Luận văn nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của loài chaetoceros muelleri và tetraselmis sp phân lập tại việt nam với mục đích ứng dụng trong nuôi trồng thuỷ sản

luận văn

Bộ giáo dục và đào tạo

Phạm mỹ Dung

Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của loài chaetoceros muelleri và tetraselmis sp phân lập tại việt nam với mục đích ứng dụng trong nuôi

Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và ch−a từng đ−ợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đ3 đ−ợc chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2009 Tác giả luận văn

Phạm Mỹ Dung

Lời cảm ơn Trong suốt quá trình thực hiện đề tài tôi đ nhận được rất nhiều sự giúp đỡ về chuyên môn và cơ sở vật chất của phòng Công nghệ Tảo, phòng Thí nghiệm trọng

điểm Công nghệ Gen - Viện Công nghệ Sinh học

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS.NCVC Đặng Diễm Hồng - Trưởng phòng Công nghệ Tảo người đ trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm đề tài Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn đến NCS Ngô Thị Hoài Thu cùng các cán bộ phòng Công nghệ Tảo - Viện Công nghệ Sinh học đ tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi thực hiện thành công đề tài này

Bên cạnh đó, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Đại học Quốc Gia TPHCM, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 3, Viện nghiên cứu Hải Dương học đ truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cho tôi trong suốt khoá học này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Vinh, Ban chủ nhiệm khoa Nông Lâm Ngư và tổ bộ môn Nuôi trồng Thủy sản đ tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ công tác, học tập và nghiên cứu khoa học trong hai năm qua

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể lớp Cao học 9 – NTTS, cùng các bạn bè

đồng nghiệp đ giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ, anh, chị, em đ động viên và giúp đỡ tôi trong hai năm học qua Đặc biệt là cảm ơn anh - người chồng đ luôn động viên, chia sẻ và giúp đỡ em trong quá trình học tập, thực hiện đề tài cũng như hoàn thành tốt khoá học này

Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2009

Mục lục

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục các chữ viết tắt và kí hiệu vi

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình viii

Mở ĐầU 1

CHƯƠNG 1 TổNG QUAN TàI LIệU 4

1.1 Tình hình nghiên cứu vi tảo ngoài nước 4

1.1.1 Khái niệm về tảo, vi tảo 4

1.1.2 Tình hình nghiên cứu về phân loại tảo 5

1.1.3 Tình hình nghiên cứu về vai trò, giá trị dinh dưỡng của vi tảo 8

1.1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi tảo 11

1.1.5 Tình hình nghiên cứu về lưu giữ, bảo quản và nuôi trồng vi tảo 17

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 21

1.3 Tình hình nghiên cứu về chi Chaetoceros và Tetraselmis 25

1.3.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chi Chaetoceros và Tetraselmis 25

1.3.2 ứng dụng của VTB C muelleri và Tetraselmis sp trong NTTS 26

CHƯƠNG 2 Vật liệu Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 29

2.1 Vật liệu nghiên cứu 29

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 29

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 30

2.3 Phương pháp nghiên cứu 30

2.3.1 Phương pháp thu thập, phân lập loài Chaetoceros muelleri và Tetraselmis sp 30 2.3.2 Phương pháp lưu giữ và bảo quản loài Chaetoceros muelleri và Tetraselmis sp 32

2.3.3 Định tên khoa học chính xác đến loài Chaetoceros sp và Tetraselmis sp phân lập được ở Việt Nam 34

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của loài Chaetoceros muelleri và Tetraselmis sp 36

2.3.5 Quy trình nuôi thu sinh khối Chaetoceros muelleri và Tetraselmis sp trong điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài tự nhiên theo định hướng ứng dụng làm thức ăn cho ấu trùng của các loài hải sản 39

2.3.6 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 40

CHƯƠNG 3 KếT QUả NGHIÊN CứU Và THảO LUậN 41

3.1 Phân lập, lưu giữ, định tên khoa học chính xác loài Chaetoceros sp và Tetraselmis sp phân lập ở Việt Nam 41

3.1.1 Kết quả phân lập hai loài Chaetoceros sp và Tetraselmis sp từ vùng biển Hải Phòng 41

3.1.2 Định tên khoa học chính xác ở mức độ sinh học phân tử của loài Chaetoceros sp và Tetraselmis sp phân lập ở Việt Nam bằng phương pháp đọc và so sánh trên trình tự nucleotit của gen 18S rRNA 43

3.1.3 Lưu giữ và bảo quản Chaetoceros muelleri và Tetraselmis convolutae 49

3.2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của loài C muelleri và loài Tetraselmis convoluate phân lập ở Việt Nam 51

3.2.1 Tối ưu hoá điều kiện nuôi trồng 51

3.2.2 Thành phần dinh dưỡng, lipít tổng số, thành phần axít béo của C muelleri và Tetraselmis convolutae 60

3.3 Nuôi thu sinh khối C muelleri và Tetraselmis convolutae trong điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài tự nhiên theo định hướng ứng dụng làm thức ăn cho ấu trùng của các loài hải sản 65

3.3.1 Sinh trưởng của C muelleri ở các thể tích nuôi khác nhau 65

3.3.2 Sinh trưởng của Tetraselmis convolutae ở các thể tích khác nhau 66

KếT LUậN Và Đề NGHị 68

1 Kết luận 68

2 Đề nghị 69

Tài liệu tham khảo 70

PHụ LụC 83

Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t vµ kÝ hiÖu

convolutae

61

T convolutae

64

Danh mục các hình

độ phóng đại 400 lần

41

(SEM) với độ phóng đại 5000 lần

41

độ phóng đại 400 lần

42

(SEM) với độ phóng đại 5000 lần

18S rRNA của loài Tetraselmis sp và Chaetoceros sp

(09/02/2009)

49

nồng độ glycerol khác nhau

50

môi trường khác nhau

cường độ chiếu sáng khác nhau

54

môi trường nuối khác nhau

56

cường độ chiếu sáng khác nhau

59

giá trị pH khác nhau

60

Mở ĐầU

Vi tảo là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn nên chúng là nguồn thức ăn không thể thiếu của nhiều đối tượng thủy, hải sản Vi tảo được sử dụng ở hầu hết các giai đoạn phát triển của động vật thân mềm, ấu trùng của giáp xác và cá (Brown et al., 1997; Wikfors và Ohno, 2001) Ngoài ra, chúng còn được sử dụng để nuôi sinh khối các loài động vật phù du (Artemia, Copepoda, luân trùng)

Hiện nay, trên thế giới đ có 40 loài vi tảo được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản (NTTS) Ưu điểm của vi tảo là có kích thước phù hợp, dễ tiêu hoá, ít gây ô nhiễm môi trường, có thể chuyển hoá trong chuỗi thức ăn, tỷ lệ phát triển nhanh, có khả năng nhân nuôi sinh khối lớn, cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho

động vật nuôi Thành phần dinh dưỡng của 40 loài vi tảo được dùng trong NTTS như protein thay đổi từ 6-52%; carbohydrate từ 5-23% và lipid từ 7-23% cũng đ được công bố (Brown, 2002; Muller et al., 2004) Ngoài ra, các loài vi tảo biển (VTB) còn giàu các axít béo không bo hoà đa nối đôi (PUFAs) đặc biệt là DHA (docosahexaenoic acid), EPA (eicosapentaenoic acid), AA (arachidonic acid), đây là các axít béo không bo hoà rất cần thiết đối với con người và động vật nuôi (Crowford, 2000; Kumon et al., 2002; Sijtsma et al., 2004) Các loài tảo đều chứa EPA chiếm 7-34% tống số acid béo, tảo Prymnesiophyceae chứa DHA: 0,2 – 11% tống số acid béo và Eustigmatophyceae lại có nhiều nhất AA: 0 – 4% tổng số acid béo; Lớp tảo Prasinophyceae (Tetraselmis, Micromonas, Pyramimonas) chứa khoảng 4-10% tổng số acid béo là DHA hoặc EPA (Brown et al., 1997)

Chaetoceros muelleri, Tetraselmis sp là một trong những loài vi tảo biển được

sử dụng làm thức ăn phổ biến cho động vật thân mềm hai mảnh vỏ, ấu trùng giáp xác Đặc biệt, chúng có nguồn PUFAs cần thiết cho sinh trưởng và phát triển của ấu trùng (Belay, 1997; Chiou et al., 2001) Chaetoceros muelleri có chứa EPA chiếm

đến 16,4% tổng số axít béo (Fabrice et al., 2003), Tetraselmis sp có chứa EPA trung bình khoảng 4,8 mg/g trọng lượng khô (Vishwanath et al., 2006) và chúng thường được nuôi kết hợp với nhau để có thể bổ sung, hỗ trợ cung cấp nguồn PUFAs cho các loại ấu trùng trong NTTS

Tuy vậy, hàm lượng lipíd và axít béo có trong VTB còn phụ thuộc nhiều vào điều kiện môi trường, chế độ chiếu sáng, nhiệt độ, dinh dưỡng, pH, độ mặn (Sukenik and (Wahnon, 1991, Tzovenis et al., 1997; Zhu et al., 1997) và cả vào giai đoạn phát triển (Piorreck and Pohl, 1984; Taguchi et al., 1987)

Tuy nhiên, hiện nay các phương pháp phân loại vi tảo vẫn chủ yếu dựa vào đặc

điểm hình thái của chúng Nhưng một số loài trong cùng một chi nếu chỉ quan sát dưới kính hiển vi quang học lại rất khó phân biệt do chúng có kích thước rất nhỏ và hình thái tế bào vi tảo rất dễ bị thay đổi khi điều kiện môi trường thay đổi Do đó, việc phân loại vi tảo cần các chuyên gia có trình độ cao, phải có các kính hiển vi hiện đại như kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) hay hiển vi điện tử quét (SEM) và tốn nhiều thời gian Vì vậy, sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác định và phân tích trình tự nucleotit của các gen bảo thủ như 18S rRNA, ITS1-5,8S-ITS2, 28S rRNA (LSU), đ hỗ trợ tích cực cho việc định tên khoa học các loài vi tảo biển một cách chính xác hơn

Mặt khác, ở nước ta hiện nay việc chủ động sản xuất thức ăn tươi sống là VTB phục vụ cho đối tượng NTTS còn gặp nhiều khó khăn Nguyên nhân chính là do đa

số các giống VTB được sử dụng đều có nguồn gốc nhập ngoại nên chưa có phương pháp lưu giữ giống thuần cũng như quy trình công nghệ nuôi chưa thích hợp với

điều kiện khí hậu ở Việt Nam Vì thế, hiệu quả đem lại chưa cao, sinh khối đạt được thấp, bị tạp nhiễm nhiều, nguồn giống sơ cấp không chủ động được Do vậy, chưa khai thác hết tiềm năng về vai trò của vi tảo cũng như chưa đáp ứng được nhu cầu thực tế của vi tảo trong nuôi trồng thủy sản

Vì thế chúng tôi đ đề xuất đề tài: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của loài Chaetoceros muelleri và loài Tetraselmis sp phân lập ở Việt Nam với mục đích ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản Công việc được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam với mục tiêu nghiên cứu:

* Mục tiêu chung: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của loài Chaetoceros muelleri và loài Tetraselmis sp phân lập ở Việt Nam với mục đích ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản

* Mục tiêu cụ thể:

- Phân lập, lưu giữ, định tên khoa học chính xác và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của loài Chaetoceros muelleri và loài Tetraselmis sp

- Nhân nhanh sinh khối 2 loài tảo này có chất lượng dinh dưỡng phù hợp làm thức

ăn cho NTTS

CHƯƠNG 1 TổNG QUAN TàI LIệU 1.1 Tình hình nghiên cứu vi tảo ngoài nước

1.1.1 Khái niệm về tảo, vi tảo

Tảo (algae) là những thực vật bậc thấp (thực vật có bào tử, cơ thể không phân chia thành thân, rễ, lá), trong tế bào có chứa diệp lục và sống chủ yếu ở nước (Dương Đức Tiến, 1978)

Cấu trúc dạng tản của tảo thường gặp gồm cấu trúc monat, Palmella, hạt, sợi, dạng bản, ống Tảo có ba phương thức sinh sản: sinh sản sinh dưỡng, vô tính và hữu tính Tảo có khả năng sống theo hình thức quang tự dưỡng (photoautotrophy) và dị dưỡng (heterotrophy) Dạng trung gian của hai hình thức trên là tạp dưỡng (mixotrophy) ở dạng tạp dưỡng, quang hợp vẫn là quá trình cơ bản để tạo chất hữu cơ cho cơ thể nhưng trong một số trường hợp, tảo sử dụng được cả các chất hữu cơ

và 32 giống, có kích thước từ vài àm đến hơn 100 àm (Gachon et al., 2007; Phang

và Chu, 2004)

* Sinh trưởng của tảo

Sinh trưởng của tảo được nuôi trồng trong điều kiện vô trùng đặc trưng bằng

đường cong sinh trưởng có 5 pha (hình 1.1) Trong đó phần ký hiệu là 1 - được gọi

là pha tiềm hay pha thích nghi Pha sinh trưởng theo hàm số mũ được ký hiệu là 2

Trong pha thứ hai, mật độ tế bào tăng theo hàm số của thời gian t, đặc trưng bằng

là tốc độ sinh trưởng đặc thù Tốc độ sinh trưởng đặc thù của từng loài tảo sẽ phụ thuộc chủ yếu vào loài tảo đó cũng như cường độ ánh sáng và nhiệt độ

Hình 1.1 Đường cong sinh trưởng của vi tảo Pha giảm tốc độ sinh trưởng được ký hiệu là 3 ở pha này, sự phân chia tế bào

hoặc các yếu tố lý hóa khác bắt đầu trở thành yếu tố giới hạn đối với sự sinh trưởng của tảo

Pha ổn định được ký hiệu là 4 ở pha thứ tư này các yếu tố giới hạn nêu trên

và tốc độ sinh trưởng của tảo được cân bằng và làm cho mật độ tế bào nhìn chung là tương đối ổn định, không thay đổi

Pha tàn lụi được ký hiệu là 5 Trong pha cuối cùng này, chất lượng nước xấu

đi và các chất dinh dưỡng suy kiệt tới mức không thể duy trì được sự sinh trưởng của tảo Khi đó, mật độ tế bào giảm mạnh và tảo chết

1.1.2 Tình hình nghiên cứu về phân loại tảo

Theo Whitake (1969) đ đưa ra hệ thống phân loại 5 giới, trong đó toàn bộ Tảo được xếp trong giới nguyên sinh Woese đ đề xuất hệ thống phân loại 5 giới (vi khuẩn, cổ khuẩn, nguyên sinh, nấm, thực vật, động vật) trong đó toàn bộ Tảo vẫn

được xếp trong giới nguyên sinh Sau đó, Valtere Evangelista et al., (2007) đ dựa

trên cơ sở nền tảng phân loại sinh giới của Van Den Hoek et al., (1995) và khóa phân loại sinh giới trước đó do Bold và Wynne, (1978), Margulis et al., (1990), Graham và Wilcox (2000), Lewin, (2004) đưa ra đ chia tảo thành những ngành khác nhau Khóa phân loại tảo theo Valtere Evangelista et al., (2007) được chỉ ra ở bảng 1 Trong đó, vi tảo chủ yếu thuộc về các chi trong các ngành như sau:

1/ Ngành Chlorophyta (Tảo lục) gồm các chi Closterium, Coelastrum,

Chlamydomonas, Haematococcus, Tetraselmis, Chlorella…;

2/ Ngành Heterokontophyta (Tảo lông roi lệch) gồm các chi Melosira, Asterionella, Cymatopleurra, Somphonema, Fragilaria, Stephanodiscus, Navicula, Malomonas, Dinobryon, Peridinium, Isochrysis, Chaetoceros, Phaeodactylum, Skeletonema, Nitzschia ;

3- Ngành Euglenophyta (Tảo mắt) gồm các chi Phacus, Trachelomonas, Ceratium 4- Ngành Rhodophyta (Tảo đỏ) gồm các chi Porphyridium, Rhodella ;

Bảng 1.1 Phân loại các nhóm ngành tảo (theo Valtere Evangelista et al., 2007)

Florideophyceae Chrysophyceae Xanthophyceae Eustigmatophyceae Bacillarophyceae Raphidophyceae Dictyochophyceae Heterokontophyta

Ulvophyceae Cladophorophyceae Bryopsidophyceae Zygnematophyceae Trentepohliophyceae Klebsormidiophyceae Charophyceae

Dasycladophyceae Hiện nay, phương pháp phân loại vi tảo vẫn chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái Nhìn chung, các chi đều có các đặc điểm cơ bản về hình thái để tạo dựng khoá phân loại, nhưng một số loài trong cùng một chi nếu chỉ quan sát dưới kính hiển vi thường thì rất khó phân biệt các đặc điểm sai khác vì quá nhỏ, và cần phải xác định dưới kính hiển vi điện tử Hơn nữa, nhiều loài hoặc chủng rất giống nhau về mặt hình thái và hình thái của chúng lại có thể bị biến đổi khi điều kiện môi trường thay

đổi

Bên cạnh đó, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử đ mở ra một phương pháp nghiên cứu mới là phân loại học phân tử, có thể dựa trên sự nghiên cứu các gen trong hệ gen nhân, hệ gen của các bào quan (ti thể và lục lạp) hoặc các sản phẩm của gen (protein, enzym) Mỗi loại gen, sản phẩm của gen lại phù hợp với từng đối tượng và mục đích nghiên cứu khác nhau Do đó, việc lựa chọn gen nào, loại protein nào có ý nghĩa lớn đối với sự thành công của mỗi nghiên cứu Với những loài sinh vật có quan hệ gần thì người ta có thể chọn những gen hay vùng ADN có độ linh động cao (như intron hay các đoạn ITS - Internal Transcribed Spacer), nhưng với nhóm sinh vật có quan hệ xa thì việc chọn gen hay vùng ADN có

độ bảo tồn cao (ví dụ 18S rRNA, gen m hóa protein) lại có ưu thế Việc chọn gen hay vùng ADN có độ bảo tồn hay độ biến thiên quá cao sẽ có thể ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu, vì vậy khuynh hướng hiện nay cũng là khuynh hướng tốt nhất là người ta kết hợp cả hai hướng này cho cùng một nghiên cứu Nhìn chung, các kỹ thuật phân tích ADN và protein có đóng góp rất quan trọng vào việc đánh giá chính xác tính đa dạng di truyền cũng như cấu trúc di truyền chủng quần của các loài tảo

Đồng thời, các nghiên cứu ADN và protein cũng cho phép đánh giá về địa lý phân

bố chủng loại (loài, loài phụ, quần thể), góp phần vào việc đánh giá tính đa dạng

sinh học của tảo Hiện nay, các kỹ thuật chỉ thị phân tử ADN đ được áp dụng rộng ri trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền các loài cũng như cấu trúc quần thể của rất nhiều loài tảo biển, tảo nước lợ, tảo nước ngọt, đặc biệt trong việc hỗ trợ định tên khoa học của các loài VTB (Bhattcharya và Medlin, 1998); (Sogin et al., 1986) Theo hướng nghiên cứu này, đ có rất nhiều công trình được công bố từ đầu những năm 90 đến nay Ví dụ, các tác giả Nhật Bản đ đánh giá tính đa dạng di truyền và quan hệ phát sinh chủng loại và định tên khoa học của 9 loài Prorocentrum dựa trên trình tự gen 18S rRNA (Grzebyk và Sako., (1998) hay dựa trên trình tự gen LSU rRNA, 5,8S và các ITS để phân tích, định tên khoa học các loài thuộc chi Alexandrium, Anopheles maculatus, Chlorella sp., Skeletonema và Dunaliella (Ki

và Han., 2006; Walton et al., 2007) Nhiều tác giả khác Scheckenbach et al., (2006); Muller et al., (2005); Zhang et al., (2006); Lim et al., (2006) cũng đ có một bài tổng quan về sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu phân loại tảo biển nói chung Các phương pháp phân loại vi tảo dựa trên các đặc điểm hình thái đ

có một số hạn chế như: do kích thước tế bào rất nhỏ và hình thái tế bào vi tảo rất dễ dàng bị thay đổi khi điều kiện môi trường thay đổi nên đòi hỏi người phân loại phải

là các chuyên gia có trình độ cao, phải có các kính hiển vi hiện đại như kính hiển vi huỳnh quang, hiển vi điện tử truyền qua (TEM) hay hiển vi điện tử quét (SEM), rất tốn thời gian Do vậy, để tháo gỡ những hạn chế của phương pháp phân loại dựa trên các đặc điểm hình thái nêu trên, các kỹ thuật sinh học phân tử như đọc và so sánh trình tự nucleotit của các gen bảo thủ như 18S rRNA, ITS1-5,8S-ITS2, 28S rRNA (LSU)… đ hỗ trợ tích cực cho việc định tên khoa học một cách chính xác hơn các loài VTB

1.1.3 Tình hình nghiên cứu về vai trò, giá trị dinh dưỡng của vi tảo

* Vai trò chung của vi tảo đối với con người và động vật

Trong tự nhiên, vi tảo là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn nên chúng là nguồn thức ăn không thể thiếu của nhiều đối tượng thuỷ sản ở hầu hết các giai đoạn phát triển của nhuyễn thể, giai đoạn ấu trùng của giáp xác và cá Ngoài ra, chúng còn được sử dụng để nuôi sinh khối động vật phù du (luân trùng, copepod, artemia) làm thức ăn cho các giai đoạn ấu trùng của giáp xác và cá

Với đặc trưng về thành phần dinh dưỡng, VTB đang là mối quan tâm lớn trong phát triển thương mại hoá sản phẩm công nghệ sinh học vi tảo như là thực phẩm chức năng cho người và động vật, đặc biệt là thức ăn cho ngành NTTS Hàng loạt các nghiên cứu về đa dạng và ứng dụng của vi tảo, thương mại hoá sản phẩm astaxanthin từ Haematococcus, carotenoid từ Dunalliela, Spirulina hay nghiên cứu

về ảnh hưởng của sắc tố này lên tỷ lệ sống sót và sinh trưởng của ấu trùng của tôm Penaeus monodon đ được thông báo Vanitha et al., (2007) và Murthy et al., (2005) đ công bố việc sử dụng VTB trong NTTS như là nguồn thức ăn tươi sống và nhân tạo cho nuôi ấu trùng tôm, Farfantepenaeus aztecus và dùng thức ăn từ vi tảo như Liqualife, Epifeed, Zeigler E-Z Larvae, Zeigler- Z-Plus and Zeigler- E-Z Artemia thay thế từng phần thức ăn Artemia nauplii trong việc sản xuất ấu trùng tôm F Aztecus Các nghiên cứu sâu về dinh dưỡng, khả năng tiêu hoá và nuôi trồng sinh khối vi tảo cho nuôi trồng ấu trùng cá biển và động vật thân mềm hai mảnh vỏ

đ được tiến hành nghiên cứu

* Giá trị dinh dưỡng của vi tảo

Ưu điểm của vi tảo là có kích thước phù hợp, dễ tiêu hoá, ít gây ô nhiễm môi trường, không có độc tố, có thể chuyển hoá trong chuỗi thức ăn, có tỷ lệ phát triển nhanh, có khả năng nuôi sinh khối lớn, cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho động vật nuôi Năm 1999, sản phẩm từ vi tảo sử dụng trong NTTS đạt 1000 tấn (trong đó 62% cho động vật thân mềm, 21% cho tôm và 16% cho cá) Becker (2004)

đ công bố về thành phần dinh dưỡng của hơn 40 loài vi tảo và ứng dụng của chúng trong NTTS

Nhìn chung, hàm lượng protein của vi tảo dùng trong NTTS thay đổi từ 6-52% trọng lượng khô (TLK), carbohydrate: 5-23%, và lipit: 7-23% (Brown, 2002; Muller

et al., 2004) Tất cả các loài vi tảo có thành phần axit amin tương tự nhau, giàu các axit amin không thay thế và không bị thay đổi nhiều trong các pha phát triển và điều kiện chiếu sáng Do vậy, sự khác nhau về chất lượng protein là một nhân tố tạo nên

sự khác nhau về giá trị dinh dưỡng của các loài vi tảo Polysaccharides của vi tảo có biến động về thành phần đường, trong đó hàm lượng về glucoza cao, đạt từ 21 đến 87% Thành phần axit béo không bo hoà đa nối đôi (polyunsaturated fatty acids –

PUFA) chủ yếu là EPA (C20:5 n-3), AA (20:4n-6), DHA (C22:6 n-3) và DPA (C22:5 n-3) Đây là những PUFA có vai trò quan trọng đối với động vật cũng như con người Ví dụ, DHA có vai trò rất quan trọng đối với hoạt động của no và mắt

và làm cho vi tảo có giá trị dinh dưỡng vô cùng quan trọng cho các đối tượng nuôi biển, đặc biệt là trong giai đoạn phát triển của ấu trùng và với cá biển

Tất cả vi tảo đều có hàm lượng cao về axit ascorbic (chiếm 1-16 mg/g TLK)

và riboflavin (chiếm 20 – 40 àg/g) Vi tảo có hàm lượng vitamin cao được sử dụng trong NTTS như Nannochloropsis atomus, Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis sp., Pavlova lutheri, Pavlova pinguis, Stichococcus sp., Chaetoceros muelleri, Thalassiosira pseudonana, Isochrysis sp (T ISO) và Tetraselmis sp đ được công bố Kết quả thu được đ cho phép định ra tiêu chuẩn

về hàm lượng vitamin trong thức ăn tươi sống dùng trong NTTS Vi tảo còn có hầu hết các loại vitamin quan trọng, đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của động vật nuôi như

các loài vi tảo là khác nhau Mức độ thay đổi cao nhất là axit ascorbic, khoảng 16 lần (từ 1 đến 16 mg/g TLK) Với các loại vitamin khác, thì nồng độ của chúng khác nhau từ 2 đến 4 lần giữa các loài vi tảo (Brown, 2002)

Sự khác nhau về hàm lượng sterols, khoáng, sắc tố cũng có thể góp phần tạo nên sự khác nhau về mặt dinh dưỡng của các VTB Mỗi một loài tảo đều có thể thiếu

ít nhất một thành phần dinh dưỡng cần thiết, ví dụ như I galbana có nhiều DHA ít EPA ngược lại tảo khuê có nhiều EPA và ít DHA Vi tảo có hàm lượng PUFAs (EPA, DHA) dao động từ 1-20 mg/mL tế bào được xem là thích hợp cho sự sinh trưởng của nhuyễn thể, nếu hàm lượng này thấp hơn 0,5 mg/mL tế bào thì được coi

là thức ăn nghèo dinh dưỡng Còn đối với giáp xác nhu cầu này đều rất cần thiết và tuỳ thuộc vào từng loài ở tôm he Nhật Bản (Penaeus japonicus), thức ăn chứa khoảng 1% EPA và DHA là phù hợp cho sinh trưởng và có vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi sinh lý của cơ quan sinh sản và tổng hợp các hormone sinh sản Trong khi nhu cầu này ở cá biển từ 1-2% TLK thức ăn Vì vậy, việc chọn lựa và sử dụng hỗn hợp các loài VTB làm thức ăn cho đối tượng thủy sản sẽ cung cấp đầy đủ các thành phần dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển và đem lại hiệu quả cao hơn

Các loài VTB có đặc tính dinh dưỡng tốt được sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp, bao gồm: Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros muelleri, Pavlova lutheri, Isochrysis sp (T ISO), Tetraselmis suecica, Skeletonema costatum và Thalassiosira pseudonana (Brown, 2002)

1.1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi tảo

* ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản

ở Hoa Kỳ, các loài Thalasiossira pseudomonas, Skeletonema, Chaetoceros

minutissima được nuôi để làm thức ăn cho luân trùng, ấu trùng hai mảnh vỏ, ấu trùng tôm và cá theo phương pháp từng mẻ hoặc bán liên tục trong những bể composite 2.000- 25.000 lít ở Hawaii, năng suất loài Nannochloropsis đạt khoảng 2,2 triệu lít/năm

ở Đài Loan, các đối tượng nuôi chính là Tetraselmis, Nannochloropsis oculata, Chlorella sp dùng cho ương nuôi ấu trùng họ tôm he (Penaeus), Isochrysis galbana trong ương nghêu Riêng loài Skeletonema tonemacostatum, sản lượng nuôi

Theo kết quả nghiên cứu của Spolaore et al., (2006) cho thấy vi tảo còn hạn chế

sự phát triển của vi khuẩn trong bể nuôi, đặc biệt là các loài thuộc nhóm Vibrio - thường là tác nhân cơ hội gây bệnh Ví dụ Tetraselmis suecica hạn chế vi khuẩn gây bệnh cho cá (Austin et al., 1992)

- Trong nuôi sinh khối luân trùng

Luân trùng Brachionus rotundiformis và B plicatilis là nguồn thức ăn không thay thế cho giai đoạn đầu của ấu trùng nhiều loài cá biển Việc đáp ứng đủ sinh khối luân trùng đạt chất lượng dinh dưỡng cho các bể ương ấu trùng là việc làm không dễ cho các trại sản xuất giống VTB là nguồn thức ăn tuyệt vời nhất trong nuôi sinh khối luân trùng để đạt năng suất và cho luân trùng chất lượng dinh dưỡng cao nhất, chúng có thể tham gia điều chỉnh thành phần lipit và các axit béo của luân

trùng trước khi chúng trở thành thức ăn cho ấu trùng vì thành phần axit béo của luân trùng có liên quan mật thiết với thức ăn

- Trong nuôi cá biển

Vi tảo được đưa trực tiếp vào bể ương ấu trùng của nhiều loài cá biển bằng kỹ thuật nuôi “nước xanh” Đối với ấu trùng cá biển, không giống như nhuyễn thể và ấu trùng giáp xác, chúng không trực tiếp ăn vi tảo mà được cung cấp dinh dưỡng thông qua các đối tượng động vật phù du làm thức ăn như Copepod, Rotifer, Artemia Giá trị dinh dưỡng của các đối tượng này phụ thuộc chủ yếu vào nguồn thức ăn chính là

vi tảo Ví dụ như nuôi Rotifer bằng Dunaliella tertiolecta (ít PUFA) thì chứa ít hàm lượng PUFA trong cơ thể, ngược lại nếu nuôi bằng Pavlova lutheri (giàu PUFA) thì cũng giàu PUFA trong cơ thể của chúng Dựa vào cỡ mồi của động vật nuôi mà các loài tảo được lựa chọn nuôi sinh khối làm thức ăn thường có kích thước từ 2 - 20 àm

và cho động vật phù du tốt nhất từ 2 - 12 àm (Mulller et al., 2003)

Việc bổ sung tảo Isochrysis galbana với mật độ 2 vạn tế bào/ml đ nâng tốc độ sinh trưởng của ấu trùng cá chẽm nuôi bằng thức ăn tổng hợp lên 40% và tăng 26%

tỷ lệ sống

- Trong nuôi tôm

Trong số 14 loài tảo thử nghiệm làm thức ăn cho ấu trùng tôm, kết quả cho thấy ấu trùng tôm biển: tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ (P merguiensis, P indicus, P japonicus) ăn các loài tảo Chaetoceros muelleri, C calcitrans, Skeletonema costatum, Rhodomonas baltica, Tetraselmis suecica, Isochrysis sp cho

tỷ lệ sống và tốc độ tăng trưởng lớn nhất (Muller et al., 2003) Vi tảo biển làm thức

ăn trực tiếp cho ấu trùng tôm biển, số lượng giảm dần theo tập tính của ấu trùng tôm

từ ăn thực vật: giai đoạn Zoea (herbivorous) sang ăn động vật (carnivorous): Mysis, Postlarvae Ngoài ra vi tảo còn ổn định chất lượng nước của bể nuôi

Nhiều nghiên cứu khác còn cho thấy hiệu quả tích cực của vi tảo khi bổ sung vào

bể nuôi tôm và cá đó là kích thích khả năng bắt mồi của ấu trùng do chúng tiết ra chất hấp dẫn (Muller et al., 2005) và có ảnh hưởng đến hệ vi khuẩn trong bể nuôi và thiết lập hệ vi khuẩn trong ruột ấu trùng (Skjermo và Vadstein., 1993; Laven và Sorgeloos., 1996)

Ngoài vai trò làm thức ăn cung cấp dinh dưỡng cho đối tượng thuỷ sản, vi tảo còn có tác dụng kích thích enzyme tiêu hoá của ấu trùng tôm sú (chủ yếu là trypsin) nâng cao tốc độ tăng trưởng (Brown., 2002)

- Trong nuôi động vật thân mềm

Vi tảo là nguồn thức ăn cho tất cả các giai đoạn của một số loài nhuyễn thể: Nghêu, hầu, sò, điệp, ốc hương, bào ngư Năm 1986, Dinet et al., đ thử nghiệm 50 loài vi tảo biển khác nhau làm thức ăn cho động vật hai mảnh vỏ và đ chọn ra 12 loài được ứng dụng rộng ri cho các trại sản xuất động vật thân mềm Trong đó, các loài Isochrrysis galbana, Isochrysis sp., Pavlova lutheri, Nannonchloropsis oculata, Tetraselmis suecica, Chaetoceros gracilis, C calcitrans, Skeletonema costatum

được sử dụng phổ biến nhất với tần số sử dụng từ 40 - 80% các trại sản xuất (Muller

et al., 2003)

Theo Susana Rivero-Rodrisguez et al., (2007) nghiên cứu về ảnh hưởng của khẩu phần ăn vi tảo lên sinh trưởng, thành phần sinh hoá và axít béo ấu trùng Hầu Crassostrea cortezinensis (Hertlein) đ cho thấy khi hầu ăn tảo Chaetocerros calcitrans (186,1 ± 1,45 mg/ngày) cho tốc độ sinh trưởng cao nhất tiếp đến là hỗn hợp C calcitrans + C muelleri (159,1 ± 41,5 mg/ngày) và C muelleri (93,2 ± 16,1mg/ngày) Thành phần sinh hoá của ấu trùng hầu khi ăn C muelleri và Tetraselmis suecica có hàm lượng cacbonhydrat đạt 0,26%, 0,25%; protein 2,03%, 1,89%; lipít tổng số 0,20%, 0,20% khối lượng tươi, tương ứng

* ứng dụng sử dụng vi tảo trong dinh dưỡng cho con người và động vật

Cho đến nay, việc sử dụng sinh khối vi tảo làm nguồn bổ sung dinh dưỡng cho người chỉ giới hạn ở một số nhóm như Spirulina, Chlorella, Dunaliella và một phần nhỏ là Nostoc và Aphanizomeron bởi những quy chế về an toàn thực phẩm Tuy nhiên việc cho phép sử dụng loài tảo biển Odonella aurita do công ty INNOVALG của Pháp sản xuất như một loại thực phẩm mới đ tạo thuận lợi lớn cho công nghệ sinh học vi tảo Trong một vài năm tới, thị trường thực phẩm chức năng được dự

đoán sẽ là thị trường sôi động nhất và có thể chiếm tới 20% trong ngành công nghiệp thực phẩm Sinh khối hoặc dịch chiết của tảo Spirulina, Chlorella,

Dunaliella đ được sử dụng trong nhiều sản phẩm cung cấp cho con người như mỳ ống, bánh mỳ, sữa chua, bia và các đồ uống nhẹ ở nhiều quốc gia trên thế giới như

Đức, Pháp, Nhật Bản, Mỹ, Trung Quốc và Thái Lan (Gross và Pulz, 2004)

Bên cạnh đó, việc sử dụng vi tảo làm thức ăn cho động vật đ thu được nhiều kết quả đáng kể Đ có những bằng chứng chỉ ra rằng chỉ với một lượng nhỏ sinh khối

vi tảo của một số loài thuộc chi Spirulina, Chlorella đ có những tác động tích cực lên sinh lý của cá, tôm Số lượng cá thử nghiệm dùng sinh khối vi tảo bổ sung vào khẩu phần thức ăn của gia cầm được xem là có triển vọng nhất trong việc ứng dụng

vi tảo làm nguồn thức ăn bổ sung cho động vật (Gross và Pulz, 2004)

Theo Gachon et al., (2007) đ công bố tập đoàn giống tảo của Malaysia gồm

150 loài với khả năng ứng dụng của chúng trong việc khai thác chất có hoạt tính sinh học như PUFA, carotenoit, phycobiliprotein, sử dụng trong xử lý nước thải công nghiệp như nước thải sản xuất cao su, dầu cọ, sản xuất thực phẩm, sử dụng vi tảo làm chỉ thị sinh học cho ô nhiễm kim loại nặng, giàu nitơ trong nước sinh hoạt, làm thức ăn cho nuôi trồng thuỷ sản và gia cầm

- Khai thác các hoạt chất từ vi tảo

Hiện nay, các sản phẩm và dịch chiết từ sinh khối vi tảo đ có một vị trí nhất định trên thị trường Vi tảo được coi là nguồn tiềm năng trong việc khai thác các hoạt chất có hoạt tính sinh học như PUFAs, chất chống oxi hoá, các protein cảm ứng nhiệt, vitamin, các sắc tố

* Axit béo không bo hoà

Vi tảo chứa nhiều chất béo với hàm lượng rất cao dao động trong khoảng từ

20 - 40% TLK Nguồn PUFAs tách từ vi tảo đang được coi là lợi thế hơn so với các nguồn truyền thống như dầu cá vì không có mùi khó chịu hay sự tích luỹ các kim loại nặng ở Châu Âu, các PUFAs tách từ vi tảo đ được tinh chế và bổ sung vào sữa bột cho trẻ Các loại mỹ phẩm có chứa lipit dạng kem hoặc dạng dung dịch với hai tác dụng vừa bảo vệ và chăm sóc da đang dần chiếm lĩnh được thị trường (Gross và Pulz, 2004)

* Chất chống oxi hoá

Vi tảo cũng giống như các thực vật bậc cao, có khả năng thích nghi với các

điều kiện sống khắc nghiệt của môi trường Hầu hết các vi tảo là sinh vật quang tự dưỡng, thường xuyên chịu tác động của ánh sáng mạnh, lượng oxi cao và các yếu tố bất lợi khác Do vậy, để thích nghi và tồn tại, các hệ thống bảo vệ cơ thể được củng

cố, nhằm chống lại quá trình oxi hoá và các yếu tố gây stress Cơ chế bảo vệ ở vi tảo cho phép ngăn chặn sự tích luỹ các gốc tự do và các phản ứng oxi hoá Nhờ vậy nó

có thể chống lại những tác động gây hại đến tế bào Các vitamin, superoxy dismutase, catalaza và glutation peoxydase Dunaliella salina, Haematococcus pluvialis và Porphyridium cruentum đang là nguồn khai thác β- caroten, astaxanthin

và superoxy dismutase (SOD)

* ứng dụng khác của vi tảo

- ứng dụng vào việc xử lí ô nhiễm nước thải

Ô nhiễm nước thải đang là vấn đề cấp thiết và cần được xử lí để bảo vệ, duy trì cuộc sống lâu bền của con người Việc tách các tác nhân gây ô nhiễm từ nước thải trước khi đổ vào môi trường chính là mục tiêu của quy trình xử lí

Vi tảo đ được sử dụng trong những lĩnh vực sau: Hồ oxy hoá, xử lí kim loại nặng

- ứng dụng vi tảo trong việc tạo nguồn năng lượng sạch

Nguồn năng lượng mà chúng ta sử dụng hiện nay xuất phát từ các loại nhiên liệu

mỏ không tái sinh như dầu mỏ, than đá, khí tự nhiên Một giải pháp hấp dẫn để thay thế nguồn dầu hỏa và than đá là sử dụng sinh khối tảo thông qua quá trình quang hợp Sinh khối này có khả năng tái tạo được và sử dụng chúng làm nguồn nhiên liệu

Một số vi tảo được coi là nguồn sản xuất các nhiên liệu có năng lượng cao như

tảo, sản xuất Ethanol và dầu lửa từ glycerol Hydrocacbon cũng được sản xuất chủ yếu là từ vi tảo, các isoprenoit với phân tử lượng thấp (<16) có thể được dùng trực tiếp làm nhiên liệu lỏng trong khi các phân tử có phân tử lượng lớn rất dễ chuyển sang nhiên liệu lỏng thông qua hoạt động của chất xúc tác phù hợp Vi tảo

Botrycoccus braunii là loài sản xuất hydrocarbon điển hình với hiệu suất tới 86% TLK (trích theo Đặng Đình Kim, 1999)

+ Sản xuất methan

hoạt động phối hợp giữa tảo và vi khuẩn Sinh khối tảo được sản xuất đại trà nhờ quang hợp, sau đó thu và sản xuất methan thông qua quá trình lên men kỵ khí Một

số loài tảo được sử dụng thành công để sản xuất methan như hỗn hợp Scenedesmus spp + Chlorella spp + Scenedesmus spp + Chlorella spp + Euglena spp +

+ Sản xuất ethanol và dầu lửa từ glycerol

Sinh khối Dunaliella có thể thu được glycerol, trong điều kiện nuôi trồng tối ưu

ethanol và dầu lửa Ethanol đang được dùng để thay thế xăng dầu ở Brazil, trong khi

ở một số vùng của Mỹ người ta bổ sung ethanol vào xăng để tạo hỗn hợp gasohol Quá trình lên men glycerol nhờ vi khuẩn Bacillus có thể đạt hiệu suất ethanol : axetat là 92 : 8

Cơ chế để sản xuất Hydrogen được tiến hành thông qua các cơ chế: sử dụng enzim nitrogenase của tảo lam hoặc enzim hydrogenase có mặt trong đa số các loài tảo Hoạt tính của nitrogenase được phát hiện trong hơn 125 chủng tảo lam, cả ở dạng có và không có tế bào dị hình

mắt và tảo đỏ Tuy vậy các nhiên liệu từ sinh khối tảo khó có thể thay thế hoàn toàn xăng dầu hoặc khí tự nhiên vì giá thành sản xuất nó còn rất cao Nhưng cho dù chỉ giới hạn ở mức độ là nguồn nhiên liệu bổ sung thì chúng vẫn có một vai trò quan trọng trong việc hạn chế gây ô nhiễm môi trường

1.1.5 Tình hình nghiên cứu về lưu giữ, bảo quản và nuôi trồng vi tảo

T×nh h×nh nghiªn cøu vÒ lưu gi÷, b¶o qu¶n vµ nu«i trång vi t¶o ®ưîc chØ ra trªn b¶ng 1.3 (Nguån: Taylor R.,& Fletcher RL., 1999 trÝch theo Kim ThÞ Thoa, 2004)

B¶ng 1.3 T×nh h×nh nghiªn cøu vÒ lưu gi÷, b¶o qu¶n vi t¶o

Horneland,

1965

Chlamydomonas reinhadtii Chlorella sp., Coccomyxa sp., Euglena sp., Scenedesmus sp.,

5% DMSO

Tsuru, 1973 Chlorella sp.,

Scenedesmus sp., Nitzshia sp., Phaeodactylum tricornutum

10% glycerol 5% DMSO 1% Tween 80

1-5% DMSO 5% DMSO 10%

PVP

18 giê

5 phót 0,05- 1%

ðạt ñến 96,7%

15 phót Ít nhÊt 30%

Saks, 1978 Nitzshia sp.,

Cylindrotheca sp., 5% glycerol 5% DMSO 30 phót ðạt ñến 87%

Phaeodactylum tricornutum Nannochloropsis sp., Dunaliella salina Giboa &Ben

0- 64,4% 20-87,1%

5-10% DMSO 5-10% glycerol 30 phót ðạt ñến 70% ðạt ñến 40% Benhra et al.,

1994 Scenedesmus subspicatus

10% sucrose 5% PVP+ 10%

10% DMSO 5% methanol 30 phót 0- 17,1%

gaditana, Nannochloropsis atomus

Rhodomnas baltica, Tetracelmis chuii, Isochrysis galbana

5-15% DMSO 1- 5% methanol 45 phót 0,10- 95,3%

Hirata et al.,

1996 Chlamydomonas reinhardtii

Một số vi tảo biển kh¸c

Canavate &

Lubian,

1997a

Chaetoceros gracilis, Nannochloris

gaditana, Nannochloropsis atomus

Rhodomnas baltica, Tetracelmis chuii

1-10% DMSO 1-10% glycerol

Day et al.,

1997 Chlorella emersonii, Tetracelmis suesica

5-10% DMSO 10% glycerol 10% methanol

70%

73%

Không xác ủịnh Day, 1998 Một số loài vi tảo

biển

5% DMSO 10% glycerol 10%methanol

2,6M DMSO 2,2M Glycerol 1M Proline 3,1M Methanol

20 phút

Tzovenis et

al., 2004 C calcitrans C muelleri,

Chaetoceros sp., Tetraselmis chuii,

Tetraselmis suecica…

5%, 10% DMSO 10%Methanol 10%Propylene glycol

Jin –Chywan

Gwo et al.,

2005

Nannochloropsis oculata

DMSO, Ethylene glycol, Glycerol, Methanol, Propylene glycol

30 phút

* Tình hình nghiên cứu về nuôi trồng vi tảo

Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều phương pháp nuôi tảo Tùy vào từng mục

đích, nhu cầu và điều kiện nuôi cụ thể mà nên áp dụng phương pháp nào cho phù hợp để giảm chi phí sản xuất và đem lại hiệu quả cao Nhìn chung, có một số phương pháp nuôi tảo như sau:

- Phương pháp nuôi theo mẻ (Hệ thống kín)

Là phương pháp không làm thay đổi môi trường nuôi đ có tảo giống cho đến khi thu hoạch Phương pháp này có đặc điểm giới hạn là bị giới hạn về thời gian, trong khi có những thay đổi về thành phần dinh dưỡng của môi trường và cường độ chiếu sáng lên từng tế bào

Để khắc phục một số điểm giới hạn của phương pháp này người ta đưa ra phương pháp nuôi bán liên tục Đây là một dạng của nuôi theo mẻ nhưng sinh khối

được kiểm tra định kỳ và giữ ổn định bằng phương pháp pha long môi trường

- Phương pháp nuôi liên tục

Là phương pháp được sử dụng rộng ri để nuôi tảo cũng như vi khuẩn Khác với phương pháp nuôi theo mẻ là người ta bổ sung liên tục dinh dưỡng cho tảo tăng trưởng Việc thu sinh khối cũng được tiến hành liên tục sao cho mật độ tế bào tảo luôn được ổn định trong môi trường (Đặng Đình Kim, 2002)

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

ở nước ta các nghiên cứu về tảo cũng đ thu được một số thành tựu đáng kể

Từ những năm 1970, Skeletonema costatum do Vũ Dũng phân lập và nhân giống thành công đ được trường Đại học thuỷ sản thử nghiệm nuôi trồng Năm 1997 với

dự án phát triển trai ngọc ở Bến Bèo, Hải Phòng, tảo Chroomonas sp được đưa vào nuôi thành công ở Trung tâm quốc gia Hải sản Miền Bắc Năm 1998, đ có công trình nghiên cứu nuôi một số loài tảo đơn bào làm thức ăn cho ấu trùng cá biển của

Lê Viễn Chí, Phạm Thị Loan và Hà Đức Thắng, kết quả đ chọn được 3 loài tảo đơn bào là Chlamidomonas sp., Chaetoceros calcitran, Dunaliella sp có khả năng làm thức ăn cho ấu trùng trai ngọc Sau đó, hàng loạt các nghiên cứu lựa chọn môi trường, điều kiện nuôi trồng thích hợp cho loài vi tảo này và Chaetoceros đ được tiến hành và nuôi phổ biến cho các cơ sở sản xuất Chúng được sử dụng rộng ri làm thức ăn cho ấu trùng tôm và tôm sú Skeletonema costatum được sử dụng làm thức

ăn cho ấu trùng tôm he tại Trại Hạ Long, Cẩm Phả, đ nâng được tỷ lệ sống của ấu

17%

Năm 2002, Nguyễn Trọng Nho đ đưa ra kết quả nghiên cứu về phương pháp thu hoạch sinh khối tảo Tetraselmis sp có thể đến 40% sinh khối tảo có chất lượng

để làm thức ăn cho động vật nuôi

Tiếp theo đó, Lê Xân và cs., (2003) đ tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ mặn, mật độ thả ban đầu lên hai loài tảo Nannochloropsis oculata và Isochrysis galbana và sử dụng tốt chúng trong sản xuất giống thuỷ sản ở Cát Bà- Hải Phòng

Đến năm 2006, Dương Đức Tiến đ phân lập, bảo quản một số loài vi tảo biển và quy trình sản suất chúng phục vụ NTTS

Vài năm trở lại đây, do yêu cầu thị trường xuất khẩu cần những sản phẩm sạch và có chất lượng cao nên nhu cầu về thức ăn tươi sống là vi tảo trong các trại sản xuất giống lại được đặt ra một cách cấp thiết Sử dụng thức ăn tươi sống là vi tảo

đ mang lại thành công đáng kể cho việc nghiên cứu sản xuất giống cua, cá biển, sò huyết, ốc hương, nghêu, tu hài, hải sâm….Tuy nhiên, một thực tế là hầu hết các chủng giống vi tảo hiện nay như Chaetoceros sp., Chlorella sp., Platymonas sp., Nannochloropsis oculata, Chaetoceros muelleri, Isochrysis galbana, Pavlova…

đều có nguồn gốc nhập ngoại Việc sản xuất ở qui mô thương mại các loài giáp xác, cá, động vật thân mềm vẫn còn phụ thuộc đáng kể vào việc sản xuất vi tảo như là thức ăn tươi sống cho ấu trùng của chúng vì đây là loại thức ăn tốt nhất, có vai trò

Viện Nghiên cứu NTTS II đ sử dụng thành công một số loài vi tảo như Tetraselmis chuii, Chlorella sp., Nannochloropsis oculata, Platymonas sp Isochrysis galbana trong “qui trình nuôi nước xanh” để ương nuôi ấu trùng cá biển

từ những năm 2000 Nhờ quy trình lưu giữ giống đạt chất lượng, nuôi sinh khối tảo

đạt mật độ cao trong dung tích lớn Trung tâm Giống Quốc gia Hải sản Nam Bộ - Viện Nghiên cứu NTTS II đ trở thành địa chỉ cung cấp giống cá chẽm (Lates calcarfer), cá mú đen chấm đỏ (Epinephelus coioides) đáng tin cậy cho người nuôi

từ nhiều năm qua Và thêm đối tượng giống cá măng (Chanos chanos) năm 2008 (Đặng Tố Vân Cầm, 2007)

Vi tảo đ được sử dụng thành công trong sản xuất giống hải sản tại Viện Nghiên cứu NTTS III trong nhiều năm qua và đ làm tăng tỷ lệ sống lên 3,95% của Vẹm xanh (Perna viridis) ở giai đoạn ấu trùng chữ D đến con giống 3 – 5 mm khi sử dụng hỗn hợp tảo tươi N oculata, Chaetoceros đơn bào, Isochrysis, Platymonas (5000- 60000 tb/ml), ốc hương (Babylonia areolata) giai đoạn Verliger lên 60-65% với hỗn hợp N oculata, Chaetoceros đơn bào, Isochrysis, Platymonas (5000-10000 tb/ml) kết hợp với thức ăn tổng hợp (TH); Sò huyết (Anadara granosa) ở giai đoạn

ấu trùng nổi lên 70% với N oculata, Chaetoeros đơn bào, Isochrysis, Platymonas (3000 - 10000 tb/ml), Trai ngọc (Pinctada maxima) giai đoạn ấu trùng chữ D-Umbo

là 23%, Tu hài (Lutraria rhynchaena) ấu trùng nổi-con giống 7–10 mm lên 1,42% với N oculata, Chaetoeros, Platymonas (3000-15000 tb/ml) so với TH: Lansy, Fripak lên 0,34%; Điệp quạt (Chlamys nobilis) giai đoạn ấu trùng D-spat lên 7,5-9,5% với hỗn hợp Chaetoeros muelleri, Platymonas, Isochrysis (3000-10000 tb/ml)

so với TH: AP, BP là 0-2,5%; Hải sâm (Holothuria scabra) giai đoạn ấu trùng nổi Auricularia lên 37,3-10,4% với hỗn hợp C muelleri, N oculata (20000-40000 tb/ml) so với thức ăn hỗn hợp là Spirulina khô, Fripak lên 10,4%; Nhum sọ (Tripneustes gratilla) giai đoạn ấu trùng nổi đến cuối giai đoạn 8 tay) lên 48,2-61,17% với tảo tươi Chaetoceros, N oculata (6000 - 8000 tb/ml) so với TH: Fripak

oculata, Chaetoceros, Platymonas kết hợp với Rotifer và Artemia so với chỉ ăn Rotifer (18,95%) hay Artemia (27,85%); Cá chẽm (Lates calcarifer) giai đoạn 15 ngày tuổi lên 50% với tảo N oculata (3 - 4 vạn tb/ml) kết hợp với Rotifer (3 - 35con/ml) so với cho ăn chỉ Rotifer (3-35con/ml) là 24% (Nguyễn Thị Thanh Thuỳ, 2007)

Theo nghiên cứu của Huỳnh Thanh Tới, (2006) đ công bố kết quả nghiên cứu khi sử dụng 3 loài tảo địa phương Chaetoceros sp., Nitzschia sp., và Oscillatoria sp

từ khu ao bón phân gây màu tại vùng nuôi Artemia tại Vĩnh Châu - Sóc Trăng làm thức ăn cho Artemia với 3 liều lượng thức ăn cho mỗi loài: mức cao, trung bình và thấp Kết quả sau 10 ngày nuôi dựa trên tỷ lệ sống và tăng trưởng của Artemia, có

thể xếp hạng từng loài tảo dùng làm thức ăn thích hợp cho Artemia như sau: M>Chae-L > Chae-H > Nitz-M >Nitz-L>Nitz-H và tảo Oscillatoria sp tỏ ra không phải là thức ăn tốt cho Artemia Khi phân tích thành phần các axit béo trong sinh khối Artemia cho thấy Artemia nuôi bằng tảo thuần Chaetoceros sp có hàm lượng các axít béo cao hơn đáng kể so với Artemia cho ăn bằng tảo tạp, đặc biệt là hàm lượng HUFA nhiều hơn gấp 3,7 lần

Hiện nay, ở nước ta tuy việc sản xuất giống các đối tượng thuỷ sản có giá trị kinh

tế phát triển manh mẽ, nhưng để chủ động sản xuất thức ăn tươi sống cho các giai

đoạn ấu trùng khác nhau còn gặp nhiều khó khăn Hầu hết các cơ sở sản xuất giống

đều bị động và phải dùng thức ăn thay thế như thức ăn chế biến, bột đậu nành, tảo khô… Nguồn giống và sinh khối tảo còn phụ thuộc vào thu vớt tự nhiên nên không thuần nhất, khó lưu giữ Nguyên nhân là do chưa có phương pháp phân lập tối ưu, nuôi giữ thuần chủng trong điều kiện phòng thí nghiệm cũng như chưa có quy trình công nghệ nuôi thích hợp đảm bảo nhân nhanh sinh khối vi tảo nhất là giống ban

đầu Do các chủng giống tảo có nguồn gốc nhập ngoại, quy trình công nghệ nuôi trồng chúng chưa thích hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam, nên hiệu quả đem lại chưa cao, sinh khối đạt được thấp, bị tạp nhiễm nhiều, nguồn giống sơ cấp không chủ động được, đặc biệt là không có được các chủng giống phân lập được từ Việt Nam nên tính chống chịu với nhiệt độ, độ mặn cao là rất thấp Do vậy, việc phân lập, định loại và sử dụng vi tảo làm thức ăn tươi sống trong sinh sản nhân tạo các loài động vật biển gặp rất nhiều khó khăn, chưa khai thác được tiềm năng về vai trò của vi tảo, chưa đáp ứng được nhu cầu thực tế Để tháo gỡ những vấn đề khó khăn

đó Viện Công Nghệ Sinh học đ tiến hành nhiều đề tài nghiên cứu như “Nghiên cứu

sử dụng quy trình công nghệ nhân nhanh sinh khối ban đầu VTB làm thức ăn tươi sống cho ấu trùng thủy sản kinh tế” do TS Trần Văn Tựa làm chủ nhiệm với nội dung thu thập và phân lập một số VTB có giá trị làm thức ăn cho ấu trùng thủy sản kinh tế; xây dựng quy trình lưu giữ giống; tìm điều kiện thích hợp cho sinh trưởng của Nannochloropsis để nhân nhanh trong điều kiện phòng thí nghiệm; xây dựng quy trình công nghệ nhân nuôi nhanh sinh khối của một loài tảo làm giống ban

đầu…Song do kinh phí hạn hẹp nên đề tài mới chỉ tập trung vào một loài vi tảo

Nannochloropsis (Trần Văn Tựa, 2002) Nghiên cứu đặc điểm sinh học của Dunaliella và Chlorella cũng đ được tiến hành nghiên cứu (Đặng Diễm Hồng,

Đặng Đình Kim, 1995; Đặng Diễm Hồng và cs., 1996; 1998) Quy trình lưu giữ một

số VTB ở nhiệt độ thấp, ni tơ lỏng cũng đ được Viện nghiên cứu NTTS 1 (RIA 1) nghiên cứu và công bố Các nghiên cứu sử dụng phương pháp phân loại học phân tử dựa trên so sánh trình tự nucleotit của đoạn gen 18S rRNA, ITS1-5,8S-ITS2 trong việc định tên và xây dựng cây phát sinh chủng loại các loài vi tảo biển của Việt Nam

đ được công bố Gần đây phòng Công Nghệ Tảo, Viện CNSH đ thành công trong việc định tên khoa học của các loài vi tảo biển dựa trên phương pháp PCR từ một tế bào (Single Cell PCR) (Đặng Diễm Hồng và cs, 2007)

Để có thể làm chủ được nguồn giống vi tảo làm thức ăn tươi sống trong NTTS ở Việt Nam, cần thiết phải có được một ngân hàng giống, làm chủ được các kỹ thuật phân lập để có được các chủng giống của Việt Nam, định tên khoa học chúng bằng các phương pháp truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái, các phương pháp sinh học phân tử, hiểu biết các đặc điểm sinh học chính của chúng để cho phép nuôi trồng thu sinh khối lớn, đáp ứng được yêu cầu thực tiễn đặt ra

1.3 Tình hình nghiên cứu về chi Chaetoceros và Tetraselmis

1.3.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chi Chaetoceros và Tetraselmis

* Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái

- Chi Chaetoceros

Chi Chaetoceros thuộc ngành Baccillariophyta, lớp Baccillariophyceae, bộ Centrales, bộ phụ Biddulphiineae và thuộc họ Chaetoceroceae Nhìn chung, các loài thuộc chi Chaetoceros có kích thước tế bào 3-15 àm, tế bào dạng hộp nhiều góc Mặt cắt ngang tế bào phần lớn là hinh bầu dục, hình thoi rất hẹp, một số loài là hình tam giác, tứ giác, rất ít khi là hình tròn ở hai cực của mặt vỏ hình bầu dục, hình thoi hoặc các góc của mặt vỏ có lông gai vươn ra hoặc có u lồi nổi lên trên ở một số loài trên mặt vỏ có gai Trục cao của tế bào thường ngắn hơn hoặc dài hơn trục dài một chút Thể sắc tố của chúng là các hạt tròn nhỏ, nhiều, cũng có khi là dạng tấm (Trương Ngọc An , 1993)

- Chi Tetraselmis

Chi Tetraselmis thuộc ngành Chlorophyta, lớp Prasinophyceae, bộ Tetraselmidales, họ Tetraselmiceae Chúng có kích thước khoảng 7-22 àm (Đặng

Đình Kim, 2002), dạng đơn bào, tế bào hình ovan hoặc hình giọt lệ, có khả năng chuyển động nhờ 4 roi, chiều dài của 4 roi này thường ngắn hơn so với chiều dài của

tế bào, có một hạt tạo tinh bột nằm ở giữa của tế bào Hạt tạo tinh bột này được bao bọc bởi lục lạp và chiếm phần lớn diện tích của tế bào Màu của thể hạt ở các loài thuộc chi này thường là màu xanh, nhưng có một số ít có thể có màu đỏ (màu của sắc tố carotenoid hoặc xanthophylls) Tetraselmis lần đầu tiên được sử dụng nuôi trồng đại trà năm 1980 Với phương pháp nuôi bán liên tục thì có thể duy trì thời gian sản xuất hơn 60 ngày Tetraselmis là nguồn thức ăn có chất lượng cao cho ấu trùng của các loại nhuyễn thể như trai, sò, ngao, hầu…(Okubo, 2000)

* Tình hình nghiên cứu đặc điểm sinh học của chi Chaetoceros và Tetraselmis

Năm 2001, Nguyễn Thị Hương nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển của quần thể C calcitrans Paulsen, (1905) nhập nội đ cho kết quả tảo sinh trưởng tốt trên môi trường F/2, TT3; độ mặn 25 - 30‰; hàm lượng Nitơ thích hợp cho tảo phát triển từ 9,69 – 12,69 mg/l; Phốtpho từ 0,86-1,36 mg/l; silíc từ 1,15-2,30 mg/l Nhưng theo nghiên cứu của Sontaya Krichnavaruk et al., (2005) cho thấy môi trường F/2 thích hợp cho C calcitrans sinh trưởng có nồng độ Nitơ 14

Đối với Tetraselmis tetrathele, theo kết quả nghiên cứu Jesse D Ronquillo et

30-50‰ Và loài Tetraselmis chuii sinh trưởng tốt trong môi trường có độ mặn 30‰,

1.3.2 ứng dụng của VTB C muelleri và Tetraselmis sp trong NTTS

Trong số các VTB giàu dinh dưỡng thì Chaetoceros muelleri, Tetraselmis sp

được sử dụng làm thức ăn phổ biến cho động vật thân mềm hai mảnh vỏ, ấu trùng giáp xác (Brown et al., 1997; Wikfors và Ohno, 2001) Trong đó, theo nghiên cứu của Susana Rivero –Rodríguez et al., (2007) thì thành phần sinh hoá của C muelleri, Tetraselmis suecica về cacbonhydrat - 15,6%, 17,7%; protein -34,4%,

40,9%; lipít tổng số - 11,1%, 16,1%, tương ứng Đặc biệt, chúng có nguồn PUFAs cần thiết cho sinh trưởng và chức năng của ấu trùng (Belay, 1997; Borowitzka, 1999; Chiou et al., 2001) VTB Chaetoceros muelleri có chứa EPA chiếm đến 16,4% tổng

số axít béo (Fabrice et al., 2003), Tetraselmis sp còn là nguồn cung cấp EPA trung bình khoảng 4,8 mg/g trọng lượng khô (Vishwanath et al., 2007) Tetraselmis sp thường được nuôi kết hợp với Chaetoceros muelleri để có thể bổ sung, hỗ trợ cung cấp nguồn PUFAs cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản

Tuy nhiên, hàm lượng lipít và axít béo có trong VTB còn phụ thuộc rất nhiều vào

điều kiện môi trường, chế độ chiếu sáng, nhiệt độ, dinh dưỡng, pH, độ mặn… (Shifrin and Chisholm, 1981; Sukenik, Wahnon, 1991, Tzovenis et al., 1997; Zhu et al., 1997, Muller et al., 2003) và cả vào giai đoạn phát triển (Piorreck and Pohl, 1984; Taguchi et al., 1987)

ở nước ta hiện nay, các phương pháp phân loại vi tảo vẫn chủ yếu dựa vào đặc

điểm hình thái của chúng Nhìn chung, các chi vi tảo đều có các đặc điểm cơ bản về hình thái để xây dựng khóa phân loại, nhưng một số loài trong cùng một chi nếu chỉ quan sát dưới kính hiển vi quang học rất khó phân biệt do chúng có kích thước rất nhỏ và hình thái tế bào vi tảo rất dễ bị thay đổi khi điều kiện môi trường thay đổi

Do đó, việc phân loại vi tảo cần các chuyên gia có trình độ cao, phải có các kính hiển vi hiện đại như kính hiển vi huỳnh quang, hiển vi điện tử truyền qua (TEM) hay hiển vi điện tử quét (SEM) và tốn nhiều thời gian Vì vậy, sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác định và phân tích trình tự nucleotit của các gen bảo thủ như 18S rRNA, ITS1-5,8S-ITS2, 28S rRNA (LSU)- đ hỗ trợ tích cực cho việc định tên khoa học các loài vi tảo biển một cách chính xác hơn

Bên cạnh đó, việc chủ động sản xuất thức ăn tươi sống là VTB phục vụ cho đối tượng NTTS còn gặp nhiều khó khăn Nguyên nhân chính là do đa số các giống VTB được sử dụng đều có nguồn gốc nhập ngoại nên chưa có phương pháp lưu giữ giống thuần cũng như quy trình công nghệ nuôi chưa thích hợp với điều kiện khí hậu

ở Việt Nam Vì thế, hiệu quả đem lại chưa cao, sinh khối đạt được thấp, bị tạp nhiễm nhiều, nguồn giống sơ cấp không chủ động được Chính vì vậy, việc phân lập, tối ưu hoá điều kiện nuôi trồng các chủng VTB hiện có mặt ở các vùng biển Việt

Nam là hết sức cần thiết để có thể chủ động nguồn giống cung cấp cho các trại NTTS

CHƯƠNG 2 Vật liệu Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

* Các mẫu vi tảo và nước biển

- Mẫu vi tảo biển Chaetoceros sp và Tetraselmis sp được phân lập tại Hải Phòng

Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ Sinh học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam

- Các nguồn nước biển được lấy từ vùng biển X Giao Xuân, Huyện Xuân Thuỷ (tỉnh Nam Định), vùng biển Cát Bà (Hải Phòng) gọi tắt là nước biển Nam Định và nước biển Cát Bà

* Hóa chất

- Các hóa chất vô cơ tinh khiết dùng để pha môi trường nuôi tảo: Erd, Walne, F/2

- Các hóa chất chuyên dùng để tách chiết chlorophyll, carotenoit như: axeton, methanol của Trung Quốc,

- Hóa chất dùng để bảo quản vi tảo biển: DMSO do hng Sigma, Mỹ cung cấp, Isopropanol (Trung Quốc), Glycerol, Agar do Công ty Takana, Nhật Bản cung cấp

* Máy và thiết bị

- Pipetteman các loại (Gilson, France); Pipette Pasteur (USA); Pipette tự động; Tủ

g; min 0,5 g; d = 0,01g) (Switzerland); Cân phân tích Shimadzu AY 120 (max 120 g; d = 0,1 mg); Máy đo OD UV 1601 (Shizuma, Japan); Máy ly tâm Sorvall Legen

RT 1900W (Kendro, Germany); Kính hiển vi quang học Olympus CX21 (Japan); Máy khử trùng (Japan); tủ sấy trọng lượng khô Gallenkamp (USA); buồng đếm Burker-Turk (Germany); máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY Digital 70 (Japan); Máy

đo pH Melter Toledo (Germany); máy nén khí, các loại cột lọc khí, màng lọc khí Satarious (Mỹ); các loại bình tam giác từ loại 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1 lít, 2

lít, 5 lít, túi ny lông, các dây dẫn khí, cục bọt khí, đèn nê ông loại 60 cm, 1,2 m, bình nuôi tảo thuỷ tinh, lamen, lam kính đều được sử dụng cho nuôi tảo

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

- Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH và CN Việt Nam 2.2 Nội dung nghiên cứu

1/ Quy trình phân lập loài Chaetoceros muelleri và Tetraselmis sp phân lập ở Việt Nam được sử dụng làm thức ăn tươi sống trong NTTS

2/ Quy trình lưu giữ hai loài trên bằng các chất bảo quản khác nhau, ở nhiệt độ thấp, trong nitơ lỏng xác định khả năng hoạt hóa lại các chủng giống ở nhiệt độ phòng, bảo đảm duy trì được các đặc điểm di truyền của từng chủng giống được lưu giữ 3/ Định tên khoa học chính xác các chủng VTB có được dựa trên các đặc điểm hình thái, đọc và so sánh trình tự nucleotit của các gen 18S rRNA, ITS1 - 5,8S - ITS2, 28S rRNA hoặc phương pháp PCR đi từ 1 tế bào (Single - cell PCR); Đăng ký được các trình tự gen cho các loài VTB của Việt Nam trên ngân hàng gen quốc tế

4/ Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của loài Chaetoceros muelleri và

như: protein, lipit, cacbonhydrat, vitamin, sắc tố, thành phần axít béo bo hòa và không bo hòa đa nối đôi - SUFAs và PUFAs), các khoáng đa và vi lượng cùng với các đặc điểm sinh lý, sinh hóa như điều kiện tối ưu cho nuôi trồng trong điều kiện phòng thí nghiệm, ngoài tự nhiên như nhiệt độ, ánh sáng, độ mặn, pH, dinh dưỡng môi trường nuôi nhằm mục đích thu được sinh khối vi tảo cao, giàu dinh dưỡng phục vụ trong NTTS

5/ Nuôi trồng thử nghiệm thu sinh khối hai loài trên có chất lượng dinh dưỡng tốt theo định hướng làm thức ăn tươi sống trong NTTS

“A Laboratory Manual” của Christopher et al., (1988), hoặc theo phương pháp phân lập, làm sạch vi tảo đ được mô tả trong quyển sách “Các kỹ thuật nuôi trồng tảo” của tác giả Andersen (2005);

* Phương pháp phân lập 1 tế bào duy nhất bằng Micropipette

Nguyên lý: gắp 1 tế bào Chaetocerros muelleri từ mẫu, sau đó rửa tế bào đ gắp được bằng nước biển có độ mặn 30‰ khử trùng, lặp lại quá trình gắp tế bào nêu trên Quá trình này được lặp lại đến khi còn 1 tế bào tảo, không có lẫn sinh vật đơn bào khác và bảo đảm tế bào tảo được gắp đ được rửa sạch, không còn dính với các

tế bào khác Mẫu sau khi phân lập được nuôi cấy trên môi trường Erdscheiber có độ

ưu điểm của các phương pháp nêu trên cho phép là thu được dòng tảo thuần, không bị tạp nhiễm Tuy nhiên, phương pháp này tiến hành cần nhiều thời gian mới kiểm tra kết quả được

* Phương pháp phân lập bằng pha loãng

Phương pháp này chỉ áp dụng hiệu quả khi loài cần phân lập chiếm đa số trong mẫu bị nhiễm Nếu số lượng tế bào xấp xỉ trong mẫu cần phân lập không biết

được và không thể tính toán ngay lập tức thì người phân lập cần phải tiến hành pha

khoảng 7 đến 10 lần nhắc lại tùy thuộc vào nồng độ mẫu cũng như trạng thái mẫu

* Phương pháp phân lập trên thạch

phương pháp của Andersen (2005) Hình thái tế bào được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi quang học (LM: Light microscope, Olympus CH02, Nhật Bản) và kính hiển vi điện tử quét (SEM: Scanning Eletric Microscope, JEOL JSM-6400, Nhật Bản) Mẫu sau khi phân lập được nuôi cấy ổn định trên môi trường Walne có độ

ưu điểm của phương pháp là phổ biến, dễ tiến hành đối với nhiều phòng thí nghiệm khác nhau và cùng một lúc có thể thu được nhiều dòng thuần khác nhau Tuy nhiên, phương pháp này cũng có giới hạn là chỉ áp dụng được với các loài có