí và yếm khí [4] Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi ðặc biệt chúng có mặt nhiều ở ñất trồng nho và các nơi trồng hoa quả Ngoài ra thấy chúng có mặt trên trái cây chín, trong nhụy hoa, trong không khí và cả nơi sản xuất rượu vang [5]

1.4.1 Hình dạng và kích thước [4]

Nấm men có hình dạng khác nhau, thường có hình cầu, hình elip, hình trứng, hình bầu dục và cả hình dài Một số loài nấm men có tế bào hình dài nối với nhau thành những dạng sợi gọi là khuẩn ty (Mycelium) hay khuẩn ty giả (Pseudo mycelium) Tuy nhiên hình dạng của chúng không ổn ñịnh, phụ thuộc vào tuổi của nấm men và

ñiều kiện nuôi cấy

Tế bào nấm men thường có kích thước rất lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước trung bình, chiều dài 5 – 10µm, chiều rộng 3 – 5µm Kích thước tế bào nấm men thay ñổi rất nhiều tùy thuộc vào từng giống, từng loài

1.4.2 Cấu tạo tế bào nấm men [5]

Tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác ñược cấu tạo chủ yếu từ các phần

cơ bản như sau:

Thành tế bào: cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau Trong ñó chủ yếu là glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin, volutin,…

Màng nguyên sinh chất: gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit enzyme permeaza…

Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protit, gluxit, lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan trong ñó

Nhân tế bào

Những thành phần – cơ quan con khác: không bào, ty lạp thể, riboxom,…

1.4.3 Sự sinh sản của nấm men [4]

Nấm men có một số hình thức sinh sản sau:

Sinh sản bằng cách nảy chồi

Sinh sản bằng cách phân ñôi

Sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử thông qua tiếp hợp ñẳng giao, tiếp hợp dị giao, sinh sản ñơn tính

1.4.4 Phân loại nấm men [5]

Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi imporfecti)

Lớp nấm men thật (lớp Ascomyces – lớp nấm túi):

Phần lớn nấm men dùng trong công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, ña số thuộc giống Saccharomyces

Giống Endomyces

Giống Schizosaccharomyces

Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti – nấm men bất toàn)

Giống Crytococus (toscula, tornlopsis)

Giống Mycoderma

Giống Eandida

Giống Geotrichum (ñã ñược xếp vào lớp nấm mốc)

Giống Rhodotorula

1.4.5 Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men [5]

Sinh dưỡng của nấm men: cấu tạo của tế bào nấm men thay ñổi khác nhau tùy

theo loài, ñộ tuổi và môi trường sống, nhưng nhìn chung bao gồm nước 75-85%, chất khô 15-25% Trong ñó chất khoáng chiếm 2-14% hàm lượng chất khô Nấm men cũng như các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, cacbon, nitơ, phospho, kali, magiê,…

Nguồn cacbon cung cấp là các loại ñường khác nhau như saccarose, maltose,

lactose, glucose…

Bảng 1-1 Thành phần hóa học của nấm men

Các chất Thành phần (% chất khô)

Cacbon CaO Nitro Hydro

Hô hấp hiếu khí:

C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + 674 cal

Hô hấp kị khí

C6H12O6 → 2CH3CH2OH + 2CO2 + 33 cal Dinh dưỡng oxy, hydro: ñược cung cấp cho tế bào từ nước của môi trường nuôi cấy hay dịch

Dinh dưỡng Nitơ: nấm men không có men ngoại bào ñể phân giải protid, nên không thể phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan,

có thể là ñạm hữu cơ hoặc vô cơ Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, urê ðạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat…

Các vitamin và chất khoáng: chất khoáng có ảnh hưởng to lớn ñến hoạt ñộng sống của nấm men

Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên kết

có năng lượng lớn

Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin

và enzyme

Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men

Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác

Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc ñẩy sự phát triển của nấm men, tham gia vào sự lên men rượu, tạo ñiều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid pyruvic

Mangan: ñóng vai trò tương tự như magiê

Cơ chế vận chuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào nấm men: Nấm men

hoàn toàn không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt, các chất dinh dưỡng mà nó sử

dụng chủ yếu ñược vận chuyển qua thành tế bào theo hai con ñường cơ bản:

Thẩm thấu bị ñộng: trên thành tế bào nấm men có những lỗ nhỏ, những lỗ này có tác dụng làm cho chất dinh dưỡng vận chuyển vào trong tế bào từ môi trường bên ngoài nhờ áp suất thẩm thấu, ngược lại chất thải trong quá trình trao ñổi chất cũng ñược thải ra theo con ñường này

Hấp thu chủ ñộng: các thành phần dinh dưỡng không có khả năng xâm nhập vào tế bào theo con ñường thứ nhất thì lập tức có hệ permeaza hoạt hóa Permeaza

là một protid hoạt ñộng, chúng liên kết với chất dinh dưỡng tạo thành hợp chất và hợp chất này chui qua thành tế bào trong, tại ñây chúng lại tách ra và permeaza lại tiếp tục vận chuyển tiếp

Quá trình sinh trưởng và phát triển

Sự sinh trưởng: Trong quá trình nuôi cấy, trong ñiều kiện dinh dưỡng ñầy ñủ, tế bào nấm men tăng nhanh về kích thước và ñồng thời sinh khối ñược tích lũy nhiều

Sự phát triển: Các nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân ñôi thường cho lượng sinh khối rất lớn sau một thời gian ngắn Trong trường hợp sinh sản theo phương pháp này thì trong dịch nuôi cấy sẽ không có tế bào già Vì rằng tế bào

ñược phân chia thành hai cứ như vậy tế bào lúc nào cũng ở trạng thái ñang phát

triển Tế bào chỉ già khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào không có khả năng sinh sản nữa Tuy nhiên ña số nấm men sinh sản bằng phương pháp nảy chồi nên hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ Khi chồi non tách khỏi tế bào mẹ ñể sống

ñộc lập thì nơi tách ñó trên tế bào mẹ tạo thành một vết sẹo Vết sẹo này sẽ không

có khả năng tạo ra chồi mới Cứ như vậy tế bào mẹ sẽ chuyển thành tế bào già theo thời gian ðể xác ñịnh số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nay người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như:

Xác ñịnh số lượng tế bào bằng phương pháp ñếm trực tiếp trên kính hiển vi hay

ñếm gián tiếp trên mặt thạch

ðo ñộ ñục của tế bào trong dịch nuôi cấy trên cơ sở xây dựng một ñồ thị chuẩn

Giai ñoạn logarit: ñây là giai ñoạn phát tế bào nấm men triển rất nhanh, sinh khối tăng ào ạt, kèm theo sự thay ñổi mạnh mẽ của dịch lên men

Giai ñoạn ổn ñịnh: tốc ñộ sinh trưởng của nấm men giảm dần, số lượng tế bào nấm men không tăng nữa, tốc ñộ sinh sản bằng tốc ñộ chết, thành phần dịch lên men còn lại ít, các sản phẩm lên men ñược tích tụ nhiều

Giai ñoạn chết: tốc ñộ chết của tế bào nấm men tăng nhanh, tốc ñộ sinh sản rất ít do ñó số lượng tế bào nấm men giảm dần

[N]

t

Hình 1-1 ðường cong biểu diễn quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men theo thời gian

1.4.6 Một số loài nấm men thường gặp trong sản xuất rượu vang [5]

Sau ñây là một số loài nấm men thường gặp trong nước quả có vai trò quan trọng trong nghề làm rượu vang

Saccharomyces cerevisiae: nấm men này phổ biến trong quá trình lên men nước quả chiếm 80% trong tổng số Saccharomyces có trong nước quả khi lên men

Nguồn dinh dưỡng cacbon của loài này là ñường, cồn và acid hữu cơ, những tác nhân sinh trưởng là acid pantotinic, biotin, mezoinozit, thiamin và piridoxin ða số

tế bào của loài này hình ovan có kích thước (3-8) x (5-12)µm, sinh sản theo lối nẩy

chồi và tạo thành bào tử Saccharomyces cerevisiae sinh ra enzyme invertase có

khả năng khử ñường sacaroza thành fructoza và glucoza, vì vậy trong lên men có thể bổ sung loại ñường này vào dịch quả và hàm lượng cồn ñược tạo thành bình thường ñối với loài này ñạt 8-10% so với thể tích Ở giai ñoạn cuối của quá trình lên

men các tế bào Saccharomyces cerevisiae thường bị già, không tiếp tục chuyển

ñường thành cồn và bị chết rất nhanh, chúng kết lắng nhanh và làm trong dịch rượu

Saccharomyces uvarum: men này ñược tách từ nước nho, rượu lên men tự nhiên

Về hình thái nó không khác với các loài khác Khả năng sinh bào tử khá mạnh trên môi trường thạch – malt Loài này có thể lên men tạo 12-130 cồn trong dịch nước nho

Saccharomyces chevalieri Theo Lodder là Saccharomyces chevalieri Guilliermond Nấm men này ñược tách từ nước nho lên men tự nhiên, từ rượu vang non ñược gây men nước dừa hoặc nước cọ Saccharomyces chevalieri thuần chủng

lên men nước nho có thể tạo 160 cồn Nó thường lẫn với Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces oviformics: nấm men này ñược tách ra từ nước nho tự lên men, nhưng loại nấm men này ít hơn so với Saccharomyces vini Giống thuần chủng phát

triển tốt trong nước nho và các loại nước quả khác, có khả năng chịu ñược ñường cao, cồn cao, lên men kiệt ñường và tạo thành tới 180 cồn Loài này có hình dáng

giống như Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces oviformics lên men ñược

glucose, fructose, mantose, saccarose, maltose và 1/3 rafinose, không lên men ñược

lactose, pentose ðiều khác nhau cơ bản của Saccharomyces oviformics với Saccharomyces vini là Saccharomyces oviformics không lên men ñược galactose và

men nổi lên bề mặt dịch lên men tạo thành màng

Hanseniaspora apiculate-Kloeckera apiculata: kích thước tương ñối nhỏ, có hình

ovan-elip hoặc hình quả chanh, tế bào có một ñầu nhỏ người ta thường gọi là men hình chùy Sinh sản bằng nảy chồi, rất phổ biến ở vỏ quả và nhiễm vào nước quả chiếm ñến 90% tổng số men khi bắt ñầu lên men Nó có thể lên men tạo thành 6- 70cồn, nhưng tạo ra một loạt các acid bay hơi cũng như các este của chúng làm cho

dịch có mùi tạp, nó còn kìm hãm các loài nấm men chính trong lên men, Kloeckera apiculata nhạy cảm với SO2 Trong nghề làm rượu vang người ta không mong muốn loài men này phát triển, nếu có thì chỉ cần có trong giai ñoạn ñầu tạo ñược 3 -

40 cồn

1.4.7 Yêu cầu ñối với chọn nấm men thuần chủng [5]

Các loài nấm men thuần khiết dùng nhiều trong sản xuất rượu vang thuộc giống

Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces oviformis Các chủng nấm men thuần

khiết này, có sự khác nhau về tốc ñộ sinh trưởng, khoảng nhiệt ñộ thích hợp ñể lên men, khả năng tạo cồn và chịu cồn, khả năng chịu ñược pH thấp cũng như khả năng kết lắng (tạo thành dạng bông hoặc dạng bụi) Những yêu cầu ñối với nấm men rượu vang là: có hoạt lực lên men cao ñối với nước quả, sử dụng ñường cho lên men gần như hoàn toàn, kết lắng tốt làm trong dịch rượu nhanh, tạo cho rượu hương vị thơm ngon tinh khiết, chịu ñược ñộ cồn cao, ñộ acid của môi trường cũng như các chất sát trùng

1.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước

1.5.1 Các nghiên cứu trong nước

“Nghiên cứu sản xuất rượu vang từ bưởi” của Phạm Trần Tố Như năm 2008 ñã khảo sát các chủng nấm men ñể tuyển chọn chủng nấm men tốt thích hợp cho quá trình lên men rượu vang bưởi, xác ñịnh các thông số tối ưu cho quá trình lên men rượu vang bưởi và khảo sát chế phẩm nấm men cố ñịnh trên cùi trắng vỏ bưởi

“Nghiên cứu quá trình sản xuất rượu vang thanh long và 1 số yếu tố ảnh hưởng

ñến chất lượng sản phẩm” của Trần Thị Thanh Thúy ñã xác ñịnh ñược qui trình lên

men rượu vang thích hợp cho thanh long, khảo sát sự sinh trưởng của ba loài nấm

men Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces oviformis, Saccharomyces vini,

nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng ñến chất lượng sản phẩm và tỉ lệ phối trộn giữa

2 chủng nấm men

“Tuyển chọn và cố ñịnh chủng vi khuẩn Oenococcus Oeni thích hợp cho lên

men Malolactic rượu vang dâu tằm” của Uông Nguyễn ðức Ninh, ñã tuyển chọn

chủng vi khuẩn Oenococcus Oeni và cố ñịnh chủng vi khuẩn này lên chất mang

Alginate Na 3% giúp cải thiện màu sắc và hương vị của rượu vang

Các ñề tài trên ña số ñã xác ñịnh ñược qui trình lên men rượu vang thích hợp cho từng loại trái cây, tuyển chọn ñược chủng nấm men thích hợp nhất cho quá trình lên

men, hay sự phối trộn giữa các chủng nấm men khác nhau nhằm làm tăng hiệu suất của quá trình lên men Hoặc thực hiện cố ñịnh nấm men trên chất mang như cùi trắng vỏ bưởi hay cố ñịnh vi khuẩn trên Alginate Na nhằm nâng cao hiệu quả lên men hoặc cải thiện chất lượng rượu vang sản phẩm Tuy nhiên chưa thấy có nghiên cứu nào ñề cập ñến việc xử lý nguồn nguyên liệu trái cây hỗn hợp nhằm tăng tính

ña dạng của sản phẩm rượu vang, hoặc việc cố ñịnh tế bào vi khuẩn trên chất mang

tạo gel cũng chưa hẳn là phương pháp tối ưu ñể cải thiện chất lượng rượu vang, vì phương pháp này chỉ thích hợp cho việc sản xuất những sản phẩm không qua hai quá trình lên men chính, phụ như rượu vang và chất mang tạo gel thường không tái

sử dụng lại ñược như chất mang là cellulose

Do ñó, ñề tài “Sản xuất rượu vang từ chanh dây và dâu tằm” ñược thực hiện với mục ñích thiết lập qui trình lên men rượu cho hỗn hợp nguyên liệu trái cây cũng như khảo sát khả năng sử dụng bã mía làm chất mang ñể cố ñịnh nấm men nhằm cải tiến qui trình sản xuất rượu vang

1.5.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Cố ñịnh các tế bào nấm men phát triển trong gel Carrageenan Gel hạt có chứa một số lượng nhỏ các tế bào ñược ủ trong môi trường ñầy ñủ dinh dưỡng Các tế bào ñã tăng trưởng rất tốt trong gel và số lượng tế bào sống trong mỗi ml của gel tăng lên ñến hơn 10 lần so với các tế bào tự do trong mỗi ml của môi trường nuôi cấy Sau khi phát triển trong các gel, các tế bào hình thành một lớp dày ñặc gần bề mặt gel và sản xuất số lượng lớn etanol Các ñiều kiện ñể sản xuất liên tục etanol bằng cách sử dụng các tế bào nấm men cố ñịnh ñang phát triển ñã ñược nghiên cứu Việc cung cấp chất dinh dưỡng thích hợp cho sự tăng trưởng của nấm men là cần thiết cho việc sản xuất liên tục Trong hoạt ñộng này, một trạng thái ổn ñịnh ñược duy trì ổn ñịnh lâu hơn 3 tháng Nồng ñộ cồn là 50 mg/ml và gần như 100% glucose

ñược chuyển ñổi thành etanol [29]

Y Kourkoutas a, M Douma a, A.A Koutinas a, M Kanellaki a, I.M Banat b,*,R Marchant b: làm rượu vang theo phương pháp lên men liên tục sử dụng tế bào nấm

men ựược cố ựịnh trên mộc qua tại nhiệt ựộ phòng và nhiệt ựộ thấp: những năm gần ựây, việc sử dụng các hệ thống tế bào cố ựịnh trong lên men rượu ựang ựược quan tâm nghiên cứu Phương pháp này ựem ựến một số lợi thế so với các phương pháp truyền thống sử dụng tế bào tự do như tăng hiệu suất và giảm chi phắ sản xuất.Trước ựây sử dụng chất mang là các vật liệu vô cơ hoặc alginate nhưng sau này các vật liệu trên ựược xem là không thắch hợp ựể làm rượu vang Và bã táo ựã

ựược sử dụng gần ựây như là một vật liệu hỗ trợ cho việc cố ựịnh Saccharomyces

cerevisiae sản xuất rượu, kết quả là cải thiện năng suất , hương thơm của sản phẩm

và hương vị [31]

Theo Mallios, P., Kourkoutas, Y., Iconomopoulou, M., Koutinas, A.A., Psarianos, C., Marchant, R and Banat I.M : lên men rượu nhiệt ựộ thấp bằng cách

sử dụng tế bào cố ựịnh trên miếng lê, các tế bào nấm men cố ựịnh ựã ựược ổn ựịnh

và hoạt ựộng ngay cả ở nhiệt ựộ thấp (<10 ồ C), rượu sản xuất theo lô lên men lúc

8oC ựã ựược hoàn thành trong vòng 15 ngày Rượu vang ựược sản xuất theo phương pháp này thì ethyl acetate ựạt 118mg/l góp phần tăng hương thơm của rượu vang sảnphẩm [28]

1.6 Nguyên liệu chanh dây dâu tằm

Dây mát hay chùm bao trứng, chanh dây, chanh leo, danh pháp khoa học là

Passiflora edulis là một loài dây leo thuộc họ Lạc tiên (Passifloraceae) Loài này có

nguồn gốc từ các nước Nam Mỹ (Argentina, Paraguay và Brazil) Loài cây này

ựược trồng ở khắp thế giới, ựặc biệt là Ấn độ, New Zealand, Sri Lanka, Mexico,

Nam Phi, PeruẦ[26]

Ở Việt Nam, chanh dây ựược trồng nhiều ở đà Lạt và các tỉnh có nhiệt ựộ không

khắ không quá nóng Khoảng hai năm trở lại ựây chanh dây ựược trồng phổ biến nhiều nơi, làm thức uống giải nhiệt rất tốt Nó cũng là một trong những loại trái cây rất có triển vọng trong tương lai ở ựồng bằng sông Cửu Long nhờ có khả năng chống chịu tốt trên vùng ựất chua phèn (khó trồng cây ăn trái), ựồng thời là loại nước giải khát tốt trong mùa nắng nóng của vùng nhiệt ựới gió mùa như ở vùng