Thu nhận enzyme phytase từ aspergillus ficuum, thử nghiệm, phân giải nguồn nguyên liệu làm thức ăn gia súc

- Về qui trình thu nhận, đã tiến hành khảo sát các thông số của quá trình nuôi cấy – thời gian lên men, nhiệt độ lên men, phổ pH hoạt động, khả năng chịu nhiệt của phytase từ chủng Asper

QUÁCH CẨM HỒNG

THU NHẬN ENZYME PHYTASE TỪ

ASPERGILLUS FICUUM, THỬ NGHIỆM

PHÂN GIẢI NGUỒN NGUYÊN LIỆU LÀM

THỨC ĂN GIA SÚC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ NGÀNH: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 11 năm 2007

Trân trọng biết ơn:

Ban Giám hiệu Trường Đại học Bách Khoa Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học Quý Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh học

Đã truyền đạt cho tôi những nền tảng tri thức vững chắc trong suốt thời gian học tập tại trường

Để có được kết quả luận án này, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến:

TS HOÀNG QUỐC KHÁNH

Đã tận tình hướng dẫn, luôn quan tâm và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận án của mình

Cô tuyến, bạn Sanh và các cô chú, anh chị tại Viện Sinh học Nhiệt đới đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này

Chị Ái, anh Duy, bạn Long và em Hiền thuộc phòng vi sinh Viện Sinh học Nhiệt đới đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện luận án này

Xin chân thành cảm ơn các Anh Chị và các Bạn lớp Cao học K2005, các bạn bè đồng nghiệp Khoa Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận án này

Cuối cùng, con xin gửi lời biết ơn vô hạn đến Ba Mẹ đã luôn yêu thương và luôn ủng hộ con tiếp bước trên con đường học vấn của mình

Đề tài nghiên cứu thu nhận enzyme phytase từ Aspergillus ficuum, thử

nghiệm phân giải nguồn nguyên liệu làm thức ăn gia súc dựa trên cơ sở sử

dụng nguồn cơ chất cảm ứng là cám ngô để thu nhận enzyme phytase rồi sau đó thử nghiệm phân giải nguồn phế phụ phẩm rẻ tiền sẵn có - cám ngô, cám mì, cám

gạo Đề tài đã được tiến hành nghiên cứu với những nội dung sau:

- Về môi trường nuôi cấy đã tiến hành lựa chọn được môi trường với thành

phần thích hợp cho hoạt độ enzyme phytase cao

- Về qui trình thu nhận, đã tiến hành khảo sát các thông số của quá trình nuôi cấy – thời gian lên men, nhiệt độ lên men, phổ pH hoạt động, khả năng chịu

nhiệt của phytase từ chủng Aspergillus ficuum

- Về tinh sạch, đã tiến hành khảo sát các phương pháp tủa – cồn, ammonium sulfate, polyethylene glycol 6000; tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel trên biogel P100; phân tách hệ enzyme phytase bằng phương pháp điện di

trên gel SDS – PAGE

- Về sản phẩm, đã nghiên cứu về hoạt độ, hàm lượng prôtêin, thử nghiệm

phân giải phytase trên nguồn nguyên liệu làm thức ăn gia súc, tạo chế phẩm enzyme phytase dạng lỏng và bột

Kết quả nghiên cứu cho thấy có thể sử dụng cám ngô như nguồn cơ chất để thu nhận enzyme phytase Chế phẩm enzyme dạng lỏng, bột có hoạt độ tương đương với các sản phẩm cùng loại trên thị trường Qui trình sản xuất enzyme phytase không quá phức tạp nên kết quả nghiên cứu rất khả thi và có thể đưa vào triển khai sản xuất và kinh doanh

This studying subject to receive enzyme phytase from Aspergillus ficumm,

test the splitting of material source used for livestock food which is based on use

of inducted substrate source, corn bran, to receive enzyme phytase, then

continue testing the splitting of available cheap waste material source such as bran of corn, manioc, rice, etc… The study was proceeded as follows:

- Nutrient medium was chosen to be the one with components well-suited to hight activity of enzyme phytase

- Receving procedure was carried on testing parameters of nutrient medium, fermentation time and temperature, acting pH spetrum, heat-proof

capacity of phytase from Aspergillus ficuum

- Purity was undergone to confirm examining the methods of alcolhol precipitation, ammonium sulfate, polyethylene glycol 6000, purifying enzyme by gel chromatography on biogel P100, separating enzyme phytase system by method of gel SDS-PAGE electrophoresis

- Products was carried on studying activity, protein content, testing phytase zymolysis on material source to produce livestock food, liquid and flour prepation

Studying results prove corn bran to be able to be used as the sustrate source to receive enzyme Liquid and flour enzyme preparation with activity equivalent to the same market products Procedure to manufacture enzyme phytase is not complex, therefore it is very realizable and able to be put into processing and trading

MỤC LỤC

Trang Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng biểu, hình vẽ

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Sơ lược quá trình nghiên cứu enzyme phytase 2

1.2 Axít phytic 8

1.2.1 Cấu trúc hóa học 10

1.2.2 Chức năng sinh lý 12

1.2.3 Tác động kháng dưỡng của axít phytic 13

1.3 Enzyme phytase 14

1.3.1 Định nghĩa 14

1.3.2 Phân loại và danh pháp 14

1.3.3 Cơ chế thủy phân của enzyme phytase 17

1.3.4 Nguồn thu nhận 20

1.3.4.1 Phytase từ thực vật 20

1.3.4.2 Phytase từ động vật 20

1.3.4.3 Phytase từ vi sinh vật 21

1.3.5 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của phytase 22

1.3.5.1 Nhiệt độ 22

1.3.5.2 pH 23

1.3.5.3 Tác động cơ chất 26

1.3.5.4 Khả năng chịu nhiệt 27

1.3.6 Các yếu tố vật lý ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase .28

1.3.6.1 Các yếu tố vật lý 28

1.3.6.2 Các yếu tố dinh dưỡng 29

1.4 Các ứng dụng của enzyme phytase 32

1.4.1 Trong công nghiệp thức ăn gia súc 32

1.4.2 Trong công nghiệp thực phẩm 33

1.4.3 Trong tổng hợp myo-inositol phosphate 34

1.4.4 Trong công nghiệp giấy và bột giấy 35

1.4.5 Các ứng dụng khác 35

1.5 Sơ lược về nấm mốc Aspergillus ficuum 36

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 38

2.1 Vật liệu 38

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 38

2.1.2 Các thiết bị chính 38

2.1.3 Nguyên liệu sử dụng làm cơ chất 38

2.1.4 Môi trường nuôi cấy nấm mốc 38

2.1.5 Hóa chất dùng xác định hàm lượng prôtêin 39

2.1.6 Hóa chất dùng xác định hoạt độ 39

2.1.7 Các hóa chất dùng trong định lượng đường tổng số bằng phản ứng màu 40

2.1.8 Các hóa chất dùng chạy điện di 40

2.1.9 Hóa chất dùng trong sắc ký lọc gel 41 2.1.10 Các hóa chất dùng xác định ảnh hưởng của pH lên hoạt độ

phytase 42

2.1.11 Các hóa chất dùng trong bảo quản enzyme phytase 42

2.2 Phương pháp 43

2.2.1 Qui trình thu nhận enzyme phytase 44

2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái Aspergillus ficuum 45

2.2.3 Phương pháp nuôi cấy Aspergillus ficuum sinh tổng hợp enzyme phytase 45

2.2.4 Phương pháp chiết dung dịch enzyme từ canh trường nuôi cấy nấm mốc 45

2.2.5 Xác định hoạt độ theo phương pháp của Murphy và Riley 46

2.2.6 Xác định hàm lượng prôtêin theo phương pháp Bradford 48

2.2.7 Phương pháp xác định đường tổng số bằng phản ứng màu 50

2.2.8 Phương pháp qui hoạch thực nghiệm 51

2.2.9 Nghiên cứu lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp phytase hoạt độ cao 52

2.2.10 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt độ phytase từ chủng A ficuum 53

2.2.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ phytase từ chủng A ficuum 53

2.2.12 Phổ pH hoạt động của phytase từ chủng A ficuum 53

2.2.13 Khả năng chịu nhiệt của phytase từ chủng A ficuum 53

2.2.14 Phương pháp tủa enzyme phytase 54

2.2.14.1 Phương pháp tủa bằng ethanol 54

2.2.14.2 Phương pháp tủa bằng ammonium sulfate (NH4)2SO4 .54 2.2.14.3 Phương pháp tủa bằng polyethylenglycol (PEG) 6000

55

2.2.14.4 Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme sau tủa .56

2.2.15 Phương pháp điện di trên gel SDS-polyacrylamid .57

2.2.16 Phương pháp sắc ký lọc gel (rây phân tử) 59

2.2.17 Phương pháp sấy phun enzyme phytase 62

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64

3.1 Kết quả quan sát hình thái 64

3.2 Định lượng đường tổng số bằng phản ứng màu 65

3.3 Khảo sát thành phần môi trường cho sinh tổng hợp phytase hoạt độ cao .66

3.4 Nghiên cứu lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp phytase hoạt độ cao 71

3.5 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt độ phytase từ chủng A ficuum 72

3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ phytase từ chủng A ficuum 74

3.7 Phổ pH hoạt động của phytase từ chủng A ficuum 75

3.8 Khả năng chịu nhiệt của phytase từ chủng A ficuum 77

3.9 Khảo sát các phương pháp tủa enzyme phytase 78

3.10 Thử nghiệm phân giải nguồn nguyên liệu làm thức ăn gia súc 82

3.11 Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel trên Biogel P-100 83

3.12 Phân tách hệ enzyme phytase bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE 86

3.13 Thử nghiệm bảo quản enzyme dạng lỏng, bột 89

3.13.1 Thử nghiệm bảo quản phytase dạng lỏng 89

3.13.2 Thử nghiệm bảo quản phytase dạng bột 95

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 99

4.1 Kết luận 99

4.2 Đề nghị 101

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HAP Histidine axít phytase

Hđph Hoạt độ enzyme phytase

HđR Hoạt độ riêng enzyme phytase

Hđs Hoạt độ riêng của dung dịch enzyme sau khi qua lọc gel

Hđt Hoạt độ riêng của dung dịch enzyme trước khi qua lọc gel IP6 hay InsP6 Myo-inositol hexakis dihydrogen phosphate

OD0 Mật độ quang của thử không

ODT Mật độ quang của thử thật

∆OD Hiệu số giữa mật độ quang của thử thật và thử không

TĂGS Thức ăn gia súc

UI Đơn vị hoạt độ (tính theo đơn vị quốc tế)

∑UI Tổng đơn vị hoạt độ (tính theo đơn vị quốc tế)

∑C Tổng hàm lượng prôtêin của dung dịch enzyme sau khi

qua lọc gel

∑H Tổng hoạt độ enzyme sau khi qua lọc gel

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Các công ty sản xuất chế phẩm phytase vi sinh

Bảng 1.2: Hàm lượng phospho tổng, phytate của các loại hạt dùng trong chế biến thức ăn gia súc

Bảng 1.3: Cơ chế thủy phân của enzyme phytase

Bảng 1.4: Giá trị pH và nhiệt độ tối ưu của các loại phytase

Bảng 2.1: Xây dựng đường chuẩn phospho

Bảng 2.2: Xây dựng đường chuẩn albumin

Bảng 2.3 Xây dựng đường chuẩn saccharose

Bảng 2.4: Lượng ammonium sulfate bổ sung theo độ bão hòa

Bảng 2.5: Lượng PEG bổ sung

Bảng 3.1: Hàm lượng đường trong rỉ đường

Bảng 3.2: Mức thí nghiệm của các yếu tố

Bảng 3.3: Bảng ma trận thực nghiệm và kết quả

Bảng 3.4: Bảng kết quả tối ưu theo phương pháp leo dốc

Bảng 3.5: Hoạt độ tổng của enzyme phytase trong dịch nuôi cấy trên các môi trường khác nhau

Bảng 3.6: Hoạt độ riêng của enzyme phytase trong dịch nuôi cấy trên các môi trường khác nhau

Bảng 3.7: Hoạt độ tổng phytase trong canh trường nuôi cấy A ficuum theo thời

gian nuôi cấy

Bảng 3.8: Hoạt độ riêng phytase trong canh trường nuôi cấy A ficuum theo thời

gian nuôi cấy

Bảng 3.9: Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến hoạt độ phytase của chủng A ficuum Bảng 3.10: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ phytase của chủng A ficuum

Bảng 3.11: Khả năng chịu nhiệt của phytase từ chủng A ficuum

Bảng 3.12: Kết tủa phytase bằng cồn

Bảng 3.13: Kết tủa phytase bằng ammonium sulfate

Bảng 3.14: Kết tủa phytase bằng polyethylene glycol 6000

Bảng 3.15: Lượng phosphat phóng thích khi phân giải nguồn nguyên liệu làm thức ăn gia súc

Bảng 3.16: Hoạt độ riêng phytase, hàm lượng prôtêin sau sắc ký

Bảng 3.17: Giá trị Rf và Log (trọng lượng phân tử) của những prôtêin trong thang chuẩn

Bảng 3.18: Kết quả theo dõi biến đổi hoạt độ và hiệu suất hoạt độ của chế phẩm enzyme phytase theo thời gian (Nhiệt độ bảo quản 28-30oC)

Bảng 3.19: Kết quả theo dõi biến đổi hoạt độ và hiệu suất hoạt độ của chế phẩm enzyme phytase theo thời gian (Nhiệt độ bảo quản 5-6oC)

Bảng 3.20: Kết quả theo dõi biến đổi hoạt độ và hiệu suất hoạt độ của chế phẩm enzyme phytase theo thời gian (Nhiệt độ bảo quản -5oC)

Bảng 3.21: Hiệu suất thu hồi enzyme sau khi sấy

Bảng 3.22: Kết quả theo dõi hoạt độ và hiệu suất hoạt độ của chế phẩm enzyme phytase theo thời gian (Nhiệt độ bảo quản 28-30oC)

Bảng 3.23: Kết quả theo dõi hoạt độ và hiệu suất hoạt độ của chế phẩm enzyme phytase theo thời gian (Nhiệt độ bảo quản 5-6oC)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Một số chế phẩm phytase dạng bột và lỏng trên thị trường

Hình 1.2: Cấu trúc của axít phytic (myo-inositol hexakis dihydrogen phosphate) Hình 1.3: Phức phytate trong tự nhiên

Hình 1.4: Axít phytic tồn tại dưới dạng không liên kết với kim loại hoặc tạo phức hợp với kim loại

Hình 1.5: Phản ứng thủy phân phytase

Hình 1.6: Cấu trúc không gian 3 chiều của Alkaline phytase và HAP

Hình 1.7: Cây phát sinh chủng loài của hai loại Histidine axít phytase và line phytase

Alka-Hình 1.8: Sơ đồ thủy phân histidine axít phosphatases (HAPs) và alkaline phytase

Hình 1.9 : Khẩu phần của lợn được bổ sung enzyme phytase

Hình 1.10 : Khẩu phần của gà được bổ sung enzyme phytase

Hình 1.11: Tảo phát triển do sự dư thừa phospho trong nước

Hình 1.12: Tảo phát triển gây sự thiếu oxy trong nước làm cá chết

Hình 1.13: Đặc điểm hình thái Aspergillus ficuum

Hình 2.1 Qui trình thu nhận enzyme phytase

Hình 2.2: Bộ điện di prôtêin Cole - Parmer

Hình 2.3: Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio - Rad

Hình 2.4: Máy sấy phun Mini- Spray Dryer, Model ADL 31,Yamoto, Nhật

Hình 3.1: Hình thái Aspergillus ficuum trên môi trường thạch đĩa

Hình 3.2: Khuẩn ty và đính bào tử của Aspergillus ficuum quan sát qua kính hiển

vi quang học vật kính 40X

Hình 3.3: Khả năng tổng hợp phytase trên các môi trường khác nhau

Hình 3.4: Sự biến đổi hoạt độ phytase trong canh trường nuôi cấy A ficuum theo

thời gian

Hình 3.5: Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến hoạt độ phytase của chủng A ficuum Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ phytase của chủng A ficuum

Hình 3.7: Khả năng chịu nhiệt của phytase từ chủng A ficuum

Hình 3.8: Hiệu suất thu hồi enzyme khi sử dụng các tác nhân tủa khác nhau

Hình 3.9: Lượng phosphate phóng thích khi phân giải nguồn nguyên liệu làm thức ăn gia súc

Hình 3.10: Sơ đồ sắc ký Biogel – P100 tinh sạch enzyme phytase

Hình 3.11: Điện di prôtêin trên gel polycrylamid SDS-PAGE các dịch enzyme từ môi trường nuôi cấy khác nhau

Hình 3.12: Điện di prôtêin trên gel polycrylamid SDS-PAGE của dịch enzyme sau sắc ký

Hình 3.13: Biểu diễn sự tương quan giữa giá trị Rf và Log (trọng lượng phân tử) của các prôtêin trong thang chuẩn

MỞ ĐẦU

Phospho là nguyên tố quan trọng cho sự sống, tham gia vào cấu tạo DNA, RNA và cấu tạo tế bào, hay vận chuyển năng lượng tế bào thông qua ATP (adenosine triphosphat) Phospho có nhiều trong các cây họ đậu và nó được dự trữ ở dạng phytate hoặc axít phytic Các động vật dạ dày đơn ngăn như gia cầm, lợn và cá không thể hấp thụ phospho trong axít phytic vì chúng thiếu enzyme nội sinh có khả năng thủy phân phytate Bên cạnh đó axít này còn ngăn cản khả năng kết hợp của các ion kim loại, prôtêin với các axít béo không no, dẫn tới làm giảm khả năng tiêu hóa thức ăn của gia súc, gây hiệu ứng kháng dinh dưỡng

Chính vì vậy đa số các loại thức ăn cho gia súc, gia cầm có nguồn gốc từ các loại đậu, ngô cần được bổ sung phytase, một enzyme có khả năng phân giải axít phytic thành inositol và phospho vô cơ Phytase được tìm thấy chủ yếu ở thực

vật, động vật, nấm men, nấm mốc, vi khuẩn, đặc biệt là chi Aspergillus vì chúng

có khả năng tổng hợp enzyme phytase cao và có thể chịu được pH thấp

Nước ta là một nước nông nghiệp, ước tính mỗi năm sản lượng lúa đạt gần

34 triệu tấn kéo theo lượng phế phụ phẩm tăng lên Với nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp dồi dào, rẻ tiền, sẵn có nên có ý nghĩa cho việc thu nhận enzyme phytase ở quy mô lớn để ứng dụng trong chăn nuôi

Với những lợi ích nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “THU NHẬN

ENZYME PHYTASE TỪ ASPERGILLUS FICUUM, THỬ NGHIỆM PHÂN

GIẢI NGUỒN NGUYÊN LIỆU LÀM THỨC ĂN GIA SÚC”

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƯỢC QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE

¾ Nghiên cứu trong nước

Hiện nay rất ít nghiên cứu về enzyme phytase cũng như chưa có cơ sở nào sản xuất và thương mại hóa chế phẩm enzyme phytase từ vi sinh vật mà chủ yếu là nhập từ nước ngoài Ở nước ta thì enzyme này đã được đưa vào sử dụng từ những năm 90, có thể kể đến một số nghiên cứu về enzyme phytase từ vi sinh vật như:

Năm 2003 Lê Thiên Minh và cộng sự đã phân lập được chủng

Aspergillus niger MP2 từ phân gà có khả năng tạo phytase trên nguồn phế phụ

phẩm nông nghiệp, sử dụng phương pháp nuôi cấy chìm trên môi trường cám ngô cho hoạt độ cao nhất là 2,45UI/ml, nhiệt độ lên men là 30oC, pH 5 và lên men trong thời gian 7 ngày [12]

Ngoài ra còn có tác giả Nguyễn Minh Hiệp - Trung tâm phát triển khoa học và công nghệ trẻ, nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp enzyme phytase từ VSV ứng dụng bổ sung thức ăn gia súc (Đề tài nghiên cứu thẩm định thông tin

2004 )

Năm 2005 tác giả Đỗ thị Huyền và cộng sự đã phân lập 27 chủng vi khuẩn từ 226 mẫu đất và phân gia cầm có khả năng tổng hợp phytase và đã

định loại được 7 chủng vi khuẩn là Bacillus subtilis có khả năng sinh phytase,

trong đó chủng B1 cho hoạt tính phytase cao nhất đạt 2850UI/lít; phân tích

trình tự đoạn gen 16S ARN riboxom khẳng định chủng B1 là Bacillus subtilis

.[7]

Năm 2006 tác giả Đỗ thị Huyền và cộng sự đã nghiên cứu khả năng

sinh phytase của chủng Bacillus subtilis B1, sử dụng phương pháp nuôi cấy

chìm trên nguồn cacbon là cám gạo và nguồn nitơ là casein kết hợp với

NH4NO3 Tại nhiệt độ 37oC chủng Bacillus subtilis B1 cho hoạt độ phytase

cao nhất bằng 0,123UI/ml, pH thích hợp nhất cho sinh tổng hợp phytase là pH 6,5-7,0, thời gian lên men là 74 giờ [8]

¾ Nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới enzyme phytase đã được nghiên cứu và đăng trên rất nhiều tạp chí Có thể liệt kê một số tác giả trong lịch sử nghiên cứu enzyme này như:

Suzuki và cộng sự lần đầu tiên phát hiện enzyme phytase khi nghiên cứu quá trình thủy phân ở cám gạo (1907), chính thức được thương mại hóa trên thị trường Châu Âu vào năm 1993-1994 bởi Gist-Brocades (DSM) và bán trên thị trường bởi BASF dưới tên thương mại là Natuphos Natuphos chuyên cung cấp các sản phẩm enzyme dạng bột, viên hay lỏng Đến nay nhờ sự tiến bộ của khoa học thì việc sản xuất phytase từ vi sinh (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc ) ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp thức ăn gia súc, tổng hợp myo-inositol phosphate, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, đã trở nên phổ biến Vào cuối thế kỷ 20, doanh số hàng năm của phytase ước tính khoảng 500 triệu đôla [23], [31]

Năm 1990 Gorcom và cộng sự đã phát hiện chủng Aspergillus ficuum

có khả năng tạo enzyme phytase có hoạt độ phytase cao hơn 50 lần so với những chủng hoang dại được xem như một phát minh thời đó [23]

Năm 1991 Gist-Brocades đã có những thành công trong sản xuất và thương mại hóa các chế phẩm phytase đầu tiên được nuôi cấy thu nhận từ

những chủng nấm mốc đột biến thông qua những phương pháp đơn giản hoặc việc sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp dùng vào mục đích hỗ trợ tiêu hóa [23]

Năm 1993 tác giả Ullah và cộng sự đã hoàn tất việc giải mã trình tự

gen của Aspergillus ficuum Prôtêin bao gồm 583 amino axít, có trọng lượng

phân tử là 64,245 KDa, 13 gốc được glycosyl, vùng hoạt động chứa trình tự RHG [43], [44]

Năm 1996 tác giả Wodzinski và Ullah đã đưa ra con số thống kê rằng nếu dùng phytase để bổ sung vào thức ăn gia súc của tất cả vật nuôi ở Mỹ sẽ giảm được 8,23×104 tấn phospho thải ra môi trường tương ứng với 168 triệu USD mỗi năm [19]

Năm 1999 tác giả Liu và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH và

khả năng chịu nhiệt của chủng Aspergillus ficuum Hoạt độ của enzyme đo

được dựa vào tỷ lệ inositol và phospho phóng thích Hoạt độ cao nhất của enzyme phytase được tìm thấy ở pH = 5 và nhiệt độ thích hợp nhất cho sự hoạt động của enzyme phytase là 50o C Dưới điều kiện này Kcat là 96 s-1 và tương ứng với Km để thủy phân axít phytic là 2,34 mM Tuy nhiên khi nhiệt độ tăng lên 58oC, các thông số Km = 3,28 mM, hoạt tính enzyme (Kcat = 33 s-1) chỉ còn lại 34,6% [30]

Năm 2000 enzyme phytase là một trong 60 enzyme được EU (European Union) cho phép sử dụng như một chất phụ gia bổ sung vào thức ăn gia súc và đã đem lại hiệu quả kinh tế cao [19]

Năm 2001 tác giả Newkirk và cộng sự đã nghiên cứu vai trò của phytase khi ủ với nguồn nguyên liệu làm thức ăn gia súc nhằm cải thiện giá trị năng lượng trao đổi (ME) của thức ăn gia súc [34], [35]

Năm 2002 tác giả Sandberg và cộng sự đã nghiên cứu phytase có nguồn gốc thực vật và vi sinh trong dinh dưỡng con người [40]

Ngày nay cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, đa số các chủng vi sinh vật dùng trong nuôi cấy thu nhận enzyme phytase là những chủng nấm mốc tái tổ hợp (Bảng 1.1) Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Mỹ, Nhật, … là những quốc gia đi đầu trong lĩnh vực cung cấp các

enzyme hỗ trợ dinh dưỡng từ vi sinh vật hàng đầu trên thế giới [23]

Bảng 1.1: Các công ty sản xuất chế phẩm phytase vi sinh [23]

STT Công ty Nước Nguồn phytase Chủng sản xuất Tên thương mại

1 AB Enzymes Đức Aspergillus awamori Trichoderma reesei Finse

2 Biotechnology Alko Phần lan Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae SP, TP, SF

3 Alltech Mỹ Aspergillus niger Aspergillus niger Allzyme phytase

4 BASF Đức Aspergillus niger Aspergillus niger Natuphos

5 Biozyme Mỹ Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae AMFERM

6 DSM Mỹ Peniphora lycii Aspergillus oryzae Bio-Feed Phytase

7 Fermic Mê hi cô Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae Phyzyme

8 International Finnfeeds Phần lan Aspergillus awamori Trichoderma reesei Avizyme

9 International Genencor Mỹ simplicissimum Penicillium funiculosum Penicillium ROVABIO

10 GRAS Mỹ Aspergillus niger Aspergillus niger Phytase

11 Helm Mỹ Pichia pastoris pastoris Pichia Helmzym-P

12 Roal Phần lan Aspergillus awamori Trichoderma reesei Finase

13 Novozymes mạchĐan

Aspergillus oryzae Peniphora lycii

Aspergillus oryzae Peniphora lycii

Ronozyme hoặc Roxazyme

(A) (B)

Hình 1.1: Một số chế phẩm phytase dạng bột và lỏng trên thị trường: (A) Chế phẩm phytase chứa trong túi nilon 2kg do công ty CBT Qingdao, Trung Quốc sản xuất, (B) Chế phẩm nutri-phytase chứa trong thùng nhựa

10 kg do công ty Ultra Bio-Logics, Mỹ sản xuất, (C), (D), (E), (F) Chế phẩm Ronozyme-P do hãng Novozymes, Đan Mạch sản xuất (C) Chế phẩm enzyme chứa trong bao giấy 20 kg, (D) Chế phẩm enzyme chứa trong bao 1000kg, (E) Chế phẩm enzyme chứa trong thùng nhựa 200 kg, (F) Chế phẩm enzyme chứa trong thùng 1000kg

1.2 AXÍT PHYTIC

Axít phytic (myo-inositol hexakis dihydrogen phosphate, phytate hay còn gọi là IP6) được biết đến như thành phần dự trữ phospho, inositol và nhiều loại khoáng chất ở thực vật Axít phytic chiếm 1-5% trọng lượng trong các loại ngũ cốc, phấn hoa, hạt chứa dầu, quả hạch và chiếm 50 đến 80% lượng phospho tổng trong các loại hạt Trong thức ăn vật nuôi thì 1/3 phospho hiện diện ở dạng phospho vô cơ tiêu hóa được trong khi 2/3 dạng phospho hữu cơ hiện diện ở dạng phytin Phytin là hỗn hợp muối canxi – magiê của axít phytic [23], [38], [45]

Bảng 1.2: Hàm lượng phospho tổng, phytate của các loại hạt dùng trong

chế biến thức ăn gia súc (Tyagi và cs., 1998) [23], [46]

Loại hạt Hàm lượng

phospho tổng (%)

Hàm lượng phytate (%)

% phytate đối với phospho tổngBắp 0,39 0,25 64 Gạo 0,15 0,09 60

Trong tự nhiên, axít phytic tồn tại chủ yếu ở dạng muối phytate dưới dạng

phức hợp với các cation quan trọng cho dinh dưỡng như Ca2+, Zn2+ và Fe2+,

Phytate chứa 14-28% phospho, 12-20% canxi, 1-2% kẽm và sắt [28], [35]

Hàm lượng và vị trí axít phytic trong các loại hạt khác nhau Trong hạt gạo

và lúa mì axít phytic hầu như không có trong phần nội nhũ mà tập trung trong

lớp mộng Lượng phytate cao nhất trong các loại ngũ cốc, bắp (0,83-2,22%) và

trong các loại đậu (5,92-9,15%) (Reddy và cs., 1989) [46]

1.2.1 Cấu trúc hóa học

Axít phytic có công thức hóa học là C6H18O24P6 tồn tại ở hai dạng lập thể khác nhau là cấu trúc đối xứng và bất đối xứng (Hình 1.2) [23], [31]

Hình 1.2 : Cấu trúc của axít phytic (myo-inositol hexakis dihydrogen

phosphate) [31]

Axít phytic có ái lực mạnh với các cation đa hóa trị và các prôtêin tích điện dương vì nó tồn tại dưới dạng phân tử tích điện âm mạnh trong phổ pH rộng [28], [41]

Hình 1.3: Phức phytate trong tự nhiên

Axít phytic có thể tồn tại ở dạng không liên kết với kim loại hoặc tạo phức với kim loại tùy thuộc vào pH của dung dịch và nồng độ cation kim loại (Hình 1.3) Tại pH axít dạng không liên kết với kim loại Tại pH trung tính, nhóm phosphat tăng ái lực với các cation kim loại khác nhau hình thành phức với những cation này, thường là Mg2+ và Ca2+ (Cheryan 1980; Maenz và cs 1999) [28], [35]

Trong phức hợp kim loại–axít phytic, Ca2+ (0,99Ao) và Sr2+ (1,12Ao) là các cation kim loại hoá trị hai có bán kính ion rộng, liên kết với hai anionoxy của hai nhóm phosphat kề nhau của axít phytic tạo cấu trúc

bidentate (Martin và Evans, 1986) Tuy nhiên, Mg2+ (0,65Ao),

Fe2+(0,74Ao), và Zn2+ (0,71Ao) được xem như các cation kim loại có bán

kính nhỏ lại liên kết tạo cấu trúc monodentate với hai nguyên tử oxy từ

hai nhóm phosphat của axít phytic (Hình 1.4) [35]

P OH O

O HO

P OH HO

O O

P OH HO

O

O

P HO

HO O

O P

O O

P O O

O O

P O O

O

O

P O

O O

O P

O O O

O P

O O

O O M

M

M

M M

M

pH kiềm và các ion kim loại

pH axit

Hình 1.4: Axít phytic tồn tại dưới dạng không liên kết với kim loại hoặc tạo

phức hợp với kim loại [35]

1.2.2 Chức năng sinh lý của axít phytic

Chất khoáng cần cho việc cấu thành xương, máu và những mô khác, cũng như giúp cho hệ thống miễn dịch thực hiện chức năng hợp lý trong khi đó axít phytic có khả năng gắn kết với những chất khoáng quan trọng như canxi, magie, Fe và Zn làm cho chúng có rất ít trong cơ thể con người Chính vì vậy người dân ở các nước như Ấn Độ, Bangladest, Philippines, Việt Nam, Indonesia và Thái Lan thường bị thiếu hụt khoáng Tuy nhiên, đối với người già thì khả năng tạo phức này giúp ngăn ngừa sự thừa khoáng ở những khớp xương [40], [45]

Axít phytic được xem như nguồn dinh dưỡng thực vật có khả năng kháng oxy hóa trong thực phẩm và rượu Ngoài ra, nó còn được dùng như là một chất phụ gia thực phẩm, axít phytic được sử dụng như chất bảo quản có mã số E391

Trong các loại hạt, axít phytic có vai trò như nguồn dự trữ phospho,

nguồn dự trữ năng lượng, nguồn cation, nguồn Myo-inositol và là chất khởi

động quá trình nảy mầm của hạt Bên cạnh đó nó còn có khả năng ngăn ngừa ung thư ruột kết và những dạng ung thư khác bởi khả năng tăng lượng lymphocyte, giúp phá hủy những tế bào tạo khối u và ngăn sự hình thành sạn thận Axít phytic làm giảm chứng tắt nghẽn mạch máu, cholesterol và triglyceride, là những chất lưu chuyển trong máu, nhờ đó ngăn ngừa các bệnh về tim [38], [45]

Thực phẩm phải được nấu chín để IP6 từ dạng sợi không hòa tan chuyển thành dạng có thể hấp thụ được IP6 được tìm thấy trong các loại đậu, lúa mì, lúa mạch và yến mạch Những nghiên cứu mới đây cho thấy những loại đậu như đậu nành có chứa lượng axít phytic cao [28], [40]

1.2.3 Tác động kháng dưỡng của axít phytic

Phân tử axít phytic có tác động kháng dưỡng mạnh, tổng số điện tích âm là 12, có ái lực mạnh với các cation hóa trị một, hai, ba và hình thành các phức hợp không tan Sáu nhóm hoạt động trong phân tử của axít phytic khiến nó trở thành một tác nhân bắt ion mạnh, có thể bắt các ion như Ca2+,

Mg2+, Fe2+, Zn2+ làm ngăn cản khả năng kết hợp của những ion này với các axit béo không no dẫn đến việc làm giảm khả năng tiêu hóa Ở pH hệ ruột và dạ dày, các động vật dạ dày một ngăn như gia cầm, lợn, cá rất khó tiêu hóa được phospho dạng phức chất trên Trong khi phospho rất cần cho hoạt động sống của chúng [31], [35], [46]

Phytate làm giảm khả năng tiêu hóa prôtêin, tinh bột và lipid Phytate tạo phức với prôtêin làm cho prôtêin kém tan Axít phytic có thể ảnh hưởng đến sự tiêu hóa tinh bột thông qua sự tương tác với enzym amylase Tại pH axít thấp, axít phytic có điện tích âm mạnh vì các nhóm phosphat phân ly hoàn toàn Dưới điều kiện này, axít phytic có ảnh hưởng xấu đến khả năng hòa tan của prôtêin vì liên kết ion giữa các nhóm phosphat của axít phytic và các gốc axit amin bị proton hoá (lysyl, histidyl và arginyl) Trong pH axít, axít phytic có thể gắn chặt với các prôtêin thực vật vì điểm đẳng điện của các prôtêin này thường nằm trong pH 4,0-5,0 Ở

pH 6,0-8,0, axít phytic và prôtêin thực vật đều có điện tích âm, phức hợp axít phytic và prôtêin vẫn được hình thành Việc gắn kết này làm giảm giá trị dinh dưỡng của các prôtêin thực vật [28], [35]

1.3 ENZYME PHYTASE

1.3.1 Định nghĩa

Phytase hay myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase là enzyme thủy phân thuộc nhóm enzyme hydrolase Enzyme này xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết monophosphoester có trong axít phytic và muối phytate [1], [35], [42]

Hình 1.5: Phản ứng thủy phân phytase [31]

1.3.2 Phân loại và danh pháp

Theo Ủy Ban Thuật Ngữ thuộc Hiệp Hội Sinh Hóa và Sinh Học Phân Tử Quốc Tế (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology –NC-IUBMB), Hiệp Hội Quốc Tế về Hóa học và Ứng Dụng (The International of Biochemistry –IUB), enzyme phytase được phân thành hai nhóm dựa trên thứ tự ưu tiên nhóm phosphate bị tấn công trong vòng carbon của inositol [35], [42], [45], [46]

(a) EC 3.1.3.8

- Tên đề nghị: 3-enzyme phytase

- Tên hệ thống: Myo-inositol-hexakisphosphat phosphohydrolase

3 Các tên khác: enzyme phytase; phytate 33 phosphatase

- Hầu hết các enzyme phytase có nguồn gốc vi sinh vật (đặc biệt các enzyme phytase có nguồn gốc nấm)

(b) EC 3.1.3.26

- Tên đề nghị: 6-enzyme phytase

- Tên hệ thống: Myo-inositol-hexakisphosphate phosphohydrolase

6 Các tên khác: enzyme phytase, phytate 66 phosphatase

- Hầu hết các enzyme có nguồn gốc thực vật thuộc nhóm này

Sự phân loại này dựa trên nhóm phospho đầu tiên bị tác động, phytase thì điển hình ở vi sinh vật, còn 6-phytase điển hình ở thực vật Tuy

3-nhiên cũng có một số trường hợp ngoại lệ như Escherichia coli có khả

năng tạo 6-phytase và hạt đậu nành thì lại có khả năng tạo 3-phytase [28], [35], [45], [46]

Dựa vào đặc điểm sinh hóa và trình tự axít amin thì enzyme phytase được chia thành hai lớp: Histidine acid phytase-HAP (PhytaseA, PhytaseB, phytaseC) và Alkaline phytase (PhytaseD) Tất cả các thành viên nhóm HAPs đều có trung tâm hoạt động là RHGXRXP [35], [45], [46]

Phytase A là đơn phân, Phytase B là tứ phân Cả hai loại này

thường được tách chiết và thu nhận từ nấm sợi, hay nấm men (Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe), kích thước phân

tử từ 62-128kDa Phytase C thường được tách chiết và thu nhận từ E.coli,

kích thước phân tử khoảng 42-45 kDa Hầu hết các phytase (phytase A, phytase B, phytase C) được biết là HAPs (EC 3.1.3.8) [35], [42], [45], [46]

Phytase D (chưa có EC) thường được tách chiết và thu nhận từ

Bacillus hay từ thực vật (lá mầm của hạt đậu nẩy mầm), kích thước phân tử

khoảng 38-44kDa [35], [42], [45], [46]

Hình 1.6: Cấu trúc không gian 3 chiều của Alkaline phytase và HAP A, C: Vị

trí liên kết với cơ chất của Bacillus amyloliquefaciens và B, D: Escherichia coli

[35]

Dựa vào phân tích trình tự axít amin, nhiều Histidine axít phytase và Alkaline enzyme phytase được phân loại theo cây phát sinh chủng loài (phylogenetic tree) [35]

Hình 1.7 Cây phát sinh chủng loài của hai loại Histidine axít phytase [35]

và Alkaline phytase

1.3.3 Cơ chế thủy phân của enzyme phytase

Enzyme 3-phytase (EC 3.1.3.8) xúc tác thủy phân trước tiên ở vị trí số D-3 của vòng myo-inositol làm tăng D-myo-inositol 1, 2, 4, 5, 6 -

pentakisphosphate (D-Ins (1, 2, 4, 5, 6)P5): Myo-inositol-hexakisphosphate + H2O = D-myo-inositol 1, 2, 4, 5, 6-pentakisphosphate + ortho-phosphate và tạo sản phẩm cuối là myo-inositol monophosphate (Ins(2)P) [30], [31], [35], [39]

Enzyme 6-phytase (EC 3.1.3.26) xúc tác thủy phân trước tiên ở vị trí số L6 (hoặc D4) tạo D-myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5-pentakisphosphate (Ins(1,

A niger A.niger

2, 3, 4, 5)P5 hay Ins(1, 2, 3, 5, 6)P5): Myo-inositol-hexakisphosphate +

H2O = D-myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5-pentakisphosphate + ortho-phosphate và sản phẩm cuối là Ins (1, 3, 5)P3 hay Ins (2, 4, 6)P3 Tuy nhiên, cũng có một số trường hợp ngoại lệ như năm 1992 tác giả Freund và cộng sự khi nghiên

cứu cơ chế thủy phân của phytase từ Paramecium thì thấy rằng axít phytic

bị khử phospho thành D-Ins (1, 2, 3, 4, 5)P5, D-Ins (1, 2, 3)P3 và cuối cùng là D-Ins (2, 3)P2 [28], [31], [35], [38]

Theo lý thuyết, inositol pentakisphosphat có thể bám ngược trở lại enzyme, giải phóng thêm một nhóm phosphat và inositol tetrakisphosphat Nhóm phosphat được giải phóng có thể gắn với thuốc thử molybdate hình thành phosphomolybdenum màu xanh lam có thể phát hiện bằng phép so màu [46]

pH axit 2,5; 5,0

pH kiềm 7,0-8,0 Phytate Ca-Phytate

Histidine axít

Hình 1.8: Sơ đồ thủy phân histidine axít phosphatases (HAPs) và alkaline phytase A HAPs có thể thủy phân 5 nhóm phosphate từ phytate tại pH axít, sản phẩm cuối là myo-inositol B Alkaline phytase có thể thủy phân 3 nhóm phosphate từ phức calcium-phytate tại pH kiềm, sản phẩm cuối là myo- inositol triphosphate [35]

Bảng 1.3: Cơ chế thủy phân của enzyme phytase [28]

Enzyme IP5 IP4 IP3 IP2 IP

Lúa mạch P1,

P2; lúa mì D21,

PHY1, PHY2,

lúa mạch, yến

mạch, gạo; đậu

E.coli InsP6->D-Ins(1,2,3,4,5)P5->D-Ins(2,3,4,5)P4 ->Ins(2,4,5)P3 ->Ins(2,5)P2 ->Ins(2)P

Paramecium InsP6->D-Ins(1,2,3,4,5)P5 ->D-Ins(1,2,3,4)P4->Ins(1,2,3)P3 ->D-Ins(2,3)P2

Lily InsP6->D-Ins(1,2,3,4,6)P5 ->D-Ins(1,2,3,4)P4/->Ins(1,2,3)P3

D-Ins(1,2,3,6)P4 Lúa mì F2 InsP6->D-Ins(1,2,3,5,6)P5->D-Ins(1,2,3,6)P4 ->Ins(1,2,3)P3 ->D-Ins(1,2)P2->Ins(2)P Đậu xanh InsP6->D-Ins(1,2,3,5,6)P5->D-Ins(1,2,3,6)P4->D-Ins(1,2,6)P3->D-Ins(2,6)P2->Ins(2)P

/Ins(1,2,3)P3->/D-Ins(1,2)P2

Bacillus subtilis InsP6->D/L-Ins(1,2,3,4,5)P5/->Ins(1,2,3,5)P4/ ->Ins(1,3,5)P3

D/L-Ins(1,2,4,5,6)P5->Ins(2,4,6)P4 ->Ins(2,4,6)P3

1.3.4 Nguồn thu nhận phytase

Ở thực vật quá trình thủy phân liên kết monophosphoester có trong axít phytic và muối phytate đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất Thật vậy, phytase có nhiều trong thực vật, những mô tế bào động vật và cả vi sinh vật Trong thực vật, phytase có nhiều trong ngũ cốc, các loại đậu, hạt đang nẩy mầm và hạt phấn Ở động vật, enzyme này có nhiều trong hồng cầu và nguyên sinh chất Một số loài vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men và các loại nấm mốc cũng có khả năng tạo phytase Thông thường, phytase tạo ra từ nấm mốc là enzyme ngoại bào, trái lại enzyme từ

vi khuẩn là enzyme nội bào ngoại trừ Bacillus subtilis và Enterobacter

[31], [38]

1.3.4.1 Phytase từ thực vật Phytase có nhiều trong các loại ngũ cốc như lúa mì, bắp, lúa mạch, gạo và các loại đậu như đậu nành, đậu xanh, đậu trắng Phytase cũng được tìm thấy trong mù tạt, khoai tây, củ cải, rau diếp, rau bina và phấn hoa huệ tây (Dvorakova,1998) Trong hạt đang nảy mầm hoặc trong hạt phấn, phytase có vai trò phân giải phytin thành phospho vô cơ và năng lượng cần cho sự phát triển của cây con [17], [46]

1.3.4.2 Phytase từ động vật

Mc Collum và Hart (1908) đã phát hiện thấy phytase từ thận và máu dê, phytase cũng được phát hiện trong máu các động vật có xương

sống bậc thấp hơn như chim, bò sát, cá, rùa biển (Rapoport và cs., 1941)

Vì phytate hoạt động như một nhân tố kháng dưỡng trong cơ thể động vật nên các nhà khoa học đã quan tâm và khảo sát sự hiện diện của phytase trong đường tiêu hóa của nhiều loài động vật Phytase được tìm thấy trong đường ruột của chuột (Patwaradha, 1937), heo, cừu, bò (Spitzer và

Phillips, 1972), gà, dê và cả ở người (Bitar và Reinhold, 1972) Tuy nhiên, phytase trong hệ ruột động vật không đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa phytate (Williams và Taylor, 1985) Phytase từ ruột người có hoạt tính thấp hơn 30 lần so với phytase từ ruột chuột và cũng không có ý nghĩa trong việc tiêu hóa phytate, phytate được tiêu hóa trong hệ thống tiêu hóa người nhờ lượng phytase có trong thực phẩm (Frolich, 1990) [23], [31], [46]

Động vật nhai lại tiêu hóa được phytase nhờ hoạt động của phytase được sản xuất bởi hệ vi sinh vật trong dạ cỏ Lượng phosphat vô cơ giải phóng ra nhờ hoạt động của phytase lên phytate được cả hệ vi sinh vật đường ruột và vật chủ sử dụng.[26], [30]

1.3.4.3 Phytase từ vi sinh vật

Phytase được tổng hợp cả ở vi khuẩn gram dương (B.subtilis) và gram âm (Aerobacter aerogegnes, E.coli, các chủng Pseudomonas, Klebsiella) Phytase từ các vi khuẩn gram âm là các protein nội bào, trong

khi phytase từ các vi khuẩn gram dương là các prôtêin ngoại bào (Choi và

cs., 2001) [28], [31]

Trên 200 loài nấm phân lập thuộc các chi như Aspergillus, Penicillium, Mucor và Rhizopus (Liu và cs., 1998) có khả năng tạo phytase ngoại bào (Liu và cs., 1998) Aspergillus ficuum NRRL 3135 được xem là

loài nấm mốc có khả năng tạo phytase có hoạt độ cao gấp 50 lần so với chủng hoang hại bằng phương pháp lên men trên môi trường rắn (SSF) hay chìm (SmF) Với phương pháp lên men chìm, việc sản sinh enzyme phytase lại chịu ảnh hưởng bởi nồng độ glucose và mức độ thông thoáng Đặc biệt độ ẩm đóng vai trò quan trọng để tạo enzyme trong phương pháp bề mặt trên môi trường rắn [29], [30], [37]

Một vài nghiên cứu cho thấy các loài nấm men cũng có khả năng

tạo phytase ngoại bào như Schwanniomyces castellii, Arxula adeniivorans, Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces castelii, Debaryomyces occidentalis, Kluyveromyces fragilis và Schwanniomyces castelii Loài nấm men Arxula Adeninivorans được

xem là một trong những loài nấm men hiếm vì khả năng đồng hóa phytate như là nguồn cacbon và phosphat duy nhất Phytase từ nấm men có sự đặc hiệu cơ chất rộng, ổn nhiệt và bền trong axít (Vohra và Satyanayana, 2002) [31], [46]

1.3.5 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của phytase

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của phytase có vai trò quan trọng trong việc xác định các ứng dụng thực tế của nó trong các ngành công nghiệp khác nhau

1.3.5.1 Nhiệt độ Trong công nghiệp thực phẩm, phytase cần phải chịu nhiệt cao vì quá trình kết vón thực phẩm (feed pelleting) được thực hiện ở 80-100oC

trong một vài giây Phytase từ Aspergillus ficuum có hoạt tính tối ưu tại

55oC vàø có thể chịu được nhiệt độ 70oC trong vòng 15-30 giây, B.subtilis (Powar và Jagannathan, 1982), E.coli (Greiner và cs 1993), Klebsiella aerogenes (Tambe và cs 1994), Enterobacter sp 4 (Yoon và cs 1996), K oxytoca MO-3 (Jareonkitmongkol và cs 1997 và Selennomonas ruminantium (Yanke và cs 1999) thể hiện hoạt tính tối ưu trong khoảng

50-60oC, trong khi phytase từ Aerobacter aerogenes có hoạt tính tối ưu tại

25oC (Greaves và cs 1967) và Bacillus sp DS11 tại 70oC [24], [26], [35], [46]

Trong số các nấm ưa nhiệt, Themomyces lanuginosus thể hiện hoạt

tính tối ưu tại 65oC và Sporotrichum thermophile tại 45oC Phytase của

A.fumigatus và A.ficuum NRRL 3135 thể hiện hoạt tính tối ưu lần lượt tại

37oC và tại 55oC (Howson và Davis, 1983) [26], [46], [47]

Khả năng chịu nhiệt của phytase đã được cải thiện bằng cách dùng các hợp chất hóa học như các loại muối và polyol Một số nghiên cứu cho thấy Calcium làm tăng tính chịu nhiệt của các loài Bacillus DS 11 (Greiner và Konietzny, 1996) Ngoài ra, có thể dùng kĩ thuật prôtêin để làm tăng tính ổn nhiệt của phytase và tạo cầu disulfide (Scott và Steven, 2000) [35], [46]

1.3.5.2 pH Phần lớn các phytase vi sinh vật, đặc biệt là phytase có nguồn gốc từ nấm, thể hiện pH tối ưu giữa 4,5 và 5,5; một số loại nấm mốc có pH tối

ưu tại 6,5 đến 7,0 Tuy nhiên phytase từ nấm mốc Aspergillus ficuum có phổ pH rộng từ 2,5-6,0 [21], [46]

A.ficuum NRRL 3135 có pH tối ưu tại pH 5,5 và 2,5 (Howson và Davis, 1983) Phytase của T.lanuginosus và A.fumigatus có hoạt tính tại pH 6-6,5 Phytase của S.castelli có pH tối ưu là 4,4 và của A.adeninivorans là

độ (Nakamura và cs., 2000) [46], [47]

Các phytase có nguồn thực vật có pH tối ưu trong khoảng 4,0-7,5,

đa số trong khoảng pH 4,0-5,6 [45], [47]

Để ứng dụng được trong công nghiệp thức ăn gia súc, phytase phải có hoạt độ cao ở pH trong hệ thống tiêu hóa Tomschy và cộng sự (2002) đã tạo được đột biến điểm định hướng bằng cách thay thế Gly-277 và Tyr-

282 của phytase chủng hoang dại A.fumigatus bằng các gốc tương đương của phytase A.niger (Lys và His) tạo được một phytase có sức chịu pH tốt hơn với pH tối ưu tại 2,8-3,4 (Tomschy và cs., 2002) [29], [46]

Bảng 1.4: Giá trị pH và nhiệt độ tối ưu của các loại phytase [46]

Chủng

Nhiệt độ tối ưu (oC)

pH tối ưu

Trọng lượng phân tử (kDa)

1.3.5.3 Tác động cơ chất

Phytase thể hiện sự đặc hiệu cơ chất rộng và có ái lực cao nhất đối với phytate Chỉ một vài phytase có tính đặc hiệu cao đối

với axít phytic Phytase từ các loài Bacillus DS11 rất đặc hiệu đối

với phytate và thể hiện hoạt tính rất yếu hoặc không có hoạt tính

đối với các phosphat ester như p-notrophenyl phosphat, ATP, ADP,

AMP, β-glycero-phosphat, sodium pyro-phosphat và

α-naphthyl-phosphate (Kim và cs., 1998) Tương tự thế, phytase từ các loài Pseudomonas không thể hiện hoạt tính đối với pyrophosphat vô cơ,

β-glycerophosphat, ADP hoặc AMP (Irving và Cosgrove, 1971) [35], [36], [46]

Các phytase từ A fumigatus, E nidulans và M thermophia thể hiện sự đặc hiệu cơ chất rộng, trong khi các phytase từ A niger,

A terreus CBS, A ficuum và E coli có tính đặc hiệu cao hơn đối với axít phytic (Wyss và cs., 1999) [36], [45], [46]

Nồng độ cơ chất quá cao sẽ gây ức chế enzym Ullah và Cummins (1988) cho biết nồng độ myo-inositol-P6 vượt quá 2 mmol/L sẽ gây ra hiện tượng ức chế [45], [46]

Sự hiện diện của cơ chất trong dịch enzym giúp enzym kháng lại sự biến tính do nhiệt khi nhiệt độ vượt quá giá trị tối ưu Phytase sẽ bị bất hoạt đến 90% khi ủ trong điều kiện 75oC, 20 phút (Sano và cs., 1999).[36], [46]