Khảo sát thời điểm thích hợp lên men malolactic trong lên men rượu vang dâu tằm bằng chế phẩm oenococcus oeni cố định

Thực hiện việc nâng cao chất lượng rượu vang dâu tằm chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu thời điểm thích hợp lên men malolactic trong lên men rượu vang dâu tằm bằng chế phẩm vi khuẩn cố đị

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬNVĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng năm

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: TRẦN MỸ XINH Giới tính: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 02/02/1982 Nơi sinh: Cà Mau

Khoá (Năm trúng tuyển): 2008

1- TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát thời điểm thích hợp lên men malolactic trong lên men rượu

vang dâu tằm bằng chế phẩm Oenococcus oeni cố định

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

- Khảo sát thời điểm thích hợp bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni lên men malolactic

- Khảo sát thời gian lên men malolactic

- Cố định tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni lên phức chất mang Bacterial Cellulose –

Alginate

- Ứng dụng chế phẩm cố định lên men malolactic theo phương pháp chu kỳ

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: tháng 1 năm 2010

4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: tháng 07 năm 2010

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

(Họ tên và chữ ký)

Đã trải qua sáu tháng trong nghiên cứu và đạt được những thành quả như hôm nay ngoài sự cố gắng nổ lực của tôi còn nhờ biết bao sự giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và người thân Để tỏ lòng biết ơn sâu sắc đó:

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh, đặc biệt quý thầy cô trong Khoa Công nghệ hóa học và Bộ môn Công nghệ sinh học, đã tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn cô – Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hương đã luôn theo sát hướng dẫn, chỉ bảo, đồng thời đã tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian em thực hiện luận văn cũng như trong suốt quá trình em học tập tại trường Cô ơi! dù sau này em có về quê thì em vẫn luôn mãi nhớ cô Em chúc cô luôn khỏe mạnh và tràn đầy hạnh phúc

để em gái út noi theo

Cuối cùng, xin gửi đến tất cả những người thương yêu nhất của tôi – những người đã luôn sát cánh cùng tôi, giúp đỡ động viên tôi rất nhiều trong suốt thời gian tôi học tập cũng như trong quá trình tôi thực hiện luận văn – Lời cảm ơn chân thành nhất

Tp HCM, tháng 8 năm 2010

Lên men malolactic là quá trình chuyển hóa acid malic thành acid lactic làm góp phần biến đổi và cải thiện tính chất cảm quan của rượu vang dâu tằm Lên men malolactic có thể thực hiện nhờ các tế bào vi khuẩn tự do hoặc tế bào được cố định trong các chất mang

Thực hiện việc nâng cao chất lượng rượu vang dâu tằm chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu thời điểm thích hợp lên men malolactic trong lên men rượu vang dâu tằm bằng chế phẩm vi khuẩn cố định, đã thu được những kết quả sau:

- Xác định được thời điểm bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni là sau khi kết thúc

lên men chính (ngày thứ 7 của quá trình lên men rượu)

- Xác định được thời gian lên men malolactic tối ưu là 3 ngày

- Cố định được tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni O1 trên chất mang BC – A (Bacterial Cellulose – Alginate) với các thông số sau:

+ Mật độ tế bào Oenococcus oeni O1 đưa vào cố định: 109 tế bào/ml

+ Chế phẩm cố định thu được có mật độ vi khuẩn cố định được: 1.4 x 109 tế bào/g

Malolactic fermentation is metabolizing malic acid into lactic acid to help transform and improve the organoleptic properties of mulberry wine Malolactic fermentation can

be done by the free bacterial cells or cells is immobilized in the carrier Perform quality mulberry wine we have conducted research at the appropriate time malolactic fermentation in wine fermented mulberry by immobilization bacterial cell, has obtained the following results:

- Determine the time of additional bacteria Oenococcus oeni is the end of

fermentation (day 7 of fermentation liquor)

- Determine the malolactic fermentation time optimization is 3 days

- Immobilizing Oenococcus oeni O cell in BC - A (bacterial cellulose - Alginate) 1

compound with the following parameters:

+ Oenococcus oeni O cell densities into immobilizing:10 cfu/ml 1 9

+ Immobilized cell density: 1.4 x 10 cfu/g 9

+ Structures: smooth, soft, solid

- The effect of using Oenococcus oeni O cell, immobilized in BC - A compound, 1for malolactic fermentation (number of re-use) is 8 times but ensuring biological

activity as originally

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 GIỚI THIỆU VỀ DÂU TẰM 3

2.1.1 Nguồn gốc 3

2.1.2 Đặc điểm sinh học 3

2.1.3 Thành phần hóa học và ứng dụng 5

2.2 LÊN MEN RƯỢU 6

2.2.1 Giới thiệu chung về rượu vang 6

2.2.2 Cơ sở hóa sinh 6

2.2.3 Tác nhân vi sinh vật 7

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng 12

2.3 LÊN MEN MALOLACTIC 14

2.3.1 Giới thiệu chung 14

2.3.2 Vai trò của quá trình lên men malolactic 15

2.3.3 Các kiểu lên men malolactic 16

2.3.4 Tác nhân vi sinh vật 18

2.3.5 Ảnh hưởng của điều kiện công nghệ và môi trường đến quá trình lên men malolactic 22

2.4 KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT 25

2.4.1 Chất mang 25

2.4.2 Alginate 25

2.4.3 Bacterial Cellulose 27

2.4.4 Các phương pháp cố định tế bào 28

2 4.5 Ưu nhược điểm của vi sinh vật cố định so với vi sinh vật tự do 30

2.5 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC LIÊN QUAN ĐẾN HƯỚNG CỦA ĐỀ TÀI 32

3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 36

3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 37

3.2.3 Phương pháp phân tích thí nghiệm 39

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 43

4.1 KIỂM TRA GIỐNG VI SINH VẬT 43

4.1.1 Saccharomyces cerevisiae 43

4.1.2 Oenococcus oeni 44

4.2 KHẢO SÁT THỜI ĐIỂM BỔ SUNG OENOCOCCUS OENI LÊN MEN MALOLACTIC 47

4.3 KHẢO SÁT THỜI GIAN LÊN MEN MALOLACTIC 55

4.4 CỐ ĐỊNH TẾ BÀO OENOCOCCUS OENI O1 TRÊN CHẤT MANG BC – A NHẰM KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALOLACTIC THEO CHU KỲ 56

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 61

5.1 KẾT LUẬN 61

5.2 KIẾN NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của quả dâu tằm 5

Bảng 2.2 Thành phần vitamin trong quả dâu tằm 5

Bảng 2.3 Tỉ lệ M/G của acid alginic từ một số loài rong nâu 27

Bảng 3.1 Thành phần môi trường MLA 34

Bảng 3.2 Thành phần môi trường Hansen 35

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian lên men malolactic 38

Bảng 4.1 Biến đổi pH theo thời gian của các mẫu bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau 48

Bảng 4.2 Biến đổi hàm lượng chất khô theo thời gian của các mẫu bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau 49

Bảng 4.3 Biến đổi hàm lượng đường tổng theo thời gian của các mẫu bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau 51

Bảng 4.4 Biến đổi nồng độ cồn theo thời gian của các mẫu bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau 52

Bảng 4.5 Biến đổi acid malic và acid lactic sau 10 ngày lên men của các mẫu khảo sát 53

Bảng 4.6 Biến đổi acid malic và acid lactic theo thời gian lên men malolactic 55

Bảng 4.7 Các thông số của dịch dâu tằm thí nghiệm 58

Bảng 4.8 Sự biến động hàm lượng acid malic và acid lactic sau mỗi chu kỳ lên men malolactic 59

Hình 2.1 Quả dâu tằm Morus nigra L lúc chín 3

Hình 2.2 Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae 8

Hình 2.3 Vi khuẩn Oenococcus oeni 19

Hình 2.4 Vi khuẩn Lactobacillus 20

Hình 2.5 Vi khuẩn Pediococcus 21

Hình 2.6 Vi khuẩn Leuconostoc oenos 21

Hình 2.7 Công thức cấu tạo của acid alginic 26

Hình 2.8 Cấu trúc cellulose vi khuẩn 27

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát của đề tài 36

Hình 4.1 Saccharomyces cerevisiae 43

Hình 4.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni O1 sử dụng trong nghiên cứu 45

Hình 4.3 Chế phẩm cố định tế bào Oenococcus oeni O1 trên phức chất mang BC – A 57

Biểu đồ 4.2 Biến đổi hàm lượng chất khô theo thời gian của các mẫu

khảo sát 50

Biểu đồ 4.3 Biến đổi hàm lượng đường tổng theo thời gian của các mẫu khảo sát 51

Biểu đồ 4.4 Biến đổi nồng độ cồn theo thời gian của các mẫu khảo sát 52

Biểu đồ 4.5 Biến đổi acid malic và acid lactic sau 10 ngày lên men của các mẫu khảo sát 54

Biểu đồ 4.6 Biến đổi hàm lượng acid malic và acid lactic trong mỗi chu kỳ khảo sát và mẫu đối chứng 60

Đồ thị 4.1 Đường cong sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae 44

Đồ thị 4.2 Đường chuẩn của Oenococcus oeni O1 46

Đồ thị 4.3 Đường cong sinh trưởng Oenococcus oeni O1 46

Đồ thị 4.4 Biến đổi acid malic và acid lactic theo thời gian lên men malolactic 55

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Nước ta có tiềm năng rất lớn trong ngành sản xuất rượu vang trên cả hai phương diện: nguồn nguyên liệu và nhu cầu tiêu thụ của thị trường Việt nam là nước có khí hậu nhiệt đới, có nhiều chủng loại quả phong phú quanh năm với sản lượng lớn, giá thành rẻ Xu hướng gần đây vang đã trở thành một loại đồ uống khá thông dụng.Công nghệ sản xuất rượu vang thường trải qua hai giai đoạn lên men:

- Giai đoạn lên men rượu: Lên men tạo độ cồn thích hợp nhờ hoạt động của nấm men

- Giai đoạn lên men malolactic: Lên men malolactic bởi Oenococcus oeni là

quá trình decarboxyl hoá L-malat thành L-lactat và CO2, làm giảm độ acid của vang Quá trình lên men malolactic là quá trình xảy ra sau giai đoạn lên men rượu, góp phần biến đổi và cải thiện các tính chất cảm quan của rượu vang Trong giai đoạn này,

Oenococcus oeni tạo ra các hợp chất thơm như diacetyl, acetoin, acetone, các

este…góp phần tạo hương cho sản phẩm Tác động của vi khuẩn Oenococcus oeni đến

các hợp chất phenol còn cải thiện màu sắc và vị của rượu vang Sự có mặt của quá trình lên men malolactic còn hạn chế vi sinh vật tạp nhiễm bởi các hợp chất kháng khuẩn

của Oenococcus oeni [6]

Có thể nói chất lượng của rượu được cải thiện rất nhiều vào giai đoạn lên men malolactic

Ở Việt Nam hầu hết các cơ sở sản xuất vang chưa thực hiện giai đoạn thứ hai, quá trình lên men phụ chủ yếu là để kết lắng nấm men làm trong rượu vang mà không có giai đoạn lên men malolactic, do vậy chất lượng rượu bị hạn chế đáng kể nhất là với các loại quả có chứa hàm lượng acid malic cao

Kỹ thuật cố định tế bào đang được đề cập và quan tâm nhiều, đặc biệt trong các lĩnh vực lên men Tế bào cố định có nhiều ưu điểm so với việc sử dụng tế bào tự do như: tế bào sau khi được cố định có thể sử dụng được nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng theo ý muốn

Nhằm mục đích nâng cao chất lượng rượu vang dâu tằm, đồng thời ứng dụng những

thành tựu khoa học - kỹ thuật mới vào sản xuất rượu vang dâu tằm, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài: “Khảo sát thời điểm thích hợp lên men malolactic trong lên men

rượu vang dâu tằm bằng chế phẩm Oenococcus oeni cố định”

Nội dung chính của đề tài:

1 Khảo sát thời điểm thích hợp bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni lên men

malolactic

2 Khảo sát thời gian lên men malolactic

3 Cố định tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni lên phức chất mang Bacterial

cellulose – Alginate

4 Ứng dụng chế phẩm cố định lên men malolactic theo phương pháp chu kỳ

Giới hạn của đề tài:

Các nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU VỀ DÂU TẰM

2.1.1 Nguồn gốc

Cây dâu tằm có tên chung là mulberry, chúng có nhiều giống khác nhau như: White

mulberry (Murus alba L.), Black mulberry (M nigra L.), American mulberry, Red mulberry (M rubra L.) Chúng có họ hàng gần với giống Korean mulberry (Morus

australis), Himalayan mulberry (M laevigata)

Murus alba L có nguồn gốc từ miền đông và miền trung của Trung Quốc Murus alba L chịu được điều kiện khô hạn, ô nhiễm và đất bạc màu Murus alba L còn được

lai với giống M rubra L có sẵn ở bản địa M rubra L có nguồn gốc từ miền đông nước Mỹ M nigra L có nguồn gốc từ châu Á và được trồng ở châu Âu để lấy quả từ trước thời kì La Mã cổ đại M nigra L cần có điều kiện thuận lợi chúng mới phát triển

tốt, chúng phát triển chậm trong điều kiện khí hậu lạnh hay nóng ẩm [8]

Hình 2.1 Quả dâu tằm Morus nigra L lúc chín [46]

2.1.2 Đặc điểm sinh học

• Quá trình sinh trưởng và phát triển :

Cây dâu tằm thuộc loại cây rụng lá theo mùa Murus alba L có thể cao đến 80ft,

thường phát triển theo dạng hình chóp hay dạng tán Trong điều kiện đất đai màu mỡ

thì M rubra L có thể cao 70ft M nigra L là giống thấp nhất trong ba giống dâu tằm, chúng chỉ cao khoảng 30ft Các loại dâu tằm có tuổi thọ rất khác nhau: giống M rubra

L có thể sống trên 75 năm, còn hai giống còn lại sống trên trăm năm

• Hình thái :

Morus alba L có tên là White mulberry không những do chồi nụ có màu trắng mà còn

do màu sắc của quả Mức độ dày mỏng và xanh sáng của lá trên cây phụ thuộc từng vị

trí của chúng trên cây, tầng lá trên ngọn thường có màu sáng và mỏng hơn Morus

rubra L có lá lớn và dày hơn so với M alba L., bề mặt của lá nhám và có lông tơ bên

dưới Morus nigra L có lá tương tự như của M rubra L nhưng nhỏ hơn, cành non thì

cứng cáp hơn, chồi cũng lớn hơn Các loài dâu có thời gian rụng lá nhất định trong năm

và thời gian rụng lá cũng khác nhau đối với từng loài M alba L rụng lá vào đầu mùa xuân còn M nigra L., M rubra L rụng lá sau đó hai tháng

• Hoa :

Dâu tằm vừa là cây đơn tính vừa là cây lưỡng tính Hoa nhỏ, rũ xuống và rất khó nhận

ra, chúng thường ra hoa từ nách lá của nhánh non đang phát triển và trên phần chồi non của nhánh già Chúng thụ phấn nhờ gió và một số phương pháp tự nhiên mà không cần thiết tới sự giao phấn

• Quả

Dâu tằm có quả không phải hoàn toàn giống quả mọng mà chỉ một tập hợp quả bề ngoài tương tự quả mâm xôi Khi hoa đã được thụ phấn chúng bắt đầu phình to, cuối cùng chúng thay đổi hoàn toàn kết cấu, màu sắc và trở nên mọng, nhiều nước Màu sắc

của quả không đồng nhất hóa với giống dâu, chẳng hạn như: Morus alba L có thể cho quả màu trắng, xanh nhạt hơi phai đỏ hoặc đen Nhìn chung Morus alba L thường cho quả ngọt nhưng lại thiếu vị chua cần thiết Morus rubra L cho quả màu đỏ thẫm gần

như màu đen Morus nigra L cho quả lớn, nhiều nước với sự kết hợp hài hòa giữa vị

ngọt và chua làm cho chúng có hương vị thơm ngon nhất trong các loài dâu tằm

• Thu hoạch :

Morus alba L và Morus rubra L thường được thu hoạch cuối mùa xuân Morus nigra L chín vào đầu cho đến cuối mùa hè Morus alba L thu hoạch bằng cách trải

một tấm vải lớn dưới gốc cây và rung mạnh cành cây Morus nigra L khó thu hoạch

hơn vì giống như những quả mọng nước khác chúng sẽ bị dập nát nếu bị nén ép Nếu không rửa thì dâu tằm có thể giữ được vài ngày dưới điều kiện lạnh Quả dâu có thể ăn

tươi hay làm bánh, siro, đặc biệt giống Morus nigra L còn có thể làm rượu vang

2.1.3 Thành phần hóa học và ứng dụng

• Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của quả phụ thuộc rất nhiều vào nhiều yếu tố như: giống, điều

kiện trồng trọt, thời tiết… Dưới đây là thành phần trung bình của giống Morus nigra L

trong điều kiện trồng trọt bình thường

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của quả dâu tằm

[8] Ngoài ra, trong quả dâu chứa một lượng vitamin tương đối lớn, thành phần vitamin của quả dâu như sau (tính trong 100g)

Bảng 2.2 Thành phần vitamin trong quả dâu tằm

Vitamin A Thiamine Riboflavin Nicotinic Ascorbic acid

[8] Ngoài ra, còn có một số thành phần vi lượng khác Các thành phần cần thiết cho ấu trùng tằm như: citral, linalyl acetate, linalol, terpinyl acetate, hexenol, β-sitosterol

• Ứng dụng:

Theo Hartwell quả dâu tằm có thể dùng làm thuốc để chữa trị bệnh u bướu, gián tiếp giải độc, chống viêm, chống ho, nghiện rượu, thuốc diệt nấm, thuốc nhuận tràng, thuốc

bổ thần kinh, thuốc xổ, giảm sốt, hồi phục sức khỏe, thuốc giảm đau, thuốc bổ, thuốc

diệt giun Ngoài ra, quả của Morus alba L còn có thể trị bệnh aphtha, bệnh armache,

hen suyễn, viêm phế quản, bệnh bugbite, cachexia, cảm lạnh, táo bón, ho, chống suy nhược cơ thể, chống được cả bệnh phù, chứng khó tiêu, động kinh, nhức đầu, tăng huyết áp, mất ngủ (Reed, 1976)

2.2 LÊN MEN RƯỢU

2.2.1 Giới thiệu chung về rượu vang

Rượu vang là loại đồ uống lên men trực tiếp từ dịch quả Khi quá trình lên men kết thúc, người ta không chưng cất mà để lắng trong tự nhiên, gạn lọc và hoàn thành sản phẩm Rượu vang vốn có nguồn gốc từ quả nho và được gọi là “wine”, ngày nay, người

ta mở rộng ý nghĩa của rượu vang là rượu không qua chưng cất có nguồn gốc từ các loại quả [18]

2.2.2 Cơ sở hóa sinh

Mục đích của quá trình lên men là chuyển hóa đường thành rượu theo phương trình tổng quát sau:

C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 + 27 Kcal

• Giai đoạn 1 (giai đoạn đường phân): Qua một loạt các chuỗi phản ứng phức tạp với sự tham gia của hệ thống nhiều enzyme, một phân tử glucose ban đầu sẽ chuyển hóa thành hai phân tử axít pyruvic

Glucose Acid pyruvic

• Giai đoạn 2 (Acid pyruvic bị decarboxyl hóa):

– CO2

Pyruvat – decarboxylase

Acid pyruvic Acetaldehyde

• Giai đoạn 3: Acetaldehyde tiếp tục nhận H2 từ NAD – H2 tạo thành etanol [20]

2.2.3.1 Hình thái tế bào nấm men

Tế bào nấm men có hình cầu, hình ovan hay hình ellip … Nấm men có thể thay đổi hình dáng trong giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường xung quanh

Kích thước tế bào nấm men tương đối lớn, đường kính khoảng 1μm, chiều dài khoảng 8μm Với kích thước này, ta có thể ước tính bề mặt của tế bào nấm men trong một lít dịch lên men vào khoảng 10m2 và do vậy cường độ trao đổi chất của tế bào nấm men với môi trường xung quanh là vô cùng lớn [1, 18]

Hình 2.2 Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [47]

2.2.3.2 Cấu tạo tế bào nấm men

Nấm men là sinh vật đơn bào hiển vi, về cơ bản cũng giống như ở tế bào thực vật

động vật

- Vỏ tế bào: Bao quanh tế bào là một lớp màng mỏng dày đặc, mềm mại, có thể đàn

hồi để định hình cũng như bảo vệ chống lại các chất độc Vỏ tế bào có mang điện, giữ

áp suất thẩm thấu nội bào, điều chỉnh các chất dinh dưỡng (các chất có phân tử lượng

thấp và các muối khoáng) đi qua tế bào Thành tế bào dày khoảng 25 nm, chiếm

khoảng 25% khối lượng tế bào, chủ yếu là phức chất protein – polysaccharide,

phosphate và lipid

Trong thành phần polysaccharide chứa chủ yếu là glucan và mannan (chiếm 90%),

glucan là một polyme phức tạp từ các tiểu phần glucose Mặc dù có cấu trúc không

gian nhưng phần lớn glucan nằm ở phía trong của vỏ và tiếp xúc với màng tế bào chất,

đây là thành phần chính cấu tạo nên vỏ tế bào, nếu thành phần này bị phá hỏng thì tế

bào bị phá vỡ hoàn toàn Mannan là polyme của đường mannanose, chủ yếu nằm ở

phần vỏ nhưng lại không phải là thành phần quyết định của vỏ tế bào, nếu phần

mannan này bị phá hủy thì hình dáng tế bào không đổi

- Màng tế bào chất: Màng tế bào chất được bao xung quanh tế bào, chiều dày không

quá 0.1nm, dính chặt với tế bào chất Có thể quan sát và nhìn thấy màng này dưới kính

hiển vi trường tối: màng là lớp viền sáng rất mỏng quanh tế bào chất

Màng tế bào chất có các chức năng cơ bản sau: Tác dụng như rào chắn thẩm thấu, điều chỉnh chất dinh dưỡng từ môi trường vào trong tế bào và ngược lại cho sản phẩm trao đổi chất đi ra ngoài; Thực hiện sinh tổng hợp một số hợp phần của tế bào; Nơi cư trú của một số enzyme và cơ quan tử của tế bào (như là ribosome)

Để vận chuyển chất qua màng thì liên quan đến tính thấm của màng, đặc tính này phụ thuộc vào các enzyme phospholipase và lipase

- Tế bào chất: Là hệ keo được cấu tạo từ protein, hydrocacbon, lipid, chất khoáng,

nước và các hợp chất khác Nước chiếm 90% ở dạng tự do dùng để hòa tan các chất trước khi tham gia vào các phản ứng trao đổi chất và dạng liên kết Tế bào chất có độ nhớt cao tương ứng với syrup hay glycerin, khi tế bào già, độ nhớt giảm xuống Trong

tế bào chất chứa đầy đủ các cơ quan tử của tế bào: ti thể, nhân, khoảng không bào, các hạt chất dự trữ dạng tinh bột, dạng chất béo, mạng lưới nội chất, các thể vùi khác … Cấu trúc tế bào chất thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và tuổi sinh trưởng của

tế bào Sự thay đổi có thể thuận nghịch hoặc không thuận nghịch là do mức độ tác động của các yếu tố bên ngoài Các tế bào trẻ có nguyên sinh chất đồng nhất, khi già, xuất hiện thêm không bào, các giọt chất béo, hạt pholyphosphat và lipid, tế bào trở nên không đồng nhất

Ngoài ra, trong tế bào chất còn có nhiều enzyme tham gia vào tất cả các phản ứng hóa sinh

- Ti thể: Có thể nhìn thấy ở giai đoạn sinh trưởng của tế bào, chiều dài 0.2 – 7.5 μm,

hình dáng có thể thay đổi trong quá trình nuôi cấy, bình thường trong tế bào, số lượng

ti thể từ 1 – 50 Trong ti thể có chứa nhiều enzyme giúp thực hiện các phản ứng quan trọng của cơ thể như: quá trình phosphoryl hóa có oxy tham gia để cung cấp năng lượng và vật liệu tham gia vào cơ chế tái tạo DNA, phiên mã, dịch mã …, các phản ứng của chu trình Krebs … Như vậy, các phản ứng quan trọng của cơ thể đều xảy ra trong ti thể

Ti thể có cấu tạo gồm 30% chất béo, 60 – 70 % là protein trong đó khoảng 25 – 75% là protein cấu trúc

- Mạng lưới nội chất: Trong tế bào chất còn chứa một hệ thống màng hai lớp, được

gọi là mạng lưới nội chất bao gồm hàng dãy màng kép có gai cong dày Một số màng

- Nhân: Nhân tế bào có màng vỏ, chất nhân và hạch nhân, đường kính của nhân

khoảng 2 µm, có dạng hình cầu hoặc ellipse Đây là nơi chứa bộ máy di truyền của nấm men, xảy ra quá trình phiên mã và sao chép DNA

- Không bào: Không bào là cơ quan nội bào có dạng hốc, bên trong chứa đầy dịch

bào và được tách ra từ tế bào chất thành màng không bào, hình dạng không bào thay đổi liên tục, dịch chuyển và tiếp xúc với tế bào chất Trong không bào, ngoài các chất điện ly hòa tan trong nước còn có các hợp chất keo như protein, chất béo, hydrocarbon

và enzyme Ngoài ra, trong dịch bào còn có chứa: K, Na, Ca, Mg, Cl, SO42-, PO43-…

- Chất dự trữ và thể vùi: Chất dự trữ và thể vùi là những hạt glycogen (gần giống

với hạt tinh bột), các hạt chất béo, hạt lưu huỳnh tích tụ, hạt acid, đường tinh thể tích

tụ, các hạt này thường ở dạng không hoạt động và không tan trong nước [1, 18]

2.2.3.3 Sinh sản của nấm men

Nấm men có hai hình thức sinh sản: hữu tính (bằng bào tử) và vô tính (bằng nảy chồi hoặc phân cắt tế bào) Tùy vào điều kiện nuôi cấy tế bào mà nấm men sẽ sinh sản theo kiểu vô tính hay hữu tính

- Sinh sản vô tính: Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi hoặc phân chia tế bào Các

tế bào mẹ không chuyển trực tiếp các vật liệu vỏ sang tế bào con mà ở chổ các mấu

chồi sẽ tổng hợp các vật liệu vỏ tế bào và tích tụ ở đây để chuyển sang cho tế bào con Chỗ mấu chồi là các sẹo thường ở đầu cong nhất của tế bào (ở đó có thể là tròn hoặc xoắn)

- Sinh sản hữu tính: Sinh sản hữu tính liên quan đến sự tạo thành bào tử nang Bào

tử nang được tạo thành là kết quả của sự giao hợp hai tế bào có tính đực và cái, sau đó phân chia nhân đã thụ thành hợp tử Sinh sản hữu tính xảy ra khi nấm men bị chuyển đột ngột sang môi trường nghèo chất dinh dưỡng nhưng vẫn đủ oxi [18]

2.2.3.4 Sinh trưởng của nấm men

- Pha lag: Là giai đoạn nấm men vừa mới được cấy vào môi trường còn chưa sinh

sản, nấm men còn làm quen với môi trường mới Tế bào có kích thước tăng đáng kể, hàm lượng các chất protein, axít nucleic đều tăng, các enzyme được tổng hợp mạnh

mẽ, nhưng số lượng tế bào không tăng hoặc tăng rất ít

- Pha log: Số lượng tế bào tăng mạnh Kích thước trung bình của S cerevisae giai

đoạn này là nhỏ nhất vì chúng còn phải nảy chồi từ nguồn tế bào chất và vỏ tế bào Nếu trong một thể tích môi trường lúc đầu có X0 tế bào thì sau n lần phân chia số tế bào là:

X = X0 2n Logarit phương trình sẽ có: LgX = Lg X0 + n Lg2

Suy ra số lần phân chia thế hệ: n = (LgX – LgX0) /Lg2

Số lần chia trong 1 giờ hay hằng số tốc độ phân chia là:

V= n/t = (lgX – lgX0)/lg2(t – t0) Thời gian thế hệ là thời gian cần cho một chu kỳ phân chia của một lứa:

g = 1/n = 1/V t: thời điểm xác định

t0: thời điểm ban đầu

X: nồng độ nấm men ở thời điểm xác định

X0: nồng độ nấm men ở thời điểm ban đầu

V: số lần phân chia trong 1 giờ

g: thời gian thế hệ, cần cho 1 lứa (chu kỳ phân chia)

- Pha ổn định: Mật độ quần thể là tối đa Số lượng tế bào sinh ra bằng số lượng tế

bào chết đi

- Pha suy vong: Số tế bào chết tăng dần và số tế bào sống giảm dần, các tế bào sống

già đi, kích thước nhỏ lại, biến dạng Nguyên nhân là do trong môi trường cạn kiệt nguồn dinh dưỡng, đồng thời có sự tích tụ các chất ức chế sự phát triển của nấm men [18]

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng

2.2.4.1 Nhiệt độ

Đối với nấm men Saccharomyces cerevisiae thích hợp lên men ở nhiệt độ tối ưu là

28 – 320C Nếu lên men ở nhiệt độ thấp 20 – 220C, thời gian lên men sẽ kéo dài Tuy nhiên, nhiệt độ này sẽ hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn Ở nhiệt độ 33 – 350C, hoạt tính của nấm men sẽ giảm và điều kiện thuận lợi để vi khuẩn, nấm men hoang dại phát triển mạnh Ở nhiệt độ 300C, nấm men hoang dại phát triển mạnh hơn nấm men

S.cerevisiae 2 – 3 lần, còn ở nhiệt độ 35 – 380C chúng phát triển nhanh gấp 6 – 8 lần Mặt khác, khi lên men rượu ở nhiệt độ cao sản phẩm sẽ tạo ra nhiều este, aldehyt,

CO2…Ở 400C, phần lớn nấm men sẽ ngừng sinh trưởng [19]

2.2.4.2 pH

Nồng độ ion H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất tham gia cấu tạo màng tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men Mỗi vi sinh vật chỉ hoạt động trong một trạng thái ion nhất định, trạng thái này phụ thuộc vào pH của môi trường

Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo thành ethanol là 4.5 – 5.0 Nếu tăng pH thì rất dễ bị nhiễm khuẩn, glycerin sẽ tạo ra nhiều hơn, do đó sẽ làm giảm hiệu suất lên

men Khi pH < 4.2 nấm men tuy phát triển chậm hơn so với pH ở 4.5 – 5.0 nhưng tạp khuẩn hầu như không phát triển

Khi nấm men đã phát triển nhanh và đủ mạnh, ta tăng pH đến giá trị tối ưu cho nấm men phát triển về điều kiện tối ưu Lúc này, điều kiện cũng tốt hơn cho các tạp khuẩn phát triển nhưng vì nấm men có lợi thế về số lượng nên lấn át được hơn so với các vi sinh vật tạp khuẩn khác nên không gây hại gì cho quá trình lên men [19]

2.2.4.3 Ảnh hưởng của hàm lượng chất khô ban đầu trong dịch lên men

Thông thường khi hàm lượng chất khô ban đầu quá cao, hiệu suất lên men không cao Khi nồng độ đường trong dịch lên men đạt 30 – 35% thì quá trình lên men dường như bị ngừng lại, còn ở nồng độ 25 – 30% thì nấm men phát triển rất chậm Nồng độ tối thích cho nấm men phát triển là 10 – 18% đường Dung dịch có nồng độ đường cao

sẽ gây ra một áp suất thẩm thấu lớn, làm mất cân bằng trạng thái sinh lí bình thường của nấm men, thời gian lên men sẽ kéo dài nấm men sẽ không sử dụng hết đường, đồng thời lượng rượu tạo thành nhiều sẽ ức chế hoạt động của nấm men Nhưng nếu lượng đường thấp thì nấm men sẽ phát triển rất chậm vì chúng hoạt động trong môi trường bị thiếu dinh dưỡng [18]

2.2.4.4 Ảnh hưởng của nồng độ rượu ethanol

Rượu được tích tụ dần trong quá trình lên men và chính nó lại là chất độc, kìm hãm

sự sinh sản cũng như khả năng lên men của nấm men Ở nồng độ 2 – 5% rượu đã có khả năng ức chế nấm men, ở 5 – 6% rượu làm nấm men đình chỉ sinh sản, mặc dù quá trình lên men vẫn tiếp tục diễn ra Mặt khác, khi lên men rượu, sản phẩm tạo thành còn

có CO2 Khí CO2 có thể ức chế lên men, nhưng cũng kích thích quá trình lên men vì chúng làm môi trường lên men được khuấy động liên tục, nấm men luôn ở trạng thái lơ lửng, giúp rút ngắn quá trình lên men [18]

2.3 LÊN MEN MALOLACTIC

2.3.1 Giới thiệu chung

Lên men malolactic là quá trình chuyển L – malic acid (chứa 2 nhóm carboxyl trong phân tử) có trong dịch quả thành L – lactic acid hoặc D – lactic acid (chỉ chứa 1 nhóm

carboxyl) và carbon dioxide được thực hiện nhờ vi khuẩn lactic gồm: Lactobacillus,

Oenococcus, Leuconostoc, Pediococcus. Thực chất đây là một quá trình dị hóa malic

acid, trong đó L – malic acid được decarboxyl hóa thành L – lactic acid bởi sự xúc tác

của enzyme malate carboxylase [31, 33]

Quá trình này xảy ra bên trong tế bào vi sinh vật theo phản ứng sau:

Malate carboxylase

COOHCH2CH(OH)COOH CH3CH(OH)COOH + CO2

Acid malic Acid lactic

Đây là một phản ứng hóa sinh có sự tham gia của một enzyme, xúc tác cho phản ứng tách nhóm CO2 của cơ chất là acid malic thành acid lactic [34]

Trong quá trình lên men malolactic, vi khuẩn lactic có thể chuyển hóa acid malic theo các con đường:

- Chuyển hóa trực tiếp L – acid malic thành L – acid lactic và carbon dioxide nhờ

enzyme malate carboxylase Cơ chế này có mặt ở hầu hết các vi khuẩn malolactic

- Phân giải acid malic nhờ xúc tác của hệ enzyme “enzymemallic” thành oxaloacetate

và tiếp tục thành acid pyruvic và CO2 L – lactate dehydrogenase, sẽ xúc tác cho phản ứng khử acid pyruvic thành L – acid lactic Cơ chế này được tìm thấy ở Lactobacillus

casei và Lactobacillus faecalis

- Vi khuẩn Lactobacillus fermentum có khả năng chuyển hóa L – acid malic thành acid lactic ở cả hai dạng đồng phân L – và D – Ngoài ra, còn một số sản phẩm trao đổi

chất trung gian như: acetate, succinate và carbon dioxide [37]

2.3.2 Vai trò của quá trình lên men malolactic

2.3.2.1 Làm giảm độ acid của dịch vang sau lên men

Về mặt hóa học, quá trình lên men malolactic làm cho pH môi trường giảm xuống

từ 0.1 đến 0.3 đơn vị và làm giảm độ acid tổng xuống khoảng 0.01 đến 0.03 g/l (tính theo acid tartaric) vì acid malic có chứa 2 nhóm – COOH khi chuyển thành acid lactic chỉ chứa 1 nhóm – COOH Tuy nhiên, không phải tất cả acid malic đều chuyển thành acid lactic mà chỉ có 2/3 trong số đó, lượng còn lại bị phân giải hoặc oxy hóa thành

CO2 và thoát ra ngoài [25]

2.3.2.2.Điều chỉnh hương vị

Sự chuyển hóa acid malic thành acid lactic thường đi kèm quá trình lên men các loại đường còn lại tạo nhiều sản phẩm là những hợp chất dễ bay hơi như: acetaldehyt, diacetyl, acetoin, acid acetic và các rượu bậc cao … Các hợp chất này tạo nên hương vị đặc trưng góp phần làm tăng giá trị cho vang thành phẩm [11]

2.3.2.2 Làm ổn định về mặt vi sinh

Về mặt bảo quản, quá trình lên men malolactic góp phần làm ổn định chất lượng cảm quan của vang, vì quá trình lên men malolactic có khả năng ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật khác Sự ức chế này được giải thích bởi nguyên nhân:

- Một số vi khuẩn không mong muốn có khả năng sử dụng acid malic làm nguồn dinh dưỡng Vì thế lên men malolactic làm giảm nguồn acid malic sẽ ức chế được những vi sinh vật không mong muốn này

- Điều kiện pH thấp, nồng độ cồn cao là điều kiện cực đoan Một số vi sinh vật cực đoan có thể phát triển trong điều kiện này Sự có mặt của quá trình lên men malolactic tạo thế cạnh tranh ức chế các nhóm vi sinh vật cực đoan khác khi ta đưa một lượng giống vi sinh vật thực hiện lên men malolactic

- Một số vi khuẩn malolactic có khả năng sinh ra độc tố có thể ức chế các vi sinh vật

có hại mà không gây ảnh hưởng đến vang và không có hại cho sức khỏe của con người [25]

2.3.3 Các kiểu lên men malolactic

2.3.3.1 Lên men tự nhiên

Sản xuất vang theo phương pháp truyền thống thì lên men malolactic diễn ra tự phát trong suốt quá trình bảo quản vang non, có thể kéo dài vài tháng hoặc nhiều năm

Vi khuẩn lên men malolactic phần lớn là những vi khuẩn có nguồn gốc trên vỏ quả, trong dịch quả, hoặc ở thùng gỗ thùng lên men [33]

Tuy nhiên trong công nghệ sản xuất vang hiện đại với quá trình chế biến sạch hơn

và thời gian ủ cần giảm tối thiểu thì quá trình lên men như trên được xem như quá

chậm và không đủ độ tin cậy Oenococcus oeni sinh trưởng chậm và đôi khi không

phát triển ở vang có pH khoảng 3.0 – 3.8, độ cồn 10 – 14%V; 10 – 100ppm SO2 và hàm lượng đường sót thấp Trong lên men malolactic tự phát ngoài tác nhân là vi

khuẩn Oenococcus oeni còn rất nhiều vi khuẩn lactic khác nên luôn có những rủi ro có

thể xảy ra do việc trao đổi chất không hoàn toàn của acid malic có thể làm cho sản phẩm có mùi lạ hoặc sẽ hình thành các amin do vi khuẩn lactic decarboxyl hóa các

amino acid Đặc biệt Pediococcus được coi là yếu tố quan trọng nhất tạo ra histamine

[26, 38, 40, 42]

Lên men tự nhiên cũng có nhiều ưu điểm: thuận lợi và không đắt tiền, nó vẫn được

áp dụng khá rộng rãi ở Pháp Thành phần vang và điều kiện môi trường đã thúc đẩy sự

sinh trưởng của Oenococcus oeni có mặt tự nhiên trong vang vùng Bordeaux của Pháp,

ở đây thông thường quá trình lên men malolactic tự nhiên xảy ra trong vòng 1 – 4 tuần sau khi quá trình lên men rượu kết thúc Thành phần và điều kiện khi đó bao gồm: SO2tổng thấp (40 – 50 mg/l), duy trì pH của vang luôn hơn 3.2 – 3.3, duy trì nhiệt độ của vang khoảng 16 – 250C Tuy nhiên, những biện pháp để thúc đẩy sự sinh trưởng của vi khuẩn tự nhiên lên men malolactic thành công hoàn toàn không phải luôn xảy ra và các phương pháp khác để thúc đẩy lên men malolactic trở nên cần thiết [25, 31, 33, 36] Như vậy lên men malolactic tự nhiên có rất nhiều nhược điểm như: khó khởi động, quá trình diễn ra chậm, khó kiểm soát được các chủng vi khuẩn tham gia vào quá trình

dẫn đến việc tạo ra các sản phẩm phụ không mong muốn…Để khắc phục tình trạng

này, người ta thường áp dụng phương pháp chủ động đưa vi khuẩn Oenococcus oeni

thuần chủng vào môi trường để thực hiện lên men malolactic [33]

2.3.3.2 Lên men một giai đoạn

Lên men một giai đoạn có nghĩa là cấy nấm men và vi khuẩn đồng thời trong quá trình lên men rượu Phương pháp này có những ưu và nhược điểm sau:

- Ưu điểm:

+ Vi khuẩn sẽ có điều kiện sinh trưởng tốt hơn trong môi trường có nồng độ cồn thấp ban đầu Khi hàm lượng cồn tăng dần trong quá trình lên men rượu, vi khuẩn sẽ thích nghi dần trước khi gặp môi trường cồn cao

+ Môi trường ban đầu còn giàu chất dinh dưỡng, thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

+ Nuôi cấy hỗn hợp còn tạo điều kiện cho sự lên men malolactic xảy ra đồng thời với lên men rượu, giúp rút ngắn thời gian lên men

2.3.3.3 Lên men hai giai đoạn tách riêng

Lên men hai giai đoạn tách riêng là tiến hành quá trình lên men rượu và lên men malolactic riêng biệt Sau khi lên men rượu bởi nấm men kết thúc đưa vi khuẩn vào thực hiện lên men malolactic

- Ưu điểm:

+ Có thể điều chỉnh dễ dàng các yếu tố môi trường thích hợp cho từng loài vi sinh vật, rút ngắn thời gian lên men

+ Không ảnh hưởng đến hiệu suất lên men cồn

+ Cuối quá trình lên men do nồng độ đường còn thấp, vi khuẩn lactic bắt buộc phải

sử dụng các acid hữu cơ làm nguồn cơ chất chính để sinh trưởng phát triển pH dịch lên men nhờ vậy giảm còn khỏang 3.5 – 4.0 đây là khoảng pH thích hợp cho việc chuyển hóa acid malic, đồng thời hoạt lực enzyme malolactic lớn nhất trong khoảng pH này + Nguy cơ đường bị chuyển thành các sản phẩm khác không mong muốn như: acid lactic, acid acetic giảm

- Nhược điểm:

+ Khi kết thúc lên men rượu, nồng độ cồn trong môi trường cao (12 – 15% V), do

đó khi cấy vi khuẩn vào môi trường, vi khuẩn sẽ dễ bị sốc, số lượng giảm đáng kể và làm chậm quá trình lên men Vì vậy cần tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng chịu được độ cồn cao kết hợp nuôi cấy huấn luyện thích nghi cho lượng vi khuẩn trước khi tiến hành lên men malolactic [33, 43]

Hình 2.3 Vi khuẩn Oenococcus oeni [48]

Oenococcus oeni (nguồn gốc từ Leuconostoc oenos) là loài được ưu tiên cho

việc thực hiện lên men malolactic hơn là Lactobacilli và Pediococci không được ưa

thích vì làm giảm chất lượng rượu vang (Davis et al., 1985; Mira de Orduna et al., 2001)

Oenococcus oeni có dạng hình cầu dài, nối với nhau thành chuỗi Tất cả các

chủng vi khuẩn Oenococcus oeni đều lên men dị hình, ngoài acid lactic được tạo thành

chúng còn cho ra các sản phẩm có hợp chất thơm như: aceton, diacetyl, ester…Điều này làm tăng giá trị sản phẩm sau quá trình lên men

Trong những giống vi khuẩn malolactic, Oenococcus oeni là loài có khả năng sinh trưởng mạnh mẽ nhất (chịu đựng và thích nghi tốt nhất trong môi trường rượu

vang) Chúng có thể phát triển ở nồng độ ethanol cao (>10%) và pH thấp (<4.2) pH tối

ưu cho sự sinh trưởng của Oenococcus oeni là 4.2 – 4.8 và pH thích hợp cho lên men

malolactic dao động trong khoảng từ 3.2 – 4.0

Vì vậy, trong công nghiệp sản xuất rượu vang Oenococcus oeni là loài mang lại nhiều

đặc tính mong muốn nhất cho chất lượng rượu vang [32]

Một số tiêu chí khi chọn chủng vi khuẩn Oenococcus oeni :

- Vi khuẩn phải có khả năng chịu được điều kiện khắc nghiệt (pH, ethanol, SO2) trong môi trường lên men, để chúng có thể phát triển vượt trội và chiếm ưu thế so với những loài khác trong cùng môi trường lên men

- Oenococcus oeni phải có khả năng phân giải tốt acid malic Trong điều kiện lên men malolactic, chúng sẽ tiến hành phân giải acid malic trước khi phân giải đường

Đây chính là mục đích chính trong lên men malolactic

2.3.4.2.Lactobacillus

Hình 2.4 Vi khuẩn Lactobacillus [49]

Các trực khuẩn thuộc giống Lactobaccilus đều là vi khuẩn Gram dương Chúng

thường có dạng hình que dài hoặc ngắn gần như hình cầu Đường kính khoảng 0.5 – 0.7 µm và chiều dài có thể đếm 8 µm, chúng đứng riêng lẻ, kết đôi hoặc kết thành

chuỗi Có nhiều loài trong Lactobaccilus được tìm thấy trong rượu vang, được chia

thành 2 nhóm: lên men lactic đồng hình và dị hình tùy thuộc vào khả năng lên men đường hexose và pentose Những loài vi khuẩn lactic dị hình là những loài dị hình bắt buộc, nghĩa là lên men đường ngoài việc tạo sản phẩm là acid lactic, chúng còn có khả năng tạo ra nhiều sản phẩm như acid acetic, acid succinic, ethanol, carbodioxide,…pH

hoạt động tối thích cho các trực khuẩn Lactobaccilus là 5.5 – 5.8 Chúng không thể

sinh trưởng được trong môi trường có pH thấp hơn 3.5 [14, 18, 25]

3.3.4.1 Pediococcus

Hình 2.5 Vi khuẩn Pediococcus [50]

Thuộc giống này là các vi khuẩn hình cầu, Gram dương, không sinh bào tử, không chuyển động, đứng riêng lẻ hoặc kết đôi, kết ba, kết bốn hoặc kết thành chùm, đôi khi thành chuỗi Chúng có thể là kị khí hoặc vi hiếu khí Tất cả các loài vi khuẩn lactic thuộc giống này đều lên men lactic đồng hình, nghĩa là chúng có thể lên men đường thành acid lactic Khác với các vi khuẩn Gram dương điển hình, chúng không chứa

acid teichoic trong thành tế bào Có 4 loài Pediococcus có khả năng phát triển ở pH = 4.2 hoặc thấp hơn thường gặp trong rượu vang là Pediococcus damnosus, Pediococcus

paruvulus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici [14, 18]

2.3.4.4 Leuconostoc

Hình 2.6 Vi khuẩn Leuconostoc oenos [51]

Vi khuẩn Leuconostoc lên men dị hình, các tế bào thuộc các giống này có hình cầu

hay hình trứng dài, đứng riêng lẻ, kết đôi hoặc tạo thành chuỗi ngắn, có khả năng tạo thành NH3 từ asparagin và không có enzyme catalase Việc nghiên cứu nuôi cấy giống

vi khuẩn này rất khó khăn vì chúng đòi hỏi môi trường nuôi cấy cần vài chất dinh dưỡng đặc biệt như: β – D glucopyranosyl – D – pantothenic, nguồn acid béo sử dụng

là tween 80 và chất ức chế nấm men cycloheximide Người ta có thể nuôi cấy chúng trong dịch ép cà chua, táo hoặc nho Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu cho thấy rằng chỉ

có một loài của Leuconostoc được tìm thấy và phân lập từ vang nho, đó là Leuconostoc

Oenococcus oeni pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 4.2 – 4.8 và pH thích hợp cho lên

men malolactic dao động trong khoảng từ 3.2 – 4.0 [32]

2.3.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Thông thường nhiệt độ 200C là nhiệt độ tối ưu để lên men malolactic, tuy nhiên trong quá trình sản xuất chỉ có ở các cơ sở có hệ thống cấp lạnh mới có thể điều chỉnh được tương đối chính xác nhiệt độ này Chỉ một số ít chủng vi khuẩn có khả năng lên men malolactic ở nhiệt độ 150C, nếu nhiệt độ dưới 150C thì quá trình lên men malolactic rất khó xảy ra [22, 25]

2.3.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ cồn

Nếu nồng độ ethanol trong dịch vang vượt quá 10%V, quá trình lên men malolactic

sẽ bị ức chế một cách mạnh mẽ Nhưng Leuconostoc và Pediococcus thì lại có thể chịu

được nồng độ cồn 12 – 14%V Khi nồng độ cồn vượt quá 15%V thì sự phát triển của vi khuẩn gần như không diễn ra nữa, tuy nhiên quá trình lên men malolactic vẫn có thể xảy ra Như vậy, cồn ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn mạnh hơn khi bắt đầu quá trình lên men malolactic, so với pH và nhiệt độ thì ảnh hưởng của nồng độ cồn đến

trình lên men malolactic ít hơn [22, 24]

2.3.5.4 Ảnh hưởng của SO 2

Trong sản xuất rượu vang người ta sử dụng SO2 để chống oxi hóa và kháng khuẩn

vì SO2 có tác dụng ức chế một vài loại enzyme oxi hóa khử và ức chế sự phát triển của

một số loài vi khuẩn lactic hay vi khuẩn acetic bất lợi Trong dịch lên men một phần

SO2 ở dạng tự do còn một phần chúng kết hợp với các cấu tử khác có trong rượu vang

Trong quá trình lên men cồn, SO2 kết hợp với nhiều chất khác, sau quá trình này ảnh

hưởng của SO2 lên vi khuẩn có giảm đi nhưng vẫn còn có những tác dụng nhất định

Trong vang hàm lượng SO2 tổng số từ 100 – 150 mg/l (tức là từ 1 – 10 mg/l SO2 tự

do) đủ để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn có trong vang Hàm lượng SO2 còn lại sau

quá trình lên men rượu không vượt quá 40 – 50 mg/l (tức 5 mg/l SO2 tự do) thì không

làm ảnh hưởng đến tiến trình lên men malolactic Ở vang có pH thấp sẽ làm cho tỉ lệ

SO2 tự do lớn nên tăng cường được tác dụng diệt khuẩn [22, 36]

2.3.5.5 Ảnh hưởng của acid malic và các acid hữu cơ khác

Acid malic là chất cảm ứng cho enzyme malolactic, vì vậy trong môi trường lên

men malolactic bắt buộc phải có thành phần acid này Nếu xét về mặt sinh trưởng và

phát triển của vi khuẩn thì acid malic hầu như không có tác dụng gì, thậm chí nó còn

ức chế khi nồng độ vượt quá 10 g/l Nồng độ acid malic cho hoạt lực enzyme

malolactic của vi khuẩn cao nhất là 10 g/l đối với dạng D và 5 g/l đối với dạng L [31,

45]

Acid lactic: Acid lactic ức chế sự phát triển của Oenococus oeni, đồng thời sự tiêu

hao glucose trong môi trường cũng phụ thuộc vào nồng độ acid lactic, khi nồng độ acid

lactic tăng lên thì lượng glucose tiêu hao cũng giảm dần đi [25, 31]

Acid citric và acid tartaric: Acid citric và acid tartaric là thành phần của dịch quả và

dịch lên men rượu vang Khi môi trường có fructose thì acid citric có tác dụng kích

thích sự phát triển của Oenococcus oeni Khi môi trường có mặt glucose thì acid citric

hầu như không có tác dụng kích thích sinh trưởng [31, 40]

2.3.5.6 Tính cạnh tranh và ức chế của nấm men và vi khuẩn malolactic

- Tác dụng kích thích: tác dụng kích thích lên vi khuẩn malolactic của nấm men có liên quan đến hiện tượng tự phân của nấm men Khi nấm men tự phân sẽ giải phóng vào dịch lên men một lượng các hợp chất nitơ và vitamin Các hợp chất này rất cần thiết cho hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn malolactic trong vang

- Tác dụng ức chế: những tác dụng ức chế của nấm men đối với vi khuẩn malolactic

có liên quan đến sự tạo thành những sản phẩm trao đổi chất ngoại bào của nấm men như: ethanol, SO2, hay các acid béo mạch trung bình và các protein

+ Ethanol có khả năng ức chế hầu hết các vi khuẩn Đối với vi khuẩn malolactic, ethanol tác dụng mạnh mẽ lên sự sinh trưởng nhưng ít ảnh hưởng đến khả năng lên men của vi khuẩn này Ở nồng độ 4% (v/v), ethanol sẽ ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic nhưng khả năng phân giải acid malic của vi khuẩn này vẫn đạt 95% + SO2 sinh ra từ nấm men cùng với SO2 được cho vào từ quá trình sulfide hóa dịch ban đầu là một trong những nguyên nhân chính ức chế vi khuẩn malolactic làm kéo dài thời gian lên men

+ Các acid béo mạch trung bình như: acid decanoic, dodecanoic, hexanoic, octanoic… cũng có khả năng ức chế sự sinh trưởng và cả khả năng lên men của các vi khuẩn malolactic

+ Sự tạo thành các hợp chất kháng khuẩn cũng đã được nghiên cứu, các hợp chất này thường có bản chất là các protein tích điện âm, tuy nhiên khả năng ức chế còn phụ thuộc vào từng chủng vi khuẩn cho lên men

Bên cạnh khả năng bị ức chế bởi các chất có hoạt tính sinh học và các chất kháng khuẩn tự nhiên, sự ức chế của vi khuẩn malolactic bởi nấm men còn do cạn kiệt nguồn dinh dưỡng Các chất này được nấm men sử dụng trong giai đoạn lên men ethanol Kết quả là sau khi kết thúc quá trình lên men ethanol và bắt đầu lên men malolactic, các chất như: amino acid, vitamin hầu như không còn đủ cho vi khuẩn malolactic phát triển [22, 26, 27]

2.4 KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT

Ngày nay tế bào cố định đã rất phổ biến, hiện đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau và đem lại rất nhiều hiệu quả kinh tế Thuật ngữ cố định tế bào cũng có thể được hiểu đơn giản hơn, đó là việc gắn các tế bào vào các chất mang không tan trong nước hay trong những dung dịch tự do mà vẫn có thể sử dụng được nhiều lần, liên tục đồng thời vẫn không bị lẫn vào sản phẩm [3, 44]

2.4.1 Chất mang

Trong kỹ thuật cố định tế bào, yếu tố quan trọng quyết định đến phương pháp, tính hiệu quả của quy trình cố định là vật liệu cố định hay còn gọi là chất mang Ban đầu, người ta thường sử dụng các chất mang trao đổi ion như: CM–, DEAE– của cellulose, sephadex…Đến những năm 1970 – 1980 chất mang polyme tổng hợp như: polyacrylamid, polyvinylacetat, polystyren, polyetylen, polyhydroxyetyl, metacrylat,… được ứng dụng Các chất mang polyme tổng hợp có ưu điểm là bền, độ trương, khả năng cố định tế bào tốt nhưng có những nhược điểm là giá thành cao, không tương hợp sinh học, có nguy cơ hủy hoại môi trường do không phân hủy sinh học nên ngày nay ít được sử dụng

Trong những năm gần đây, một số polyme sinh học đang được chú ý để nghiên cứu và chế tạo chất mang cố định tế bào như: tinh bột, chitin, chitosan, alginate…Các chất mang polyme sinh học có ưu điểm: là sản phẩm của tự nhiên, rất phong phú và rẻ tiền, có khả năng phân hủy sinh học, nhưng có nhược điểm là tính chất cơ lý kém bền,

độ trương thấp và không đồng nhất [4, 17]

2.4.2 Alginate

Acid alginic là một polysaccharide đặc biệt có trong các loài rong nâu: Ascophyllum,

Fucus, Laminaria, Macrococystys, Sargassum,… Năm 1883, lần đầu tiên Stanford

khám phá ra “argin” nhưng đến năm 1896 Krefting mới tách được ở dạng tinh khiết và ông gọi là “acid rong biển” Những năm sau này thuật ngữ “algin” dùng để chỉ các dung dịch muối của acid alginic Nhiều năm sau, các nhà khoa học khác không ngừng

khám phá về acid alginic, Chapmann (1970) đã công bố công thức tổng quát của acid alginic là (C6H8O6)n và xem đây như là một acid D – maruronic với các liên kết cầu nối

1 – 4 glucozid Đó là một polyme mạch thẳng được cấu tạo từ 2 gốc monome là acid β – D – mannuronic và acid α – L – guluronic Theo công thức cổ điển của Haworth thì

hai monome này chỉ khác nhau ở chỗ nhóm cacboxyl nằm ở trên và dưới mặt phẳng của vòng pyranoza

Hình 2.7 Công thức cấu tạo của acid alginic [52].

Để đặc trưng cho thành phần hóa học của alginate, trước đây, người ta chỉ có thể xác định tỷ lệ mol của hai gốc monome cấu tạo nên alginate, tức là tỷ lệ M/G và sự phân bố được biểu hiện bởi tần suất của các khúc đôi (diad), khúc ba (triad)

Bảng 2.3 Tỉ lệ M/G của acid alginic từ một số loài rong nâu [17]

có hai tính chất quan trọng, đó là độ nhớt và tính tạo gel

- Độ nhớt của alginate phụ thuộc chủ yếu vào khối lượng phân tử alginate, còn tính chất tạo gel lại phụ thuộc chủ yếu vào cấu trúc của alginate, cấu trúc này phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng Ở các loài rong nâu khác nhau, cùng với độ trưởng thành khác nhau và các bộ phận trên một cá thể rong khác nhau sẽ cho alginate có cấu trúc khác nhau và với các tính chất đặc trưng của nó [4, 9, 17, 22]

2.4.3 Bacterial Cellulose

Hình 2.8 Cấu trúc cellulose vi khuẩn [53]

Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi nối β – 1,4 Các nghiên cứu cơ bản về BC cho thấy, BC có cấu trúc hóa học giống y hệt PC (plant cellulose – cellulose thực vật) Tuy nhiên, cấu trúc đa phân và thuộc tính của BC khác với PC Các sợi mới sinh ra của BC kết lại với nhau để hình thành nên các sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng khoảng 1.5 nm, là những sợi mảnh nhất có nguồn gốc tự nhiên Các sợi cơ bản kết lại thành các vi sợi (microfibril) Các vi sợi nằm trong các bó (bundle), và cuối cùng hình thành các dải (ribbon) Trong khi chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là 30000 – 75000 nm hay

gỗ bulô (Betula) là 14000 – 40000 nm Những dải vi sợi cellulose mịn có chiều dài

thay đổi từ 1 – 9 µm làm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các

nối hydrogen

BC khác PC về chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hóa BC có mức độ polymer hóa từ

2000 – 6000; một vài trường hợp đạt tới 16000 – 20000, trong khi mức polymer hóa ở thực vật là 13000 – 14000 So với PC, BC có độ kết tinh cao hơn, thấm nước tốt hơn, sức bền cơ học ở trạng thái ẩm cao hơn và dễ uốn nắn hơn [2, 7, 23, 28]

2.4.4 Các phương pháp cố định tế bào

2.4.4.1 Phương pháp gắn tế bào vi sinh vật bằng các liên kết hóa học

Phương pháp này được áp dụng khá rộng rãi để thu nhận tế bào cố định Thông thường, những tế bào vi sinh vật được kết hợp với chất mang không hòa tan Việc chọn chất mang có ý nghĩa rất lớn ảnh hưởng đến hoạt tính trao đổi chất của tế bào cố định Các chất mang không hòa tan phải đảm bảo các tính chất sau: có độ hòa tan thấp và bền vững với tác dụng cơ học và hóa học; không gây tác dụng kiềm hãm đến tế bào; không hấp phụ phi chọn lọc đối với các protein khác; chất mang tốt hơn cả là có bản chất háo nước, vì chất mang kỵ nước có thể gây ra tác dụng ức chế đến tế bào vi sinh vật đã được liên kết

Các chất mang loại này thường là polypeptid, polysaccarit, dẫn xuất cellulose, dextran (DEAE – cellulose, CM – cellulose, DEAE – sephadex, CM – sephadex),

agaroza và các chất polyme tổng hợp khác nhau như polyarylamide, polystirol, polyamide và các chất vô cơ: silicagel, bentomide, nhôm hydroxide…

2.4.4.2 Cố định tế bào vi sinh vật bằng phương pháp hấp phụ trên các chất mang

Tế bào vi sinh vật có thể được hấp phụ trên các chất mang như than hoạt tính, cellulose, agarose, kitin, polyacrylamide, nylon, polystirol, nhựa trao đổi ion, silicagel, thủy tinh…

Có ba trường hợp xảy ra: trường hợp chất mang không có lỗ xốp, tế bào vi sinh vật

sẽ được đính vào chất keo theo từng lớp trên bề mặt; trường hợp chất mang có lỗ xốp,

tế bào vi sinh vật sẽ xâm nhập vào các lỗ xốp này; nếu chất mang có tích điện sẽ tạo thành các liên kết ion giữa chất mang và tế bào

2.4.4.3 Phương pháp nhốt vi sinh vật trong khuôn gel

Để gói tế bào vi sinh vật vào khuôn gel, người ta tiến hành trùng hợp hóa các gel khi có mặt đồng thời tế bào vi sinh vật Sau khi hoàn thành, tế bào vi sinh vật bị giữ chắc trong gel Các tế bào vi sinh vật gói trong khuôn gel kiểu này thường phân bố không đồng đều Thông thường chỉ những phần tế bào vi sinh vật nằm gần bề mặt gel

là tiếp xúc được với cơ chất và tham gia quá trình lên men

Một số phương pháp nhốt tế bào vi sinh vật:

- Các gel được hình thành từ các polymer tổng hợp như polyacrylamide, hydroxyletyl – 2 – metacrylat đã tạo phức có hình càng cua Gel có thể cắt thành màng đặt trên một giá rắn, hoặc cũng có thể nghiền thành bột khi khử nước

Alginate và carageenan lấy từ rong biển thường có khả năng tạo gel rất tốt và rất thuận lợi để bao gói các enzyme hoặc tế bào nguyên vẹn Có thể tạo khối dưới dạng viên đường kính 0.5 – 4 mm bằng cách nhỏ giọt dung dịch natri alginate 2% vào trong dung dịch giàu canxi clorua

- Các tế bào vi sinh vật bị nhốt trong các lỗ nhỏ của các sợi tổng hợp

Phương pháp Dinelli được tiến hành giống như tạo sợi cellulose trong công nghiệp dệt Một nhũ tương của cellulose triacetat có trong metyl clorua và tế bào vi sinh vật