Cố định tế bào nấm men saccharomyces cerevisiae có hoạt tính invertase trên phức chất mang bacterial cellulose alginate và ứng dụng

 BÙI THỊ THANH HƯƠNG CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE CÓ HOẠT TÍNH INVERTASE TRÊN PHỨC CHẤT MANG BACTERIAL CELLULOSE – ALGINATE VÀ ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Công nghệ



BÙI THỊ THANH HƯƠNG

CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN SACCHAROMYCES

CEREVISIAE CÓ HOẠT TÍNH INVERTASE TRÊN PHỨC

CHẤT MANG BACTERIAL CELLULOSE – ALGINATE VÀ

ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ Hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2010

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hương

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 15 tháng 01 năm 2010 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1

2

3

4

5

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Bộ môn quản lý chuyên ngành sau Đại học khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Bộ môn quản lý chuyên ngành

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: Bùi Thị Thanh Hương Giới tính : Nam / Nữ 

Ngày, tháng, năm sinh : 13/05/1985 Nơi sinh : Buôn Ma thuột Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoá (Năm trúng tuyển) : 2008

1- TÊN ĐỀ TÀI: Cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có hoạt tính

invertase trên phức chất mang Bacterial cellulose-alginate và ứng dụng

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

- Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae có hoạt tính invertase cao

- Cố định chủng nấm men có hoạt tính invertase trên phức chất mang Bacterial cellulose-alginate

- Khảo sát chế phẩm nấm men cố định thủy phân dung dịch sucrose và nước mía

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 15/06/2008

4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 30/12/2008

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi đầy đủ học hàm, học vị ):

Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hương Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

(Họ tên và chữ ký)

LỜI CẢM ƠN

Em xin được bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc và niềm vinh hạnh lớn lao đã được học tập kiến thức và kinh nghiệm quý báu của các Thầy Cô bộ môn Công nghệ Sinh học, các Thầy Cô giảng dạy cao học ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách khoa Tp Hồ Chí Minh Thầy Cô đã hết lòng giảng dạy, truyền đạt tri thức cho chúng em, đã hỗ trợ và tạo điều kiện tốt nhất để chúng em hoàn thành luận văn

Và từ sâu thẳm tấm lòng, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cô giáo kính yêu của em, Cô Nguyễn Thúy Hương Những lời dạy, những lời động viên, chia sẻ của Cô là điểm tựa cho em vững bước trên con đường phía trước; bóng dáng tất tả, lo lắng cho từng “học trò nhỏ” của Cô là hình ảnh khắc ghi trong trái tim em, dạy cho em biết sống yêu thương, nhân ái với mọi người…“Dẫu đếm hết sao trời đêm nay, dẫu đếm hết lá mùa thu rơi, nhưng ngàn năm, làm sao em đếm hết công ơn người thầy …”

Hương xin cảm ơn đến tất cả bạn bè, người thân luôn động viên, chia sẻ với Hương trong thời gian qua Cảm ơn Uyên người bạn đồng hành cùng Hương Và đặc biệt, chị cảm ơn các em SH05, cảm ơn “cư dân” phòng thí nghiện 108 B2, cảm

ơn bé Thảo, bé Hiền các em đã giúp chị rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Và cuối cùng, con xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất đến ba mẹ và gia đình thân yêu của con Ba mẹ luôn lặng thầm theo những bước chân con đi, hi sinh tất cả vì những ước mơ, khát vọng của con Ba mẹ mãi mãi là một nơi bình yên nhất trong cõi lòng con!

Bùi Thị Thanh Hương

TÓM TẮT LUẬN VĂN

TÓM TẮT: Nghiên cứu khảo sát khả năng tái sử dụng chế phẩm tế bào nấm

men có hoạt tính invertase cố định trên phức chất mang Bacterial cellulose-alginate trong thủy phân sucrose và ứng dụng thủy phân vào một loại thực phẩm đồ uống có

sự hiện diện của sucrose là nước mía Đầu tiên, chúng tôi tiến hành tuyển chọn chủng nấm men S cerevisiae có hoạt tính invertase cao, sau đó cố định chủng nấm men này trên phức chất mang BC-alginate và ứng dụng thủy phân sucrose Một số kết quả thu được như sau: chủng BK1 có hoạt tính invertase cao nhất 750UI/ g sinh khối ướt; sử dụng dung dịch sodium alginate 2,0% w/v, CaCl 2 2,0% w/v, mật độ tế bào đưa vào 10 9 TB /ml, chế độ lắc 200 vòng/phút thời gian lắc 30 phút, nhiệt độ ủ

30 o C, thời gian ủ 3 ngày để cố định tế bào lên phức chất mang Điều kiện thủy phân tốt nhất của chế phẩm nấm men cố định là nhiệt độ 55 o C, pH 5,0, thời gian thủy phân 6 giờ, và hiệu suất trung bình thủy phân dung dịch sucrose tinh khiết và sucrose nước mía 14 lần tái sử dụng trên 80%

SUMMARY: Research surveyed re-used possibility of immobilized yeast in

Bacterial cellulose-alginate complexes carrier in sucrose hydrolysis and application in food-beverages presence of sucrose as sugarcane juice Firstly, we conducted selection strain S cerevisiae invertase active high, then immobilized this yeast in complexes carrier, finally application hydrolysis of sucrose Some results were as follows: strain BK1 active invertase highest 750UI/g wet biomass; immobilization use of sodium alginate 2.0% w/v, CaCl 2 2,0% w/v, density cells into

10 9 cells/ml, shake 200 rpm in 30 min, incubation times 3 days at 30 o C The optimal condition of immobilized yeast: temperature 55 o C, pH 5.0, for 6 hours; average performance hydrolysis of pure sucrose solution and sucrose sugarcane juice 14 times use over 80%

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về nấm men Saccharomyces cerevisiae 3

1.1.1 Hình thái và cấu tạo tế bào nấm men 3

1.1.2 Quá trình dinh dưỡng tế bào nấm men 5

1.1.3 Quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào nấm men 7

1.1.4 Ảnh hưởng các yếu tố bên ngoài đến hoạt động của nấm men 9

1.2 Tổng quan về enzyme invertase 10

1.2.1 Đặc điểm và tính chất enzyme invertase 10

1.2.2 Nguyên lý điều hòa sinh tổng hợp invertase 11

1.2.3 Cơ chế xúc tác invertase 12

1.2.4 Các ứng dụng enzyme invertase 12

1.3 Tổng quan về cố định tế bào vi sinh vật 13

1.3.1 Đặc điểm và tính chất tế bào cố định 13

1.3.2 So sánh việc sử dụng enzyme trong tế bào cố định và enzyme tự do 14

1.3.3 Các phương pháp cố định tế bào 15

1.3.4 Chất mang cố định tế bào sử dụng trong nghiên cứu 18

1.4 Tổng quan về cây mía 25

1.4.1 Giới thiệu cây mía 26

1.4.2 Qui trình sản xuất nước mía 28

1.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng đề tài 30

1.5.1 Các nghiên cứu về enzyme invertase 30

1.5.2 Các nghiên cứu về cố định nấm men S cerevisiae và ứng dụng 31

1.5.3 Các nghiên cứu sử dụng invertase cố định và nấm men cố định có hoạt tính invertase thủy phân dung dịch sucrose 32

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35

2.1 Vật liệu 35

2.2 Phương pháp 36

2.2.1 Tuyển chọn chủng nấm men S cerevisiae có hoạt tính invertase cao 37

2.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân dung dịch sucrose bằng tế bào tự phân 43

2.2.3 Phương pháp cố định nấm men lên phức chất mang BC-alginate 45

2.2.4 Khảo sát khả năng tái sử dụng của chế phẩm nấm men cố định tự phân trong thủy phân dung dịch sucrose 49

2.2.5 Ứng dụng chế phẩm nấm men cố định có hoạt tính invertase thủy phân sucrose trong qui trình sản xuất nước mía đóng hộp 51

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 56

3.1 Tuyển chọn chủng nấm men có hoạt tính invertase cao 56

3.1.1 Đặc tính hình thái khuẩn lạc – hình thái tế bào nấm men 56

3.1.2 Sự sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm men trong môi trường nhân giống 58

3.1.3 Sự sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm men trong môi trường cảm ứng invertase 60

3.2 Xúc tác thủy phân dung dịch sucrose bằng nấm men tự phân 64

3.2.1 Ảnh hưởng của lượng nấm men tự phân 64

3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất sucrose 65

3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 66

3.2.4 Ảnh hưởng của pH 67

3.3 Cố định tế bào nấm men có hoạt tính invertase cao trên phức chất mang BC-alginate 68

3.3.1 Bẫy – hấp phụ tế bào nấm men lên chất mang BC 68

3.3.2 Nhốt tế bào nấm men trong hệ gel alginate 68

3.3.3 Cố định tế bào nấm men trên phức chất mang BC-alginate 73

3.4 Khả năng tái sử dụng của chế phẩm nấm men cố định tự phân xúc tác thủy phân dung dịch sucrose 76

3.5 Khả năng tái sử dụng của chế phẩm nấm men cố định tự phân xúc tác thủy phân sucrose trong nước mía 78

3.5.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân sucrose nước

mía bằng nấm men tự phân 78

3.5.2 Khả năng tái sử dụng chế phẩm nấm men cố định tự phân thủy phân sucrose trong nước mía 83

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 86

4.1 Kết luận 86

4.2 Đề nghị 88

TÀI LIỆU THAM KHẢO 89

PHỤ LỤC 97

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Nấm men S cereviciae 3

Hình 1.2: Cấu tạo tế bào nấm men S cerevisiae 5

Hình 1.3: Đường cong sinh trưởng nấm men nuôi cấy theo chu kì 8

Hình 1.4: Phản ứng thủy phân sucrose bằng xúc tác invertase 10

Hình 1.5: Cơ chế xúc tác invertase 12

Hình 1.6: Sơ đồ các phương pháp cố định tế bào 16

Hình 1.7: Các phương pháp cố định tế bào 16

Hình 1.8: Cấu tạo phân tử cellulose 19

Hình 1.9: Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật 19

Hình 1.10: Cơ chế sinh tổng hợp BC của A xylinum 20

Hình 1.11: Cấu trúc alginate 22

Hình 1.12: Các loại block của alginate 23

Hình 1.13: Cơ chế của quá trình tạo gel alginate 24

Hình 1.14: Cấu tạo hình “hộp trứng” của Alg-Ca 25

Hình 1.15: Cây mía 26

Hình 2.1: Sơ đồ tổng hợp các vấn đề nghiên cứu 36

Hình 2.2: Sơ đồ tuyển chọn chủng nấm men có hoạt tính invertase cao 37

Hình 2.3: Buồng đếm hồng cầu 38

Hình 2.4: Khuẩn lạc mọc trên đĩa Petri 39

Hình 2.5: Sơ đồ thực hiện tự phân tế bào 40

Hình 2.6: Phản ứng giữa DNS và đường khử 41

Hình 2.7: Sơ đồ khảo sát nồng độ dung dịch sucrose thủy phân 44

Hình 2.8: Sơ đồ cố định tế bào lên phức chất mang BC-alginate 45

Hình 2.9: Sơ đồ bẫy hấp phụ tế bào lên chất mang BC 46

Hình 2.10: Phương pháp nhốt tế bào nấm men trong hệ gel alginate 47

Hình 2.11: Sơ đồ khảo sát khả năng tái sử dụng chế phẩm nấm men cố định tự phân thủy phân dung dịch sucrose 50

Hình 2.12: Sơ đồ khảo sát các điều kiện thủy phân sucrose của nước mía 52

Hình 2.13: Sơ đồ khảo sát lượng nấm men tự phân xúc tác thủy phân sucrose nước

mía 53

Hình 2.14: Sơ đồ khảo sát khả năng tái sự dụng của chế phẩm nấm men cố định tự phân trong thủy phân sucrose nước mía 55

Hình 3.1: Khuẩn lạc chủng nấm men BK1 56

Hình 3.2: Hình chụp tiêu bản chủng nấm men BK1 57

Hình 3.3: Chế phẩm nấm men cố định trên chất mang BC 69

Hình 3.4: Chế phẩm nấm men cố định trên alginate 75

Hình 3.5: Chế phẩm nấm men cố định trên phức chất mang BC-alginate 76

DANH MỤC BẢNG-BIỂU ĐỒ-ĐỒ THỊ

Bảng 1.1: Bảng phân loại khoa học mía 27

Bảng 1.2: Các thành phần hóa học chính của nước mía 28

Bảng 3.1: Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc và tế bào các chủng nấm men 57

Bảng 3.2: Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định nấm men bằng chất mang alginate 73

Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng lượng nấm men tự phân đến hiệu suất thủy phân 65

Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân 67

Biểu đồ 3.3: So sánh khả năng tái sử dụng của các chế phẩm cố định trong thủy phân dung dịch sucrose 77

Biểu đồ 3.4 Khả năng tái sử dụng của chế phẩm nấm men cố định trên phức chất mang BC-alginate 83

Đồ thị 3.1: Đường cong sinh trưởng của các chủng nấm men trong môi trường nhân giống 59

Đồ thị 3.2: Đường cong sinh trưởng của các chủng nấm men trong môi trường cảm ứng 61

Đồ thị 3.3: Hoạt độ invertase của các chủng nấm men 62

Đồ thị 3.4: Hoạt độ invertase và sự sinh trưởng của chủng nấm men BK1 63

Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hiệu suất thủy phân 66

Đồ thị 3.6: Ảnh hưởng pH đến hiệu suất thủy phân 68

Đồ thị 3.7: Ảnh hưởng tốc độ lắc đến mật độ tế bào cố định trên BC 70

Đồ thị 3.8: Ảnh hưởng nhiệt độ ủ đến mật độ tế bào cố định trên BC 71

Đồ thị 3.9: Ảnh hưởng thời gian ủ đến mật độ tế bào cố định trên BC 72

Đồ thị 3.10: Ảnh hưởng lượng tế bào nấm men tự phân đến hiệu suất thủy phân sucrose nước mía 79

Đồ thị 3.11: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân 80

Đồ thị 3.12: Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất thủy phân 81

MỞ ĐẦU

Hiện nay, trong ngành công nghiệp thực phẩm và đồ uống syrup đường nghịch đảo glucose-fructose được sử dụng để thay thế một phần hay hoàn toàn syrup đường sucrose ngày càng tăng Syrup đường nghịch đảo glucose-fructose mang nhiều đặc tính chức năng có lợi cho sức khỏe con người như giảm cholesterol, chống béo phì, phòng ngừa bệnh tiểu đường…So với syrup sucrose, syrup đường nghịch đảo có hương vị đặc trưng, nguyên liệu sản xuất phong phú và làm tăng độ ngọt của sản phẩm lên 1,3 lần ở cùng nồng độ sử dụng, đồng thời tăng hàm lượng chất khô, ổn định chất lượng và ngăn ngừa hiện tượng kết tinh đường Đặc biệt, áp lực thẩm thấu của hỗn hợp glucose – fructose cao, tăng cường khả năng ức chế vi sinh vật, kéo dài thời gian bảo quản dịch đường Với những ưu điểm trên, mức độ tiêu thụ hỗn hợp glucose-fructose ngày càng tăng (hằng năm tăng 20%÷30%), đưa sản lượng tiêu thụ trên thế giới lên gần 10 triệu tấn/năm [2, 61]

Tiến hành thủy phân sucrose với xúc tác acid hữu cơ (acid citric, tartaric, malic…) hoặc enzyme invertase sẽ thu được hỗn hợp đường nghịch đảo glucose- fructose So với trường hợp xúc tác acid, sử dụng enzyme invertase làm điều kiện phản ứng trở nên ôn hòa hơn, và chất lượng syrup sẽ tốt hơn Invertase được tìm thấy trong nhiều loại thực vật và vi sinh vật khác nhau, tuy nhiên các chế phẩm invertase hiện nay được thu nhận chủ yếu từ nấm men, đặc biệt là từ giống

Saccharomyces Những chủng nấm men có hoạt tính invertase cao đều được chứng

minh là những invertase tồn tại ở không gian chu chất, nơi tiếp xúc trực tiếp với cơ chất Vì vậy có khá nhiều tác giả cho rằng những invertase này là invertase “ngoại bào”, có vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa sucrose vì cơ chất không

có khả năng thấm qua màng tế bào chất [1, 15, 62] Dựa vào đặc điểm này, các nghiên cứu gần đây của nhiều nhóm tác giả đã khai thác sử dụng trực tiếp nấm men

có hoạt tính invertase cao để thủy phân sucrose với giá thành thấp Ở Việt Nam, mảng nghiên cứu này còn khá mới mẻ Với một chất mang mới là phức chất mang

Bacteria cellulose-alginate chúng tôi tiến hành đề tài: Cố định tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae có hoạt tính invertase trên phức chất mang Bacterial

cellulose-alginate và ứng dụng” Mục đích giảm hàm lượng đường sucrose, tăng

độ ngọt, giảm hiện tượng kết tinh đường, ổn định chất lượng, tăng thời gian bảo quản các nhóm thực phẩm có sự hiện diện của sucrose nhờ sử dụng chế phẩm invertase từ tế bào cố định

Một phần kết quả của đề tài đã được đăng qua hai bài báo:

1 Nguyễn Thúy Hương, Bùi Thị Thanh Hương – Nghiên cứu điều kiện cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae N28 bằng chất mang cellulose vi khuẩn

và bước đầu ứng dụng trong lên men rượu vang – Tạp chí Công nghệ Sinh

Chương 1

Tổng quan tài liệu

1.1 Tổng quan về nấm men Saccharomyces cerevisiae

Nấm men là cơ thể đơn bào, có khả năng sống trong môi trường dinh dưỡng

có chứa đường, nitơ, photpho và các chất hữu cơ khác Chúng là các vi sinh vật dị dưỡng có khả năng sống trong cả điều kiện hiếu khí và yếm khí

1.1.1 Hình thái và cấu tạo của tế bào nấm men

Nấm men S cerevisiae thường

có hình ovan, hình bầu dục hay hình

tròn Kích thước của tế bào nấm men

thay đổi tùy thuộc vào giống, loài,

tuổi và điều kiện nuôi cấy, chiều rộng

trung bình từ 2,5÷10µm và chiều dài

từ 4,5÷2µm, tối đa có chủng đạt chiều

dài đến 30µm Nấm men có xu hướng

dài ra trong điều kiện nuôi cấy có hàm

lượng nitơ (N) thấp

Cấu tạo của tế bào nấm men gồm

có: thành tế bào, vùng ngoại biên, màng

nguyên sinh chất, nguyên sinh chất, ty thể, nhân tế bào, không bào, bộ máy golgi, ribosome và các hạt lipid Thành tế bào chứa chủ yếu là glucan và mannan với lượng tương đương nhau và chiếm đến 90% khối lượng khô tế bào Ngoài ra thành

tế bào còn có protein với hàm lượng từ 6÷7%, lipid khoảng 1% và một lượng nhỏ các hợp chất khoáng Trên thành tế bào có nhiều lỗ nhỏ, chất dinh dưỡng từ môi trường thấm vào bên trong tế bào và các sản phẩm trao đổi chất từ tế bào thải ra ngoài đều qua các lỗ nhỏ này một cách có chọn lọc Thành tế bào có tác dụng bảo

vệ hình dạng tế bào nấm men, duy trì áp suất thẩm thấu bên trong tế bào và góp phần điều hòa các quá trình trao đổi chất

Hình 1.1: Nấm men S cerevisiae [85]

Vùng ngoại biên là vùng giữa màng nguyên sinh chất và thành tế bào, có chứa các enzyme invertase và photphatase…Vùng này rất khó quan sát bằng kính hiển vi khi nấm men ở trạng thái sinh lý bình thường Thể tích vùng ngoại biên có thể tăng lên khi tế bào ở trạng thái ưu trương

Hình 1.2: Cấu tạo tế bào nấm men S cerevisiae [27]

Màng nguyên sinh chất nằm ở lớp trong thành tế bào, dày khoảng 7,5nm, có chức năng điều hòa việc hấp thụ các chất dinh dưỡng vào tế bào nhờ các enzyme permease Màng nguyên sinh chất được cấu tạo bởi một lớp photpholipid kép, có các protein đảm bảo vận chuyển enzyme trong màng Màng nguyên sinh chất của tế bào bền với pH acid nhưng kém bền với pH kiềm và là nơi đầu tiên chịu tác dụng của nhiệt, ethanol

Nguyên sinh chất là hệ thống keo nhớt, gồm có các thành phần protein, polysaccharide, muối khoáng và nước Trong nguyên sinh chất đáng chú ý là các hạt ribosome, tham gia vào quá trình tổng hợp các hợp chất trong cơ thể Có hai loại ribosome, ribosome 80S (gồm hạt 60S+40S) tồn tại tự do và ribosome 70S (50S+ 40S) liên kết với cấu trúc màng

Ty thể nấm men có hình bầu dục, kích thước khoảng 0,2÷0,5µm × 0,4÷1,0µm Ty thể được bao bọc bởi hai lớp màng, màng trong gấp nếp tạo thành nhiều tấm răng lược hoặc nhiều ống nhỏ xuyên vào khối chất nền nằm bên trong ty thể, có tác dụng làm tăng bề mặt bên trong của ty thể Màng ngoài được cấu tạo bởi sterol, phospholipid và protein Trên bề mặt các lớp màng có rất nhiều hạt nhỏ hình cầu giúp ty thể thực hiện các phản ứng oxy hóa giải phóng điện tử, chuyển điện tử qua chuỗi các hợp chất tham gia vào quá trình tổng hợp ATP và cũng tham gia giải phóng năng lượng ATP thành những dạng năng lượng khác cung cấp cho các nhu cầu của tế bào

Nhân tế bào nấm men hình tròn hoặc bầu dục, hình dạng và kích thước nhân thay đổi tùy thuộc vào tuổi và trạng thái sinh lý của tế bào Tế bào đang hoạt động mạnh, nhân khá lớn Xung quanh nhân là màng nhân, trong màng nhân có dịch nhân, dịch nhân có các protein, ADN, ARN và nhiều enzyme khác nhau Nhân quyết định tính di truyền và tham gia điều khiển tất cả mọi hoạt động của tế bào Khi sinh sản nhân phân chia theo kiểu gián phân và đôi khi theo kiểu trực phân

Trong mỗi tế bào nấm men có một không bào khá lớn hoặc nhiều không bào nhỏ Không bào chứa đầy dịch tế bào và bên ngoài được bao bọc bởi một màng lipo-protein gọi là màng không bào Dịch bào chứa các chất hữu cơ ở dạng keo (protein, lipid, glucid, enzyme) và các chất điện phân ở trạng thái hòa tan (Na, K, Ca…) Không bào có tác dụng tham gia điều hòa áp suất thẩm thấu trong tế bào và

là nơi xảy ra các quá trình oxy hóa khử, tích lũy nhiều chất dự trữ khác nhau [5, 27, 34]

1.1.2 Quá trình dinh dưỡng của tế bào nấm men

Nguồn thức ăn chủ yếu cho nấm men là các chất hữu cơ ở dạng dễ hấp thu và các chất vô vơ Ngoài ra để nấm men phát triển bình thường cần một lượng nhỏ các yếu tố vi lượng và các chất kích thích sinh trưởng

Nước: nước rất cần thiết cho hoạt động của tế bào nấm men Không có nước không thể có quá trình đồng hóa thức ăn và quá trình trao đổi chất bên trong tế bào

Nguồn cacbon: nguồn cacbon là nguồn chủ yếu liên quan đến quá trình trao đổi chất và chuyển hóa năng lượng Nấm men có khả năng đồng hóa hoàn toàn đuờng glucose, fructose và mannose Ngoài ra, tùy thuộc vào chủng giống nấm men còn có thể đồng hóa hoàn toàn hoặc một phần nào đó đường galactose

Đường disaccharide quan trọng cần quan tâm là sucrose, lactose, maltose Nấm men đồng hóa lên men rất tốt maltose và sucrose, đồng hóa hoàn toàn hoặc một phần lactose

Các polysaccharide (C6H12O6)n nếu được thủy phân hoàn toàn bằng acid hay enzyme nấm men có thể sử dụng được Trong điều kiện giàu oxy, sự oxy hóa xảy ra mạnh, nấm men cũng có thể sử dụng các acid hữu cơ, ethanol, aldehyte…

Nguồn nitơ: nấm men cần nitơ ở nhiều dạng khác nhau trong quá trình sống

để tạo thành các nhóm amin (-NH2) và (-NH-) trong phân tử các acid amin, các nucleotic purin, pirimidin…Có thể cung cấp nitơ từ bên ngoài vào môi trường dưới các dạng sau:

Hợp chất nitơ hữu cơ như protein, hoặc acid amin…Nấm men không hấp thu được protein ngay mà sẽ tiết ra hệ enzyme để thủy phân protein thành các acid amin

và peptide mạch ngắn Các acid amin cũng không được nấm men sử dụng trực tiếp làm nguyên liệu xây dựng tế bào mà phải tiến hành hai phản ứng trao đổi chất là khử amin và khử cacboxyl

Nguồn nitơ vô cơ như muối amon…Khi bổ sung muối amon vào môi trường nuôi cấy thì nấm men đồng hóa NH4+, còn các nhóm SO42-, Cl-, HPO42- sẽ làm pH môi trường giảm xuống, cần điều chỉnh lại pH Hợp chất nitơ được nấm men đồng hóa tốt nhất là urea Nấm men không có khả năng đồng hóa nitrat

Nguồn khoáng và các chất sinh trưởng: các chất khoáng cần với số lượng rất nhỏ nhưng lại rất quan trọng vì chúng đóng vai trò giữ pH môi trường ổn định, tham gia vào các coenzyme và tham gia vào quá trình trao đổi chất Nếu trong môi trường tổng hợp thì các chất khoáng K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O,…

Các chất kích thích sinh trưởng thường là các acid amin và vitamin, tế bào nấm men sử dụng các chất này để tạo nguyên sinh chất các vitamin B3, B6, B7 quan

trọng trong quá trình nuôi cấy nấm men [6, 30, 34]

1.1.3 Quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men

Quá trình sinh trưởng và phát triển là đặc tính chung của sinh vật sống Sinh trưởng là quá trình tăng kích thước và khối lượng tế bào (sự tăng sinh khối), sinh sản là sự tăng lên về số lượng tế bào Sự tăng số lượng tế bào không phải bao giờ cũng diễn ra song song với sự tăng sinh khối Trong môi trường nghèo chất dinh dưỡng tế bào nấm men vẫn có khả năng sinh sản nhưng kích thước tế bào giảm đi

so với điều kiện đầy đủ dinh dưỡng

Sự sinh trưởng của nấm men: trong môi trường sống đầy đủ chất dinh dưỡng

và điều kiện nuôi cấy thích hợp thì nấm men vừa tăng nhanh về kích thước đồng thời sinh khối sẽ được tích lũy Có thể kiểm tra sự sinh trưởng của nấm men bằng cách đo kích thước tế bào non và tế bào trưởng thành, xác định hàm lượng nitơ tổng

số hoặc cacbon tổng số…

Sự phát triển của nấm men: nấm men sinh sản chủ yếu bằng cách nảy chồi Đầu tiên hạch dày ra rồi thắt lại ở chính giữa Tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con Một phần hạch và nguyên sinh chất chuyển vào tế bào con Chồi con lớn dần, khi gần bằng tế bào mẹ, chồi con tự tách ra và sống độc lập Nơi chồi con tách khỏi

tế bào mẹ sẽ không bao giờ tạo ra một chồi non mới mà sẽ tạo ra một vết sẹo

Các giai đoạn của quá trình sinh trưởng và phát triển nấm men trong

nuôi cấy theo chu kỳ

Nuôi cấy theo chu kỳ là phương pháp nuôi cấy ở đó môi trường được giữ nguyên từ khi bắt đầu nuôi cấy đến khi kết thúc quá trình nuôi cấy mà không cho thêm chất dinh dưỡng mới vào Sản phẩm của quá trình lên men chỉ lấy ra sau khi hết quá trình nuôi cấy Sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong hệ kín này tuân theo một qui luật nhất định, được biểu thị qua đường cong sinh trưởng đơn:

Hình 1.3: Đường cong sinh trưởng của nấm men nuôi cấy theo chu kỳ [41]

Pha thích nghi (Lag phase): giai đoạn được tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy đến lúc bắt đầu thấy sự sinh trưởng và phát triển nhanh của vi sinh vật Trong giai đoạn này, vi sinh vật chưa tiến hành sinh sản mà chỉ xảy ra quá trình thích nghi môi trường nuôi cấy Kích thước của tế bào tăng dần do sự trao đổi chất với môi trường rất mạnh Thời gian của pha ngắn dài phụ thuộc vào tuổi sinh lý của giống vi sinh vật đưa vào và môi trường dinh dưỡng

Pha tăng trưởng (Log phase): giai đoạn được biểu hiện rõ nét bởi tốc độ sinh sản đạt cực đại Vi sinh vật vừa sinh sản mạnh vừa tăng sinh khối Ở giai đoạn này,

vi sinh vật tiến hành tổng hợp enzyme với số lượng và chất lượng cao, vì thế nếu mục đích của quá trình là thu nhận các chất có hoạt tính sinh học, hoặc tế bào có khả năng hoạt động mạnh, người ta kết thúc quá trình ở cuối giai đoạn này

Pha cân bằng: trong giai đoạn này quần thể sinh vật ở trạng thái cân bằng động Tổng số tế bào mới sinh bao giờ cũng gần bằng tổng số tế bào chết đi Sinh khối chung trong pha này đạt được cao nhất trong quá trình nuôi cấy

Pha tử vong: sự phát triển sẽ tạo nên các sản phẩm xuất ra môi trường, ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật Do đó, sau một thời gian, tốc độ phát triển của vi sinh vật giảm cho đến khi dừng hẳn Sự dừng là do hết chất dinh dưỡng (giới hạn chất dinh dưỡng), hay do tích tụ độc chất trong môi trường (giới hạn độc chất) [6, 34, 41]

1.1.4 Ảnh hưởng của yếu tố bên ngoài đến hoạt động của nấm men

Trong quá trình phát triển và sinh sản, nấm men chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố bên ngoài: yếu tố lý học, hóa học và sinh học

Nhiệt độ: nhiệt độ tối ưu của sự sinh trưởng và phát triển của nấm men trong khoảng 28-32oC Khi nhiệt độ giảm, tốc độ sinh khối của nấm men giảm dần và hoàn toàn bị ức chế ở nhiệt độ từ 2-5oC Khi nhiệt độ tăng quá cao, sự sinh trưởng của nấm men cũng bị ức chế, nấm men sẽ chết ở nhiệt độ trên 60oC

Oxy: Oxy tham gia trực tiếp vào quá trình tổng hợp protein của tế bào, tạo sinh khối và là yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính của quá trình lên men Nhu cầu về oxy trong từng giai đoạn là khác nhau, thời kỳ đầu sinh khối còn ít mà hàm lượng oxy hòa tan còn lớn thì không cần thông khí nhiều Oxy hòa tan vào môi trường lỏng ở dạng bọt khí nhỏ làm kích thích sự sinh sản của nấm men, tạo điều kiện hô hấp cho nấm men

pH môi trường: phản ứng pH môi trường tác động trực tiếp lên vi sinh vật

pH ảnh hưởng khả năng thẩm thấu của tế bào đối với những ion nhất định, vì vậy sẽ tác động đến các enzyme có mặt trên thành tế bào pH thích hợp cho nấm men phát triển từ 4÷5 pH < 2 và pH> 7,5 nấm men bị ức chế và ngưng phát triển [27, 41]

1.2 Tổng quan về enzyme invertase

1.2.1 Đặc điểm và tính chất của invertase

Hình 1.4: Phản ứng thủy phân sucrose bằng xúc tác invertase [35]

Invertase có tên khoa học β-D fructofuranosidase (EC 3.2.1.26), có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân liên kết glucoside giữa các α-D glucose và β-D fructose trong phân tử đường sucrose tạo ra hỗn hợp glucose và fructose với tỉ lệ mol 1:1 (syrup đường nghịch đảo) Ngoài ra invertase còn có khả năng phân giải một số trisaccharide và tetrasaccharide tạo ra glucose và fructose ở đầu và cuối mạch ra

Invertase là một enzyme phổ biến trong nhiều loài động thực vật và vi sinh vật Tuy nhiên các chế phẩm enzyme thương mại hiện nay được thu nhận chủ yếu

từ nấm men, đặc biệt là từ giống Saccharomyces Tùy theo nguồn thu nhận mà các

bậc cấu trúc và phân tử lượng của enzyme cũng như tính chất động học của chúng

sẽ khác nhau Đối với S cerevisiae, người ta tìm thấy tồn tại ở hai không gian khác

nhau trong tế bào Invertase thứ nhất tồn tại ở khoảng không gian giữa màng tế bào

và màng tế bào chất (không gian chu chất), có khối lượng phân tử khoảng 270 KDa Invertase này có bản chất là một glycoprotein với mức độ glycose hóa cao và giữ vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa sucrose vì cơ chất không có khả năng thấm qua màng tế bào chất Invertase thứ hai tồn tại trong tế bào chất, trọng lượng phân tử khoảng 135 KDa, chỉ thoát ra ngoài khi màng tế bào bị vỡ hoặc tính thấm của màng bị thay đổi Sự tạo thành invertase được kiểm soát bởi sự ức chế dị hóa trong quá trình dị hóa Các sản phẩm của quá trình thủy phân sucrose là các chất ức chế invertase

Invertase bền trong khoảng pH từ 3,5÷5,5, hoạt động tốt ở pH 4,5 Nồng độ sucrose từ 2÷10% tối cho sự thủy phân của invertase Hoạt độ invertase chỉ còn ¼ khi nồng độ sucrose tăng lên 70-80% trong cùng điều kiện pH tối ưu 4,5 [2, 68, 75]

1.2.2 Nguyên lý điều hòa sinh tổng hợp enzyme invertase của nấm men

Enzyme invertase là một loại protein, được tổng hợp trong tế bào Tế bào được cấu tạo và hoạt động như một nhà máy tự động hóa hoàn toàn, sản xuất ra enzyme Ở đó, ty thể luôn luôn sẵn sàng cung cấp năng lượng thông qua phản ứng thuận nghịch của ATP DNA có trong nhân tế bào điều khiển các quá trình tổng hợp enzyme và xác định chính xác các trình tự amino acid trong cấu trúc enzyme Nơi tạo ra tiền enzyme trong tế bào là ribosome Đây được coi như phân xưởng sản xuất chính các loại enzyme

Mỗi enzyme được tổng hợp ra được điều khiển bởi một gen Như vậy gen quyết định đến cấu trúc enzyme, chiều hướng phản ứng của enzyme Nếu gen bị thay đổi cấu trúc, enzyme bị thay đổi theo và phản ứng sẽ bị thay đổi hoàn toàn

Sinh tổng hợp enzyme invertase còn bị điều khiển bởi cơ chế thứ hai là cơ chế cảm ứng Theo đó, những chất cảm ứng sucrose (cơ chất đặc hiệu) có trong môi trường có tác dụng đặc hiệu lên tế bào Từ đó hình thành chuỗi thông tin Các gen

có trách nhiệm tổng hợp ra enzyme tương ứng với chất cảm ứng đó sẽ được hình thành Enzyme này sẽ tham gia phân hủy cơ chất, hệ thống điều khiển quá trình tổng hợp sẽ hoạt động liên tục

Trong sản xuất enzyme, quá trình sinh tổng hợp enzyme còn được điều khiển bằng cơ chế kiềm hãm tốc độ sinh tổng hợp enzyme bằng sản phẩm cuối cùng Cơ chế này gọi là cơ chế ức chế ngược bởi sản phẩm cuối cùng Khi sản phẩm cuối cùng được tạo ra sẽ phong tỏa toàn bộ hệ thống hoạt động điều khiển sự tổng hợp enzyme tạo ra sản phẩm cuối Như vậy, muốn cho quá trình tổng hợp enzyme xảy ra liên tục thì phải lấy sản phẩm cuối ra khỏi quá trình sản xuất enzyme hoặc tìm

phương pháp chuyển hóa tiếp sản phẩm đó bằng sự chuyển hóa khác để tạo ra sản phẩm khác [18, 62, 67]

1.2.3 Cơ chế xúc tác enzyme invertase

Theo khảo sát của Reddy và Maley (1996) trên invertase từ nấm men S cerevisiae, có hai acid amine trong phân tử enzyme giữ vai trò quan trọng để xúc

tác thủy phân là aspartide ở vị trí 23 (Asp-23) và glutamide ở vị trí 204 (Glu-204) trong chuỗi polypeptide Cơ chế xúc tác theo thứ tự như sau :

 Invertase tạo phức chất với sucrose thông qua trung tâm hoạt động tại vị trí Glu-204 bằng liên kết hydro

 Gốc fructose trong phân tử

sucrose liên kết cộng hóa trị với

Asp-23 của phân tử invertase tại

1.2.4 Các ứng dụng của enzyme invertase

Ngày nay các chất xúc tác sinh học được ứng dụng ngày càng rộng rãi trong công ngiệp thực phẩm nói chung và trong lãnh vực sản xuất thức uống nói riêng

Hình 1.5: Cơ chế xúc tác của invertase [2]

Sản xuất đường nghịch đảo bằng phương pháp enzyme có một số ưu điểm so với trường hợp sử dụng xúc tác acid như:

Điều kiện phản ứng ôn hòa hơn: nhiệt độ 50-60oC, pH tối thích nằm trong vùng acid yếu Điều này giúp tiết kiệm chi phí năng lượng trong sản xuất và ngăn ngừa hiện tượng sẫm màu của syrup

Chất lượng syrup thu được sẽ tốt hơn: sản phẩm không có nguy cơ nhiễm kim loại nặng như trường hợp sử dụng acid vô cơ làm xúc tác

Với những lợi thế của syrup đường nghịch đảo bằng enzyme như tăng độ ngọt và cải thiện vị ngọt của syrup; tăng hàm lượng chất khô; ổn định chất lượng syrup, ngăn ngừa hiện tượng tái kết tinh đường; tăng khả năng ức chế vi sinh vật trong syrup, độ tinh khiết cao…việc sử dụng invertase tạo syrup đường nghịch đảo trong công nghiệp thực phẩm-đồ uống, công nghiệp sữa mà còn ứng dụng trong y học Invertase được ứng dụng trong sản xuất bánh ngọt, chocolate, sữa cô đặc (vỏ bánh có màu đẹp, nhân bánh mềm mại), mứt trái cây (nâng cao hương vị và kết cấu mứt), nước ngọt, mật ong nhân tạo, thực phẩm trẻ em…Đường nghịch đảo bằng invertase là một chất ngọt thân thiện với sức khỏe con người, đường fructose có thể

sử dụng cho bệnh nhân tiểu đường vì sự trao đổi chất của nó độc lập với insulin [28, 61]

1.3 Tổng quan về cố định tế bào vi sinh vật

1.3.1 Đặc điểm và tính chất của tế bào cố định

Cố định tế bào được hiểu là sự giam giữ hoặc định vị lại các tế bào trong một không gian phản ứng sao cho chúng bảo toàn được đặc tính xúc tác sinh học và giữ cho được các đặc tính sống của chúng để các tế bào có thể tái sử dụng nhiều lần hoặc liên tục sản xuất ra các sản phẩm mong muốn

Tế bào vi sinh vật là nguồn dự trữ tự nhiên và sinh tổng hợp mạnh mẽ các chất có hoạt tính sinh học như: enzyme, vitamin, acid amin và các hormone sinh

trưởng Việc cố định tế bào có ý nghĩa rất quan trọng, đặc biệt là khi enzyme cần nghiên cứu có độ ổn định thấp, hoạt tính enzyme tách ra thấp hơn so với enzyme nội bào; việc tách và tinh sạch enzyme đòi hỏi kỹ thuật công nghệ cao, không hiệu quả…

Tế bào cố định có khả năng thực hiện nhiều phản ứng enzyme kế tiếp nhau, vấn đề đặt ra là cần khai thác loại enzyme nào có trong vi sinh vật để chủ động điều khiển các điều kiện tối ưu trong nuôi cấy

Cố định tế bào còn giúp tế bào và enzyme nội bào được bảo vệ khỏi tác động của các yếu tố cơ học, hóa học, ánh sáng…Sau khi thực hiện phản ứng, các enzyme nội bào không bị phân hủy, enzyme được tự do và tiếp xúc với cơ chất mới Khi hoạt lực enzyme giảm, có thể phục hồi lại hoạt động sống cho tế bào, theo đó hoạt lực của enzyme được khôi phục và tái sử dụng

Việc cố định tế bào vi sinh vật sẽ giúp giải quyết được nhiều qui trình công nghệ có ý nghĩa kinh tế ở qui mô sản xuất công nghiệp Tế bào cố định cho phép thay thế lên men gián đoạn bằng lên men liên tục, tạo ra mật độ tế bào lớn trong thiết bị lên men, rút ngắn thời gian lên men, tăng năng suất Tạo điều kiện tách tế bào ra khỏi môi trường lên men Việc thu hồi sinh khối dễ dàng hơn

Bên cạnh những ưu điểm vượt trội, việc sử dụng tế bào cố định cũng tồn tại một vài nhược điểm như các protease có mặt trong tế bào có thể phản ứng thủy giải đối với enzyme Có thể xảy ra phản ứng không đặc hiệu do tác động hoạt động sinh

lý và sinh hóa tế bào [4, 45, 65]

1.3.2 So sánh việc sử dụng enzyme trong tế bào cố định so với enzyme tự do

Sử dụng enzyme trong tế bào cố định xúc tác phản ứng sinh học, sẽ có những mặt tích cực rất có ý nghĩa về mặt kỹ thuật, công nghệ cũng như hiệu suất được biểu hiện qua những ưu và nhược điểm so với enzyme tự do

Enzyme trong tế bào cố định có tính bền nhiệt, acid, kiềm dung môi hữu cơ hay một số ion kim loại nặng hơn enzyme tự do vì chúng được bảo vệ bởi chất mang

Enzyme trong tế bào cố định không đòi hỏi công đoạn tách chiết và tinh chế enzyme ra khỏi tế bào Quá trình tách chiết và tinh sạch enzyme trải qua nhiều công đoạn như phá vỡ tế bào, ly tâm dung dịch huyền phù, kết tủa và tinh sạch enzyme…

đã làm giảm hoạt độ enzyme và tăng giá thành chế phẩm cao Sử dụng chế phẩm enzyme cố định trong tế bào đã tìm ra giải pháp kỹ thuật lớn trong công nghệ enzyme, đó là sử dụng được enzyme xúc tác đúng mục đích công nghệ song không cần phải tách chiết enzyme

Enzyme trong tế bào cố định có khả năng tái sử dụng nhiều lần, hoạt tính của enzyme ít thay đổi trong những lần tái sử dụng Đặc điểm này làm cho việc sử dụng enzyme cố định mang lại hiệu quả kinh tế cao trong quá trình sản xuất

Enzyme trong tế bào cố định không lẫn vào sản phẩm cuối của phản ứng, do

đó không phải tách enzyme ra khỏi sản phẩm, sản phẩm cuối thu được tương đối sạch

Đó là những ưu điểm, tuy nhiên so với enzyme tự do, enzyme trong tế bào cố định cũng tồn tại những hạn chế như phản ứng giữa cơ chất và enzyme trong tế bào

cố định có thể xảy ra hiện tượng cạnh tranh cơ chất với enzyme và chất mang Sự khuếch tán cơ chất và các sản phẩm phản ứng bị cản trở làm giảm tốc độ phản ứng [45, 49]

1.3.3 Các phương pháp cố định tế bào

Hình 1.6: Sơ đồ các phương pháp cố định tế bào [4]

Không mang chất mang

Phương pháp khác

Liên kết

cộng hóa

trị

Liên kết hấp phụ

Nhốt trong

hệ sợi tổng hợp

Nhốt trong cấu trúc gel

Liên kết chéo

Màng Membrane

Gel lạnh sâu

Cố định liên hợp

Trong các phương pháp trên, người ta thường sử dụng hai phương pháp: cố định tế bào trên bề mặt chất mang và cố định tế bào trong lòng chất mang

Phương pháp cố định tế bào trên bề mặt chất mang

Cố định tế bào trên bề mặt chất mang bằng liên kết hấp phụ: quá trình hấp phụ tế bào lên bề mặt chất mang là quá trình vật lý có sự tham gia của một số lực liên kết Đó là tác động qua lại của các lực liên kết hydro và liên kết ion khác cực Phương pháp có ưu điểm đơn giản, ít ảnh hưởng đến cấu hình của chất xúc tác sinh học của tế bào Tuy nhiên, liên kết hấp phụ tương đối yếu, tế bào dễ bị phản hấp phụ khi có sự thay đổi về nhiệt độ, đặc biệt là sự thay đổi về nồng độ ion hay nồng

độ cơ chất

Cố định tế bào trên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị: được biểu hiện qua những đôi điện tử góp chung tạo liên kết tương đối bền giữa chất mang và tế bào Phương pháp thường được thực hiện bằng cách cho chất mang vào dịch huyền phù

tế bào và khuấy một thời gian Nhược điểm của phương pháp này là chất xúc tác sinh học phải chịu tác động cơ học dẫn đến dễ thay đổi về hình dạng, cấu trúc và hoạt lực sinh học

Cố định tế bào trên chất mang bằng liên kết ion: phương pháp dựa vào lực hút tĩnh điện giữa các điện tích trái dấu của chất mang và tế bào Phương pháp được thực hiện đơn giản bằng cách cho chất mang vào dung dịch huyền phù tế bào và khuấy một thời gian, hoặc cho dịch tế bào chảy qua lại chất mang Chất mang được

sử dụng cho phương pháp này là chất trao đổi ion DEAE cellulose và sephadex Sau khi dùng một thời gian nếu lực hấp thụ giảm có thể phục hồi bằng cách tái sinh [45, 68]

Phương pháp cố định tế bào trong lòng chất mang

Nhốt tế bào trong gel: phương pháp dựa trên cơ sở tạo ra một lớp màng bọc hay một polymer Tế bào được trộn trong một polymer, sự có mặt của một hay

nhiều tác nhân khâu mạch, quá trình trùng hợp tạo ra phức chalate Các thành phần dinh dưỡng trong môi trường và sản phẩm phản ứng có thể thẩm thấu vào trong hoặc ra ngoài thông qua màng bọc và tế bào vẫn được giữ nguyên trong khuôn gel

Nhốt trong hệ sợi: nhốt tế bào trong hệ sợi có khả năng xúc tác tốt hơn phương pháp nhốt trong hệ gel Các sợi để nhốt thường là những sợi nhân tạo Các loại sợi này có độ bền với acid, kiềm, các loại ion và dung môi hữu cơ hòa tan [ 45, 65]

1.3.4 Chất mang cố định tế bào

1.3.4.1 Các yêu cầu của chất mang lý tưởng

Chất mang có tính quyết định đến chất lượng của quá trình cố định tế bào Vì vậy, tùy vào mục đích sử dụng tế bào cố định có những yêu cầu khác nhau đối với chất mang Song nhìn chung chất mang phải đảm bảo một số tính chất như sau:

 Chất mang có độ tinh khiết cao, tạo điều kiện tốt cho tế bào phát triển, bảo vệ

tế bào khỏi các tác động của các yếu tố cơ học và ánh sáng

 Chất mang có tính cơ lý bền vững, ổn định chịu được các tác động (khuấy,

áp lực…) trong quy trình sản xuất

 Chất mang bền vững về mặt hóa học, không tan trong môi trường phản ứng, không phản ứng với cơ chất và sản phẩm do tế bào tạo ra, có khả năng tái sử dụng được nhiều lần

 Chất mang có tính kháng khuẩn cao, bền với sự tấn công của vi sinh vật

 Chất mang có độ trương tốt, diện tích tiếp xúc bề mặt lớn làm tăng khả năng

cố định và tăng khả năng tiếp xúc cơ chất

 Chất mang có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể ở dạng hạt, dạng màng hay dạng phim mỏng, phù hợp với nhiều loại thiết bị

 Chất mang rẻ tiền, dễ kiếm, dễ sản xuất và an toàn sinh học [68,79]

1.3.4.2 Cố định tế bào trên chất mang cellulose vi khuẩn

Cấu trúc cellulose vi khuẩn

Cellulose là dạng polymer sinh học có nhiều nhất trên trái đất, là cấu trúc chính của sinh khối thực vật, nhưng cũng là một trong những polymer ngoại bào của vi sinh vật Cellulose là một polysaccharide mạch thẳng của các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glycoside Cellulose thực vật và cellulose vi khuẩn có cùng cấu trúc hóa học nhưng khác nhau về đặc tính

Hình 1.8: Cấu tạo phân tử cellulose [66]

Hình 1.9: Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật [66]

Cellulose vi khuẩn được tạo ra từ loại vi khuẩn lên men acid acetic, Acetobacter xylinum Đường kính BC bằng khoảng 1% cellulose từ thực vật BC

còn khác với cellulose thực vật ở mức độ polymer hóa BC có từ 2000-6000 đơn

Hình 1.10: Cơ chế sinh tổng hợp BC của A xylinum [22]

phân, một số trường hợp có thể lên đến 20000, trong khi đó số lượng đơn phân trung bình ở thực vật từ 13000-14000

Những chuỗi BC mới tạo thành tập hợp lại thành subfibrils (dài 1,5nm) Nhiều subfirbrils kết hợp lại thành microfibrils có dạng bó (bundles) và dãi (ribbons) Những dãi BC, dài từ 1-9mm, tạo thành cấu trúc lưới đậm đặc ổn định nhờ liên kết hydro ngoại phân tử [13, 51]

trường tự nhiên, đa số vi khuẩn tổng

hợp polysaccharide ngoại bào tạo

thành lớp màng bao quanh tế bào

BC là một trong số những chất này

Độ nhớt và đặc tính ưa nước của BC

giúp vi sinh vật tăng khả năng kháng

lại điều kiện bất lợi của môi trường

(giảm lượng nước, thay đổi pH, các

chất độc, sinh vật nhiễm…) Nhờ

vậy vi sinh vật có thể tăng trưởng và

phát triển bên trong lớp màng BC

còn giúp vi sinh vật chống lại sự

chiếu xạ và tia cực tím BC được

khi nguồn thức ăn cạn kiệt, chúng được phân giải bởi enzyme exo và endo- glucanase [22, 76]

Cơ chế sinh tổng hợp BC từ A xylinum

A.xylinum hấp thụ đường glucose từ môi trường nuôi cấy Trong tế bào vi

khuẩn glucose sẽ kết hợp với acid béo tạo thành một tiền chất nằm trên lớp màng tế bào Chất này thoát ra ngoài tế bào cùng với một enzyme, enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose [22]

Sự tổng hợp xảy ra như sau

( X-X-X-X-)n+ UDP-X  ( X-X-X-X-X-) n+1+ UDP

Các tính chất của BC dùng làm chất cố định tế bào

Một trong những tính chất quan trọng của BC là tính thuần khiết về mặt hóa học, trong khi cellulose từ thực vật chứa nhiều hemicelluloses và lignin cấu trúc, gây khó khăn trong xử lý {BC có những tính chất đáp ứng đủ yêu cầu của một chất

BC có cấu trúc siêu lỗ, có thể nhốt tế bào vào trong nhưng đồng thời có thể cho cơ chất đi vào và sản phẩm đi ra trong quá trình phản ứng [51]

Cố định tế bào trên BC

Tế bào được cố định trên chất mang BC bằng phương pháp bẫy hấp phụ gồm hai giai đoạn:

 Giai đoạn hấp phụ: ngâm BC trong dịch tế bào, BC sẽ trương nở về trạng thái ban đầu, đồng thời sẽ hấp phụ tế bào vào hệ thống sợi bên trong cũng như trên bề mặt bên ngoài

 Giai đoạn bẫy tăng sinh: các tế bào được hấp phụ tiếp tục phát triển và tăng sinh trên giá đỡ BC, khi tiếp tục ủ ở điều kiện tối ưu của vi sinh vật [7, 33]

1.3.4.3 Cố định tế bào trên chất mang alginate

Cấu trúc alginate

Alginate là tên gọi chung họ các muối của acid alginic, đó là một polyme mạch thẳng được tạo từ liên kết 1,4 glucoside của 2 monomer là acid β-D-manuronic (M) và acid α-L-guluronic (G)

Sự kết hợp này không phải ngẫu nhiên mà thành 3 block như sau:

 Block homopolyguluronic gồm các acid guluronic: G-G-G-G-G

 Block homopolymannuronic gồm các gốc mannuronic:M-M-M-M-M

 Block luân hợp hai acid mannuronic và gluronic: M-G-M-G-M-G

Alginate được xem như một copolymer block Độ dài trung bình của mạch phân tử, độ dài của mỗi block, tỷ lệ và trình tự kết hợp của chúng với nhau tùy theo nguồn gốc của alginate [16, 126]

Hình 1.11: Cấu trúc alginate [16]

Hình 1.12 Các loại block của alginate [79]

Một số tính chất của alginate

Acid alginic không tan trong nước nhưng có khả năng hấp thu một lượng nước lớn, trương nở và tạo thành bột nhão Ngược lại, các muối Na+, K+, NH4+ alginate tan trong nước tạo thành dung dịch có độ nhớt cao Alginate có khối lượng phân tử trung bình càng lớn thì độ nhớt dung dịch càng lớn Độ nhớt của dung dịch alginate còn phụ thuộc vào nhiệt độ, khi nhiệt độ tăng 1oC độ nhớt giảm khoảng 2,5% Độ nhớt của dung dịch alginate không bị ảnh hưởng trong khoảng pH từ 5-

11

Alginate có khả năng tạo gel trong những điều kiện nhất định Khi phản ứng với ion hóa trị 2 và 3, dung dịch alginate sẽ tạo gel theo hình “hộp trứng” Các gel được hình thành ở nhiệt độ phòng hay bất cứ nhiệt độ nào cho đến 100oC và chúng không tan chảy khi đun nóng [16, 47]

Cơ chế của quá trình tạo gel alginate calcium

Cơ chế tạo gel được mô tả bằng phản ứng

3Alg-Na + CaY2  (Alg)2Ca +NaY

Hình 1.13 Cơ chế của quá trình tạo gel alginate [45]

Y: anion

Alg: anion aginate

NaY có khả năng giữ Ca2+ dưới

dạng hòa tan hoặc không hòa

tan

Sodium alginate ngâm

trong nước trương nở tạo dung

dịch có nhớt Khi được nhỏ

vào dung dịch Ca2+, Na+

được thay thế bởi Ca2+, hình thành hạt xốp calcium alginate không tan trong dung dịch Các tế bào vi sinh vật hoặc enzyme có thể được hòa trộn vào dung dịch Alg-

Na và sẽ được cố định trong hạt gel Alg-Ca [45, 47]

Bản chất của quá trình định hình và cấu trúc hạt gel khi sử dụng chất mang là alginate có thể diễn ra theo hai phương pháp: phương pháp khuếch tán hoặc phương pháp tạo hạt gel bên trong

Tạo gel theo phương pháp khuếch tán: Các ion tạo gel ở bên ngoài giọt dung dịch sodium alginate và khuếch tán vào bên trong Phương pháp có đặc điểm là động học tạo gel nhanh và với đặc điểm đó được ứng dụng cho mục đích cố định các tác nhân có hoạt tính sinh học như enzyme hay tế bào Hạt gel tạo thành có cấu tạo không đồng thể cao, biểu hiện ở chỗ alginate sẽ tập trung phần lớn vùng bề mặt

và giảm dần vào phía trong hạt gel

Phương pháp tạo gel bên trong: dựa trên việc cho các ion liên kết ngang ở dạng vô hoạt vào trong dung dịch sodium alginate Ví dụ như ion Ca2+ thì dùng dạng CaCO3, CaSO4 hoặc ở dạng phức với các tác nhân chelating như EDTA,citrate…Khi pH thay đổi, Ca2+ sẽ giải phóng ra dần dần Quá trình tạo gel chậm sẽ tạo ra gel có tính đồng thể cao hơn

Khi nhỏ hỗn dịch Na-Alg-tế bào nấm men từng giọt xuống dung dịch tạo gel CaCl2, các ion Ca2+ sẽ tác dụng rất nhanh với các phân tử alginate ở bề mặt giọt dung dịch và quá trình tạo gel bắt đầu Ion Ca2+ sẽ liên kết với các nhóm COO- ở 4 gốc G và các nhóm -OH trên hai chuỗi alginate khác nhau, tạo hình “hộp trứng”

Hình 1.14 Cấu tạo hình “hộp trứng” của Alg-Ca [79]

Các chuỗi khác tiếp tục chồng lên trên theo mô hình “hộp trứng” Các ion

Ca2+ khuếch tán từ ngoài vào trong, vùng gel ở bề mặt sẽ dịch dần vào trong làm hạt gel bị co rút lại, đẩy nước thoát ra ngoài dẫn đến thể tích hạt gel giảm dần, khối lượng hạt gel giảm tương ứng Mạng lưới gel phía ngoài dầy lên dần, sự khuếch tán

Ca2+ vào sâu bên trong chậm lại, dẫn đến mạng lưới gel phía trong thưa hơn

Sự chuyển động và sắp xếp alginate trong quá trình tạo gel, đã kéo theo sự phân bố của tế bào vi sinh vật Tế bào tụ tập quanh các mạng lưới gel Và sự bao bọc của “hộp trứng” làm tế bào vi sinh vật được “nhốt kín” và khó thoát ra ngoài trong quá trình sử dụng Tuy nhiên, quá trình tạo gel như trên làm cho sự phân bố tế bào trong hạt gel không đồng đều Tế bào vi sinh vật sẽ tập trung chủ yếu ở biên trong của hạt gel, càng vào sâu vùng hạt gel, mật độ tế bào càng giảm nhanh Sự phân bố tế bào ở gần bề mặt với mật độ cao, giúp phân tử cơ chất khuếch tán từ môi trường vào tế bào và sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra môi trường ngắn nhất [19,

23, 40, 58]

1.3.4.4 Phức chất mang BC-alginate

Bên cạnh những đặc tính tốt của chất mang BC trong cố định tế bào vi sinh vật như: độ tinh khiết cao, khả năng giữ tế bào bên trong mạng lưới cấu trúc cellulose rất tốt, khả năng đàn hồi và tính chất cơ lý bền vững…cũng tồn tại một vài nhược điểm như liên kết hấp phụ của tế bào và ở bề mặt ngoài BC kém bền, làm hiện tượng rửa trôi tế bào trong quá trình phản ứng xảy ra Khác với sự phân bố tế bào trên giá thể BC, tế bào nhốt trong mạng lưới gel alginate tập trung chủ yếu ở biên trong, càng vào sâu vùng tâm hạt gel, mật độ tế bào càng giảm mạnh và ở vùng lõi hầu như rỗng và chỉ chứa nước Cũng chính sự phân bố tế bào ở gần vùng bề mặt với mật độ cao, làm cho khoảng cách mà phân tử cơ chất khuếch tán từ môi trường vào tế bào được rút ngắn Sự kết hợp của hai loại chất mang BC và alginate tạo ra phức chất mang BC-alginate (gel alginate bao bọc phía ngoài BC) mục đích

sẽ phát huy được những ưu điểm, đồng thời khắc phục các nhược điểm của mỗi chất mang mang lại hiệu quả kinh tế trong sản xuất Phức chất mang BC-alginate sẽ cố định lượng tế bào bên trong và bề mặt ngoài bền vững hơn chất mang BC hay alginate, đồng thời phức chất mang BC-alginate sẽ có hình dạng phù hợp với các thiết bị lên men, có độ chịu lực tác động cơ học cao hơn alginate nhiều [15, 58, 66]

1.4 Tổng quan về cây Mía

1.4.1 Giới thiệu cây Mía

Hình 1.15: Cây mía [82]

Bảng 1.1: Bảng phân loại khoa học mía [81]

Đặc điểm hình thái

Mía là loại cây thảo, cao, sống dai nhờ rễ Thân đặc cao từ 2÷5m Lá phủ một lớp sáp, lá to, bẹ có nhiều lông, dễ rụng, đốt dài từ 5÷10cm, rộng từ 3÷6cm, màu lục, vàng hay đỏ tím, có một gân trắng ở giữa Cụm hoa là chùy (cờ) rộng và to ở ngọn cây, mang hoa dày đặc, bông nhỏ có một hoa sinh sản

Tính vị, tác dụng

Mía có vị ngọt, ngon, tính mát, có tác dụng giải khát, mát phổi, lợi đàm, điều hòa tỳ vị Là nguyên liệu chính sản xuất đường kính ở các nước khí hậu nhiệt đới [32]

Thành phần hóa học của nước mía