Tuyển chọn, định tên vi khuẩn sinh enzyme β galactosidase ưa lạnh, bước đầu nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ HUYÊN TUYỂN CHỌN, ĐỊNH TÊN VI KHUẨN SINH ENZYME β-GALACTOSIDASE ƯA LẠNH, BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME TRONG SẢN XUẤT SỮA TƯƠI TIỆT TRÙNG

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ HUYÊN

TUYỂN CHỌN, ĐỊNH TÊN VI KHUẨN SINH ENZYME β-GALACTOSIDASE ƯA LẠNH, BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME TRONG

SẢN XUẤT SỮA TƯƠI TIỆT TRÙNG KHÔNG LACTOSE

Mã số: 8 54 01 01 Người hướng dẫn: 1 TS Nguyễn Tiến Thành

2 PGS.TS Nguyễn Hoàng Anh

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình khoa học của tôi cùng nhóm nghiên cứu, số liệu và các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 05 tháng 10 năm 2018

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Huyên

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, ngoài sự nỗ lực học hỏi của bản thân, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo,

sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Tiến Thành, PGS.TS Nguyễn Hoàng Anh và

KS Nguyễn Thị Hồng đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn chuyên môn và tạo điều kiện giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, cùng quý Thầy/Cô trong Bộ môn Hóa sinh - Công nghệ sinh học thực phẩm, Phòng Thí nghiệm Trung tâm khoa học và công nghệ thực phẩm, Khoa Công nghệ Thực phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thành viên tham gia nhóm nghiên cứu vì sự cộng tác, chia sẻ kiến thức, tìm kiếm phương pháp, tiến hành thí nghiệm cùng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, động viên, khuyến khích và giúp tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 05 tháng 10 năm 2018

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Huyên

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục từ viết tắt và ký hiệu v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract x

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích – yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Tổng quan về sữa tươi 3

2.1.1 Sữa tươi 3

2.1.2 Tình hình sản xuất 4

2.1.3 Tình hình tiêu thụ 6

2.2 Một số ứng dụng của enzyme trong công nghệ sản xuất sữa 8

2.2.1 Ứng dụng enzyme trong bảo quản sữa 8

2.2.2 Ứng dụng của enzyme trong chế biến sữa 10

2.3 Tổng quan về β-galactosidase 11

2.3.1 β-galactosidase 11

2.3.2 Nguồn thu nhận 12

2.3.3 Vai trò của β-galactosidase 13

2.3.4 Tình hình nghiên cứu về β-galactosidase 14

Phần 3 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 16

3.1 Vật liệu 16

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

3.1.2 Môi trường nuôi cấy, thí nghiệm 17

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 18

3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 19

3.3 Nội dung nghiên cứu 20

3.4 Phương pháp nghiên cứu 20

3.4.1 Tuyển chọn vi khuẩn lactic, Bacillus sinh β-galactosidase 20

3.4.2 Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gıan nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp β-galactosidase 23

3.4.3 Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn sinh enzyme có hoạt độ cao ở nhiệt độ thấp 23

3.4.4 Phương pháp tinh sạch sơ bộ β-galactosidase 24

3.4.5 Phương pháp xác định đặc tính của enzyme sau khi tinh sạch sơ bộ 26

3.4.6 Định danh vi khuẩn có khả năng sinh β-galactosidase ưa lạnh 27

3.4.7 Bước đầu đề xuất quy trình sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose sử dụng enzyme β-galactose ưa lạnh 28

Phần 4 Kết quả và thảo luận 29

4.1 Tuyển chọn vi khuẩn lactic, Bacillus sinh β-galactosidase 29

4.1.1 Kết quả xác định vi khuẩn sinh β-galactosidase bằng phương pháp Test X-Gal 29

4.1.2 Hoạt độ β-galactosidase của vi khuẩn lactic và Bacillus 30

4.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp β-galactosidase nội bào của hai chủng SC3 và SC4 31

4.3 Tuyển chọn vi khuẩn sinh enzyme có hoạt độ cao ở nhiệt độ thấp 33

4.4 Tinh sạch sơ bộ β-galactosidase 34

4.5 Đặc tính của β-galactosidase từ chủng SC3 sau khi tinh sạch sơ bộ 35

4.5.1 Độ bền của β-galactosidase ở 4 o C 35

4.5.2 Khả năng phân giải lactose trong sữa của β-galactosidase ở 4ºC 36

4.6 Định danh chủng SC3 bằng phương pháp xác định trình tự gen 16 rDNA 38

4.7 Bước đầu đề xuất quy trình sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose 39

Phần 5 Kết luận và đề nghị 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Đề nghị 42

Tài liệu tham khảo 43

Phụ lục 48

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

Chữ viết tắt Chữ tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

X- gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosit

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của sữa bò tươi tính trên 100g 3

Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn được sử dụng để nghiên cứu 16

Bảng 3.2 Môi trường đĩa thạch MRS pH:6-6,5 sử dụng lactose 17

Bảng 3.3 Môi trường đĩa thạch NA (Mirac Yilmaz et al., 2006) 17

Bảng 3.4 Danh sách các thiết bị sử dụng để nghiên cứu 18

Bảng 3.5 Danh sách các hóa chất 19

Bảng 3.6 Pha dãy đường chuẩn protein 24

Bảng 3.7 Số liệu dựng đường chuẩn lactose 26

Bảng 4.1 Khả năng sinh enzyme bằng phương pháp test X-Gal 30

Bảng 4.2 Hoạt độ enzyme nội bào của chủng SC3 và SC4 tại 30 o C và 4 o C 34

Bảng 4.3 Bảng kết quả thu nhận β-galactosidase bằng muối amonisunfate từ chủng SC3 35

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Sản lượng sản xuất sữa giai đoạn 2010-2015 4

Hình 2.2 Sản lượng sữa tươi theo tháng năm 2015 và 6 tháng đầu năm 2016 5

Hình 2.3 Tăng trưởng doanh thu ngành sữa Việt Nam 7

Hình 2.4 Sơ đồ thủy phân lactose của β-galactosidase 12

Hình 3.1 Biểu đồ đường chuẩn oNP 22

Hình 3.2 Đường chuẩn protein 25

Hình 3.3 Biểu đồ đường chuẩn lactose 27

Hình 4.1 Màu của khuẩn lạc khi thủy phân X-gal 29

Hình 4.2 Hoạt độ β-galactosidase của vi khuẩn 31

Hình 4.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ β-galactosidase nội bào từ chủng vi khuẩn SC3 32

Hình 4.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ β-galactosidase nội bào từ chủng vi khuẩn SC4 33

Hình 4.5 Hoạt tính β – galactosidase ở 4ºC sau 24 ngày 36

Hình 4.6 Khả năng phân giải lactose của β-galactosidase đã tinh sạch sơ bộ từ chủng SC3 37

Hình 4.7 Kết quả tách chiết DNA tổng số 38

Hình 4.8 Kết quả PCR với mồi 16 rDNA của vi khuẩn SC3 38

Hình 4.9 Kết quả so sánh trı̀nh tự tương đồng của SC3 theo mồi 16 rDNA bằng công cụ Blast 39

Hình 4.10 Lưu đồ sản xuất sản phẩm sữa tiệt trùng không lactose 40

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Nguyễn Thị Huyên

Tên luận văn: “Tuyển chọn, định tên vi khuẩn sinh β-galactosidase ưa lạnh, bước đầu

nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose”

Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện được đề tài chúng tôi đã sử dụng các phương pháp sau:

1 Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy giống được tiến hành theo Nguyễn Lân Dũng và

6 Phương pháp tinh sạch β-galactosidase theo Wendry Setiyadi Putranto (2007)

7 Xác định độ bền ở nhiệt độ thấp của β-galactosidase theo Nguyễn Thị Vân Linh và

− Từ 68 vi khuẩn sau khi kiểm tra bằng phương pháp cấy trên đĩa thạch xác định

được 11 chủng có khả năng sinh β-galactosidase

− Trong 11 chủng được chọn, chủng SC3 và SC4 cho hoạt độ cao nhất ở 30oC sau 24h nuôi, lần lượt là 389,58 U/l và 369,16 U/l Hoạt độ tương đối của enzyme ở 4ºC so với 30 o C của chủng SC3 và SC4 tương ứng là 24,36% và 11,10%

− Enzyme nội bào của chủng SC3 cho hoạt tính riêng cao nhất 2,783 (U/mg) khi tinh sạch sơ bộ bằng muối amonisunphat bão hòa 60% tương đương với hiệu suất thu hồi là 86,63% Hoạt độ của enzyme đã tinh sạch bền sau 24 ngày bảo quản ở 4ºC còn 56,15%

− Sau 27h ở 4oC với lượng enzyme sử dụng 2,110 U/1 g lactose (công thức 2) lượng lactose còn lại là 40,67b %

− Kết quả định danh chỉ ra chủng SC3 là Streptococcus thermophilus và được đặt

tên là Streptococcus thermophilus SC3

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Nguyen Thi Huyen

The thesis title: "Selection and identification of bacteria producing cold active

β-galactosidase, preliminary reasearch on application of enzyme in production of lactose sterilized milk."

non-Major: Food Technology Code: 8 54 01 01

Educational organization: Vietnam National University and Agriculture (VNUA) Research objectives

From one to two new bacteria producing cold active β-galactosidase will be identified

Materials and Methods

To carry out the topic, we used the following methods:

1 Bacteria were activated and cultured according to Nguyen Lan Dung et al

4 Effects of culturing time on growth and biosynthesis of β-galactosidase were

determined according to Nguyen Thu Ha et al (2006)

5 Bacteria producing β-galactosidase enzyme with high activity at low

temperature was selected by method of Nguyen Thi Van Linh et al (2013)

6 β-galactosidase enzyme was purified according to Wendry Setiyadi Putranto (2007)

7 Low temperature stability of β-galactosidase enzyme in pH 6.5 was done as described by Nguyen Thi Van Linh and cs (2013)

8 Lactose degradability of β-galactosidase in fresh milk at low temperature was analyzed by using HPLC

9 The bacteria producing cold active β-galactosidase were identified through the

DNA sequence analysis of the specific gene encoding 16rDNA

Main findings and conclusions

- From 68 strains, after screening by agar plate 11 strains that were able to produce β-galactosidase enzyme

- In the 11 selected strains, SC3 and SC4 gave the highest intracellular enzymatic activity was highest after 24-hour culturing at 30 o C, reaching 389.58 U/l and 369.16 U/l respectively The enzyme relative activity at 4ºC and 30 o C of SC3 strain and SC4 strain were 24.36% and 11.10%

- The intracellular enzyme of SC3 gave the highest specific activity of 2,783 (U/mg) when purified with 60% saturated ammonium sulphate salts, equivalent to the recovery rate of 86.63% The purified enzyme activity was very stable after 24 days of storage at 4ºC with 56,15% of enzyme activity still remained

- When using formula 2 (2,110 U/1 g lactose) for 27 hours at 4°C, it hydrolyzes 67% of lactose

- SC3 strain was identidied to be Streptococcus thermophilus and was named

Streptococcus thermophilus SC3

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Xã hội phát triển con người càng quan tâm tới chất lượng cuộc sống, đặc biệt là chế độ dinh dưỡng trong khẩu phần ăn hàng ngày của mỗi gia đình Việc chi tiêu cho sữa chiếm hơn 10% trong tổng chi tiêu cho thực phẩm tại Việt Nam (VIRAC, JSC, 2016) Sữa là một thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giàu protein và các khoáng chất thiết yếu, tiện lợi khi sử dụng và đóng vai trò quan trọng trong chế độ dinh dưỡng của mọi lứa tuổi, đặc biệt là trẻ em và người già

(Furlan et al., 2000)

Trong sữa động vật phần lớn là đường lactose 4)-α-D-glucopyranose, loại đường đôi gồm hai đơn phân glucose và galactose liên kết với nhau bởi liên kết 1-4 glucoside) Cơ thể muốn hấp thụ được thì ruột non phải tiết ra một loại enzyme là β-galactosidase có chức năng phân giải đường lactose thành đường đơn là glucose và galactose Tuy nhiên, ở một số người, cơ thể thiếu β-galactosidase (hiện tượng bất dung nạp lactose) khiến đường lactose không được tiêu hóa, khi vào cơ thể vi khuẩn đường ruột sẽ chuyển hóa nó thành acid lactic và carbondioxide, khiến người sử dụng gặp các triệu trứng: đầy hơi, chướng bụng, nôn, tiêu chảy Trên thế giới có khoảng 75% dân số không có khả năng dung nạp lactose, trong đó có khoảng 46% người trên 50 tuổi gặp tình trạng này Nguyên nhân là do khả năng tổng hợp β-galactosidase bị mất dần sau một thời gian dài không sử dụng sữa (Nguyễn Văn Cách và cs., 2007) Vì vậy, việc nghiên cứu ứng dụng β-galactosidase để sản xuất các sản phẩm sữa cho những người không hấp thu đường lactose là rất cần thiết

(β-D-galactopyranosyl-(1-Tất cả các sản phẩm sữa đều được sản xuất từ sữa tươi Sữa sau khi vắt (sữa tươi) sẽ được bảo quản lạnh bằng các bồn hoặc xe chứa để vận chuyển từ nông trại về nhà máy chờ chế biến, đây cũng là thời gian lý tưởng để thực hiện quá trình phân giải lactose trong sữa bằng cách bổ sung enzyme β-galactosidase chịu lạnh, vì nó tiết kiệm được chi phí và thời gian trong quá trình chờ sữa về đến nhà máy Khi về đến nhà máy hoặc trước khi đưa vào sản xuất đường lactose trong sữa đã được phân giải hết thành đường glucose và galactose, sẵn sàng cho quá trình chế biến tiếp theo để tạo ra các sản phẩm sữa không lactose

β-galactosidase được tìm thấy phổ biến trong tự nhiên, có thể ở thực vật, động vật hoặc vi sinh vật Tuy nhiên nguồn thu nhận enzyme từ vi sinh vật được

ứng dụng nhiều hơn cả, vì tốc độ sinh sản nhanh và sinh khối lớn Mặt khác, môi trường dinh dưỡng lại rẻ tiền, dễ kiếm nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao và ít tốn kém (Đỗ Thị Bích Thủy, 2012) Enzyme β-galactosidase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn vi sinh vật khác

nhau: vi khuẩn (Bacillus subtilis, Lactococcus pneumonira, Lactobacilus

delbrueckii ), nấm men (Cryptococcus laurentii, Candida pseudtropicalis, ) hay

nấm mốc (Aspergillus awmori, Chaetomium globosum, ) (Davail et al., 1994) Trong đó, vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn lactic được sử dụng nhiều do có nhiều ưu

điểm hơn các loài vi sinh vật khác bởi chúng là những sinh vật an toàn, dễ nuôi cấy

và chịu được pH thấp

Hiện nay có rất nhiều các công trình nghiên cứu về vi sinh vật sinh enzyme β-galactosidase tại Việt Nam và trên thế giới Tuy nhiên, chưa có công trình nào nghiên cứu về các chủng vi khuẩn sinh enzyme β-galactosidase chịu lạnh để ứng dụng trong ngành công nghệ chế biến sữa Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên

cứu: Tuyển chọn, định tên vi khuẩn sinh β-galactosidase ưa lạnh, bước đầu

nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose

- Tuyển chọn vi khuẩn sinh β-galactosidase

- Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng

sinh tổng hợp β-galactosidase

- Tuyển chọn vi khuẩn sinh β-galactosidase có hoạt độ cao ở nhiệt độ thấp

- Tinh sạch sơ bộ β-galactosidase

- Xác định đặc tính của enzyme sau khi tinh sạch sơ bộ

- Định tên vi khuẩn có khả năng sinh β-galactosidase ưa lạnh

- Bước đầu đề xuất quy trình sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose sử

dụng β-galactosidase ưa lạnh

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ SỮA TƯƠI

2.1.1 Sữa tươi

Sữa tươi nguyên liệu theo định nghĩa là sữa được lấy từ động vật cho sữa (bò, trâu, dê, cừu ) mà không bổ sung hoặc rút bớt các thành phần của sữa và chưa qua xử lý ở nhiệt độ cao hơn 40°C (Bộ Khoa học và Công nghệ, 2004) Trong khi đó sữa tươi tiệt trùng lại được định nghĩa là sản phẩm được chế biến hoàn toàn từ sữa tươi nguyên liệu, có bổ sung đường, các loại nguyên liêu khác như các loại nước quả, cacao để tạo hương vị cho sản phẩm, có hoặc không bổ sung phụ gia thực phẩm, đã qua xử lý ở nhiệt độ cao (Bộ Khoa học và Công nghệ, 2009) Để chuẩn hoá nguyên liệu, có thể bổ sung sữa bột hoặc chất béo từ sữa nhưng không quá 1% tính theo khối lượng của sữa tươi nguyên liệu Trong sữa có nhiều thành phần dinh dưỡng cần thiết cho sức khỏe:

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của sữa bò tươi tính trên 100g Thành phần dinh dưỡng Đơn vị Hàm lượng

Hiện nay, sữa tươi tiệt trùng có thể được đựng trong hộp giấy, chai thủy tinh hoặc chai nhựa kín Sản phẩm có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng, trong điều kiện không mở bao bì có thê bảo quản trong khoảng thời gian từ 6 – 8 tháng

2.1.2 Tình hình sản xuất

Ngành công nghiệp sản xuất, chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa của Việt Nam những năm gần đây có sự phát triển mạnh, đáp ứng nhu cầu trong nước, từng bước thay thế các mặt hàng sữa nhập khẩu và tham gia xuất khẩu với

sự đa dạng về mẫu mã và chủng loại Bên cạnh đó, ngành đã có nhiều đóng góp đáng kể vào ngân sách nhà nước, tạo nhiều việc làm cho người lao động, góp phần bảo đảm đời sống nhân dân

Do thuộc nhóm sản phẩm thiết yếu, nên dù trong những năm kinh doanh

ảm đạm của các doanh nghiệp trong toàn bộ nền kinh tế, các doanh nghiệp ngành sữa vẫn giữ tăng trưởng mạnh với mức 2 con số

Từ năm 2001 – 2014, sản xuất sữa trong nước tăng trưởng 26,6%/năm, đạt

456400 tấn năm 2013, chỉ đủ đáp ứng 28% nhu cầu trong nước và đạt 549500 tấn vào năm 2014 Hai mảng chính trong ngành sữa là sữa nước và sữa bột với tổng giá trị chiếm gần 3/4 giá trị thị trường, trong đó giá trị sữa nước chiếm 30% Tính chung giai đoạn 2010-2015, sản lượng sản xuất sữa tươi tăng trung bình 16%/năm, từ mức 520,6 triệu lít năm 2010 lên 1093 triệu lít năm 2015 Theo Tổng Cục Thống kê, năm 2015 ngành sữa Việt Nam có sản lượng sản xuất các loại sữa cao nhất từ trước đến nay

Hình 2.1 Sản lượng sản xuất sữa giai đoạn 2010-2015

Nguồn: Tổng cục Thống kê (2015)

Tháng 6/2016, sản lượng sữa tươi đạt 99,1 triệu lít; tăng 1,3% so với tháng

5 trước đó Tính chung 6 tháng đầu năm 2016, sản lượng sữa tươi ước đạt 553,1 triệu lít, tăng 4% so với cùng kỳ năm 2015

Đa số các sản phẩm sữa tại Việt Nam được sản xuất cho trẻ em dưới 3 tuổi

và người cao tuổi, trong khi thị trường lớn cho sữa tiêu dùng hàng ngày hay sữa cho người trưởng thành chưa được đầu tư mạnh

Số lượng bò sữa tại Việt Nam tăng khá nhanh trong những năm gần đây Theo Tổng cục thống kê, tính đến thời điểm 1/10/2015, Việt Nam có khoảng 257,3 nghìn con bò sữa, tăng 21% so với năm 2014 Tính trong giai đoạn 10 năm gần nhất (2006 – 2015), lượng bò sữa tăng trưởng trung bình hơn 11%/năm Quy

mô đàn bò mở rộng là yếu tố tích cực thúc đẩy sản lượng sữa sản xuất tại Việt Nam có xu hướng tăng mạnh qua từng năm

Ngành sữa đang đẩy mạnh hiện đại hóa các trang trại bò sữa một cách nhanh chóng Việt Nam cũng đề ra kế hoạch đáp ứng 60% nhu cầu trong nước đối với sữa tươi, tương ứng dự báo dân số tăng lên 113 triệu người vào năm

2045 Để đáp ứng mục tiêu này, đất nước cần phải phát triển số lượng bò sữa có khả năng sản xuất 5,65 triệu tấn sữa hàng năm

Có khoảng 24000 hộ gia đình tham gia chuỗi sản xuất chăn nuôi phục vụ ngành sữa Đây là một lực lượng rất quan trọng giúp ngành sữa Việt Nam phát triển bền vững Bởi chăn nuôi hộ gia đình quy mô vừa phải sẽ đỡ phải chịu áp lực

về môi trường như các trang trại quy mô tập trung quá lớn Theo Hiệp hội Sữa Việt Nam, nếu không phát triển chăn nuôi hộ gia đình mà chỉ tập trung vào phát triển trang trại quy mô lớn sẽ gặp rất nhiều khó khăn: thiếu đất đai, nông dân mất đất sẽ gặp khó khăn trong cuộc sống mưu sinh, năng suất, bệnh tật và nhất là vấn

đề môi trường

Dự báo tăng trưởng sản lượng sữa Việt Nam từ năm 2015 – 2045:

- Giai đoạn 2015 – 2025: Tăng trưởng 12%/năm;

- Giai đoạn 2026 – 2035: Tăng trưởng 5%/năm;

- Giai đoạn 2036 – 2045: Tăng trưởng 3%/năm

Đầu tư trang thiết bị và quản lý chất lượng: Nhiều doanh nghiệp trong ngành không ngừng đầu tư trang thiết bị hiện đại, cập nhật công nghệ tiên tiến để sản xuất ra những sản phẩm đạt chất lượng, bảo đảm an toàn thực phẩm và có sức cạnh tranh trên thị trường trong và ngoài nước, đáp ứng đòi hỏi ngày càng cao của người tiêu dùng

2.1.3 Tình hình tiêu thụ

Thị trường sữa Việt Nam đang phát triển nhanh chóng trong những năm gần đây và vẫn còn tiềm năng tăng trưởng Tốc độ tăng trưởng của ngành năm sau cao hơn năm trước, bình quân tăng 17%/năm trong giai đoạn 2011-2015

Theo đánh giá của Euromonitor International, năm 2014, doanh thu ngành sữa Việt Nam đạt 75000 tỉ đồng, tăng trưởng 20% Đến năm 2015, tổng doanh thu toàn ngành ước đạt 92000 tỷ đồng, tăng trưởng 22,7% so với năm trước, tăng gấp hơn 2 lần so với năm 2010 (đạt 42 nghìn tỷ), là mức cao nhất trong lịch sử ngành

Chỉ trong vòng 6 năm từ 2008 – 2014, mức chi tiêu tháng của một người

Việt Nam đã tăng hơn gấp đôi từ 792 nghìn đồng lên đến gần 1,9 triệu đồng Trong gần 1,9 triệu đồng, mỗi người Việt có thể bỏ ra tới một nửa để chi cho ăn uống, một tỷ lệ đã cải thiện rõ rệt so với năm 2007

Hình 2.3 Tăng trưởng doanh thu ngành sữa Việt Nam

Là một quốc gia đông dân và mức tăng dân số cao khoảng 1,2%/năm, thị trường sữa tại Việt Nam luôn được đánh giá là có tiềm năng lớn Tỉ lệ tăng trưởng GDP 6%-8%/năm, thu nhập bình quân đầu người tăng 14,2%/năm, kết hợp với xu thế cải thiện sức khỏe và tầm vóc của người Việt Nam khiến cho nhu cầu tiêu thụ các sản phẩm sữa luôn giữ mức tăng trưởng cao Lượng sữa tiêu thụ bình quân theo đầu người của Việt Nam năm 2015 đạt khoảng 23 lít/người/năm, trong khi đó năm 2010 đạt 12 lít/người/năm Tính cả giai đoạn 2010 - 2015, trung bình mỗi người Việt Nam tiêu thụ khoảng 15 lít sữa/năm Trong những năm tới, ngành sữa vẫn có tiềm năng lớn khi nhu cầu tiêu thụ được dự báo tăng trưởng 9%/năm, đạt mức 27-28 lít sữa/người/năm vào năm 2020, tăng gần gấp rưỡi so với hiện tại Hiện mức tiêu thụ sữa bình quân đầu người ở Việt Nam còn thấp so với các nước trong khu vực và thế giới

Trong số các ngành hàng tiêu dùng nhanh, ngành hàng sữa, bao gồm sữa bột và sữa tươi, cũng đang là một ngành tăng trưởng mạnh mẽ Và theo xu hướng chung của thị trường thế giới thì ngành sữa Việt Nam vẫn đang trong chu kỳ tăng trưởng Có thể nói, thị trường sữa đang có những bước phát triển nhanh chưa từng thấy trong những năm gần đây với tốc độ tăng trưởng năm sau cao hơn năm trước Nhóm hàng sữa đã đóng góp 13% trong tổng doanh thu ngành hàng tiêu dùng

Thực tế, thị trường sữa tươi Việt Nam vẫn đang tập trung chủ yếu vào các

dòng sản phẩm cho trẻ em Trong khi nhu cầu tiêu dùng sữa cho mọi lứa tuổi ở Việt Nam được đánh giá là còn rất lớn Một trong những trở ngại trong việc phát triển các dòng sản phẩm mới là hiện tượng kém dung nạp và không dung nạp lactose ở người Nguyên nhân của hiện tượng này là sự giảm hoặc không hoạt động của β-galactosidase (thủy phân lactose), dẫn tới dư thừa lactose ở ruột non

gây ra triệu chứng buồn nôn, đầy bụng, đau bụng, tiêu chảy… (Benjamin et al.,

2013) Vì vậy việc nghiên cứu sản xuất các sản phẩm sữa ít lactose hoặc không lactose nói chung và sữa tươi không lactose nói riêng sẽ góp phần mở rộng thị trường tiêu dùng sữa Và đây cũng là cơ hội để các doanh nghiệp sản xuất sữa trong nước mở rộng quy mô và phát triển

2.2 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT SỮA

2.2.1 Ứng dụng enzyme trong bảo quản sữa

Trong công nghiệp sản xuất sữa không thể không sử dụng các chất bảo quản, việc sử dụng các enzyme trong bảo quản thực phẩm đặc biệt là sử dụng các enzyme có sẵn trong thực phẩm đang ngày càng được ứng dụng rộng rãi Một số enzyme được sử dụng trong bảo quản sữa sẽ được trình bày dưới đây

• Bảo quản sữa bằng phức chất Lactoperoxidase

Theo Bafort et al (2014) phức chất Lactoperoxydase (LPO) là một enzyme

có trong sữa, là một glycoprotein với một loại coenzyme hemin liên kết chặt chẽ với mỗi phân tử protein Một enzyme có nguồn gốc từ sữa khi kết hợp với hydrogen peroxide, thiocyanate hoặc iod thì nó sản sinh ra ion hypoiod hoặc ion hypocyanate Những ion này oxi hóa các con đường biến dưỡng của vi sinh vật

LPO xúc tác quá trình oxi hóa hydrogen peroxide của iod

Những phân tử này là tác nhân kháng vi sinh vật rất hiệu lực kháng vi khuẩn, virus, và nấm men

Phức chất Lactoperoxydase (LPs) là phương tiện bảo vệ tự nhiên có sẵn trong sữa Nó bao gồm một enzyme (Lactoperoxydase) liên kết với một anion

và một lượng nhỏ peroxydase Phức chất này oxy hóa các cơ chất đặc trưng trên màng tế bào và làm rối loạn quá trình trao đổi chất và kết quả là vi khuẩn có thể chết

2I- + H2O2 + 2H+ I2 + 2H2O

• Enzyme oxy hóa Glucose oxydase – Catalase

Glucose oxydase được tạo ra bởi nấm thuộc họ Penicillium và Aspergillus Glucose oxydase nấm mốc hoạt động trong khoảng pH 2.5 – 7.5 và ở nhiệt độ 30 – 40oC Glucose oxydase là enzyme oxy hóa khử, chỉ tác dụng lên glucose khi có mặt oxy, nó oxy hóa glucose thành acid gluconic và H2O2

để ngăn chặn quá trình oxy hóa và kiểm soát sự dễ hư hỏng của thực phẩm Catalase thường được sử dụng với glucose oxidase để bảo quản thực phẩm Glucose oxydase – catalase có thể loại bỏ oxy không khí khỏi môi trường và có tác dụng ức chế với các vi khuẩn gram dương, vi khuẩn gram âm, thậm chí đến các loài vi khuẩn kháng Penicillin hoặc các kháng sinh khác Sử dụng những enzyme này cho phép kéo dài thời gian bảo quản sữa và nhiều thực phẩm khác (Raveendran

Clostridium tyrobutyricum trong quá trình chín của một số loại phomai Châu Âu

(Liburdi et al., 2014)

2.2.2 Ứng dụng của enzyme trong chế biến sữa

Ngoài tác dụng bảo quản, trong công nghệ chế biến sữa enzyme và các chế phẩm của nó đóng vai trò quyết định trong việc tạo ra các sản phẩm

- Ứng dụng của enzyme tạo kết tủa và gây đông tụ sữa

Trước đây, người ta chế biến sữa hoàn toàn sử dụng nguồn enzyme từ đường tiêu hóa của động vật như pepsin, rennin Sau này, người ta sử dụng nhiều chế phẩm enzyme từ nguồn vi sinh vật và thực vật Các chế phẩm enzyme được sử dụng trong chế biến sữa thành các sản phẩm khác nhau

Kết tủa và đông tụ sữa

Trong công nghệ sản xuất phomat sử dụng enzyme rennin và pepsin để kết tủa protein Rennin là một enzyme thủy phân protein được tách chiết từ mô ruột của động vật Trên thị trường hiện nay có chế phẩm Rennet là hỗn hợp của rennin và pepsin, tỷ lệ của 2 enzyme này có thể thay đổi Chế phẩm Rennet tồn tại dưới dạng dịch, viên hoặc dạng bột Mục đích của việc sử dụng là loại bỏ hoặc hạn chế tác dụng của κ-casein Kết tủa sữa bằng Rennet hoặc rennin hiệu quả hơn so với kết tủa bằng axit, ngày nay phần lớn phomat được sản xuất theo công nghệ này

Lactase trong quá trình lên men sữa chua

Quá trình chủ yếu trong lên men sữa chua là đường lactose chuyển hóa thành glucose và galactose dưới tác dụng của enzyme lactase sau đó các sản phẩm đường này chuyển hóa thành axit piruvic Axit piruvic khử hydro tạo thành axit lactic giúp sữa đông tụ lại

- Ứng dụng enzyme để thủy phân protein

Quá trình thủy phân protein là chuyển nitơ hữu cơ dạng không hòa tan (protein) sang nitơ hữu cơ hòa tan (peptide và amino acid) Hỗn hợp các amino acid và peptide hòa tan rất có ý nghĩa trong sản xuất thực phẩm Khi sử dụng enzyme thủy phân protein trong sữa sẽ làm xuất hiện vị đắng, có thể loại chúng bằng sự hấp thụ của than hoạt tính

- Ứng dụng enzyme để thủy phân chất béo

Người ta tiến hành thủy phân chất béo bằng enzyme lipase từ động vật

và vi sinh vật

Lipase thương mại chủ yếu được sử dụng để phát triển hương vị trong

các sản phẩm sữa và chế biến các loại thực phẩm khác có chứa chất béo Họ có thể cải thiện hương vị đặc trưng của phomai bằng cách tác động lên chất béo sữa để sản xuất axit béo tự do sau khi thủy phân Các loại phomai khác nhau có thể được thực hiện bằng cách sử dụng lipases từ nhiều nguồn khác nhau (Raveendran et al., 2018).

- Enzym trong sản xuất sữa không có lactose

Thủy phân lactose là một quá trình công nghệ sinh học quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm Enzyme lactase (β-galactosidase) xúc tác quá trình thủy phân lactose thành đường galactose và glucose Lactase được sử dụng với sữa và các sản phẩm từ sữa để để tạo ra các sản phẩm ít lactose hoặc không chứa lactose giúp giảm sự không dung nạp lactose ở người Ứng dụng thủy phân lactose cũng được sử dụng trong công nghệ sản xuất kem và các sản phẩm sữa, giúp nâng cao chất lượng sản phẩm bằng cách cải thiện vị ngọt và giảm tình trạng

sạn đường (Raveendran et al., 2018)

- Ngoài các ứng dụng trên enzyme còn được sử dụng để tạo mùi vị, cấu trúc cho sản phẩm chế biến từ sữa và sản xuất prebiotic, cụ thể như:

Protease tự nhiên đóng góp đáng kể vào các đặc tính hương vị của phomai Chúng được sử dụng để tăng tốc độ chín phomai, để thay đổi các đặc tính chức năng và làm giảm tính chất gây dị ứng của các sản phẩm sữa

Một ứng dụng khác của lactase là sự hình thành galactooligosaccharide (GOS) từ quá trình thủy phân lactose do hoạt tính chuyển hóa glycososylase của β-galactosidase Các GOS có thể được sử dụng như các thành phần thực phẩm

prebiotic (Raveendran et al., 2018)

Trong các ứng dụng trên, việc ứng dụng enzyme trong sản xuất sữa và các sản phẩm sữa không lactose đang là vấn đề được quan tâm nghiên cứu nhiều trong thời gian gần đây

2.3 TỔNG QUAN VỀ β-GALACTOSIDASE

2.3.1 Βeta-galactosidase

Beta-galactosidase hay còn gọi là lactase, là enzyme có khả năng xúc tác cho hai kiểu phản ứng: phản ứng thủy phân và phản ứng chuyển gốc galactozyl Phản ứng thủy phân chính của β-galactosidase là thủy phân đường đôi lactose thành hai đường đơn glucose và galactose và trong một số trường hợp enzyme

tham gia phản ứng transgalactosylation chuyển gốc galactose đến cơ chất lactose

tạo galactose - oligosaccharides (GOS) (Davail et al., 1994) Galacto -

oligosaccharides cùng với fructo - oligosaccharides được nghiên cứu nhiều nhất tạo ra prebiotic oligosaccharides có lợi cho con người bằng cách kích thích sự tăng trưởng và hoạt động của vi khuẩn có lợi trong hệ tiêu hóa của người

Hình 2.4 Sơ đồ thủy phân lactose của β-galactosidase

2.3.2 Nguồn thu nhận

β-galactosidase trong tự nhiên có thể tìm thấy ở các loài thực vật, động vật

và vi sinh vật Tuy nhiên, tính chất của enzyme được thu nhận từ các nguồn khác nhau có sự khác nhau rõ rệt Enzyme được sản xuất từ vi sinh vật ngày càng nhiều, là nguồn duy nhất được sử dụng như nguồn sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp Nguồn enzyme từ động vật và thực vật rất khó triển khai theo quy

mô công nghiệp vì những hạn chế sinh lý và hạn chế kỹ thuật So với động vật và thực vật, vi sinh vật có rất nhiều ưu điểm (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

Một số ưu điểm của vi sinh vật có thể kể tới như: Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh, enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt độ cao và thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp… Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng trong một ngày đêm, tốc độ tạo sinh khối ở vi sinh vật cao gấp hàng ngàn lần so với tốc độ tăng sinh khối của động vật và thực vật Để đạt được tốc độ tăng sinh khối lớn như vậy, vi sinh vật phải chuyển hóa một khối lượng cơ chất rất lớn

Để chuyển hóa được khối lượng cơ chất lớn như vậy, chúng phải tổng hợp ra được lượng enzyme rất lớn Chính vì thế, nếu sử dụng vi sinh vật như nguồn sinh học để sản xuất enzyme rất có lợi Ngoài ra, trong quá trình sản xuất và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật có thể kiểm soát được các yếu tố môi trường (nhiệt độ, độ ẩm, dinh dưỡng, pH…) mà không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài Không chỉ vậy nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme theo quy

mô công nghiệp thường rẻ tiền và dễ kiếm

Hiện nay galactosidase được nghiên cứu khá đầy đủ và sản phẩm galactosidase thương mại hiện nay chủ yếu là sản xuất từ nấm men Các loài nấm

β-men như Kluyverromyces lactics, Kluyverromycesmarxianus, Torulopsis

spherical, Torulautilis sp, Saccharomyces fragilis, Candida pseudotropicalis

Ngoài ra lactase còn được sản xuất từ: vi khuẩn (chủ yếu là Gram dương, thuộc

giống LactoBacillus, Lactoccoccus, Bacillus và vi khuẩn Gram âm là E.coli, nấm sợi (Trichoderma sp, Fusarium sp, Asperigillus sp )

2.3.3 Vai trò của β-galactosidase

β-galactosidase có vai trò vô cùng to lớn trong ngành công nghiệp thực phẩm và nhất là trong ngành công nghiệp chế biến sữa Ứng dụng chính của

enzyme là thủy phân lactose trong sữa thành glucose và galactose (Davail et al.,

1994) Thủy phân lactose là một trong ứng dụng quan trọng của β-galactosidase trong ngành công nghiệp chế biến sữa, giúp làm tăng độ ngọt của sản phẩm (Rosenberg, 2006) Enzyme này được sử dụng trong ngành công nghiệp sữa để sản xuất các sản phẩm sữa không chứa lactose, khắc phục tình trạng không dung

nạp lactose ở con người (Haju et al., 2012)

Ngoài ra, sự thủy phân lactose trong sữa giúp ngăn ngừa sự kết tinh lactose khi bảo quản sữa ở nhiệt độ thấp và ở sản phẩm sữa cô đặc Hơn nữa việc

sử dụng sữa đã thủy phân trong sản xuất sữa chua và pho mát sẽ làm tăng quá trình acid hóa, bởi vì thủy phân lactose thường làm giảm thời gian đông đặc của

sữa chua và tăng tốc độ phát triển cấu trúc và hương vị cho pho mat (Parmjit et

al., 2010) Nó chống lại sự kết tinh đường lactose bằng cách thủy phân thành

glucose và galactose và tham gia vào quá trình tạo Galacto-oligosaccharides (GOS- một prebiotic được ứng dụng nhiều trong ngành công nghiệp thực phẩm

Không những được ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, trong y dược, chúng được sử dụng làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa cho những người thiếu khả năng hấp thụ lactose hoặc bổ sung cho những người bị bệnh GM1- gangliosidosis

và bệnh Morquio típ B do suy giảm hoạt độ của của β- galactosidasetrong tế bào Ngoài ra β- galactosidase còn đóng vai trò là chất chỉ thị để tách và chọn dòng phân tử trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp Enzyme β- galactosidase còn được ứng dụng trong kỹ thuật ELISA vì chúng hoạt động với nhiều cơ chất sinh màu tổng

hợp như oNPG, PNPG, X-gal (Trương Nam Hải, 2004)

Từ những ứng dụng thực tiễn trên mà β-galactosidase được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, tách chiết enzyme từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau, để tiến hành sản xuất ở quy mô công nghiệp

2.3.4 Tình hình nghiên cứu về β-galactosidase

2.3.4.1 Trên thế giới

Nghiên cứu β-galactosidase từ nấm men được nghiên cứu khá đầy đủ và sản phẩm β-galactosidase thương mại hiện nay chủ yếu là sản xuất từ nấm men

Các loài nấm men như Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus,

Torulopsisspherical, Torulautilis sp, Sacchromyces fragilis, Candida pseudotropicalis β-galactosidase từ Sacchromyces fragilis được nghiên cứu từ

rất sớm Về lactase của Candida pseudotropicalis, nghiên cứu của Sonia A et al

(1979), nuôi trong canh trường chứa 10-12% nước chiết rút sản xuất phomai (whey) bổ sung thêm khoáng và nước chiết nấm men Hoạt tính enzyme thu được

là 468 U/ml và 4.35 U/g sinh khối Hoạt tính enzyme tối ưu ở pH 6.2 và nhiệt độ

47oC Hoạt tính này có thể bảo tồn 95% sau 3 tháng bảo quản ở -20oC Trên thế giới việc tạo dòng và nghiên cứu sản xuất β-galactosidase đã được thực hiện từ

lâu Gần đây, có một vài công trình tiêu biểu như Petzelbauer et al., 2000; Hanson and Adlercreutz, 2001; Park et al., 2008… đều cho thấy nguồn gene mã

hóa β-galactosidase đã được phân lập từ các nguồn vi khuẩn khác nhau, được tạo

dòng và biểu hiện trong E coli Một số công trình công bố về tạo dòng và biểu hiện β-galactosidase từ LactoBacillus reuteri 103X và Bacillus megaterium (Li et

al., 2005) đã nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định đặc tính của

β-galactosidase (Aaβ-gal) từ vi khuẩn vừa có khả năng chịu nhiệt vừa có khả năng

chịu acid AlicycloBacillus acidocaldarius Nhóm của Nguyễn Thu Hà và cs,

2006 nghiên cứu sự biểu hiện của β-galactosidase ở 2 chủng LactoBacillus

reuteri L103 và L461 Đây là nghiên cứu hoàn toàn cơ bản, cho thấy 2 enzyme

bao gồm 2 tiểu phần (2 chuỗi peptide có trọng lượng là 35kDa và 75kDa) Các enzyme này có khoảng pH hoạt động khá hẹp, một enzyme từ pH 3.8 – 4.0 (chủng L461) và một pH 4.6 – 4.8 (chủng L103) Nhóm tác giả này sau đó có một số nghiên cứu tinh sạch enzyme để sử dụng tổng hợp galacto - oligosaccharides mang hoạt độ sinh học

2.3.4.2 Tại Việt Nam

Nhóm tác giả Nguyễn Văn Cách và cs (2008) đã tinh sạch β-galactosidase

từ Aspergillus oryzae và xác định một số tính chất lý - hóa của nó Quyền Đình

Thi và cs (2008) đã tạo dòng và phân tích trình tự gene mã hóa β-galactosidase

từ chủng Bacillus subtilis G1 Ngoài ra có công trình nghiên cứu của Trương

Nam Hải (2004) với đề tài cấp quốc gia “Nghiên cứu, phân lập và tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp β-galactosidase có hiệu suất cao

và ứng dụng trong thực phẩm” đã thành công trong biểu hiện và xác đi ̣nh hoạt độ

β-galactosidase nhưng việc biểu hiện trong E Coli lại không an toàn trong thực

phẩm, protein thu được đa phần nằm trong dạng thể vùi dẫn đến gặp khó khăn trong việc thu hồi enzyme có hoạt độ cao ứng dụng trong quy mô công nghiệp Gần đây có một số nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Vân Linh và cs (2013) đã

nghiên cứu thu nhận và tinh sạch β-galactosidase từ LactoBacillus acidophilus

Và tác giả Nguyễn Hoàng Anh và Trần Thị Na (2017) nghiên cứu tuyển chọn và

định danh vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh β-galactosidase chịu nhiệt

Từ thực trạng nghiên cứu cho thấy ở Việt Nam những nghiên cứu về galactosidase mới dừng lại ở nghiên cứu cơ bản, có một số nghiên cứu ứng dụng tạo GOS để bổ sung và sản xuất các sản phẩm: sữa chua, thực phẩm chức năng

β-và vi sinh vật chịu nhiệt Tuy nhiên trong nước chưa có nghiên cứu nào liên quan tới việc tuyển chọn các vi sinh vật sinh enzyme chịu lạnh

Kế thừa những thành quả đạt được chúng tôi đưa ra mục tiêu sẽ tuyển

chọn và định tên được các chủng lactic/Bacillus có khả năng tạo β-galactosidase

chịu lạnh, một trong những đối tượng được chú trọng nghiên cứu từ lâu do ưu điểm nổi bật là khả năng an toàn (“genereally regarded as safe”- GRAS) được Hiệp hội Thuốc và Thực phẩm của Mỹ FDA chứng nhận và khả năng chịu được các điều kiện nuôi cấy, bảo quản khắc nghiệt (Driks, 1999) Từ enzyme thu nhận được chúng tôi sẽ xác định ảnh hưởng của nhiê ̣t đô ̣ thấp tới enzyme, sau đó đưa

đi xác định khả năng phân giải lactose trong sữa tươi ở nhiệt độ thấp để ứng dụng trong viê ̣c sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose Đây là hướng mới của đề tài

so với các nghiên cứu trên

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 VẬT LIỆU

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Từ các nghiên cứu khảo sát trước đây, 68 chủng vi khuẩn (lactic và

Bacillus) đã được phân lập từ sữa tươi, sữa chua và các nguồn đất khác nhau đã

được định danh sơ bộ bằng hình thái và phương pháp hóa sinh, lưu giữ tại ngân hàng giống của phòng Thí nghiệm Trung tâm, khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam (bảng 3.1) được sử dụng để sàng lọc vi khuẩn có khả năng sinh β-galactosidase ưa lạnh

Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn được sử dụng để nghiên cứu

STT Nguồn phân lập Số chủng Tên kí hiệu các chủng

1 Mẫu sữa

1.1 Sữa bò tươi tại trại bò Đông Anh 4 SDA2, SDA3, SDA3.1, SDA4 1.2 Sữa bò tươi tại trại bò Phù Đổng 7 SPD1.3, SPD1.7, SPD2.3, SPD2.5, SPD2.7, SPD3.3,

SPD3.7 1.3 Sữa chua Vinamilk 3 SC3, SC4, SC5 1.4 Sữa bò trong kho lạnh tại trại bò Ba Vì 2 SBV3, SBV4

Đất xung quanh ống nước thải từ chuồng bò sữa Phù

NT4.1, NT4.2, NT4.3, NT4.4, NT4.5, NT4.6, NT4.7, NT4.8, NT4.9

3.6 Mẫu lấy trong nền kho sữa lạnh ở Ba Vì 4 KL3, KL4, KL5, KL7

4 Mẫu phân

4.1 Phân bò sữa ở Nghệ An 7

PBNA1, PBNA2, PBNA3, PBNA4, PBNA5, PBNA7, PBNA9

4.2 Phân bò sữa ở Phù Đổng 10

PB3.1, PB3.2, PB3.3, PB3.4, PB3.5, PB3.6, PB3.8, PB3.9, PB3.10, PB3.11

Tổng = 68 chủng

3.1.2 Môi trường nuôi cấy, thí nghiệm

Môi trường MRS và NA được dùng để hoạt hóa vi khuẩn lactic và Bacillus

Bảng 3.2 Môi trường đĩa thạch MRS pH: 6-6,5 sử dụng lactose

Môi trường NB (Mirac Yilmaz et al., 2006) dùng để hoạt hóa vi khuẩn

Bacillus có thành phần giống môi trường NA nhưng không sử dụng agar

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ

3.1.3.1 Thiết bị

Bảng 3.4 Danh sách các thiết bị sử dụng để nghiên cứu

STT Tên thiết bị Hãng sản xuất Xuất xứ

5 Quang phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS Shimadzu Nhật

16 Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với

3.1.3.2 Dụng cụ

Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu bao gồm các dụng cụ cơ bản như: cốc đong, pipet thủy tinh, bình đựng, que cấy, que trang, ống nghiệm, ống fancol (15 ml, 50 ml), đĩa peptri, bình tam giác (50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml) bình định mức (50 ml, 100 ml, 200 ml, 250 ml), ống đong, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, đèn cồn, màng lọc, micropipet…

17 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) Đức

3.2 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đi ̣a điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa học và công nghệ thực phẩm, khoa Công nghệ Thực phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam Thời gian nghiên cứu: từ tháng 8/2017 đến 10/2018

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Tuyển chọn vi khuẩn sinh β-galactosidase

- Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng

sinh tổng hợp β-galactosidase

- Tuyển chọn vi khuẩn sinh β-galactosidase có hoạt độ cao ở nhiệt độ thấp

- Tinh sạch sơ bộ β-galactosidase

- Xác định đặc tính của enzyme sau khi tinh sạch sơ bộ

- Định tên vi khuẩn có khả năng sinh β-galactosidase ưa lạnh

- Bước đầu đề xuất quy trình sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose

sử dụng β-galactosidase ưa lạnh

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.1 Tuyển chọn vi khuẩn sinh β-galactosidase

3.4.1.1 Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy giống

Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy giống được tiến hành theo Nguyễn Lân Dũng và cs (1978) và được mô tả như sau:

- Hoạt hóa lần 1

• Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa 5ml môi trường NB (cho vi khuẩn

Bacillus) hoặc môi trường MRS lỏng (cho vi khuẩn lactic) đã hấp khử trùng ở

121oC, 1 atm, trong 15 phút Dùng đầu que cấy nhọn tiệt trùng lấy khuẩn lạc và cho vào ống nghiệm Nút miệng ống nghiệm bằng màng bọc thực phẩm, đánh dấu tên chủng, thời gian cấy Các thao tác thí nghiệm đều được thực hiện trong buồng cấy vi sinh và trên ngọn lửa đèn cồn Sau đó, các ống nghiệm được chuyển vào tủ nuôi cấy, nuôi ở 37oC, lắc 200 vòng/phút trong vòng 24 giờ

- Hoạt hóa lần 2

• Tiếp giống 1% từ ống nghiệm hoạt hóa vào bình tam giác chứa môi

trường NB (Bacillus) hoặc MRS lỏng (lactic) có bổ sung 1% đường lactose đã

hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút Nuôi cấy ở 37oC, lắc 200 vòng/phút trong 24h

3.4.1.2 Xác định vi khuẩn sinh β-galactosidase bằng phương pháp Test X-Gal

Chủng vi khuẩn Bacillus/lactic sinh β-galactosidase được xác định theo

phương pháp của Toru Nakayama và Teruo Amachi, 1996, được tóm tắt như