Tuyển chọn chủng nấm men saccharomyces và tối ưu hóa điều kiện lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm

− Để tăng khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men các nguồn dinh dưỡng và thành phần môi trường lên men bao gồm: + Nguồn cacbon là đường glucose với nồng độ 100g/l.. Mục tiêu cụ

Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Thị Kim Oanh

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cám ơn và các thông tin được trích dẫn trong khóa luận này đã được ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2018

Tác giả luận văn

Lê Hồng Quang

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, các thầy cô Khoa Công Nghệ Thực Phẩm đã trang bị cho tôi những kiến thức cơ bản và cần thiết, là nền tảng quan trọng cho quá trình thực tập

và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô Vũ Thị Kim Oanh giảng viên Khoa Công Nghệ Thực Phẩm – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam đã dành nhiều thời gian trực tiếp chỉ bảo hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này

Xin gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh Đạo và các cô, chú, anh, chị cán bộ trong Viện Công nghiệp thực phẩm Đặc biệt là các cô, chú, anh, chị Trung tâm Hoá sinh công nghiệp và môi trường – Viện Công nghiệp thực phẩm và đề tài “Nghiên cứu ứng dụng

và phát triển công nghệ cấp quốc gia – ĐTĐL.CN-59/15” đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi được tiếp cận, giao lưu học hỏi và tăng cường nhận thức của mình về nghề nghiệp và hoàn thành đề tài này

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, những người đã động viên giúp đỡ tôi

về tinh thần cũng như vật chất trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2018

Tác giả luận văn

Lê Hồng Quang

MỤC LỤC

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract xi

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu chung 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Vai trò, nhu cầu của vi chất kẽm 3

2.1.1 Tầm quan trọng của nguyên tố vi lượng kẽm (Zn) 3

2.1.2 Nhu cầu bổ sung kẽm của cơ thể 5

2.1.3 Tình hình sử dụng kẽm hiện nay 6

2.1.4 Phương pháp bổ sung kẽm 8

2.2 Nấm men saccharomyces và nguyên tố vi lượng kẽm 9

2.2.1 Giới thiệu chung về nấm men Saccharomyces 9

2.2.2 Khả năng hấp thụ kẽm của nấm men 10

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men 12

2.2.4 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến quá trình chuyển hoá, tích luỹ kẽm 14

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 16

3.1 Vật liệu 16

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

3.1.2 Hóa chất và vật liệu 16

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ 16

3.2 Nội dung 17

3.3 Phương pháp nghiên cứu 17

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 17

3.3.2 Phương pháp phân tích 20

3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 20

Phần 4 Kết quả nghiên cứu 21

4.1 Kết quả tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm cao 21

4.2 Kết quả ảnh hưởng nguồn muối kẽm khác nhau đến quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm 22

4.3 Kết quả lựa chọn nguồn dinh dưỡng cho quá lên men 25

4.3.1 Kết quả lựa chọn nguồn dinh dưỡng 25

4.3.2 Kết quả ảnh hưởng của ion kim loại 29

4.4 Kết quả lựa chọn điều kiện lên men 32

4.4.1 Kết quả lựa chọn nhiệt độ 32

4.4.2 Kết quả lựa chọn pH 33

4.4.3 Kết quả lựa chọn chế độ lắc 35

4.4.4 Kết quả tối ưu hóa điều kiện lên men 35

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Kiến nghị 40

Tài liệu tham khảo 41

Phụ lục 47

DANH MỤC VIẾT TẮT

AAS Atomic absorption spectroscopy Quang phổ hấp thu nguyên tử

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Lương thực và Nông

nghiệp Liên Hiệp Quốc WHO World Health Organisation Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Nhu cầu kẽm đối với những đối tượng khác nhau theo độ tuổi và

giới tính 6 Bảng 2.2 Những protein vận chuyển kẽm tham gia vào quá trình cân bằng nội

bào kẽm 11 Bảng 2.3 Nhu cầu khoáng đối với nấm men 15 Bảng 4.1 Khả năng sinh trưởng và hàm lượng kẽm trong sinh khối của 15

chủng có khả năng tích lũy kẽm cao 22 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của các loại muối kẽm tới khối lượng sinh khối khô và

hàm lượng kẽm tích lũy 23 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các nguồn cacbon tới khối lượng sinh khối khô và

hàm lượng kẽm tích lũy 26 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới khối lượng sinh khối khô và hàm

lượng kẽm tích lũy 27 Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng bổ sung khoáng chất tới khối lượng sinh khối

khô và hàm lượng kẽm tích lũy 30 Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng

kẽm tích lũy 32 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của pH tới khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm

tích lũy 34 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của chế độ lắc tới khối lượng sinh khối khô và hàm

lượng kẽm tích lũy 35 Bảng 4.9 Khối lượng sinh khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy sau lên men ở

các điều kiện khác nhau 36

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Tình trạng thiếu kẽm hiện nay trên thế giới 7

Hình 2.2 Hình dạng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae 10

Hình 2.3 Sơ đồ vận chuyển kẽm trong tế bào nấm men 12 Hình 4.1 Khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối của các chủng nấm men được

sàng lọc 21 Hình 4.2 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung muối kẽm tới khối lượng sinh khối

khô và hàm lượng kẽm tích lũy 24 Hình 4.3 Ảnh hưởng bởi nồng độ glucose tới khối lượng sinh khối khô và hàm

lượng kẽm tích lũy 26 Hình 4.4 Ảnh hưởng bởi nồng độ cao nấm men tới khối lượng sinh khối khô và

hàm lượng kẽm tích lũy 28 Hình 4.5 Thí nghiệm tối ưu hóa quá trình lên men tạo sinh khối nấm men

giàu kẽm 37 Hình 4.6 Kết quả phân tích JMP về hàm lượng kẽm trong sinh khối (A), khối

lượng sinh khối (B) và các hệ số hồi quy thu được từ thực nghiệm 37 Hình 4.7 Điều kiện tối ưu và hiệu xuất dự kiến bởi phần mềm JMP 39

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Lê Hồng Quang

Tên Luận văn: Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces và tối ưu hoá điều kiện lên

men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

- Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces có khả năng tích luỹ kẽm cao từ bộ

sưu tập giống của Viện Công nghiệp thực phẩm

- Tối ưu hoá điều kiện lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu: Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men trên tất cả các thí nghiệm

- Thí nghiệm 1: Môi trường lên men có bổ sung muối Zn(NO3)2 với nồng độ 1g/l,

tỷ lệ tiếp giống 10% Quá trình lên men thực hiện trong bình tam giác 250ml với thể tích môi trường lên men là 100ml Điều kiện lên men được tiến hành trong máy lắc 150 vòng/phút, ở điều kiện nhiệt độ 28°C trong 72 giờ

- Thí nghiệm 2: Các loại muối kẽm được khảo sát là: Zn(NO3)2, ZnSO4, ZnCl2 Với các dải nồng độ: 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2g/l được bổ sung vào môi trường lên men có: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết man, 5g/l bacto pepton, 10g/l glucose với tỷ lệ tiếp giống là 10% Thí nghiệm tiến hành trong môi trường có pH được hiệu chỉnh về 6,0; lên men ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150 vòng/phút Sau đó khảo sát thời điểm bổ sung muối kẽm tại 0, 9, 18, 27 giờ để xác định điều kiện phù hợp nhất

- Thí nghiệm 3:

+ Các nguồn cacbon khảo sát: Glucose, galactose, frutose, lactose, maltose, sucrose với nồng độ 10g/l được thêm vào môi trường có: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết man, 5g/l bacto pepton, 1g/l ZnSO4 với 10% tỷ lệ tiếp giống Tiếp đó khảo sát nồng độ cacbon thích hợp ở 10, 50, 100, 150g/l Quá trình lên men được tiến hành ở 28°C trong

+ Nguồn ion kim loại khảo sát là: MgSO4 với nồng độ: 0; 0,5; 1,5 g/l; KH2PO4 với nồng độ: 0; 1; 2; 3; 4; 5 g/l và Fe2(SO4)3 với nồng độ 0; 0,5; 1; 2 g/l được bổ sung vào môi trường lên men có 1g/l kẽm ZnSO4 và tỷ lệ tiếp giống 10% Quá trình lên men được tiến hành ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150vòng/phút

- Thí nghiệm 4: Sử dụng 100ml môi trường YM có bổ sung 1 g/l ZnSO4 trong bình tam giác 250ml pH của dịch môi trường trước lên men được khảo sát tại: từ 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7 hiệu chỉnh bằng dung dịch H2SO4 0,1M hoặc NaOH 0,1M Các mức nhiệt độ là 25, 28, 30, 35 oC Các chế độ lắc khảo sát là: 0, 50, 100, 150, 200 vòng/phút

để tìm ra điều kiện thích hợp nhất

- Thí nghiệm 5: Sau khi nghiên cứu lựa chọn nguồn dinh dưỡng, thành phần môi trường, điều kiện lên men phù hợp tiến hành thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy với 3 yếu tố ảnh hưởng nhiều Việc thiết kế thí nghiệm và xử lí số liệu cho quá trình tối

ưu hóa tạo sinh khối nấm men giàu kẽm được thực hiện bằng phần mềm JMP 10.0 Phương pháp phân tích: Phân tích hàm lượng kẽm tổng số trong tế bào nấm men bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) ở bước sóng 213,9 nm

Kết quả chính và kết luận

− Từ 96 chủng nấm men thuộc Saccharomyces, chủng S.cerevisiae CNTP 4087

được sàng lọc có khả năng tích luỹ kẽm cao trong sinh khối đạt 8,91 mg/g sinh khối khô

− Nguồn muối kẽm sử dụng cho quá trình lên men là muối ZnSO4 với nồng độ 1g/l được bổ sung vào thời điểm 9h tính từ lúc bắt đầu quá trình lên men

− Để tăng khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men các nguồn dinh dưỡng

và thành phần môi trường lên men bao gồm:

+ Nguồn cacbon là đường glucose với nồng độ 100g/l

+ Nguồn nitơ là cao nấm men với nồng độ 10g/l

+ Ion kim loại được bổ sung vào môi trường nuôi cấy bao gồm: MgSO4 với nồng

độ 0,5g/l, KH2PO4 với nồng độ 3g/l và Fe2(SO4)3 với nồng độ 0,5g/l

− Điều kiện lên men gồm: Nhiệt độ lên men là 30oC, pH môi trường là 6,5 và chế

độ lắc là 150 vòng/phút

− Điều kiện tối ưu quá trình lên men cho hàm lượng kẽm trong sinh khối khô đạt 12 mg/g và lượng sinh khối nấm men thu được là cao nhất bao gồm: Nồng độ kẽm trong môi trường nuôi cấy: 1,5 g/l, nồng độ glucose: 100 g/l và cao nấm men: 5g/l

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Le Hong Quang

Thesis title: Screening of Saccharomyces yeast strain and optimize fermentation

conditions to receive zinc – enriched yeast biomass

Major: Faculty of food science and technology Code: 8 54 01 01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

- Screening of zinc – enriched Saccharomyces yeast strain with high zinc

accumulates ability from the collection of Food Industry Research Institute

- To optimize fermentation conditions to receive zinc – enriched yeast biomass

Materials and Methods

Research method: Parameter interested: Zn2+ concentration was accumulated in the yeast cell and biomass in all experiments

- Experiment 1: Stock cultures were maintained on YM medium containing (g/l) Zn(NO3)2 (1), 10% transplanting rate with 100ml culture media in 250ml erlenmeyer flask and the procedures were allowed to proceed at 28ºC for 72 hours on a rotary shaker at 150 rpm

- Experiment 2: Zinc sources were investigated: Zn(NO3)2, ZnSO4, ZnCl2 at concentration of 0; 0.25; 0.5; 0.75; 1; 2g/l were added into fermentation medium containing (g/l) yeast extract (3), malt extract (3), bacto peptone (5), glucose (10), 10% transplanting rate pH of environmental was adjusted to 6.0; Fermentation medium was shaken on a rotary shaker at 150 rpm and 28°C for 72hours After that, we investigated time points to added zinc salts at 0, 9, 18, 27 hours so that we determined the best condition

- Experiment 3:

+ Carbon sources were investigated: Glucose, galactose, fructose, lactose, maltose, sucrose with concentration at 10 g/l were added to culture media containing (g/l) yeast extract (3), malt extract (3), bacto peptone (5), ZnSO4 (1), 10% transplanting rate Next, we investigated suitable carbon concentration at 10, 50,

100, 150 g/l The procedures were allowed to proceed at 28ºC for 72 hours in a rotary shaker at 150 rpm

+ Nitrogen sources were investigated: yeast extract, tryptone, peptone, beef extract, casein, with concentration at 10 g/l were added to culture media containing (g/l) malt extract (3), glucose (10), ZnSO4 (1), 10% transplanting rate Then, We investigated suitable nitrogen concentration at 5, 10, 15, 20 g/l Fermentation medium was shaken on a rotary shaker at 150 rpm and 28°C for

72hours

+ Ion metal sources were investigated: MgSO4 with concentration 0; 0.5; 1.5 g/l,

KH2PO4 with concentration 0; 1; 2; 3; 4; 5 g/l and Fe2(SO4)3 with concentration 0; 0.5; 1; 2 g/l They were added into culture media containing ZnSO4 (1) and 10% transplanting rate The procedures were allowed to proceed at 28ºC for 72 hours in a rotary shaker at 150 rpm

- Experiment 4: Using 100ml YM culture media in 250ml erlenmeyer flask containing 1 g/l ZnSO4, pH of culture media before fermentation was investigated: 4; 4.5; 5; 5.5; 6; 6.5; 7, adjusted by H2SO4 0,1M or NaOH 0,1M solution The range of temperature was investigated: 25, 28, 30, 35 oC The investigated shaker modes were: 0, 50, 100, 150, 200 rpm to determine the best condition

- Experiment 5: After the research of selecting nutrition resources, nutritional ingredients, suitable fermentation conditions, as for the optimization of the culture conditions, the experiment was arranged based on with 3 factors affect The optimal condition was treated by JMP 10.0 statistics software

Analysis method: Analysing total zinc content in a yeast cell by Atomic Absorption Spectrophotometric (AAS) at wavelength 213,9 nm

Main findings and conclusions

- The S.cerevisiae CNTP 4087 strain was selected for its high zinc accumulation in biomass of 8.91 mg / g dry biomass from 96 yeast strains of Saccharomyces

- The source of zinc salts used for fermentation was ZnSO4 salt with a concentration of 1 g / l added at 9 hours from the beginning of fermentation

- The source of sources and nutritional ingredients included:

+ Carbon source was glucose at a concentration of 100 g/l

+ Nitrogen source was yeast extract at a concentration of 10 g/l

+ Ions metal were added into medium included (g/l): MgSO4 (0.5), KH2PO4 (3),

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong cơ thể người kẽm là một trong những khoáng chất quan trọng nhất, xuất hiện trong mọi tế bào trong cơ thể với nhiều nhiệm vụ quan trọng Thiếu kẽm sẽ làm tổn thương chức năng miễn dịch, làm tăng nguy cơ mắc các bệnh nhiễm khuẩn Đặc biệt kẽm đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong sự phát triển chiều cao, cơ bắp và miễn dịch của trẻ những năm đầu đời (Nguyễn Xuân Ninh, 1999) Kẽm có vai trò sinh học rất quan trọng, tác động chọn lọc lên quá trình tổng hợp, phân giải axit nucleic và protein – những thành phần quan trọng nhất của sự sống sống Vì vậy các cơ quan như hệ cơ quan như hệ thần kinh trung ương, da, niêm mạc, hệ tiêu hoá và hệ tuần hoàn rất nhạy cảm với sự thiếu hụt kẽm (Prasad, 2012)

Trong những năm gần đây tình trạng thiếu kẽm vẫn đang là vấn đề khá phổ biến trong cộng đồng, khoảng 30% dân số thế giới bị thiếu kẽm và một tỷ lệ lớn trẻ em dưới 5 tuổi ở các nước đang phát triển bị thiếu kẽm Các nghiên cứu chỉ ra rằng, tỷ lệ thiếu kẽm ở trẻ em Việt Nam khá cao: 25 – 40% tuỳ từng địa phương, nhóm tuổi và khoảng 33% nam giới bị thiếu kẽm Phụ nữ mang thai và cho con bú, người cao tuổi cũng nằm trong đối tượng có nguy cơ thiếu kẽm cao (Nguyễn Thị Lâm, 2012) Chính vì vậy, việc bổ sung kẽm vào chế độ dinh dưỡng trong cộng đồng là hết sức cần thiết Tuy nhiên, kẽm không dễ dàng được hấp thụ vào cơ thể ở dạng tự nhiên mà chúng phải được gắn vào các chất mang khác, với các hợp chất hữu cơ, amino axit hoặc được đồng hoá trong tế bào vi sinh vật (Lê Bạch Mai, 2007)

Nấm men từ lâu đã được xem là một trong các đối tượng nghiên cứu chính của ngành Công nghiệp thực phẩm Nhờ vào khả năng hấp thu và đồng hóa một

số kim loại một trong số đó là nguyên tố vi lượng kẽm để tạo ra dòng sản phẩm nấm men giàu kẽm sẽ là nguồn thực phẩm chức năng có giá trị dinh dưỡng cao, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm

Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tuyển

chọn chủng nấm men Saccharomyces và tối ưu hoá điều kiện lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm”

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

1.2.1 Mục tiêu chung

Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces và tối ưu hoá điều kiện lên

men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces có khả năng tích luỹ kẽm cao

từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp thực phẩm;

- Nghiên cứu sự ảnh hưởng nguồn muối kẽm và các ion kim loại khác nhau đến quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm;

- Nghiên cứu lựa chọn nguồn dinh dưỡng, thành phần môi trường, điều kiện lên men phù hợp cho quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm;

- Tối ưu hoá điều kiện lên men thu sinh khối nấm men giàu kẽm

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 VAI TRÒ, NHU CẦU CỦA VI CHẤT KẼM

2.1.1 Tầm quan trọng của nguyên tố vi lượng kẽm (Zn)

- Kẽm (Zn) từ lâu đã được biết đến là một trong những yếu tố quan trọng đối với con người Kẽm tham gia vào thành phần cấu trúc tế bào, tác động đến hầu hết các quá trình sinh học trong cơ thể Ngoài ra, kẽm có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch, trong sự hình thành xương, sự tăng trưởng các mô, sự phát

triển của thai nhi và trẻ nhỏ (Barbarot et al., 2010) Kẽm cũng góp phần không

nhỏ vào sự hình thành tinh trùng cũng như quá trình vận động của cơ thể (Henkel

et al., 1999; Henkel et al., 2003) Như vậy, chức năng của kẽm trong cơ thể con

người có thể chia thành 3 nhóm: Vai trò xúc tác, tham gia vào cấu trúc và điều

tiết (Tuerk et al., 2009; Yoshihisa et al., 2012)

+ Trong vai trò xúc tác, kẽm là thành phần của ít nhất 200 loại enzym khác nhau, đặc biệt có trong hệ thống enzym vận chuyển, thủy phân, đồng hóa, xúc tác phản ứng gắn kết các chuỗi trong phân tử AND, xúc tác phản ứng

oxy hóa cung cấp năng lượng (Stephan et al., 2004; Park et al., 2009; Yamaoka et al., 2000)

+ Trong vai trò cấu trúc, kẽm tham gia vào các trình tự mã hoá protein (domains protein) nhất định tạo thành cấu trúc kẽm-protein Những cấu trúc này

có vai trò quan trọng trong các hoạt động sống của tế bào Một trong những cấu trúc kẽm-protein quan trọng được biết đến là protein Zac1 có chức năng như là

một gen ức chế những khối u tiềm ẩn (Tsuda et al., 2004) Ngoài ra, gen Zac1

còn được biết đến như là một gen điều hoà (Tseng, 1998) Bên cạnh đó, Basonuclin lại là một cấu trúc protein-kẽm khác được tìm thấy trong các biểu

mô khác nhau ở lớp biểu bì, ở thực quản, giác mạc, tinh trùng, noãn, đây là protein đóng vai trò trong quá trình sinh sản của tế bào thể hiện rõ ở sự hình thành tinh trùng, tế bào trứng và cả sự hình thành và phát triển ban đầu của phôi

thai (Mahoney et al., 1998)

+ Trong vai trò điều tiết, kẽm rất cần thiết cho một số quá trình sinh học

như là điều chỉnh gen (Yoshihisa et al., 2012) Ví dụ như MMP-19 là một trong

những thành viên của nhóm enzym phân giải protein phụ thuộc vào kẽm và

nhóm enzym này tác động trực tiếp đến sự phát triển của các khối u (Impola et

al., 2003)

- Thông qua 3 vai trò kể trên, kẽm có vai trò quan trọng trong hoạt động sống của hầu kết các cơ quan ở cơ thể con người như là:

+ Kẽm có vai trò điều hòa chuyển hóa lipit và ngăn ngừa mỡ hóa gan;

+ Kẽm tham gia vào chức năng tạo máu Vai trò của kẽm trong cơ thể không kém vai trò của sắt;

+ Kẽm cần thiết cho sự biệt hóa tế bào và sự ổn định màng;

+ Kẽm ảnh hưởng đến tốc độ hấp thu các axit amin Kẽm cần thiết cho tổng hợp tryptophan;

+ Ảnh hưởng của kẽm đối với hoạt động các hocmon tuyến yên, thượng thận và thận đã được thừa nhận Theo Scott và Fisher, tác dụng giảm đường huyết của insulin phụ thuộc vào kẽm có trong insulin;

+ Kẽm có vai trò trong hệ miễn dịch Nó kích thích sự phát triển và biệt hóa

tế bào lympho Nó đẩy mạnh sự xuất tiết các cytokin (nhất là interleukin 2) để đáp ứng lại các kích thích kháng nguyên

- Ngoài ra, các công trình nghiên cứu còn cho thấy kẽm có vai trò làm giảm độc tính của các kim loại độc như nhôm (Al), asen (As), cadimi (Cd) góp phần vào quá trình giảm lão hóa, thông qua việc ức chế sự ôxy hóa và ổn định màng tế bào Khả năng miễn dịch của cơ thể được tăng cường nhờ kẽm, bởi nó hoạt hóa

hệ thống này thông qua cơ chế kích thích các đại thực bào, tăng các limpho T Vì vậy, khi thiếu kẽm, nguy cơ nhiễm khuẩn ở bệnh nhân sẽ tăng lên

- Vai trò của kẽm cực kỳ quan trọng tương đương với vai trò của sắt đối với

cơ thể đặc biệt là đối với trẻ em Từ năm 2004, Tổ chức Y tế Thế giới đã khuyến cáo sử dụng kẽm trong điều trị tiêu chảy cấp ở trẻ em Nhiều nghiên cứu khoa học đã chứng minh bổ sung kẽm cho trẻ suy dinh dưỡng, trẻ tiêu chảy đã rút ngắn số ngày bị bệnh, giảm số lần tiêu chảy, cải thiện tình trạng suy dinh dưỡng của trẻ Kẽm là một chất xúc tác không thể thiếu được của ARN- polymerase có vai trò quan trọng trong nhân bản ADN và tổng hợp protein, kẽm tham gia điều hoà và tổng hợp hocmon tăng trưởng, kích thích sự tăng trưởng của trẻ Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng của bổ sung kẽm đối với tăng trưởng của trẻ em, đặc biệt là cải thiện chiều cao của những trẻ thấp còi

2.1.2 Nhu cầu bổ sung kẽm của cơ thể

Ở người trưởng thành, cơ thể chứa khoảng 2g kẽm, trong đó có 20% nằm

ở da và ở tóc (Anavekar et al., 2007) Kẽm được dung nạp vào cơ thể con người

chủ yếu qua đường tiêu hoá Phần lớn kẽm được hấp thụ ở ruột non, chủ yếu tại

tá và hỗng tràng, một ít tại hồi tràng (Bagherani et al., 2011) Chính axit dạ dày

làm tăng cường khả năng hấp thu kẽm trong hệ tiêu hoá Trong điều kiện chuẩn,

nồng độ kẽm tối đa đạt được sau 2-3 giờ kẽm đưa vào cơ thể (Stephan et al.,

2004)

Chúng ta đều cần phải bổ sung một lượng kẽm nhất định hàng ngày Đối với trẻ em, kẽm cần thiết cho sự phát triển, đối với người trưởng thành, kẽm đảm bảo cho quá trình duy trì sức khỏe Nhưng với mỗi đối tượng khác nhau tùy vào

độ tuổi và trạng thái sinh lý thì nhu cầu kẽm hàng ngày hoàn toàn khác nhau

Kể từ những năm 1990, Tổ chức Lương thực thế giới (WHO), Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp, Hiệp hội Thực phẩm và Dinh dưỡng (FNB) đã triệu tập các chuyên gia để nghiên cứu, ước tính về nhu cầu kẽm của con người ở các nhóm tuổi khác nhau (WHO, 2002; Press National Academy, 2002) Các phương pháp ước tính yêu cầu về lượng kẽm trung bình được xác định sau khi đã ước tính cả lượng kẽm đã bị mất khi đi qua đường ruột Đối với trẻ em đang lớn và phụ nữ mang thai, lượng kẽm nhu cầu được tính bao gồm cả lượng kẽm tích luỹ

ở các mô Đối với phụ nữ cho con bú lượng kẽm cần bổ sung được tính cả lượng kẽm tiết ra trong sữa Kết quả nghiên cứu điều tra cho thấy với mỗi cá thể thì khả năng hấp thụ kẽm là khác nhau Theo tính toán thì có khoảng 25-33% lượng kẽm đưa vào được hấp thu, lượng kẽm còn lại bị thất thoát trong đường tiêu hoá hoặc

bị thải ra ngoài (Brown et al., 2001) Nhu cầu bổ sung kẽm theo đường tiêu hoá được ước tính và đưa ra trong bảng 2.1 (Roohani et al., 2013)

Trên thực tế trẻ em vẫn là nhóm đối tượng có nguy cơ cao bị thiếu hụt kẽm trong quá trình phát triển Trẻ em được bú sữa mẹ hoàn toàn có đủ lượng

kẽm cho cơ thể trong thời gian từ 5-6 tháng đầu đời (Brown et al., 2004), sau đó

tuỳ theo nhu cầu của từng lứa tuổi cần có chế độ dinh dưỡng và biện pháp bổ sung kẽm phù hợp Riêng đối với trẻ em suy dinh dưỡng, nhu cầu kẽm cần bổ sung cao hơn so với trẻ phát triển bình thường, nó được ước tính là từ 2-4mg/kg

thể trọng (Muller et al., 2001)

Bảng 2.1 Nhu cầu kẽm đối với những đối tượng khác nhau theo độ tuổi

và giới tính

Cân nặng trung bình (kg)

Yêu cầu thực

tế của cơ thể (mg/ngày)

Yêu cầu kẽm cần bổ sung (mg/ngày)

Nguồn: Roohani et al (2013)

Đối với phụ nữ mang thai và cho con bú thì hàm lượng kẽm cần bổ sung tăng vọt Chính vì vậy, bên cạnh việc bổ sung đầy đủ dinh dưỡng thì giai đoạn này cũng cần đặc biệt quan tâm tới việc bổ sung các chất vi lượng cần thiết đặc

biệt là sắt và kẽm (King, 2000; Obrien et al., 2000)

2.1.3 Tình hình sử dụng kẽm hiện nay

Thiếu kẽm sẽ gây ra những ảnh hưởng đến sức khỏe như mất cân bằng lượng đường trong máu, tỷ lệ trao đổi chất chậm, quá trình phân chia tế bào và

tổng hợp DNA cũng sẽ bị thay đổi (Henkel et al., 2003) Quá trình cơ thể thiếu

kẽm lâu ngày sẽ dẫn đến tổn thương chức năng miễn dịch, làm tăng nguy cơ mắc các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm virus từ đó làm giảm tăng trưởng, phát triển của

trẻ, làm tăng nguy cơ bị suy dinh dưỡng (Mocchegiani et al., 2005; Coelho et al., 2006; Kuramoto et al., 1991)

Những biểu hiện thường gặp khi trẻ bị thiếu kẽm: Trẻ thường biếng ăn, rối loạn giấc ngủ: ngủ không ngon giấc, khóc đêm, hay bị mắc các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp và tiêu hoá, chậm phát triển chiều cao

Hình 2.1 Tình trạng thiếu kẽm hiện nay trên thế giới

Nguồn: Andrew Green (2013)

Báo cáo đánh giá sự thiếu hụt kẽm ở Trung Quốc và Ấn độ đã cảnh báo, vấn đề thiếu kẽm đang là một vấn đề trên toàn cầu Theo thống kê của nhóm tác giả cho thấy: 2 tỷ người trên toàn thế giới bị thiếu kẽm; 1,5 triệu trẻ em chết mỗi năm vì tiêu chảy; 800.000 người trong đó có 450000 trẻ em có nguy cơ tử vong mỗi năm do thiếu kẽm (Andrew Green, 2013)

Người ta ước tı́nh rằng 35% tử vong ở trẻ em có thể gây ra do suy dinh dưỡng – làm tăng nguy cơ và mức độ nặng của những bệnh nhiễm trùng như bệnh tiêu chảy, viêm phổi và sốt rét Thiếu hu ̣t kẽm là một thành phần phổ biến của suy dinh dưỡng và có liên hệ với ngưng phát triển chiều cao, và tı̉ lệ nhiễm trùng đường hô hấp dưới và tiêu chảy cao, đặc biệt ở trẻ dưới 5 tuổi Trên toàn cầu, sự thiếu hu ̣t kẽm chi ̣u trách nhiệm cho khoảng 176000 ca tử vong liên quan đến bệnh tiêu chảy, và 406000 ca tử vong liên quan đến viêm phổi ở trẻ dưới năm tuổi, cũng như khoảng 4% gánh nặng tử vong và bệnh tật toàn cầu ở trẻ nhỏ

(Hess et al., 2009; Fischer walker et al., 2010)

Tại Việt Nam, một nghiên cứu trên học sinh (11-17 tuổi) tại vùng nông thôn tỉnh Hà Nam, kết quả cho thấy có khoảng 26,5% trẻ có mức Kẽm huyết thanh thấp Nhiều nghiên cứu trên trẻ em bị suy dinh dưỡng và tiêu chảy kéo dài vào viện tại Hà Nội và Tp Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ thiếu kẽm huyết thanh còn rất cao, vào khoảng 50%-90% tùy theo mức độ Điều tra về tình hình thiếu vi chất năm 2010 trên 586 trẻ 6 tháng đến 75 tháng tại Việt Nam, kết quả cũng cho

thấy tỷ lệ thiếu kẽm là 51,9% Nhóm trẻ nhỏ nhất (6-17 tháng) có nguy cơ bị thiếu kẽm cao nhất khi so sánh với các nhóm tuổi khác (Cao Thị Thu Hương và cs., 2004)

Kết quả từ cuộc điều tra dinh dưỡng quốc gia năm 2010 cho thấy tỷ lệ thiếu máu dinh dưỡng ở trẻ em dưới 5 tuổi là 29%, tỷ lệ thiếu vitamin A tiền lâm sàng là 14% và 51% trẻ thiếu kẽm (Khuất Thị Tuyết Tường và cs., 2013)

Việt Nam có dân số khoảng 90 triệu người và ước tính trong số đó có khoảng 7,1 triệu trẻ em ở độ tuổi dưới 5 tuổi Điều đáng lo lắng hiện nay là nghiên cứu của Viện Dinh dưỡng Quốc gia năm 2012 cho thấy chế độ ăn điển hình của trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ không cung cấp đủ năng lượng, chất dinh dưỡng

và vi chất dinh dưỡng cho trẻ em để có sự tăng trưởng và phát triển tối ưu (Khuất Thị Tuyết Tường và cs., 2013)

Lê Danh Tuyên (2014) - Viện trưởng Viện Dinh dưỡng phân tích, việc thiếu vi chất dinh dưỡng có ảnh hưởng không tốt đến sự tăng trưởng và phát triển ở trẻ em Ở Việt Nam, tỷ lệ suy dinh dưỡng thể thấp còi ở trẻ em dưới 5 tuổi là gần 26% Như vậy, cứ 4 bé thì có hơn một bé bị suy dinh dưỡng thấp còi, do vậy trẻ không thể đạt mức phát triển tối đa Theo Lê Danh Tuyên (2014), kẽm ảnh hưởng rất rõ đến sự phát triển chiều cao của trẻ Tỷ lệ trẻ em Việt Nam thiếu dinh dưỡng dẫn tới việc thấp hơn so với lứa tuổi còn ở mức rất cao, chính vì vậy, việc bổ sung thêm kẽm cũng là một giải pháp để hỗ trợ tăng thêm chiều cao của trẻ em

2.1.4 Phương pháp bổ sung kẽm

Đa dạng hóa khẩu phần dinh dưỡng: Đa dạng hoá bữa ăn là sự kết hợp các

loại thực phẩm khác nhau làm cho bữa ăn cân đối hơn về giá trị dinh dưỡng, vi chất dinh dưỡng, đồng thời làm tăng hấp thu các chất dinh dưỡng Trong một số giai đoạn sinh lý của cơ thể (trẻ em trong giai đoạn đang phát triển, phụ nữ có thai) nhu cầu của một số vi chất dinh dưỡng như kẽm, sắt, iốt và kể cả vitamin A

là rất cao, và không thể được đáp ứng chỉ bằng khẩu phần ăn từ các thực phẩm tự nhiên sẵn có, bắt buộc phải đưa thêm qua đường bổ sung bằng đường uống hoặc đưa vi chất vào thực phẩm Để bổ sung thêm kẽm cho cơ thể dưới dạng các thực phẩm ta có thể lựa chọn một số loại thực phẩm có hàm lượng kẽm cao như: sò huyết, ngao, hàu, thịt đỏ, ngũ cốc,…

Bổ sung vi chất dinh dưỡng: Đây là giải pháp bổ sung kẽm dưới dạng

dược phẩm hoặc thực phẩm chức năng Bổ sung vi chất dinh dưỡng là biện pháp

có hiệu quả khắc phục nhanh chóng tình trạng thiếu các vi chất dinh dưỡng đang lưu hành cũng như dự phòng cho các quần thể dân cư có nguy cơ cao Kẽm có thể được bổ sung dạng viên uống kẽm vô cơ hoặc kẽm gluconat

2.2 NẤM MEN SACCHAROMYCES VÀ NGUYÊN TỐ VI LƯỢNG KẼM 2.2.1 Giới thiệu chung về nấm men Saccharomyces

Nấm men Saccharomyces thuộc họ Saccharomycetaceae, lớp

Ascomycetes, ngành nấm Là vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, không di động, có

khả năng sinh sản nhanh, sinh sản chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi Sinh khối của chúng rất giàu protein, vitamin và lipit Tế bào nấm men thuộc loại Eukaryota (nhân thật), có khả năng hô hấp yếm khí tuỳ tiện

Chúng phân bố rất rộng rãi trong thiên nhiên nhất là trong đất, có thể nói đất là môi trường tự nhiên để giữ giống nấm men và đặc biệt là trên bề mặt của rất nhiều loại lá cây, các loại quả hay các loại cây lương thực thực phẩm khác Nấm men có khả năng lên men các loại đường để tạo thành rượu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng tạo thành sinh khối tế bào Vì thế, nấm men được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát lên men, sản xuất men bánh mì, sản xuất protein sinh khối, tạo hương nước chấm, sản xuất chất béo,… (Lê Văn Việt Mẫn

và cs., 2006; Lao Thị Nga, 1987; Lương Đức Phẩm, 2009; Đặng Trung Trụ, 2001)

Đa số nấm men Saccharomyces có hình ovan, hình bầu dục, hình tròn Nấm men có hình tròn, hình trứng như Saccharomyces cerevisiae, hình elip như

Saccharomyces ellipsoideus, hình quả chanh như Saccharomyces apiculatus, đôi

khi có hình chai như Saccharomyces ludwigii

So với các vi sinh vật khác (đối với vi khuẩn chẳng hạn), nấm men có kích thước tương đối lớn Một số nấm men được sử dụng trong công nghệ thực phẩm thường có kích thước khoảng 3 – 5 × 5 – 10µm (Đặng Trung Trụ, 2001) Kích thước này cũng thay đổi nhiều tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường sống,…

Tế bào nấm men trong tự nhiên có thể đứng riêng lẻ hoặc sau khi nảy chồi vẫn dính vào nhau tạo thành chuỗi

Hình 2.2 Hình dạng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

Hiện nay trong công nghệ thực phẩm đang sử dụng hai loại nấm men bia,

đó là nấm men nổi (Saccharomyces cerevisiae) và nấm men chìm (Saccharomyces carlbergensis), là tế bào hình cầu hay hình trứng, có kích thước

2,5-10 µm chiều rộng và 4,5-21 µm chiều dài

2.2.2 Khả năng hấp thụ kẽm của nấm men

Cơ chế vận chuyển kẽm vào tế bào nấm men

Ion kẽm khi tồn tại trong dung dịch là một ion có điện tích cao, không thể vận chuyển qua màng sinh học (màng tế bào) bằng sự khuếch tán thụ động và do

đó chúng phải được vận chuyển bởi các protein vận chuyển (Guerinot et al., 1999) Nấm men S.cerevisiae được chứng minh có một lượng lớn gen có chức

năng vận chuyển ion kim loại Nồng độ kẽm được duy trì cân bằng nội môi thông qua hoạt động điều hòa các protein vận chuyển được tìm thấy trên màng các bào quan và màng tế bào Quá trình điều hòa này được tiến hành trung gian qua cả 2 cấp độ phiên mã và sau dịch mã để đáp ứng với những thay đổi về nồng độ kẽm trong tế bào (Eide, 2003) Hệ thống phiên mã hoạt động ở mức kẽm nội bào vừa phải, giữa 0,01 và 0,07 nmol Zn/triệu tế bào, và mức sau dịch mã hoạt động khi

mức kẽm nội bào ở trên 0,07 nmol Zn/triệu tế bào (Zhao et al., 1998; Gitan et al.,

1998) Ở giai đoạn phiên mã, ít nhất 3 hệ thống hấp thu được biết đến để kiểm soát sự hấp thụ kẽm trong đó bao gồm:

- Hệ thống có ái lực cao (Kd = 10 nmol/l) hoạt động trong các tế bào có nhu cầu về kẽm hạn chế Hệ thống ái lực này sử dụng protein vận chuyển là Zrt1

(Zhao et al., 1996a)

- Hệ thống có ái lực thấp hơn (Kd = 100 nmol/l) hoạt động trong các tế bào

có khả năng sử dụng kẽm lớn Hệ thống ái lực này sử dụng protein vận chuyển là

Zrt2 (Zhao et al., 1996b)

- Hệ thống protein vận chuyển Fet4

Trong những hệ thống vận chuyển kẽm này có 2 hệ thống đầu hoạt động theo ái lực đối với kẽm thì hoạt động rất nghiêm ngặt chỉ tham gia vào quá trình hấp thụ kẽm và không tham gia vào quá trình hấp thụ các kim loại khác Mỗi protein vận chuyển sẽ hoạt động cho 1 trong 2 hệ thống: Zrt1 chỉ cho hệ thống ái lực cao và Zrt2 chỉ cho hệ thống ái lực thấp (Eide, 2003) Còn đối với hệ thống thứ ba, protein Fet4 không chỉ tham gia và sự hấp thụ kẽm mà còn tham gia vào

sự hấp thụ sắt và đồng (Waters et al., 2002)

Protein Zrt1, Zrt2 và Fet4 thuộc họ ZIP (ZIP lấy tên từ những chữ cái đầu tiên được viết tắt Zinc Iron-regulated transporter Protein) ZRT1 và ZRT2 là các gen mã hóa cho Zrt1 và Zrt2, tương ứng như vậy FET4 mã hóa cho Fet4 Các protein vận chuyển ion kẽm được tổng hợp trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Những protein vận chuyển kẽm tham gia vào quá trình cân bằng

nội bào kẽm

Tình trạng kẽm trong tế bào

4 Zrt3 Không bào ZIP Từ trạng thái dư thừa sang

cạn kiệt

5 Zrcl Không bào CDF Từ trạng thái cạn kiệt

chuyển sang dư thừa

chuyển sang dư thừa

7 Msc2 Mạng lưới nội chất CDF Trạng thái bình thường

8 Zip7 Bộ máy Golgi ZIP Trạng thái cạn kiệt

Nguồn: Satyanarayana et al (2009)

Cơ chế vận chuyển và tích lũy ion kẽm trong nội bào, tế bào nấm men được mô tả trong hình 2.3 Khi kẽm được đưa vào tế bào, kim loại này được sử dụng cho các chức năng trao đổi chất trong tế bào chất và trong một số bào quan

bao gồm ti thể và lưới nội chất Nếu kẽm vượt quá các yêu cầu cần thiết của tế bào nấm men, một số cơ chế có thể được kích hoạt để lưu trữ kẽm cho đến khi nó

có thể được yêu cầu Không bào men được biết có chức năng tích lũy một số cation hóa trị hai, chẳng hạn như Zn2+, Ca2+, Fe2+… và các các cation hoá trị một như là: K+, Li+, Cs+ (White et al., 1987)

Hình 2.3 Sơ đồ vận chuyển kẽm trong tế bào nấm men

Nguồn: Li et al (1998); Miyable et al (2001); Macdiarmid et al (2002); Huang et al

(2005)

Sự vận chuyển kẽm vào không bào được kiểm soát bởi 3 protein vận chuyển: Zrc1, Cot1, Zrt3 Trong khi vai trò của Zrc1 và Cot1 ngăn không cho đưa kẽm vào bởi endocystosis, thì Zrt3 có vai trò huy động kẽm tại các “kho”

tích trữ kẽm ở không bào khi tế bào tiếp xúc với điều kiện hạn chế kẽm (Li et

al., 1998; Miyable et al., 2001; Huang et al., 2005) Một protein vận chuyển

thứ tư được biết đến là Msc2 có ảnh hưởng đến sự cân bằng kẽm nội bào (Li and Kaplan, 2001), nó phân bố ở mạng lưới nội chất và có chức năng điều hoà việc cung cấp kẽm cho chính mạng lưới nội chất này (Ellis, 2004) Ngoài ra còn có protein vận chuyển Zip7 có vai trò vận chuyển kẽm từ tế bào chất tới

bộ máy Golgi khi tế bào nấm men được nuôi trong môi trường cạn kiệt kẽm (Huang, 2005)

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men

2.2.3.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến đời sống vi sinh vật Mỗi loài vi sinh

vật chỉ có khả năng hoạt động sống trong một giới hạn nhiệt độ nhất định Giới hạn này chia làm 3 điểm: nhiệt độ cực đại, cực tiểu và tối thích Quan hệ với nhiệt độ của vi sinh vật cũng chia thành 3 nhóm: vi sinh vật ưa lạnh, vi sinh vật

ưa ấm và vi sinh vật ưa nóng

Trong công nghiệp vi sinh vật, người ta sử dụng các giống ưu ẩm là chủ yếu trong lên men Đối với sinh trưởng của đa số nấm men nhiệt độ tối thích vào khoảng 28 - 32°C, nhưng với lên men thì lại không hoàn toàn trùng với khoảng nhiệt độ này Đối với lên men rượu etylic để sản xuất rượu trắng (cồn thực phẩm, rượu Vodka, các rượu trắng truyền thống) nhiệt độ thích hợp nhất là 30 - 35°C, với lên men rượu vang là 20 - 25°C, lên men bia là 6 - 10°C hoặc 8 - 12°C …

2.2.3.2 pH

pH môi trường: pH môi trường ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của

vi sinh vật, làm thay đổi diện tích của màng tế bào chất, dẫn đến thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào

Mỗi loài vi sinh vật có pH tối thích, cực tiểu, cực đại riêng Đại thể là vi khuẩn và xạ khuẩn thích hợp với pH ở vùng trung tính và kiềm (trừ các vi khuẩn sinh các axit hữu cơ) Vi khuẩn gây thối phát triển tốt ở môi trường kiềm, trong các môi trường axit, chúng bị ức chế hoặc có thể bị chết Ở nhóm nấm men, với

các giống nấm men rượu Saccharomyces cũng có những pH tối thích khác nhau

Đối với nấm men rượu và men bia pH ban đầu thích hợp cho lên men là khoảng 5,5 Trong quá trình lên men pH giảm xuống 4,4 - 4,5 rồi lại tăng dần lên Nguyên nhân giảm pH hay tăng độ chua của môi trường được giải thích bằng sự tạo thành CO2 và các axit hữu cơ trong quá trình

2.2.3.3 Oxy hoà tan – độ hiếu khí

Độ hiếu khí được thể hiện bằng lượng oxy (O2) hoà tan trong môi trường, đơn vị tính là mg O2/ 1lít môi trường Cần chú ý một điều là nhiệt độ càng cao lượng oxy hoà tan trong dịch càng thấp

Oxy hoà tan vào môi trường lỏng ở dạng bọt khí nhỏ làm kích thích sinh sản của nấm men và tạo điều kiện cho tế bào nấm men hô hấp Trong trường môi trường có khuấy trộn và thổi khí làm cho bọt khí càng phân tán nhỏ và đều hơn

Do đó, tế bào nấm men càng được tiếp xúc với chất dinh dưỡng và oxy tốt hơn Bình thường oxy hoà tan tối đa trong nước đến 9 mg/l Nồng độ giảm xuống còn

1 mg/l nấm men sẽ ngừng sinh sản

2.2.3.4 Thành phần môi trường

Thành phần môi trường lên men có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của nấm men và trao đổi chất trong tế bào, đặc biệt là có thể quyết định cả hiệu suất lên men hoặc chuyển hướng lên men từ sản phẩm này sang sản phẩm khác Trong môi trường có thể chia thành 4 nhóm thành phần là:

- Nguồn cacbon dinh dưỡng, chủ yếu là các loại đường có thể lên men;

- Nguồn nitơ dinh dưỡng;

- Các nguồn chất khoáng đa lượng, trung lượng và vi lượng;

- Nguồn các chất sinh trưởng gồm các vitamin, các axit amin, peptit, nucleotit, nuclezit (Lương Đức Phẩm, 2009)

2.2.4 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến quá trình chuyển hoá, tích luỹ kẽm

2.2.4.1 Ảnh hưởng của các nguồn muối kẽm bổ sung tới quá trình tích luỹ kẽm

Với công nghệ lên men truyền thống kết hợp với các phương pháp công nghệ hiện đại, để tăng hàm lượng kẽm vào sinh khối nấm men các nhà khoa học hiện nay đã tiến hành bổ sung các loại muối kẽm vô cơ có tính tan tốt như là: kẽm nitorat, kẽm sunphat, kẽm clorua… vào môi trường nuôi cấy với nồng độ thích hợp Đây là 3 loại muối kẽm vô cơ phổ biến nhất được sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm thu được sinh khối nấm men giàu kẽm Các nguồn muối kẽm vô cơ khác có tính tan kém hoặc không tan trong nước hầu như không được sử dụng trong các nghiên cứu tạo sinh khối nấm men giàu kẽm

Sillerova et al (2012) đã nghiên cứu tạo sinh khối nấm men giàu kẽm bằng

việc sử dụng các nguồn muối kẽm khác nhau như: kẽm nitorat, kẽm sunphat, kẽm clorua ở dải nồng độ từ 250 mg/l đến 3000 mg/l Đồng thời, so sánh hiệu quả tích lũy kẽm lên các chủng nấm men được khảo sát Kết quả cho thấy, ở cùng một nồng độ muối kẽm xác định thì các loại muối khác nhau cho hiệu quả tích lũy kẽm trên chủng nấm men nghiên cứu và tác dụng độc hại của nó lên tế

bào là khác nhau (Sillerova et al., 2012)

2.2.4.2 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến quá trình trích luỹ kẽm

Để tạo nấm men giàu kẽm điều cần thiết là phải lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp để nấm men có thể sinh trưởng phát triển tốt từ đó làm tăng khả

năng đề kháng với kẽm Khi sử dụng môi trường nuôi cấy tổng hợp ngoài việc cung cấp nguồn cacbon và nitơ đầy đủ thì việc cung cấp các nguyên tố khoáng vi lượng với tỉ lệ thích hợp là hết sức cần thiết để duy trì tốt sự sinh trưởng và phát triển của nấm men Nhu cầu của vi sinh vật cũng không giống nhau đối với tuỳ loài, tuỳ giai đoạn sinh trưởng và phát triển Người ta nhận thấy nồng độ cần thiết

về các muối khoáng đối với nấm men thường thay đổi trong các phạm vi sau đây:

Bảng 2.3 Nhu cầu khoáng đối với nấm men

Nguồn: Nguyễn Lân Dũng và cs (2002)

Có thể nhận thấy các nguyên tố khoáng vi lượng là một trong các bộ phận cấu thành nên cấu trúc của tế bào, có vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzym tham gia vào các quá trình chuyển hóa Mặt khác, khả năng tích lũy kẽm

có liên quan mật thiết đến hoạt động của các enzym chuyển hóa xúc tác các phản ứng trong tế bào Chính vì vậy, việc nghiên cứu bổ sung các nguyên tố vi lượng

và nghiên cứu các tác động qua lại của các ion kim loại tới quá trình tích lũy kẽm

là hết sức cần thiết (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2002)

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 VẬT LIỆU

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

− 96 chủng nấm men thuộc chi Saccharomyces bao gồm các loài S

cerevisiae, S carlsbergensis, S bruxellensis, S checvalieri,… đã được phân lập

từ các mẫu lấy ở các tỉnh thành trong nước và các chủng được lấy từ các nguồn nước ngoài như là: Thuỵ Điển, Pháp, Đức, Thái Lan,… (danh sách được thể hiện

ở phụ lục) Các chủng này đang được lưu giữ tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp - Viện Công nghiệp Thực phẩm Việt Nam

− Môi trường dùng trong nghiên cứu: Môi trường lên men vi sinh vật YM (3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l pepton, 10g/l glucose, 1000ml nước cất)

- Box cấy (Bioblock Scientific-Pháp);

- Cân điện tử (Precisa, Thụy Điển);

- Kính hiển vi quang học (Lieca DM2700M);

- Lò vi sóng (LG, Hàn Quốc);

- Máy đo pH HANNA 98107(Rumani);

- Máy lắc ổn nhiệt GYROMAX 373R (Hàn Quốc);

- Máy ly tâm cao tốc (Heraeus, Sepatech);

- Nồi hấp thanh trùng (Himayatoko, Nhật Bản);

- Thiết bị lên lên men, nhân giống Genenis 20L (Solaris Biotechnology, Italia);

- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS-6800 Shimadzu (Nhật Bản);

- Tủ sấy MEMMERT (Nhật Bản);

- Tủ lạnh SANYO (Nhật Bản);

- Máy ly tâm MIKRO 220R (Đức);

- Tủ cấy vô trùng (Nhật Bản): Vô khuẩn có đèn UV;

- Các dụng cụ khác: Pipet Nichipet EX (Nhật Bản), đầu típ, nồi, đĩa peptri, ống nghiệm, bình tam giác, ống falcon,…

3.2 NỘI DUNG

Nội dung 1: Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces có khả năng tích

luỹ kẽm cao từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp thực phẩm

Nội dung 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng nguồn muối kẽm đến quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm

Nội dung 3: Nghiên cứu lựa chọn nguồn dinh dưỡng, thành phần môi trường cho quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm

Nội dung 4: Nghiên cứu điều kiện lên men phù hợp cho quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm

Nội dung 5: Tối ưu hoá điều kiện lên men thu sinh khối nấm men giàu kẽm

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tích luỹ kẽm cao

− Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm cao từ 96 chủng

nấm men thuộc Saccharomyces được tiếp nhận từ trung tâm Vi sinh vật công

nghiệp – Viện Công nghiệp thực phẩm Môi trường lên men YM có bổ sung muối vô cơ Zn(NO3)2 với nồng độ 1g/l, tỷ lệ tiếp giống 10% Quá trình lên men thu sinh khối được thực hiện trong bình tam giác 250ml với thể tích môi trường

lên men là 100ml Điều kiện cho quá trình lên men được tiến hành trong máy lắc

150 vòng/phút, ở điều kiện nhiệt độ 28°C trong 72 giờ

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men

Thí nghiệm 2: Lựa chọn, xác định nồng độ và thời điểm bổ sung muối kẽm

− Để lựa chọn nguồn kẽm phù hợp cho việc tạo sinh khối nấm men giàu kẽm, các loại muối kẽm được khảo sát là: Zn(NO3)2, ZnSO4, ZnCl2 Với các dải nồng độ: 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2g/l được bổ sung vào môi trường lên men có chứa: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton, 10g/l glucose với

tỷ lệ tiếp giống là 10% Thí nghiệm được tiến hành trong môi trường có pH được hiệu chỉnh về 6,0 bằng dung dịch HCl 0,1M Quá trình lên men được tiến hành ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150 vòng/phút

− Sau khi đã lựa chọn được nồng độ và nguồn muối kẽm phù hợp tiến hành lên men bổ sung muối kẽm tại các thời điểm 0, 9, 18, 27 giờ để xác định điều kiện phù hợp nhất

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men

Thí nghiệm 3: Lựa chọn nguồn dinh dưỡng, thành phần môi trường lên men

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới quá trình tích lũy kẽm

+ Lựa nguồn cacbon cho quá trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm được thực hiện trên môi trường cơ bản có chứa: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton, 1g/l ZnSO4 với 10% tỷ lệ tiếp giống, có bổ sung thêm 10g/l với một trong các nguồn cacbon cần khảo sát chọn lựa sau: Glucose, galactose, frutose, lactose, maltose, sucrose Sau khi đã lựa chọn được nguồn cacbon phù hợp, tiến hành khảo sát nồng độ cacbon ở 10, 50, 100, 150g/l để xác định được nồng độ thích hợp cho quá trình tích lũy kẽm Quá trình lên men được tiến hành ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150vòng/phút

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men

+ Nguồn nitơ bao gồm: cao nấm men, tripton, pepton, cao thịt bò, casein, 10g/l mỗi loại được bổ sung vào môi trường cơ bản có chứa: 3g/l dịch chiết malt,

10g/l glucose, 1g/l ZnSO4 với tỷ lệ tiếp giống 10% Khảo sát ảnh hưởng bởi các nguồn nitơ tới quá trình tích lũy kẽm Tiếp tục thí nghiệm khảo sát nồng độ nitơ thích hợp với các mức 5; 10; 15; 20g/l để xác định nồng độ phù hợp Quá trình lên men được tiến hành ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150vòng/phút

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men

- Nghiên cứu lựa chọn ion kim loại bổ sung

Để lựa chọn ion kim loại phù hợp cho việc tạo sinh khối nấm men các loại ion kim loại được khảo sát là MgSO4 với nồng độ: 0; 0,5; 1,5 g/l; KH2PO4 với nồng độ: 0; 1; 2; 3; 4; 5 g/l và Fe2(SO4)3 với nồng độ 0; 0,5; 1; 2 g/l được bổ sung vào môi trường YM để tiến hành lên men có 1g/l kẽm ZnSO4 và tỷ lệ tiếp giống 10% Quá trình lên men được tiến hành ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150vòng/phút

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men.

Thí nghiệm 4: Lựa chọn điều kiện cho quá trình lên men

Khảo sát điều kiện pH, nhiệt độ, chế độ lắc tới quá trình tích lũy kẽm

Sử dụng môi trường YM có bổ sung 1 g/l ZnSO4 trong nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành trên bình tam giác 250ml trong đó có chứa 100ml dung dịch môi trường lên men pH của dịch môi trường trước lên men được khảo sát tại các giá trị: từ 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7 hiệu chỉnh bằng dung dịch H2SO4 0,1M hoặc NaOH 0,1M Các mức nhiệt độ được khảo sát là: 25, 28, 30, 35 oC Các chế

độ lắc được khảo sát là 0, 50, 100, 150, 200 vòng/phút để tìm ra điều kiện thích hợp nhất

Chỉ tiêu theo dõi: nồng độ Zn2+ được tích lũy trong tế bào nấm men, sinh khối nấm men

Thí nghiệm 5: Tối ưu hoá điều kiện lên men thu sinh khối nấm men giàu kẽm

Sau khi nghiên cứu lựa chọn nguồn dinh dưỡng, thành phần môi trường, điều kiện lên men phù hợp tiến hành thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy với

3 yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp leo dốc ứng với 3 yếu tố ảnh hưởng được khảo sát: x1, x2, x3 Hàm mục tiêu (y) là hàm lượng kẽm trong sinh khối Phương trình hồi quy có dạng:

y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b123x1x2x3 Với: b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23 là các hệ số của phương trình hồi quy Việc thiết kế thí nghiệm và xử lí số liệu cho quá trình tối ưu hóa tạo sinh khối nấm men giàu kẽm được thực hiện bằng phần mềm JMP 10.0

3.3.2 Phương pháp phân tích

− Phương pháp xử lý mẫu sinh khối nấm men giầu kẽm: Sinh khối nấm men thu được mang đi rửa với nước khử ion với tỉ lệ 1:5, rửa 3 lần Sử dụng máy li tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong thời gian 20 phút để thu sinh khối sau khi rửa Tiến hành làm khô sinh khối nấm men ở 60oC trong 2h, sau đó kết thúc quá trình sấy ở 105oC đến khối lượng không đổi

− Phương pháp phân tích AAS: Hàm lượng kẽm tổng số trong tế bào nấm men được xác định bằng quang phổ hấp phụ nguyên tử (AAS) Cân 50 mg mẫu nấm men khô chuyển vào bình phá mẫu, thêm vào 2 ml HNO3 đặc và ngâm qua đêm, thêm 1 ml H2O2 đặc và tiến hành phá mẫu bằng lò vi sóng Mẫu sau khi để nguội được định mức thành 10 ml, lấy 1 ml pha loãng thành 10 ml bằng dung dịch HNO3 2% Mẫu sau khi xử lí được đưa vào hệ thống máy đo quang phổ hấp phụ nguyên tử và tiến hành phân tích hàm lượng kẽm ở bước sóng 213,9 nm

(Shet et al., 2011)

3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý trên Excel, minitab 16, thuật toán thống kê student T’test, F’test và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (one way ANOVA) Nếu p < 0.05 được coi là sai khác có ý nghĩa, nếu p > 0,05 sự sai khác là không có ý nghĩ thống kê Xử lí số liệu cho quá trình tối ưu hóa tạo sinh khối nấm men giàu kẽm được thực hiện bằng phần mềm JMP 10.0

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY KẼM CAO

Từ 96 chủng nấm men thuộc Saccharomyces được tiếp nhận từ trung tâm

Vi sinh vật công nghiệp – Viện Công nghiệp thực phẩm Môi trường lên men

YM có bổ sung muối vô cơ Zn(NO3)2 với nồng độ 1g/l Quá trình lên men thu sinh khối được thực hiện trong bình tam giác 250ml với thể tích môi trường lên men là 100ml, pH của môi trường được điều chỉnh tới 4,5 bằng HCl 0,1M Điều kiện cho quá trình lên men được tiến hành trong máy lắc 150 vòng/phút, ở điều kiện nhiệt độ 28°C trong 72 giờ

Kết thúc quá trình sàng lọc cho thấy, khả năng tích luỹ kẽm ở tất cả các chủng là rất khác nhau Trong đó chủng thể hiện khả năng tích luỹ kẽm cao nhất

là chủng S.cerevisiae CNTP 4087 với mức kẽm là 8,91 mg/g sinh khối khô, còn chủng thấp nhất là S.cerevisiae CNTP 4100 ở mức kẽm tích luỹ là 0,56 mg/g

Kết quả chi tiết về hàm lượng kẽm trong sinh khối và lượng sinh khối tích luỹ của các chủng được thể hiện tại Phụ lục

Hình 4.1 Khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối của các chủng nấm men

được sàng lọc

Kết quả cho thấy, trong tổng số 96 chủng nấm men được nghiên cứu có 39 chủng thể hiện khả năng tích kẽm thấp, dưới 1 mg/g sinh khối khô chiếm tỷ lệ 40,62%; 42 chủng tích kẽm trong khoảng từ 1-3 mg/g sinh khối chiếm tỷ lệ

43,75% và 15 chủng có khả năng tích lũy kẽm với hàm lượng trên 3 mg/g sinh khối, chiếm tỷ lệ 15,63% được thể hiện qua bảng dưới đây:

Bảng 4.1 Khả năng sinh trưởng và hàm lượng kẽm trong sinh khối của 15

chủng có khả năng tích lũy kẽm cao

STT Chủng S.cerevisiae Khối lượng sinh khối khô

(g/100ml)

Hàm lượng kẽm trong sinh khối khô (mg/g)

Kết quả trên cho thấy, sau khi được bổ sung nồng độ muối kẽm ở nồng độ

1 g/l vào môi trường cơ bản thì hàm lượng muối kẽm thu được trong sinh khối

khô nấm men tăng mạnh, điển hình là lên tới 8,91mg/g ở chủng S.cerevisiae

CNTP 4087 Điều này kiểm chứng thêm một lần nữa về khả năng tích lũy các

nguyên tố vi lượng trong đó có kẽm của S.cerevisiae Chính vì vậy chủng nấm men S.cerevisiae CNTP 4087 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

4.2 KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG NGUỒN MUỐI KẼM KHÁC NHAU ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN THU NHẬN SINH KHỐI NẤM MEN GIÀU KẼM

Để lựa chọn nguồn kẽm phù hợp cho việc tạo sinh khối nấm men giàu

kẽm, các loại muối kẽm được khảo sát là: Zn(NO3)2, ZnSO4, ZnCl2, 3 loại muối kẽm này là các muối thường được sử dụng cho các nghiên cứu tích lũy kẽm trong

tế bào nấm men Với các dải nồng độ: 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2g/l được bổ sung vào môi trường lên men có chứa: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton, 10g/l glucose Thí nghiệm được tiến hành trong môi trường có pH được hiệu chỉnh về 6,0 bằng dung dịch HCl 0,1M Quá trình lên men được tiến hành ở 28°C trong 72 giờ, chế độ lắc 150vòng/phút

Sau khi đã lựa chọn được nồng độ và nguồn muối kẽm phù hợp tiến hành lên men bổ sung muối kẽm tại các thời điểm 0, 9, 18, 27 giờ để xác định điều kiện phù hợp nhất

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của các loại muối kẽm tới khối lượng sinh khối khô và

Các chữ cái khác nhau là khác nhau về ý nghĩ thống kê với α = 0,05

Qua bảng 4.2 kết quả về hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men trên 3 loại muối kẽm nitorat, kẽm sunphat và kẽm clorua hoàn toàn có sự sai khác, mức sai khác này là có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Kết quả này cho thấy, khả năng chuyển hóa nguồn muối kẽm tích lũy kẽm trong tế bào nấm men

S.cerevisiae CNTP 4087 với mỗi loại muối kẽm khác nhau là khác nhau Việc sử

dụng muối kẽm sunphat và kẽm clorua cho khả năng tích lũy kẽm cao hơn muối kẽm nitorat Hơn nữa, xét về khối lượng sinh khối khô thu được thì kẽm sunphat

thu được khối lượng sinh khối khô sau lên men cao hơn hai muối còn lại ở tất cả các nồng độ nghiên cứu Chính vì vậy, muối kẽm sunphat được lựa chọn làm nguồn muối bổ sung cho các nghiên cứu tiếp sau

Có thể nhận thấy, nồng độ muối kẽm bổ sung vào môi trường nuôi cấy có mối liên quan chặt chẽ với hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối Nồng độ muối kẽm bổ sung càng cao thì hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối càng lớn Tuy nhiên, tác dụng độc hại của kim loại này lên sinh trưởng và phát triển của tế bào lại rất rõ rệt khi tăng dần nồng độ muối kẽm Điển hình là khi bổ sung ở nồng độ 0,25 g/l kẽm sunphat khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối chỉ đạt 2,48 mg/g, nồng độ này chưa ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của nấm men Khi nồng độ bổ sung muối kẽm sunphat lên tới 1 và 2 g/l thì hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối có sự gia tăng mạnh tới 9,15 mg/g và 11,96 mg/g nhưng ở nồng độ 2g/l thì nấm men bị ức chế sinh trưởng hoàn toàn Chính vì vậy, với mục tiêu thu nhận được lượng lớn sinh khối nấm men giàu kẽm thì chỉ nên lựa chọn nồng độ muối kẽm 1g/l ZnSO4 cho quá trình lên men

Sau khi đã lựa chọn được nguồn muối kẽm phù hợp, thí nghiệm được tiếp tục tiến hành và khảo sát thời điểm bổ sung muối kẽm sao cho lượng kẽm tích lũy trong sinh khối khô đạt hiệu quả cao nhất Theo đó, chủng nấm men được tiến hành lên men trong môi trường YM có bổ sung kẽm sunphat nồng độ 0,5 g/l tại các thời điểm 0, 9, 18 và 27 giờ Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần, các kết quả cụ thể được trình bày ở hình 4.2

Hình 4.2 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung muối kẽm tới khối lượng sinh

khối khô và hàm lượng kẽm tích lũy

Kết quả ở hình 4.2 cho thấy, thời điểm bổ sung muối kẽm sunphat có ảnh hưởng rất lớn tới hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men Đồng thời, thời điểm bổ sung kẽm sau 9 giờ của quá trình lên men thì hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối giảm dần Cụ thể, hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối tại thời điểm 0 và 9 giờ của quá trình lên men dao động trong khoảng 8,92 - 8,89 mg/g nhưng tại thời điểm 18 và 27 giờ giá trị này giảm dần chỉ còn 4,53 và 2,26 mg/g sinh khối Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của nhóm nghiên

cứu Roepcke et al (2011), khi nghiên cứu xác định ảnh hưởng bởi thời điểm bổ

sung kẽm đến lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men Đồng thời, các tác giả khác cũng cho rằng quá trình hấp thụ các ion kim loại diễn ra ở pha sớm của

quá trình lên men (pha logarit), ở đó nguồn năng lượng đạt cao nhất (Waters et

quá trình lên men tích kẽm

4.3 KẾT QUẢ LỰA CHỌN NGUỒN DINH DƯỠNG CHO QUÁ LÊN MEN 4.3.1 Kết quả lựa chọn nguồn dinh dưỡng

4.3.1.1 Kết quả lựa chọn nguồn cacbon

Lựa nguồn cacbon cho quá trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm được thực hiện trên môi trường cơ bản có chứa: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton, 1g/l ZnSO4 có bổ sung thêm 10g/l với một trong các nguồn cacbon cần khảo sát chọn lựa sau: glucose, galactose, frutose, lactose,

maltose, sucrose Kết quả thí nghiệm được thể hiện như sau:

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các nguồn cacbon tới khối lượng sinh khối khô và

Từ bảng 4.3 cho thấy, khi sử dụng các nguồn cacbon khác nhau thì khả năng tích lũy kẽm cũng như tốc độ sinh trưởng của nấm men có sự khác biệt rõ

rệt Khả năng tích lũy kẽm vào sinh khối của S cerevisiae CNTP 4087 giảm dần

theo trật tự sau: glucose > sucrose > fructose > galactose>lactose > maltose Chính vì vậy, nguồn cung cấp cacbon được lựa chọn là đường glucose cho các nghiên cứu tiếp sau Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Cha khi tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy tạo sinh khối nấm men giàu

kẽm trên chủng S cerevisiae FF10 (Cha et al., 2009) Tiếp đó tiến hành khảo sát

ảnh hưởng của glucose tới khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men ở các

nồng độ: 10, 50, 100 và 150g/l Kết quả được trình bày hình 4.3

Hình 4.3 Ảnh hưởng bởi nồng độ glucose tới khối lượng sinh khối khô và

Kết quả ở hình 4.3 cho thấy, tốc độ sinh trưởng và phát triển của nấm men tăng mạnh mẽ khi tăng nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy từ 10g/l tới 100g/l Điều này thể hiện rõ qua khối lượng sinh khối thu được sau lên men Khi nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy lên tới 150g/l sự sinh trưởng và phát triển của nấm men sau nuôi cấy có sự thay đổi không đáng kể Kết quả về hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men ở các nồng độ glucose bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho thấy, khi tăng nồng độ glucose từ 10g/l tới 150g/l đường biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ đường và hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối có chiều hướng giảm dần Tuy nhiên, sau khi so sánh về mặt thống kê thì sự sai khác giữa các giá trị này là không có ý nghĩa với p > 0,05 Có thể nhận thấy glucose không ảnh hưởng tới khả năng hấp thu kẽm trong sinh khối nhưng lại ảnh hưởng trực tiếp tới sự sinh trưởng và phát triển của nấm men cũng như khối lượng sinh khối sau lên men Bởi lẽ, glucose là nguồn năng lượng chính cho nấm men đồng hóa và xây dựng cấu trúc tế bào và gia tăng sinh khối Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, glucose với nồng độ 100g/l là nguồn cacbon phù hợp

cho quá trình lên men thu nhận sinh khối nấm men giàu kẽm

4.3.1.2 Kết quả lựa chọn nguồn nitơ

Nguồn nitơ bao gồm: cao nấm men, tripton, pepton, cao thịt bò, casein, 10g/l mỗi loại được bổ sung vào môi trường cơ bản có chứa: 3g/l cao nấm men, 3g/l dịch chiết malt, 5g/l bacto pepton, 10g/l glucose và 1g/l ZnSO4 Khảo sát ảnh hưởng bởi các nguồn nitơ tới quá trình tích lũy kẽm Tiếp tục thí nghiệm khảo sát nồng độ nitơ thích hợp với các nồng độ: 5; 10; 15; 20g/l nồng độ phù hợp

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới khối lượng sinh khối khô và