nghiên cứu thay thế chủng nakayama bằng chủng Beijing-1 trong sản xuất vắc xin viêm não Nhật bản

Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) lần đầu tiên được ghi nhận năm 1871, với các triệu chứng viêm não ở ngựa và ở người. Năm 1873, bệnh xuất hiện rải rác ở nhiều vùng tại Nhật Bản. Năm 1924, một vụ dịch lớn xảy ra tại Nhật Bản với 6000 người mắc và có đến 60% trong số này tử vong [62]. - Năm 1934, Hayashi đã gây bệnh thực nghiệm trên khỉ bằng cách lấy não người tử vong do mắc viêm não tiêm vào não khỉ và sau thời gian ủ bệnh từ 10-14 ngày, thấy xuất hiện các triệu chứng viêm não [57, 115]. - Năm 1935, lần đầu tiên phân lập được virut VNNB từ não một trẻ em bị chết do viêm não tại Tokyo (Nật Bản), chủng được đặt tên là Nakayama [24, 183]. - Năm 1937, phân lập được virut gây viêm não ở ngựa, về sau virut này được xếp vào chủng viêm não ngựa miền Tây. - Năm 1938, Mitamura đã phân lập được virut VNNB từ muỗi Culex tritaeniorhynchus, mặc dù từ những năm 1930 người ta đã nghi ngờ sự lây truyền của bệnh là do muỗi truyền [183]. - Năm 1936-1938, Mitamura và Takanouchi đã nghiên cứu sản xuất thử văcxin viêm não từ não chuột, dù bước đầu nhưng là rất sớm sau khi đã phân lập được virut VNNB [16]. Công nghệ này 40 năm sau mới được hoàn thiện. Văcxin bất hoạt tinh khiết, an toàn cao và hiện đang có mặt trên thị trường quốc tế, đó là văcxin của hãng Biken theo phương pháp hóa lý của Takaku Nhật Bản [111]. - Năm 1959, Buecher và Scherer đã nghiên cứu về sinh thái học bệnh VNNB ở Nhật Bản và đã chứng minh chim và lợn là những vật chủ chính bị nhiễm virut huyết và nhờ có muỗi là vectơ hút máu các động vật nhiễm truyền virut sang cho người. Từ đó bệnh VNNB được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

viện vệ sinh dịch tễ trung ương công ty vắc xin và sinh phẩm số 1

báo cáo tổng kết đề tài KHCN cấp Nhà nước

nghiên cứu thay thế chủng nakayama bằng chủng Beijing-1 trong sản xuất

vắc xin viêm n∙o Nhật bản

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1 Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm não Nhật Bản

- Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) lần đầu tiên được ghi nhận năm 1871, với các triệu chứng viêm não ở ngựa và ở người Năm 1873, bệnh xuất hiện rải rác ở nhiều vùng tại Nhật Bản Năm 1924, một vụ dịch lớn xảy ra tại Nhật Bản với 6000 người mắc và

có đến 60% trong số này tử vong [62]

- Năm 1934, Hayashi đã gây bệnh thực nghiệm trên khỉ bằng cách lấy não người tử vong do mắc viêm não tiêm vào não khỉ và sau thời gian ủ bệnh từ 10-14 ngày, thấy xuất hiện các triệu chứng viêm não [57, 115]

- Năm 1935, lần đầu tiên phân lập được virut VNNB từ não một trẻ em bị chết do viêm não tại Tokyo (Nật Bản), chủng được đặt tên là Nakayama [24, 183]

- Năm 1937, phân lập được virut gây viêm não ở ngựa, về sau virut này được xếp vào chủng viêm não ngựa miền Tây

- Năm 1938, Mitamura đã phân lập được virut VNNB từ muỗi Culex tritaeniorhynchus, mặc dù từ những năm 1930 người ta đã nghi ngờ sự lây truyền của

bệnh là do muỗi truyền [183]

- Năm 1936-1938, Mitamura và Takanouchi đã nghiên cứu sản xuất thử văcxin viêm não từ não chuột, dù bước đầu nhưng là rất sớm sau khi đã phân lập được virut VNNB [16] Công nghệ này 40 năm sau mới được hoàn thiện Văcxin bất hoạt tinh khiết, an toàn cao và hiện đang có mặt trên thị trường quốc tế, đó là văcxin của hãng Biken theo phương pháp hóa lý của Takaku Nhật Bản [111]

- Năm 1959, Buecher và Scherer đã nghiên cứu về sinh thái học bệnh VNNB ở Nhật Bản và đã chứng minh chim và lợn là những vật chủ chính bị nhiễm virut huyết và nhờ có muỗi là vectơ hút máu các động vật nhiễm truyền virut sang cho người Từ đó bệnh VNNB được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu [21]

2 Phân loại virut VNNB

Virut VNNB là một thành viên của virut Arbo (arthropod borne viruses) Là những virut do côn trùng tiết túc truyền cho động vật có xương sống qua đường máu Tất

cả các virut arbo đều có hệ gen (genome) là ARN, hầu hết chúng đều có vỏ lipit và bị bất hoạt bởi ether hoặc sodium deoxycholate [20, 24] Việc đặt tên cho các virut arbo đôi khi dựa vào bệnh như sốt Dengue, số vàng (yellow fever) hoặc theo vùng địa lý mà ở đó lần

đầu tiên phân lập được virut như viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis), St Louis encephalitis, West Nile fever

Có trên 350 loài trong nhóm virut arbo, trong đó arbo gây bệnh cho người có trên

75 thành viên, được sắp xếp theo mối quan hệ kháng nguyên Một số tác giả nghiên cứu

để xếp loại theo các đặc tính địa lý Nhiều virut arbo được xếp vào họ Togaviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae Họ Togaviridae được chia thành 2 chi

(genus) là Alphavirus thuộc nhóm A trong đó điển hình là các loài Aura; Babanki; Barmah Forest; Eastern equine encephalitis; Everglades; Western equine encephalitis;

Whataroa Họ Flaviviridae thuộc nhóm B bao gồm: Japanese encephalitis (VNNB);

Dengue; Yellow fever; West Nile fever; Brazilian encephalitis…

Hình 1: Mô hình so sánh các virut trong nhóm Flavivirus dựa vào trình tự axit amin của protein vùng vỏ (E-protein), sử dụng phần mềm Beckman Microgenie

Software package, Version 4.0 [ 101 ]

(DEN: Dengue; WN: West Nile; KVN: Kunjin; MVE: Murray Valley encephalitis; JE: Japanese encephalitis; SLE: St Louis encephalitis; YF: Yellow fever; POW: Powassan; LGT: Langat; LI: Louping ill; TBE: Tick borne encephalitis)

Các tác giả phân tích trong 3 nhóm chính DEN, JE và TBE cho thấy: Phân tích huyết thanh hỗn hợp JE và DEN thì tỷ lệ giống nhau là 46-53% DEN1 và DEN3 có quan

hệ gần nhất (77% tương đồng); với DEN2 là 69% và DEN4 là 62% JE và TBE có tỷ lệ nucleotit cùng loại 72-77%, còn axit amin của protein E cùng loại là 40-44% [101]

3 1 2 4

77

69

62

Hội nghị 1992 tại Geneve, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đã xếp loại viêm não

do muỗi truyền và gây tổn thương thần kinh trung ương được ký hiệu như sau:

A83.0 Viêm não Nhật Bản

A83.1 Viêm não ngựa miền Tây

A83.2 Viêm não ngựa miền Đông

A83.3 Viêm não St Louis

A83.4 Viêm não châu Úc

A83.5 Viêm não California

A83.6 Viêm não virut Nga

A83.7 Viêm não virut do muỗi truyền khác

A83.8 Viêm não virut do muỗi truyền không xác định

Viêm não Nhật Bản được xếp hàng đầu trong các loại viêm não do muỗi truyền, bệnh để lại hậu quả nặng nề nên đã có văcxin phòng bệnh từ 1954, và sớm có các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm để xác định căn nguyên [31, 47, 95, 115, 120, 139,

148, 187]

3 Đặc điểm và cấu trúc của virut VNNB

Virut có hình cầu, đường kính trung bình 40-50nm, có màng lipid kép, gắn vào lớp

vỏ là glycoprotein E và protein màng (M) Vật liệu di truyền là 1 sợi ARN đơn phân cực dương xoắn, được bao bọc bởi nucleocapsid Hạt virut VNNB tinh khiết cho thấy sợi ARN chiếm 6%, protein 66%, lipid 17% và carbonhydrate chiếm 9%, cấu trúc của lớp lipid kép phụ thuộc vào tế bào chủ, nơi virut nhân lên [152, 180]

Cấu trúc phân tử của sợi ARN bao gồm 11000 nucleotid, tương ứng với 3400 axit amin Đây chính là yếu tố gây nhiễm của virut Hệ gen của virut VNNB mã hóa cho 10 protein gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc trong một khung đọc mở liên tục và trật tự từ đầu 5’ đến đầu 3’ và các vùng không mã hóa Kết quả dịch mã để hình thành một polyprotein đơn được giải phóng sau sự hoạt hóa của tế bào chủ và enzym chuyển hóa tạo ra sự phân cắt của các protein [31]

Trên hình 2, cho ta thấy sắp xếp thứ tự các protein trong sợi ARN: Cap preM-M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’ Đầu 3’ sợi ARN của virut VNNB không chứa đuôi polyA nhưng được coi là làm khuôn mẫu cho các cấu trúc tiếp theo Từ đầu 5’ các gen được mã hóa cho protein vỏ capsid của ARN (C); protein tiền màng (preM); hoặc protein màng (M) của virut trưởng thành và protein vỏ (E) là protein cấu trúc chiếm 1/4 chiều dài của hệ gen Các protein không cấu trúc là phần còn lại của

NS4A NS4B NS2B

NS2A

Phiªn m· trªn m¹ng l−íi néi chÊt h¹t

Hình 2: Sơ đồ cấu trúc hạt virut VNNB (Flaviviruses)

3.1 Protein C

Protein C rất nhỏ, chỉ 9-12 KDa gồm 112-127 axit amin được tạo thành rất vững chắc gồm một số lớn axit amin Lys và Arg Các axit amin trong protein C liên kết với nhau rất chặt chẽ, có thể loại trừ khả năng trung hòa của phân tử ARN của virut với các tác nhân liên quan [106, 148]

3.2 Protein M

Protein M có 2 dạng: protein preM chưa trưởng thành trong tế bào chủ và quan sát thấy có 165 axit amin không trùng lặp với protein E Từ đó một số tác giả nghiên cứu sử dụng protein E trong sản xuất văcxin VNNB tái tổ hợp để tổng hợp preM của virut với mục đích tạo các nếp gấp chính xác ở tại protein M và lắp ráp vào protein E của 1 flavivirus nào đó (như yellow fever) Trước khi virut được giải phóng ra ngoài tế bào, preM được phân cắt bởi một phân tử protease (furin-like) để tạo thành protein M hoàn chỉnh PreM chưa trưởng thành không tự tiến tới tế bào đích nhưng lại rất cần thiết cho hoạt động chức năng duy trì nòi giống của virut trưởng thành [148, 170, 189]

Protein M có trong virut trưởng thành ngoài tế bào Hạt virut trưởng thành có khả năng kháng axit kém hơn hạt virut chưa trưởng thành khoảng 400 lần khi nghiên cứu so sánh trên hạt virut chưa hoàn chỉnh, vì vậy khả năng tiếp cận với tế bào đích dễ dàng hơn

Sự ly giải preM khi ra ngoài tế bào tạo ra sự sắp xếp lại các cấu trúc oligo trên bề mặt hạt virut do đó làm tăng khả năng gây nhiễm của virut trưởng thành tới vật chủ [58, 104]

3.3 Protein E

Có trọng lượng phân tử 55-60KDa, là một glycoprotein bao gồm khoảng 494-501 axit amin là thành phần cấu tạo chính của vỏ (E) So sánh các chuỗi axit amin tương đồng cho thấy protein E là một protein cấu trúc có tính bảo tồn cao trong các virut thuộc nhóm flavivirus Protein E có liên quan chặt chẽ đến chức năng sinh học của virut như chức năng bám dính, thụ cảm thể, ngưng kết hồng cầu, trung hòa kháng thể, điều chỉnh pH nội nguyên sinh chất của tế bào chủ [56, 59, 115, 139, 147, 149]

3.4 Các protein không cấu trúc (NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)

- NS1: có trọng lượng phân tử 42-50KDa, là một glycoprotein gồm 353-354 axit

amin Chức năng chưa rõ, có thể như một bổ thể hòa tan cố định kháng nguyên khi bộc lộ trên tế bào cảm nhiễm, có thể NS1 như là đích của đáp ứng miễn dịch chăng? [86, 88,

148]

- NS3: có trọng lượng phân tử 67-70 KDa gồm 618-623 axit amin và có tính bảo

tồn cao trong chuỗi nucleotid của nhóm flavivirus, đóng vai trò mã hóa cho enzym proteaza và helicaza [31, 101, 148]

- NS5: có trọng lượng phân tử 104-106 KDa gồm 900-905 axit amin và cũng có

tính bảo tồn cao trong chuỗi nuleotid Một số nghiên cứu khác cho thấy NS5 gắn liền với

sự tạo vỏ capsid của ARN Các nghiên cứu invitro polymeraza đã thẩm định và cho thấy NS3 và NS5 được sử dụng khi ARN của virut nhân lên [148, 149, 176, 179, 181]

- NS2A-NS2B-NS4A và NS4B: đều rất nhỏ bé, có tính chất bảo tồn kém trong

chuỗi nucleotid, có thể nghĩ đến sự mã hóa của chúng có liên quan đến protein M

Những năm gần đây, các nghiên cứu về sinh học phân tử của virut VNNB đã có những bước tiến đáng kể Định loại cấu trúc 3 protein của virut VNNB là M, C và E Protein E phân lập được từ bề mặt của hạt virut Thử nghiệm trên động vật có vú cho thấy protein E tạo ra kháng thể trung hòa sau khi tiêm và các động vật này (chuột nhắt trắng)

đã sống sót sau khi thử thách bằng chủng độc lực Khả năng bảo vệ của protein E được thử nghiệm và phân tích bằng thử nghiệm kháng thể đơn dòng (MAb) để định loại nhiều epitop có phản ứng chéo với các flavivirus và cũng giống nhau về đặc tính sinh học [23,

24, 31]

3.5 Tính chất hóa lý và bền vững của virut VNNB [ 31, 82 ]

- Virut VNNB có tỷ trọng 1,19-1,20g/cm3 trong đường và 1,22-1,24g/m3 trong cesium chlorid

- Hệ số lắng 200S

- Trọng lượng phân tử 60-70 x 106 dalton

- Độ bền vững: với độ pH giao động từ 7-9 Thích hợp nhất là pH 8

- Virut dễ bị bất hoạt bởi nhiệt độ cao: 50oC trong 50 phút ; 37oC trong vài giờ Nhiệt

độ thấp như -80oC, -20oC virut tồn tại trong nhiều năm và trong nitơ lỏng (-196oC) virut tồn tại vĩnh cửu

- Virut VNNB rất nhạy với dung môi hòa tan như ether, sodium deoxycholate, dễ dàng

bị bất hoạt bởi tia cực tím, formaldehyt

3.6 Thành phần và quyết định kháng nguyên

Theo nhiều nghiên cứu đã cho thấy kháng nguyên của flavivirus có phản ứng chéo với nhau, 3 nhóm kháng nguyên quan hệ mật thiết và rất khăng khít với nhau đó là sốt Tây sông Nile (West Nile fever), viêm não Louis (Louis encephalitis) và viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis) [29, 140] Bằng các phản ứng huyết thanh với kháng thể đa dòng rất khó phân biệt Riêng phản ứng trung hòa (NT) là nhạy nhất tiếp đến là phản ứng

kết hợp bổ thể (CF), rồi miễn dịch huỳnh quang (IF) Vậy đánh giá đáp ứng miến dịch sau khi tiêm văcxin bằng ký thuật trung hòa là đặc hiệu nhất, đặc biệt là trung hòa giảm 50% đám hoại tử (PRNT) trên tế bào [126, 127] Hoặc dùng kháng thể đơn dòng để định loại flavivirus và phân biệt với virut VNNB [59, 68, 74, 102, 104, 123, 126, 127, 128,

139, 151]

Những năm cuối thập kỷ 90, công nghệ sinh học phân tử phát triển không ngừng

và chỉ cần sử dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR), với cặp mồi (primer) đặc hiệu thì rất nhanh chóng định loại được typ virut trong các flavivirus [118, 133] Hoặc xa hơn còn phân tích được đặc tính di truyền của các virut VNNB lưu hành ở các vùng khác nhau bằng phương pháp phân tích trình tự gen (sequencing), so sánh trình tự các nucleotid của các chủng virut VNNB khác nhau [134, 185] Ngày nay, nhờ công nghệ này mà nhiều nhà khoa học đã cố gắng chế tạo các văcxin tái tổ hợp ADN nhằm cải thiện một bước công nghệ gen trong việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng [65]

3.7 Khả năng bảo vệ của kháng nguyên

Kháng nguyên tạo ra kháng thể tương ứng, nhưng không phải tất cả các kháng nguyên đều liên quan đến việc gây bệnh và sinh miễn dịch Thường có 1-2 kháng nguyên quyết định tính sinh miễn dịch và cũng là kháng nguyên bị kháng thể trung hòa nếu xâm nhập vào cơ thể đã được miễn dịch Kháng nguyên này nằm ngay trên bề mặt của hạt virut Đó là kháng nguyên chịu trách nhiệm tiếp xúc đầu tiên trên tế bào chủ Với hạt virut VNNB thì kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA) và hoạt tính trung hòa là glycoprotein trên preM và E (vỏ và tiền màng của virut), cũng chính 2 thành phần glycoprotein này sinh kháng thể ƯCNKHC (HI) và kết hợp bổ thể (CF), kháng thể trung hòa (NT) [31, 96, 111, 151] Để chứng minh đều này khi Kitano và Suzuki đã tách chiết ngưng kết tố hồng cầu trên bề mặt hạt virut VNNB rồi gây miễn dịch cho chuột nhắt trắng Kết quả là kháng thể trung hòa ở chuột được gây miễn dịch với hạt virut VNNB nguyên vẹn và bằng kháng nguyên HA đều có hiệu giá như nhau Từ đó hai tác giả kết luận yếu tố ngưng kết hồng cầu (HA) là kháng nguyên kích thích tạo ra kháng thể trung hòa [82]

4 Sự nhân lên của virut trên tế bào

4.1 Chu kỳ nhân lên của virut ARN

Khi virut gặp tế bào cảm thụ và nhận biết các thụ thể trên màng tế bào, tiến đến và bám vào thụ thể, màng tế bào bị tác động và tạo khe hở cho virut thâm nhập vào bên trong tế bào gây cảm ứng tổng hợp ARN [35, 115, 148] Sau đó sợi ARN được bộc lộ là ARN đơn-polymeraza để tạo thành ARN phân cực (-) bổ sung thành chuỗi ARN kép nhờ phiên mã sớm và thông tin trung gian sao chép sợi ARN kép được làm khuôn để tổng

hợp các sợi ARN mới theo cách bán bảo tồn và không đối xứng Khung đọc mở được đồng dịch mã bằng cách cắt đoạn protein liên tiếp thành các đoạn protein cấu trúc và không cấu trúc [172] ARN và protein của virut được tổng hợp trên lưới nội chất có hạt, vùng quanh nhân trong nguyên sinh chất của tế bào chủ Sự nhân lên của virut liên quan đến phát triển của lưới nội chất tạo thành các nội bào đặc trưng Các sản phẩm tổng hợp được lắp ráp ở màng tế bào chất Sau đó các hạt virion được giải phóng qua bộ máy Golgi bằng ngoại bào xuất tiết và các virut mới tiếp tục xâm nhập vào tế bào khác và bắt đầu một chu kỳ mới [52, 53, 54]

4.2 Sự nhân lên của virut trong tế bào

Hình 3 : Sơ đồ nhân lên của flaviviruses [ 148 ]

Virut VNNB nhân lên trên nhiều loại tế bào cả ở trên tế bào tiên phát và tế bào thường trực, chúng có nguồn gốc từ người, khỉ, gặm nhấm, lợn, chim, gia cầm và muỗi [23, 24, 45] Tế bào thận bào thai người, thận khỉ, thận lợn, tế bào phôi gà các dòng tế bào thường trực như GMK2, Vero (thận khỉ), BHK21 (thận chuột đất vàng), C6/36 (tế bào muỗi Albobitus) Virut nhân lên gây hủy hoại tế bào (CPE) nhưng cũng có một số

7 Sự hình thành virion trong NSC

9 Phóng thích các hạt virut

loại tế bào quan sát dưới kính hiển vi quang học, không thấy hiện tượng CPE [119] Hiệu giá virut đạt được tùy thuộc vào tế bào chủ, loại cảm ứng và thích hợp virut nhân lên tốc

độ nhanh, thời gian tạo CPE nhanh sau 1-2 ngày gây nhiễm (Tế bào C6/36, Vero và BHK21) [117]

Hình ảnh tế bào tổn thương quan sát trên kính hiển vi quang học cho thấy: tế bào phình to, các tiểu thể hạt xuất hiện ở lưới nội chất làm rối loạn chức năng phân chia tế bào, vỏ màng nội bào tạo thành các không bào căng phồng và các tiểu thể trong nhân bị méo mó Tăng sinh tiểu thể Lysosom và làm loãng nguyên sinh chất của tế bào Hoạt tính enzym lysosom tăng lên trong tổ chức tế bào nhiễm [132]

5 Sinh bệnh học

Virut VNNB có cấu trúc kháng nguyên giống như các flavivirus khác, bao gồm virut viêm não St Louis, virut West Nile vì vậy, chúng có phản ứng chéo với các epitop trung hòa với virut VNNB trên kháng nguyên bề mặt E Một số phân typ của kháng nguyên đã được nghiên cứu, mặc dù vậy cho đến nay nghiên cứu sự khác nhau giữa các phân typ về độc tính thần kinh, vật chủ vẫn còn nghèo nàn Vẫn các giả thiết, muỗi đốt qua da rồi virut nhân lên tại chỗ sau đó tiến đến các hạch lympho vùng Virut tấn công đến hệ thần kinh trung ương và chắc chắn sẽ đến hệ tuần hoàn tổn thương tế bào thần kinh trung ương rồi hủy hoại hệ thần kinh trung ương [92] Virut nhân lên và khu trú ở não, vùng chất xám, vùng đồi thị, tiểu não và có mặt trong nước não tủy [40, 74, 75, 76]

Chẩn đoán căn nguyên VNNB chủ yếu dựa vào huyết thanh học [61, 80] Sử dụng

bộ sinh phẩm MAC-ELISA để phát hiện sớm IgM đặc hiệu kháng virut VNNB trong nước não tủy hoặc trong máu bệnh nhân trong vòng 4-7 ngày sau khởi bệnh [8, 22, 25,

26, 48, 71, 194] Những phương pháp chẩn đoán khác như dot-blot hoặc kỹ thuật tủa miễn dịch (immuniprecipitation IgM assay) phát hiện IgM [167] Có thể phân lập virut từ máu bệnh nhân trong giai đoạn sớm, từ dịch não tủy hoặc từ não tử thi Kỹ thuật PCR để phát hiện hệ gen đặc hiệu của virut, đặc biệt trong dịch não tủy cũng dễ dàng phát hiện được sự có mặt của hệ gen virut VNNB [68, 93, 107, 133]

Mô hình nghiên cứu thí nghiệm trên chuột nhắt trắng là rõ ràng nhất [40] Những nghiên cứu sâu về các thể lâm sàng và nhiễm virut thể ẩn cho thấy mức độ thể hiện lâm sàng: từ từ, đột ngột, thể nhẹ, thể nặng, thể ẩn phụ thuộc vào các yếu tố: đường gây nhiễm (dưới da, phúc mạc, não); số lượng virut xâm nhập vào cơ thể; tính độc lực của chủng virut; tuổi cảm nhiễm của vật chủ Vật chủ là yếu tố rất quan trọng về tạo miễn dịch, sinh interferon Sức khỏe của vật chủ ảnh hưởng đến tính sinh bệnh [73] Thử nghiệm tiêm vào não chuột liều cao thì bệnh thể hiện dồn dập, đột ngột Nếu liều gây nhiễm qua da, lượng virut thấp nên diễn biến trước tiên virut nhân lên ở máu ngoại vi rồi

hướng thần kinh trung ương và sau đó gây ra Hội chứng não cấp Tính từ khi virut nhân lên đến thời điểm sốt, đó là giai đoạn ủ bệnh Thời gian này có thể 6-16 ngày, tùy thuộc vào các yếu tố trên Hệ miễn dịch hoạt động trước khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng Do đó, khởi bệnh sau 3-4 ngày đã có thể phát hiện kháng thể IgM và chính giai

đoạn sớm này có thể phân lập được virut một cách dễ dàng từ dịch não tủy [25]

Hình 4: Quá trình xâm nhập và phát triển trong cơ thể sau nhiễm virut VNNB [ 121 ]

Theo sơ đồ trên cho thấy: muỗi đốt, virut truyền qua da, nhân lên tại chỗ và tiến tới hạch lympho vùng, tuyến ức (hệ miễn dịch) rồi vào máu Trước tiên, gây nhiễm virut huyết và các tổ chức ngoài thần kinh như cơ vân, cơ trơn, cơ tim, nội mao mạch, các tổ chức lympho, tuyến nội tiết, ngoại tiết và vào hệ tuần hoàn Nhiễm virut huyết dao động bởi tỷ lệ di chuyển của macrophage và cuối cùng kích thích sinh kháng thể dịch thể, qúa trình này diễn biến khoảng một tuần sau khi nhiễm virut Khi virut tiến tới hệ thần kinh trung ương, ngay lập tức gây cảm ứng thần kinh: thử nghiệm rất rõ ở chuột nhắt và khỉ, biểu hiện thương tổn chủ yếu ở vùng chất xám, đồi thị và tiểu não Huang và Wong đã

Tổ chức ngoài thần kinh

- Cơ vân, cơ trơn

- Tuyến tụy, thượng thận

Tế bào nội mạc võng mô

- Rối loạn chức năng tế bào

Mô thần kinh

nghiên cứu theo dõi và miêu tả các tổn thương thần kinh trung ương cho thấy, liệt ngoại biên, liệt 4 chi và liệt toàn thân [66] Miyake mô tả lại bệnh lý thể hiện ở người trong giai đoạn cấp: xung huyết, phù nề, xuất huyết vi thể ở não, gây hủy hoại và thái hóa tế bào thần kinh, viêm tắc mạch vi thể chủ yếu xảy ra ở chất xám, não giữa và thân não [111] Ngoài ra các thương tổn ngoài tổ chức thần kinh như tăng sinh các trung tâm bạch huyết, viêm cơ tim, xuất hiện các tế bào kuffler ở gan, viêm phổi, xuất huyết thận [160]

Lợn nhiễm virut viêm não dẫn đến sẩy thai và tìm thấy các thương tổn ở bào thai lợn bị sẩy Virut viêm não còn gây vô tinh, viêm mào tinh hoàn, viêm bao tinh hoàn và dừng sinh tinh dịch Sau khi tiêm virut viêm não vào chuột cái chửa cũng gây sẩy thai Ở người cũng đã chứng minh nhiễm virut truyền qua nhau thai, gây sẩy thai và đã phân lập được virut ở bào thai [111]

Đáp ứng miễn dịch bảo vệ: miễn dịch bảo vệ được kết hợp với sự phát triển của

kháng thể trung hòa [193] Mặc dù chưa có tiêu chuẩn quốc tế quy định, hiệu giá kháng thể trung hòa 1:10 hoặc lớn hơn 1:10 là đủ bảo vệ Vai trò của miễn dịch trung gian tế bào cũng được chứng minh trong nghiên cứu trên mô hình chuột

Đáp ứng miễn dịch thụ động: Globulin miễn dịch để điều trị viêm não điều chế

từ huyết tương người chưa có Theo kinh nghiệm của một số tác giả, bệnh viêm não do

ve truyền thì phải được sử dụng ngay trước khi khởi bệnh mới có hiệu quả, nếu chỉ muộn

4 ngày sau khởi bệnh cũng không có hiệu quả Một số nghiên cứu để điều trị sớm bằng α-interferon, có thể kết hợp với plasma miễn dịch điều trị dự phòng tốt hơn [50, 51, 64

165]

Đáp ứng miễn dịch chủ động: Văcxin phòng bệnh VNNB được sử dụng rộng rãi

trên thế giới Tuy nhiên, hiện tại chỉ có văcxin bất hoạt, tinh khiết từ não chuột là được sử dụng rộng rãi [1, 4, 5, 6, 63, 70, 72, 168, 171, 182]

Văcxin bất hoạt và văcxin sống giảm độc lực trên tế bào thận chuột đất vàng tiên phát (PHK) được sản xuất và phân phối tại Trung Quốc với hơn 75 triệu liều văcxin bất hoạt và 25 triệu liều văcxin sống giảm động lực được sử dụng hàng năm tại Trung Quốc

để dự phòng cho trẻ em [60, 116]

Tại Nhật Bản, các nhà sản xuất hàng năm chỉ đạt 11 triệu liều, đủ cung cấp trong nước và xuất khẩu 2 triệu liều Văcxin bất hoạt từ não chuột do BIKEN (Nhật Bản) và Green Cross (Hàn Quốc) sản xuất đều được sử dụng ở các nước châu Âu, bắc Mỹ và Úc Sau khi một sinh viên Mỹ ở Bắc Kinh chết do VNNB Trung tâm kiểm soát bệnh tật (CDC, Hoa Kỳ) chỉ sử dụng văcxin của BIKEN để tiêm cho lính Mỹ và du khách Mỹ đến các vùng có dịch

Gây bệnh thực nghiệm: Mô hình thực nghiệm có hiệu quả nhất là chuột nhắt,

chuột hamster Đó là động vật dễ cảm nhiễm với virut VNNB nhưng các yết tố có quyết định đến tính sinh bệnh là :

+ Đường gây nhiễm

+ Lượng virut thâm nhập vào cơ thể

+ Tuổi cảm nhiễm

+ Độc lực thần kinh của chủng gây nhiễm

Nhiều tác giả đã nghiên cứu, đều có chung một nhận xét là chuột non có tính cảm nhiễm mạnh hơn chuột già [54] Họ còn chứng minh đường gây nhiễm trực tiếp vào não, thời gian ủ bệnh và phát bệnh nhanh hơn đường ngoại biên [52] Năm 1991, Ogata đã chứng minh virut viêm não có ái tính với tế bào thần kinh [125] Dù đường vào cơ thể bằng trực tiếp với tổ chức não hay bằng đường ngoại biên thì virut cũng theo các hạch bạch huyết, hướng tới các nơron thần kinh và nhân lên mạnh mẽ, nhanh chóng ở tổ chức

tế bào thần kinh Miura đã nghiên cứu, phân tích về tính độc lực thần kinh ở chủng độc lực có một gen trội, chính gen này quyết định tính độc lực của chủng virut VNNB Huang

và Wong đã nghiên cứu và công bố kết quả trùng lặp với một số tác giả trước đó là: Trong giai đoạn cấp tính virut VNNB nhân lên và gây tổn thương tổ chức não như hiện tượng xung huyết, phù nề và xuất huyết ở não chuột [66, 122] Các tiêu bản cắt cực mỏng soi trên kính hiển vi cho thấy sự thoái hóa, hoại tử tế bào thần kinh, hạch thần kinh đệm, nơron thần kinh, hiện tượng viêm quanh mao mạch [54, 132] Các hiện tượng này xảy ra

ở não trung gian, não giữa và thân não chủ yếu ở vùng chất xám Ngoài ra người ta cũng ghi nhận được sự tăng sinh của các trung tâm bạch huyết, tăng các tiểu thể Malpighi ở lách, viêm cơ tim, viêm tế bào Kuffler ở tổ chức gan, viêm giãn phế nan ở phổi và các nốt xuất huyết cục bộ ở thận Johnson đã phát hiện thấy các kháng nguyên virut VNNB tập trung ở nơron thần kinh vùng đồi thị và thân não của bệnh nhân tử vong do VNNB [75]

Nghiên cứu virut VNNB ở lợn cho thấy lợn không có triệu chứng viêm não mà thường virut viêm não gây thai chết lưu hoặc sẩy thai và đã chứng minh virut viêm não ở não của lợn con bị sẩy Ở lợn đực thì virut gây thiểu năng tinh dịch hoặc không có tinh dịch, viêm mào tinh hoàn và vỏ tinh hoàn

Ở phụ nữ mang thai bị viêm não sẽ gây sẩy thai và phân lập được virut từ bào thai Tiêm virut viêm não qua đường phúc mạc cho chuột chửa cũng gây sẩy thai Chuột nhiễm virut thể ẩn trong thời kỳ mang thai có thể nhiễm virut thể ẩn ở lần mang thai sau

6 Xét nghiệm cận lâm sàng và chẩn đoán nghiên cứu phòng thí nghiệm

6.1 Xét nghiệm lâm sàng [ 77, 109, 110 ]

- Bạch cầu tăng: 10-34x109/l; số lượng trung tính giao động 51-90%

- Áp lực nước não tủy tăng (NNT)

- Tế bào trong NNT tăng 10-980 x 106/l; protein < 900mg/l; nồng độ glucose bình thường

- Điện não đồ không có gì đặc biệt, bao gồm cả sóng theta và delta

Điện não đồ thay đổi có thể giúp phân biệt với viêm não do Herpes Phân tích hình ảnh qua computer có thấy một chút thay đổi ở vùng chất xám, nhưng phải là chuyên gia

có nhiều kinh nghiệm mới phát hiện được

6.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

Các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm vẫn thường theo một quy trình nhất định Chẩn đoán sớm, nhanh và các phương pháp dịch tễ học Phát hiện kháng thể IgM đặc hiệu kháng virut VNNB còn phục vụ nghiên cứu, xác định căn nguyên là phân lập virut Chúng tôi trình bày tuần tự các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm theo qui trình của TCYTTG

6.2.1 Phân lập virut [ 43, 80, 81, 94, 162, 112, 193 ]

- Tiêm vào não chuột sơ sinh

- Nuôi cấy trên tế bào phôi gà, phôi vịt tiên phát

- Nuôi cấy trên các dòng tế bào thường trực: Vero, LLCMK2, C6/36 và AP/61

- Kỹ thuật tiêm vào muỗi

6.2.2 Phát hiện kháng nguyên [ 39, 143, 145, 193 ]

- Ngưng kết hồng cầu thụ động ngược

- Miễn dịch huỳnh quang

- Miễn dịch gắn vàng, bạc (MIGSS)

6.2.3 Phát hiện kháng thể [ 26, 36, 45, 55, 167 ]

- ELISA tóm bắt kháng thể IgM

- Avidin biotin system

- Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn Biotin

- Thử nghiệm miễn dịch DOT tóm bắt IgM phát hiện màng nitrocellulose

- Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu

- Kỹ thuật kết hợp bổ thể

- Kỹ thuật tan huyết phóng xạ đơn

- Kỹ thuật trung hòa

Để có thể chẩn đoán phân biệt viêm não do herpes hay VNNB , vùng tổn thương chủ yếu là diencephalon và basal ganglia, nơi virut herpes gây viêm não thường gây biến đổi ở vùng sừng trước

6.2.4 Chẩn đoán căn nguyên [ 8, 166, 167 ]

Dựa vào phân lập virut, phát hiện kháng nguyên, kháng thể đặc hiệu trong máu, trong dịch não tủy Chẩn đoán phòng thí nghiệm xác định VNNB theo một trong ba yêu cầu sau:

- Hiệu giá kháng thể lấy máu lần 2 tăng hơn máu lần 1 gấp 4 lần, hoặc cao hơn, nếu là

kỹ thuật HI hoặc ELISA-IgG (hiệu giá kháng thể HT2 ≥ 4 lần so với HT1)

- Phân lập và định loại virut hoặc xét nghiệm trình tự hệ gen trong dịch nuôi cấy virut, máu, dịch não tủy hoặc các dịch khác của cơ thể;

- Phát hiện kháng thể IgM trong máu, dịch não tủy bằng thử nghiệm miễn dịch enzym (ELISA) Đây là phương pháp chẩn đoán nhanh và rất đặc hiệu, với độ pha loãng của huyết thanh là 1/100 cho kết quả OD mẫu thử/OD HT (-) ≥ 2 là dương tính Thời gian thực hiện chỉ sau 4 giờ là đã có kết quả

6.2.4.1 Phân lập virut trên não chuột

Cho đến nay việc phân lập virut VNNB cũng như các virut Arbo hiệu quả nhất là tiêm vào não chuột nhắt trắng 1-3 ngày tuổi 0,01-0,02ml/con và thường kết hợp với 1 liều tiêm dưới da hoặc tiêm phúc mạc 0,03-0,05ml/com Chuột sơ sinh được coi là vật chủ nhạy cảm nhất Chuột đất vàng sơ sinh cũng có thể sử dụng nhưng không cho kết quả tốt hơn Điểm tiêm là vùng đồi thị của não, giữa tai và mắt Sau khi tiêm chuột vẫn bú mẹ, vì vậy chú ý mỗi ổ chuột không quá 6-8 con để chuột mẹ chăm sóc tốt hơn Chuột bị chết trước 24 giờ đều loại bỏ do đó trong 24 giờ đầu phải thăm chuột 2 lần để loại bỏ chuột chết do tiêm hoặc do các nguyên nhân khác

Quan sát các biểu hiện lâm sàng ở chuột ốm, bỏ bú, dạ dày không có sữa, chuột mất màu hồng, tím tái, chậm chạp, nằm liệt nhưng khó quan sát thấy liệt

Thu thập chuột ốm, xử lý chuột bằng dung dịch khử trùng và mổ lấy não vô trùng Sau đó nghiền đồng nhất 10% trong PBS pH8 có chứa BSA (albumin bò) Ly tâm lạnh 2000v/p trong 20 phút Lấy nước nổi bảo quản ở -80oC hoặc Nitơ lỏng Một phần thử nghiệm ngưng kết hồng cầu ngỗng Cũng có thể phải tiêm truyền 3 lần, chuột không ốm mới loại

bỏ

6.2.4.2 Phân lập virut trên tế bào [ 44, 69 ]

Sau khi tiêm não chuột ổ (+) Não chuột nhiễm được nghiền đồng nhất 10-20% trong PBS pH8 Ly tâm loại tủa, lọc vô trùng (millipore Millex) Huyền dịch virut sau lọc được cấy vào tế bào C6/36 (nhạy nhất) hoặc Vero Theo dõi sử hủy hoại của tế bào, trong 14 ngày nếu có CPE sớm hơn thì gặt và cấy truyền tiếp để nâng hiệu giá

Hình 5: Sơ đồ phân lập virut viêm não Nhật Bản [ 150 ]

- Não: Sinh thiết vùng chất xám

- Lách, phổi, gan và các cơ quan khác

Xử lý

- Tách chắt huyết thanh, bỏmáu đông

- Pha loãng 1/10 hoặc khôngpha loãng

- Nghiền đồng nhất 10-20% trong PBS pH8, có chất bền vững và kháng sinh Ly tâm 1000v/p, trong 20 phút

- Lấy nước nổi pha 10-1-10-2

Tiêm truyền

- Chuột nhắt 1-3 ngày tuổi: tiêm não 0,01-0,02ml

- Chuột hamster sơ sinh: tiêm não 0,01-0,02ml

- Nuôi cấy tế bào C6/36, BHK21, Vero CPE hoặc plaques

- Tiêm vào ngực của muỗi Culex

Quan sát Chuột ốm hoặc chết Tế bào: CPE,PFU, FA (không đặc hiệu)Phôi gà Muỗi, FA, CF

Tiêm truyền tiếp

- Huyền dịch não 10% (±)

- Tiêm truyền não chuột (+)

- Dich nổi tế bào, tiếp tục cấy truyền: CPE

- Chuẩn độ PFU bằng phương pháp phủ thạch

Tiếp tục tiêm truyền trên chuột, trên tế bào hoặc trên muỗi

Phương pháp khó thực hiện (cần phải điêu luyện)

(+) (-) Hủy (+) (-) Hủy

Sau khi tiêm truyền nhiều lần (theo sơ đồ phân lập) cho đến khi đạt hiệu giá ≥ 10-5

(LD50) và hình ảnh thương tổn tế bào CPE điển hình Sau đó kiểm tra vô khuẩn và bảo

quản ở dạng pha loãng 20% có chất bền vững và chất bảo quản virut

Hình 6: Sơ đồ định loại virut [ 150 ]

6.2.5.1 Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học

- Ngăn ngưng kết hồng cầu (HI): Đặc hiệu là ngưng kết hồng cầu Ngỗng, kỹ thuật này

đã ứng dụng cách đây 50 năm và ngày nay vẫn được sử dụng ở nhiều phòng thí

Định loại

Nếu nghi ngờ mẫu phân lập có ít virut, chuẩn bị kháng huyết thanh hoặc kháng thể đơn dòng, để thử nghiệm tiếp

Nếu việc định loại không nghi ngờ

Pha dung dịch borate pH9 cho phảnứng CF và HI

- Thử nghiệm HA

- Thử nghiệm CF và HI với khánghuyết thanh chuẩn

Lọc, tinh khiết, soi HVĐT

Định loại bằng kỹ thuật trung hòa (NT) hoặc CF, HI, ELISA Tách chiết thành phần HA bằng sucrose aceton và siêu âm

Nếu virut có phản ứng chéo phải chuẩn bị kháng thể đơn dòng để loại trừ

Lấy kháng nguyên HA thử nghiệm với KHT mẫu chuẩn

Thử nghiệm khuếch đại gen bằng

kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu

Nếu nghi ngờ virut Arbo mới cần

mở rộng định loại, phối hợp với các phòng Thí nghiệm chuẩn thức quốc tế để thực hiện định loại bằng kỹ thuật PCR và phân tích trình tự gen (sequencing)

Nếu không tìm thấy virut nhưng nghi ngờ thì phải phân lập lại từ đầu

nghiệm vì kỹ thuật đơn giản và không cần thiết bị [38] Do đó, giá thành để xét nghiệm rẻ hơn so với các kỹ thuật khác

- Kết hợp bổ thể (CF): Hầu như ít phòng thí nghiệm còn sử dụng vì phức tạp và độ tin cậy thấp

- Hấp phụ liên kết enzym (ELISA): gồm có GAC-ELISA để phát hiện kháng thể IgG

và MAC-ELISA để phát hiện IgM Là các kỹ thuật đang sử dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm trên thế giới [22, 43]

- Miễn dịch huỳnh quang (IF)[143]: với kháng nguyên chuẩn: Yêu cầu trước tiên kính hiển vi huỳnh quang, đây là một loại thiết bị đắt tiền và các sinh phẩm chuẩn thức quốc tế, do đó các tuyến dưới khó có thể áp dụng nếu không có kinh phí và không được đào tạo

- Miễn dịch phóng xạ (RIA): để phục vụ nghiên cứu ở các Viện Ở Bệnh viện lớn kỹ thuật này ít có giá trị trong chẩn đoán nên áp dụng hạn chế

6.2.5.2 Các phương pháp phát hiện virut: Để phục vụ nghiên cứu là chủ yếu

- Nhuộm âm bản soi hiển vi điện tử (cần phải có mẫu virut tinh khiết)

- Miễn dịch HVĐT (miễn dịch gắn vàng): là kỹ thuật rất đặc hiệu và chỉ những nước phát triển và các phòng thí nghiệm chuẩn thức mới thực hiện vì rất tốn kém Phòng thí nghiệm Hiển vi Điện tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã ứng dụng kỹ thuật này nhưng để nghiên cứu về virut VNNB thì các phương pháp trên đã đủ để xác định, chưa phải dùng kỹ thuật này trừ khi là một virut mới gây viêm não

- Miễn dịch điện di đối lưu, khuếch tán

- Miễn dịch huỳnh quang: dễ dàng phát hiện virut khi có kháng thể đơn dòng

- Sinh học phân tử: Bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho kết quả chính xác, có thể phát hiện một lượng virut rất nhỏ (100 hạt virut/ml bệnh phẩm) Ngày nay nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng kỹ thuật này để phát hiện nhanh virut, chỉ cần mồi đặc hiệu [37, 93, 107] Tuy nhiên, các thiết bị cho kỹ thuật này thường tốn kém, sinh phẩm đắt tiền cho nên không thể phổ biến cho tuyến cơ sở

loạn tinh thần, ngủ gà ngay ở giai đoạn đầu, lên cơn co giật Thể nặng dẫn đến hôn mê nhanh chóng và có thể không hồi phục Một số trường hợp tiến triển viêm não, màng não rất nhanh chỉ trong phút chốc Trong 50.000 ca được báo cáo mỗi năm thì 10.000 ca tử vong Số còn sống sót đều để lại di chứng thần kinh và tinh thần cần tiếp tục điều trị và chăm sóc Hầu hết di chứng để lại ở trẻ <10 tuổi [112, 159]

Kinh nghiệm cho thấy phụ nữ mang thai mắc viêm não rất hạn chế Tuy nhiên một nghiên cứu của Uttar Pradesh (Ấn Độ) đã xác định rằng nguy cơ sẩy thai ở 1-6 tháng mang thai nếu nhiễm virut viêm não thể nặng [46, 91] Vấn đề này còn được tiếp tục nghiên cứu mới có kết luận đầy đủ Một vài thể VNNB ở góc độ dịch tễ học cần phải tiếp tục nghiên cứu Ví dụ phân vùng địa lý, lưu hành virut giữa các vụ dịch, chu kỳ dịch bùng phát

Tính nghiêm trọng của bệnh thể hiện ở bệnh cảnh lâm sàng Thời kỳ ủ bệnh 5-16 ngày Sau đó, khởi bệnh ồ ạt bằng các triệu chứng sốt cao đột ngột, đau đầu, đau cơ, buồn nôn, nôn Tiếp đến là rối loạn ý thức xuất hiện các dấu hiệu như lú lẫn, mê sảng, hôn mê Rối loạn vận động như trương lực cơ tăng, chân tay co cứng, cứng gáy, cử động bất thường, có các cơn co giật Nặng hơn là liệt nửa người hoặc liệt toàn thân Bệnh để lại di chứng liệt vận động hoặc rối loạn tinh thần Bệnh VNNB thể hiện rất đa dạng: từ thể VNNB điển hình, viêm màng não nước trong đến những trường hợp nhẹ chỉ sốt, đau đầu

và phần nhiều là nhiễm virut nhưng không biểu hiện triệu chứng gọi là nhiễm thể ẩn với

tỷ lệ 200/1-300/1, có nghĩa là cứ 200-300 trường hợp nhiễm mới có mội trường hợp điển hình Hoặc theo TCYTTG tỷ lệ này giao động 200/1- 1000/1

Tiêu chuẩn để chẩn đoán bệnh VNNB

Cần phối hợp dịch tễ học, lâm sàng và xét nghiệm Dựa vào các tiêu chuẩn dưới đây để chẩn đoán bệnh VNNB:

- Dịch tễ học

Vùng có lưu hành các yếu tố dịch tễ học và gây bệnh VNNB như nuôi lợn gần nhà, muỗi Culex phát triển, mùa bệnh tháng 4-tháng 7 hàng năm Tuổi cảm nhiễm 1-15 tuổi, đặc biệt ở nhóm 1-4 tuổi

- Lâm sàng

+ Hội chứng màng não (cơ năng và thực thể) ;

+ Hội chứng viêm não cấp tính: sốt > 38oC, co giật liên tiếp hoặc liệt vận động, ngủ gà hoặc hôn mê

- Xét nghiệm lâm sàng

+ Dịch não tủy: Tế bào 10-100 bạch cầu/ml, chủ yếu là lympho bào; protein 1g/l ; glucoza và clo bình thương

0,5-+ Công thức máu: bạch cầu tăng cao, chủ yếu là bạch cầu trung tính

- Xét nghiệm huyết thanh

+ ELISA phát hiện kháng thể IgM (+), kháng nguyên đặc hiệu là Nakayama hoặc Beijing-1

+ HI và ELISA phát hiện kháng thể IgG Nếu lấy máu 2 lần cách nhau 1-2 tuần thì hiệu giá kháng thể máu 2 tăng gấp 4 lần so với máu 1 Nếu lấy máu đơn với HI phải đạt ≥ 1/640 và ELISA là ≥ 1/1600

- Xét nghiệm bệnh nhân đã tử vong

+ Phân lập và định loại virut VNNB: sinh thiết não vùng đồi thị và chất xám (phương pháp phân lập chuột ổ, trên tế bào C6/36)

+ Giải phẫu bệnh vi thể: hình ảnh tổn thương thường gặp nhất là viêm quanh mạch, các đám tế bào hoại tử rải rác chiếm ưu thế trong chất xám

8 Dịch tễ học bệnh VNNB

Hình 7: Sự lan truyền của virut VNNB kể từ lần đầu tiên được ghi nhận 1871 cho đến

năm 1998 đã đến Australia [ 163 ]

Virut VNNB lưu hành rộng rãi ở hầu hết các nước trong khu vực châu Á (hình 7), bao gồm: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Triều Tiên, Philippine, vùng viễn đông Nga, tất cả các nước Đông Nam Á và Ấn Độ Dần dần nó đã lan tràn đến các vùng khác không thuộc châu Á như vùng Torres của Australia [49, 141] Hàng năm, trong khu vực này có khoảng 50.000 trường hợp mắc và trong đó có khoảng 10.000 tử vong, số sống sót mang nhiều di chứng thần kinh nặng nề [164]

Bảng 1 : Phân bố bệnh VNNB ở một số nước theo vùng và mùa [ 171 ]

Bangladest

Ít số liệu, dự đoán lưu hành rộng

Tháng 7- tháng 12 (giống miền Bắc Ấn Độ)

Dịch rải rác một số huyện, không thông báo đầy đủ

Bhutan Không có số liệu Không có số liệu Không có số liệu

Brunei Dịch rải rác giống

tháng 8-12 ; ở Kanataka (đỉnh dịch tháng 2 tháng 4-6 ở Mandya) ; Andrha Pradesh : tháng 9-12 ; Bắc Ấn Độ : tháng 7-

12

Dịch bùng phát ở Bắc Bengal, Bihar Goa, Urbun (theo Lucknow)

Indonesia Kalimantan, Bali, Nusa,

Tenggara, Sulawesi, Mollucas, Tây Irian Jaya và Lombok

Nguy cơ quanh năm, tùy thuộc từng đảo

Đỉnh dịch kết hợp với mùa lúa canh tác, chăn nuôi lợn Dịch tháng 11-tháng 3 ;

Bệnh dịch ở người xảy ra ở Bali và Java ; chỉ 4 ca khách du lịch đến Bali

tháng 6- tháng 7 ở một số nơi

Nhật Bản Hiếm, một vài ca rải rác

ở tất cả các đảo trừ Hokkaido

Tháng 6 - tháng 9, Đảo Okinawa tháng 4 – tháng 10

Tiêm văcxin không thường xuyên, khuyến cáo du khách đến Tokyo và các thành phố có dịch phải tiêm văcxin

Hàn Quốc Bắc Triều Tiên không

có số liệu; Nam Triều Tiên dịch xảy ra rải rác

Tháng 7 - tháng 10 ; hầu hết ca dịch vào tháng 8 và tháng 9

Vụ dịch lớn xảy ra vào năm 1982-1983

Lào Lưu hành trong cả nước Có thể tháng 5 -

Myanma Lưu hành dịch cao

trong cả nước

tháng 5 - tháng 10 Dịch xảy ra ở Shan và

thung lũng ChangMai Nepal Dịch ở phía Nam

(Terai), thung lũng Kathmandu dịch vào những năm gần đây

tháng 7 - tháng 12 ; hầu hết các ca bệnh bùng phát ở tháng 8

và tháng 11

Không tiêm phòng thường xuyên, khuyến cáo khách

du lịch nên tiêm phòng trước khi đến vùng lưu hành dịch

Trung Quốc Tất cả các tỉnh ngoại trừ

Xizang, Xinziang, Quinghai Dịch thường xuyên ở phía Nam Trung Quốc

Pakistan Châu thổ miền trung Tháng 6 - tháng 1 Thông báo ca bệnh ở

Karachi, vùng lưu hành VNNB và West Nile virus Philippine Hầu như xảy ra ở tất cả

các đảo

Tháng 4 – tháng 11 ; đỉnh vào tháng 9 và tháng 1

Dịch được thông báo ở Nueva Ecija, Luzon và Manila

LB Nga Vùng Trung cận đông

maritime, Phía Nam của Khabarousk

Tháng 7 – tháng 9 Ca bệnh ghi nhận đầu tiên

Srilanka Dịch xảy ra ở tất cả các

vùng núi ở các tỉnh miền Bắc và miền Trung

Tháng 10 – tháng 1, đỉnh tháng 5 – tháng

6 (mùa truyền bệnh trong động vật chứa virut)

Những năm gần đây dịch xảy ra ở miền Trung và các tỉnh Tây Bắc

Đài Loan Có dịch rải rác Tháng 4 – tháng 10,

đỉnh tháng 6

Ca bệnh thông báo ở vùng Đài Bắc

Thái Lan Dịch thường xuyên ở

phí Bắc, phí Nam rải rác

số ca rải rác ở bờ biển phía Tây, của Cap York Penninsula, Australia và phía Tây của Papua New Guinea

Tháng 9 – tháng 1 (Thái Bình Dương)

và tháng 3 – tháng 4 (Torres Strait)

Chu kỳ truyền bệnh trong động vật không thể duy trì

ở các đảo, dịch có thể theo mùa và phụ thuộc vào virut phát triển

Bệnh VNNB thường do muỗi Culex đốt truyền vào ban đêm Tỷ lệ nhiễm ở muỗi

vào khoảng 1-3% [70] Loài muỗi này sống chủ yếu ở đồng ruộng lúa nước nhưng có thể

di chuyển vào vùng dân cư sinh sống gần đó Các ca bệnh thường là ở vùng ngoại ô thành phố [70, 175, 186] Các động vật hoang dã và động vật nuôi như Lợn, Chim là vật chủ chính cho virut VNNB phát triển, người là vật chủ cuối cùng và tồn tại trong thời gian ngắn với hiệu giá virut ở máu ngoại vi rất thấp [186] Hầu hết số nhiễm không có biểu hiện lâm sàng, tỷ lệ nhiễm trên thể ẩn vào khoảng 1/30-1/50 [186] Theo Bernard Field là 1/200-1/300 (tùy thuộc từng vùng lưu hành) Tuổi mắc tập trung ở trẻ <15 tuổi, ở người lớn tại các vùng lưu hành dịch đều có huyết thanh dương tính [70, 175] Tỷ lệ tử vong 10-25% tùy thuộc vào sự điều trị và chăm sóc Khoảng 30-55% số sống sót để lại di chứng thần kinh Virut có thể gây nhiễm bào thai gây ra sẩy thai trong thời kỳ mang thai

3 tháng đầu [175, 186]

Bệnh VNNB thường xảy ra quanh năm, nhưng dịch thường bắt đầu trong mùa mưa khi quần thể muỗi phát triển tối đa và nhiệt độ ở các khu vực này thích nghi cho nguồn bệnh [186] Thường là vào khoảng tháng 5 đến tháng 9 ở các nước bán nhiệt đới

và nhiệt đới phụ thuộc vào mật độ muỗi và động vật khuếch đại, lượng mưa, chim di cư

và canh tác nông nghiệp là các yếu tố quan trọng Tỷ lệ mắc giảm dần ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản nhưng lại tăng lên ở Bangladest, Myanmar, Ấn Độ, Nepal, Bắc Thái Lan và Việt Nam [186] Phòng bệnh bằng giám sát vectơ, động vật chứa virut, nằm màn chống muỗi đốt và tiêm văcxin cho người và động vật [175]

Hình 8: Số mắc VNNB đã thông báo ở một số nước trong vùng lưu hành dịch

hoặc nghi ngờ 1986-1990 [ 183 ]

Nguy cơ cho du khách đến vùng có dịch lưu hành với tỷ lệ 1/106 trong vòng 4 tuần, ngoài ra còn phụ thuộc vào mùa, vùng nguy cơ, thời gian lưu trú Nếu du khách vào vùng trong mùa dịch thì tỷ lệ này là 1/5000 [161, 168, 174, 175] Năm 1969, có ít nhất

10000 lính Mỹ đã bị nhiễm ở Việt Nam và 57 ca VNNB và 24 ca viêm não là các khách

du lịch ở phương Tây đến Việt Nam từ 1978-1992 [70, 175]

Theo Igarashi và cộng sự, chu kỳ truyền bệnh của virut VNNB trong tự nhiên

cũng được biết đến rất nhiều Vectơ chính là muỗi Culex tritaeniorhynchus hoặc một số

loài muỗi có liên quan Lợn và chim là động vật khuếch đại chủ yếu [9, 11, 13, 124] Như chúng ta biết virut VNNB tồn tại ở nhiều nước Đông Á, Đông Nam Á và Nam Á Hầu hết khí hậu những khu vực này là ôn hòa, mưa nhiều, gió mùa phù hợp với các cánh đồng ruộng lúa nước, đồng thời chăn nuôi lợn cũng phát triển ở các nước này Trên cơ sở về môi trường của các nước nông nghiệp này tạo điều kiện cho chu kỳ truyền bệnh trong thiên nhiên được dễ dàng Vectơ phát triển tỷ lệ thuận với các động vật khuếch đại và chu

kỳ truyền virut sang người cũng dễ dàng nên số mắc bệnh ngày càng tăng nếu không có văcxin dự phòng [14, 65]

- Miền Bắc Thái Lan có tỷ lệ mắc 25/105 dân số

- Việt Nam: lưu hành rộng rãi từ Bắc đến Nam, nhưng đặc biệt nghiêm trọng là ở vùng châu thổ Sông Hồng và Trung du, tỷ lệ mắc trung bình 5-6/105 dân

- Nhật Bản và Hàn Quốc đã dự phòng bằng văcxin từ lâu nên số mắc bệnh rất thấp Ở Nhật Bản chỉ có 10-20 trường hợp/năm

Bệnh VNNB trước tiên xuất hiện tại châu Á, chủ yếu là ở trẻ em dưới 15 tuổi Trong số nhiễm có 70% phát bệnh thể lâm sàng Số mắc bệnh hoặc chết hoặc để lại di chứng thần kinh suốt đời Từ ca bệnh được ghi nhận cuối thế kỷ 19, bệnh VNNB lan truyền do du khách từ vùng viễn nam như châu Úc và viễn Tây như Pakistan Đến nay bệnh VNNB chưa lan truyền đến châu Phi, châu Âu và châu Mỹ Văcxin VNNB được sử dụng từ năm 1941 nhưng rất hạn chế ở nhiều nước lưu hành bệnh 60 năm trước có khoảng 10 triệu trẻ em mắc VNNB, tử vong 3 triệu và di chứng thần kinh lâu dài > 4 triệu Việc giám sát bệnh VNNB còn nghèo nàn và hạn chế Không được tiêm văcxin đầy

đủ, thiếu sự hướng dẫn và hỗ trợ thường xuyên để tiêm chủng và ý thức về phòng chống bệnh VNNB còn chưa quán triệt đầy đủ

Tổ chức PATH đã đưa ra một dự án nhằm mục đích:

- Cải thiện việc giám sát bệnh VNNB

- Phát triển nhanh văcxin VNNB thích hợp

- Đưa văcxin VNNB đến nơi cần nhất

- Đẩy mạnh đầu tư tiêm chủng VNNB

Đây cũng là một chủ trương đúng đắn nhằm ngăn chặn sự lan truyền bệnh VNNB

9 Sinh thái bệnh VNNB

9.1 Diễn biến dịch VNNB trong mối quan hệ ổ chứa, vectơ và người

Virut VNNB được truyền qua người do muỗi đốt, các động vật mang virut và truyền sang cho người Như vậy, người được cho là vật chủ cuối cùng của virut VNNB [18, 188]

Ở người, virut VNNB tồn tại trong một thời gian rất ngắn ở máu ngoại biên và hiệu giá rất thấp, do đó virut không thể truyền trực tiếp từ người sang người Mặt khác, muỗi thích hút máu động vật hơn máu người [21]

Theo nghiên cứu tại đảo Honshu (Nhật Bản) năm 1964 cho thấy: Lợn bị nhiễm virut huyết 4 ngày, sau đó muỗi đốt truyền bệnh Có 20% lợn bị nhiễm virut VNNB vào đầu tháng 7 Sau khi hút máu lợn có chứa virut VNNB, virut nhân lên ở muỗi sau 14 ngày của chu kỳ ủ bệnh và chính những con muỗi này lại tiếp tục truyền virut viêm não đợt 2 cho lợn cảm nhiễm khác và như vậy 100% số lợn có kháng thể Số lợn nhiễm virut

và số muỗi nhiễm virut luôn luôn tỷ lệ thuận với nhau Từ đó muỗi truyền virut qua cho người một cách dễ dàng Tuy nhiên, người sống trong vùng lưu hành dịch có miễn dịch

do các liều virut truyền từ muỗi sang chưa đủ gây bệnh do vậy tỷ lệ mắc bệnh VNNB thể lâm sàng so với thể ẩn là 1/200-1/300

Hình 9 : Chu kỳ truyền bệnh VNNB [ 183 ]

Theo Maeda và cộng sự 1978, đã chứng minh rằng: phân lập được virut từ muỗi sau 17-20 ngày thì dịch viêm não xảy ra nếu không có biện pháp phòng chống [153]

Igarashi 1994, đã nghiên cứu cho thấy virut VNNB tồn tại trong thiên nhiên bởi sự

phát triển kế tiếp nhau của virut trong vật chủ và vectơ, quan trọng nhất là Culex tritaeniorhynchus và một số loài muỗi khác sống ở đồng ruộng lúa nước, chỉ cần một

mảnh ruộng lúa nước trong vòng 1 ngày có thể sản sinh ra 30.000 con muỗi trưởng thành

Muỗi hoặc động vật

tái nhiễm Khuếch đại nhân lên của virut

Chu kỳ truyền virut trong động vật, ổ chứa thiên nhiên

Người và động vật nhiễm cuối cùng của chu

kỳ

[190] Lợn là vật chủ mà muỗi ưa hút máu nhất Lợn bị nhiễm virut huyết nhưng không biểu hiện các triệu chứng lâm sàng nhưng có thể gây ra thai chết lưu hoặc sẩy thai [28]

Igarashi còn nghiên cứu, mặc dù bò rất ít cảm nhiễm với virut VNNB nhưng cũng

là vật chủ thu hút vectơ, do đó không loại trừ được sự lây truyền virut [124]

Ngoài lợn ra, một số loài chim như diệc đen, cò trắng, liếu điếu được coi là ổ chứa quan trọng trong thiên nhiên [183]

Ngựa nhiễm virut viêm não có thể hiện các triệu chứng lâm sàng và tỷ lệ tử vong cao như ở Trung Quốc và đã gây thiệt hại lớn về kinh tế qua các vụ dịch viêm não ở ngựa Tuy nhiên, ngựa không có vai trò quan trọng trong việc lây truyền virut viêm não như lợn và chim

9.2 Ổ chứa virut VNNB trong thiên nhiên

Nhiều nghiên cứu về động vật cảm nhiễm cho thấy trong máu lợn, ngựa và chim

có hiệu giá kháng thể kháng virut VNNB cao Còn trâu, bò, dê, khỉ và chó có hiệu giá kháng thể thấp Lợn và chim là những vật chủ quan trọng nhất để dự trữ, nhân lên và lây truyền bệnh VNNB [27] Còn loài gặm nhấm được chứng minh là vật chủ không quan trọng

Lợn là ổ chứa virut quan trọng để truyền cho muỗi vì:

- Chỉ số lợn bị nhiễm virut viêm não trong thiên nhiên cao nhất

- Virut VNNB nhân lên ở máu ngoại vi của lợn rất nhanh và rất cao nên khi muỗi hút máu lợn là có thể lây truyền virut một cách dễ dàng

- Thời gian nhiễm virut huyết ở lợn kéo dài 2-4 ngày có điều kiện cho muỗi hút máu nhiều lần

- Sự lây truyền virut từ lợn qua lợn bằng đường muỗi Culex tritaeniorhynchus đốt đã

được chứng minh trong phòng thí nghiệm

- Muỗi Culex tritaeniorhynchus rất ưa hút máu lợn

- Một số lượng lớn quần thể lợn cảm nhiễm mới từ 6 đến 8 tháng tuổi được thay thế hàng năm cho lò mổ, do vậy ổ chứa này không tiêm phòng sẽ là nguồn mang bệnh để muỗi dễ dàng truyền bệnh sang cho người và động vật khác

Chu trình truyền bệnh VNNB chim-muỗi-chim cũng được coi là quan trọng trong môi trường sống Ở Ấn Độ đã thử nghiệm giám sát 514 loài chim và kết quả cho thấy 34,8% có kháng thể kháng virut VNNB, 25% điệc đen và cò trắng truyền kháng thể từ

mẹ sang con và kháng thể tồn tại ở con được 3-5 tuần

9.3 Vectơ truyền bệnh [ 24, 95, 108, 123 ]

Những yếu tố quan trọng để vectơ truyền bệnh :

- Vectơ truyền bệnh là muỗi cái Sau khi hút máu động vật nhiễm, virut nhân lên ở muỗi cái rất nhanh và có thể truyền virut qua thế hệ ấu trùng muỗi

- Muốn truyền được virut qua một vật chủ khác thì virut phải có mặt ở tuyến nước bọt của muỗi để truyền theo nốt đốt và gây nhiễm cho động vật cảm nhiễm

- Mật độ vectơ càng cao thì khả năng truyền bệnh càng dễ dàng nhưng vectơ này phải

có mặt ở quần thể động vật cảm nhiễm

- Nhiều nghiên cứu cho thấy muỗi Culex tritaeniorhynchus là vectơ chính để truyền

bệnh Trong 17 loài muỗi phát triển ở đồng ruộng có 2 loài phát triển quanh năm và

khả năng truyền bệnh cao nhất đó là C tritaeniorhynchus và C vishnui [19, 23, 95,

155] Mặc dù vậy 2 loài muỗi này thích hút máu lợn và chim non hơn là máu người 2 loài muỗi này bay xa 1,5km, chúng có thể sống cách mặt đất 13-15m, trên các ngọn cây cao để hút máu các loài chim

- Các loài muỗi khác: C anulus, C quinquefasciatus và Armigeres subalbatus cũng truyền virut VNNB qua trứng như C tritaeniorhynchus nhưng virut nhân lên ở các

loài muỗi này với hiệu giá rất thấp do vậy khả năng truyền bệnh kém hơn và cơ hội phân lập được virut ở chúng cũng rất hạn chế

9.4 Virut VNNB tồn tại và nhân lên ở muỗi trong điều kiện khí hậu lạnh

Chúng ta biết là khí hậu nhiệt đới là điều kiện tốt nhất cho muỗi phát triển và cũng

là nhiệt độ thích hợp cho virut tồn tại và nhân lên ở muỗi Vậy ở các nước ôn đới và á nhiệt đới thì virut sống qua đông giá như thế nào? người ta chứng minh rằng virut vẫn tồn tại ở cơ thể muỗi ngủ đông ở ngay trong trứng muỗi, trong cơ thể bò sát hoặc trong các loài chim di cư đi trốn đông đến xứ ấm áp

Ở Hàn Quốc người ta đã thu thập và nghiên cứu trên 50000 con muỗi trong mùa đông liên tiếp trong 6 năm và đã phát hiện được 2 chủng virut VNNB (1 chủng vào tháng

12 và 1 chủng vào tháng 2) Virut cũng phân lập được vào tháng 6 Những nghiên cứu này đã chứng tỏ muỗi truyền virut qua trứng là khả năng sinh tồn của virut VNNB giữa các vụ dịch Hay nói một cách khác sự duy trì của muỗi qua thời kỳ giá lạnh trong cơ thể muỗi gọi là virut sống qua đông [158]

9.5 Vai trò của loài bò sát trong việc duy trì virut VNNB

Năm 1965-1970 Hàn Quốc đã nghiên cứu trên 2000 con rắn đã chứng minh 40%

có kháng thể kháng virut VNNB (bằng kỹ thuật HI) Đã phân lập được 2 chủng virut từ

747 con rắn (1 chủng tháng 1 và 1 chủng tháng 10) Điều này cho thấy điều kiện ngủ đông nhân tạo của virut VNNB có thể được hồi phục từ các loài rắn, ếch, nhái sau 6 tháng mùa đông ở Hàn Quốc [158]

9.6 Bệnh VNNB phân bố theo mùa

Những nước thuộc khí hậu nhiệt đới có lưu hành VNNB thì bệnh xảy ra quanh năm Nhưng dịch VNNB thường bắt đầu vào mùa mưa, đó là thời điểm muỗi phát triển tối đa Tại Tamil Nadu ở Ấn Độ đã chứng minh: Tiếp theo lượng mưa tăng thì mật độ muỗi tăng và sự biến động có chiều hướng tăng lên của kháng thể trong máu lợn ở các trại chăn nuôi và cuối cùng bệnh VNNB xuất hiện ở người Tại bang Karnataka Ấn Độ mỗi năm có 2 mùa dịch vào tháng 4 đến tháng 7 và từ tháng 9 đến tháng 12 [30, 42]

Ở Thái Lan: mùa nóng, khô thì hiệu giá kháng thể trong lợn rất thấp nhưng chỉ vài tuần sau mưa đầu tiên quần thể lợn đã bị nhiễm virut [126]

Ở Việt Nam: Một nghiên cứu của Vũ Sinh Nam và cộng sự tại Đông Anh, Hà Nội

cho thấy: Mật độ muỗi C tritaeniorhynchus cao và tháng 4 đến tháng 9 và rất thấp ở các

tháng còn lại Hai đỉnh mật độ muỗi tăng lên rõ rệt là tháng 4 và tháng 8 Trong khi đó đỉnh của lượng mưa lại là tháng 6 Do đó mật độ muỗi không phụ thuộc trực tiếp vào lượng mưa mà có liên quan đến 2 vụ lúa nước trong tháng 5-6 và tháng 11-12 Đỉnh cao

thứ 2 của mật độ C tritaeniorhynchus là tháng 8 nhưng hiệu giá kháng thể lợn giảm xuống và nhiệt độ từ tháng 10 đến tháng 3 không đủ cao để C tritaeniorhynchus hoạt

động và phát triển Trong khi đó bệnh VNNB đỉnh cao ở tháng 5, tháng 6 hoặc tháng 7 tùy thời tiết hàng năm

Tác nhân gây bệnh VNNB cho đến nay đã dễ dàng xác định Trước hết là bằng kỹ thuật MAC-ELISA để phát hiện kháng thể IgM Đây là một kỹ thuật chẩn đoán sớm (3 ngày sau phát bệnh) và rất nhanh, chỉ sau vài giờ là có kết quả Đặc biệt là rất đặc hiệu vì IgM chỉ xuất hiện trong giai đoạn cấp nên không thể nhầm với các flavivirus (như sốt xuất huyết Dengue) [8, 11, 22, 26, 33]

Nhưng hiện nay chẩn đoán sàng lọc của lâm sàng còn rất hạn chế Tất cả các bệnh nhân có các triệu chứng giống hội chứng não cấp (HCNC) đều cho là VNNB

Ở Việt Nam chưa có thống kê chính xác về tỷ lệ VNNB trong tổng số bệnh nhân mắc HCNC do virut nói chung Tuy nhiên, sau hơn 10 năm sử dụng văcxin VNNB của Việt Nam cho thấy tỷ lệ VNNB trong tổng số viêm não do virut đã giảm đi từ 70-75% đến nay chỉ còn 25-30% [4, 5, 6, 7, 9]

Một số nước như Nhật Bản, Hàn Quốc thì 100% số ca bệnh đều được xác định căn nguyên vì số mắc rất ít < 50 ca/năm Ở Việt Nam số mắc HCNC từ 1500-2500 ca/năm, số được chẩn đoán chỉ có khoảng 10% [2, 6, 10, 12]

9.7 Sự phân bố bệnh VNNB theo tuổi

Tuổi mắc bệnh còn tùy thuộc vào từng vùng khác nhau [99] Nhưng nhìn chung nhóm tuổi có tỷ lệ mắc cao nhất là 1-3 tuổi, là nhóm tuổi vừa mất kháng thể mẹ truyền Nhưng theo giám sát dịch tễ học và đã thống kê thì tỷ lệ mắc cao ở trẻ 3-6 tuổi [5, 72, 85,

99] Đặc điểm của nhóm trẻ này là rất hiếu động, vào lúc chập tối thường đùa nghịch ở

quanh nhà, gần chuồng gia súc và cũng là lúc muỗi C tritaeniorhynchus hoạt động, trẻ

bị muỗi đốt và truyền bệnh Tỷ lệ mắc bệnh giảm ở trẻ trên 14 tuổi cùng với sự tăng hiệu giá kháng thể trung hòa ở nhóm tuổi này Điều này cũng chứng minh rằng tại nơi lưu hành bệnh, trong suốt thời kỳ niên thiếu, trẻ có nhiều cơ hội bị phơi nhiễm với virut VNNB và có thể đã mắc bệnh VNNB không điển hình hoặc nhiễm thể ẩn và tạo được miễn dịch cho các em

Ở một số vùng như miền Bắc Ấn Độ, Nepal và Srilanca thì tất cả mọi lứa tuổi đều cảm nhiễm với VNNB Khách du lịch ở vùng không có lưu hành dịch đến nơi có dịch rất

dễ mắc bệnh nếu có đủ các yếu tố truyền bệnh

Ở Việt Nam, giám sát dịch tễ học từ năm 1985 đến 1998 ở miền Bắc Việt Nam số

ca bệnh VNNB thể lâm sàng đều ở trẻ dưới 15 tuổi [3, 9] Tỷ lệ mắc ở trẻ em trên 15 tuổi không đáng kể, nhóm tuổi có tỷ lệ mắc cao nhất là 1-4 tuổi chiếm 36,9%, 5-9 tuổi chiếm 34,6%, trẻ dưới 1 tuổi là 3,9% Một nghiên cứu khác của Viện VSDTTƯ trên 793 bệnh nhân VNNB thể lâm sàng thuộc 12 tỉnh phía Bắc từ 1989-1991 cho thấy 401/793 có kháng thể IgM kháng virut VNNB dương tính (50,57%) Trong số 401 ca thì 381 ca là trẻ

em dưới 15 tuổi chiếm 95% Nếu tính số trẻ em dưới 10 tuổi tỷ lệ này là 85,5% [6] Dựa vào kết quả trên ta thấy ở miền Bắc Việt Nam số trẻ có nguy cơ mắc tập trung ở lứa tuổi dưới 15 tuổi Trong đó trẻ cảm nhiễm cao với virut VNNB là 1-10 tuổi Như vậy, nhóm tuổi cần thiết tiêm phòng văcxin VNNB trước hết là 1-10 tuổi ở những nơi có lưu hành dịch [6]

9.8 Sự phân bố VNNB theo vùng địa lý

Những nước đã được thông báo có dịch VNNB là Ấn Độ, Nepal, Srilanca, Malysia, Singapore, Philipppine, Indonesia, Trung Quốc, vùng viễn đông Liên Xô cũ,

Hàn Quốc và Nhật Bản Nói chung chỉ có một số ít ca bệnh được chẩn đoán lâm sàng bằng huyết thanh học còn hầu hết các trường hợp đều dựa trên lâm sàng

Bangladesh : 1977 lần đầu tiên VNNB được thông báo, là nước có điều kiện sinh

thái và dịch tễ học để virut VNNB phát triển

Trung Quốc : hàng năm có khoảng 10000 người mắc, phân bố ở hầu hết các tỉnh,

trừ 2 tỉnh phía Tây Trung Quốc Lần đầu tiên ở Trung Quốc phân lập được virut VNNB

là 1941 Dịch VNNB bùng nổ ở Bắc Kinh năm 1982-1983 Vectơ chính là C tritaeoniorhynchus Trung Quốc đang sử dụng văcxin trên tế bào nuôi để tiêm phòng

đồng loạt cho trẻ em Trung Quốc, do đó tỷ lệ mắc hàng năm có giảm [67, 188]

Ấn Độ : Thường xuyên có dịch VNNB xảy ra ở nhiều vùng khác nhau với các thể

lâm sàng khác nhau [46, 91, 159] Lần đầu tiên phát hiện ra VNNB năm 1955 có 63 ca Năm 1973 tại tỉnh Bengal xuất hiện 763 trường hợp trong đó có 325 trường hợp tử vong (42,6%), năm 1976 vụ dịch 307 ca trong đó 126 tử vong (34,05%) ; 1978 dịch bùng phát

có 1256 trường hợp trong đó 544 ca tử vong (43,3%) kết quả chẩn đoán huyết thanh học dương tính 64-69% Sau đó Ấn Độ sản xuất được văcxin tiêm phòng và tỷ lệ mắc đã giảm xuống đáng kể Từ năm 1997 Bộ Y tế Ấn Độ quyết định dừng sản xuất văcxin VNNB và bệnh lại có xu hướng tăng trở lại [146] Từ tháng 7 đến tháng 10 năm 2005, đã xảy ra một vụ dịch VNNB tại bang Uttar Pradesh (Ấn Độ) có 4679 ca mắc và 1016 ca đã

tử vong (21,7%) và miền Tây của Nepal có 1879 ca mắc trong số đó có 298 đã tử vong (15,8%) [129]

Indonesia : Không có thông báo dịch VNNB, hàng năm có 1000-2500 ca Từ năm

1991 đã có thông báo ở một số bệnh nhân hội chứng não cấp và chẩn đoán huyết thanh học cho thấy 24% dương tính Đã phân lập được virut từ người, lợn, muỗi Các vùng khác nhau ở Indonesia cũng có tỷ lệ người lành mang kháng thể VNNB khác nhau như Lombok 14%, Bali 52%, Borneo 25% [33]

Nhật Bản : Là nước đầu tiên phát hiện và nghiên cứu bệnh VNNB Số mắc trước

đây rất cao, mỗi đảo có hàng 1000 ca/năm Cuối thập kỷ 60 của thế kỷ trước đã bắt đầu

sử dụng văcxin và các vụ dịch giảm dần Ngoài tiêm phòng văcxin cho người, Nhật Bản còn thay đổi phương thức canh tác và chăn nuôi lợn, tăng cường dùng hóa chất để diệt côn trùng Đến nay các trường hợp VNNB chỉ còn xuất hiện rải rác với số lượng không quá 10 ca/năm

Hàn Quốc : Một vụ dịch lớn đã được thông báo năm 1949, với số mắc 5548 ca và

trong số này đã có 2429 ca tử vong (43,78%) Hàn Quốc là nước sản xuất được văcxin và tiêm phòng tích cực từ năm 1971 Tỷ lệ mắc giảm dần và ngày nay chỉ còn vài chục ca mắc mỗi năm [37]

Malaysia : Dịch xảy ra hàng năm, chẩn đoán huyết thanh học có 20-60% dương

tính 80% số mắc là trẻ em dưới 15 tuổi Phân lập được virut từ C tritaeniorhynchus và

C gelidus Miền Tây Malaysia và Sarawak thường có dịch viêm não rải rác quanh năm

[124]

Myanmar : Lần đầu tiên đã phát hiện được VNNB vào 7/1974, ở vùng biên giới

với Thái Lan (tại 1 huyện có 5 ca mắc trong đó có 4 ca tử vong và 1975: 42 ca mắc trong

đó có 32 ca tử vong), giám sát vectơ phát hiện thấy C tritaeniorhynchus Huyết thanh

lợn dương tính 81,5% và người lành có kháng thể kháng virut VNNB là 42%

Đài Loan : Số mắc cao ở trẻ 2-4 tuổi Đã phân lập virut để xác định căn nguyên

Là nước sản xuất được văcxin và dự phòng bệnh sớm từ năm 1968 nên hiện tại số mắc rất ít ở những người không tiêm phòng

Thái Lan : Là nước tích cực giám sát VNNB Nhìn chung ở Thái Lan có 10-20%

người lành mang kháng thể Riêng ở tỉnh Chang Mai gần 100% người lành mang kháng thể 10 năm trở lại đâymỗi năm có khoảng 1500-2500 ca thể lâm sàng Một số nơi trước đây không có bệnh viêm não thì nay lại xuất hiện Dịch thường xảy ra từ tháng 5 đến tháng 9, đỉnh là tháng 7 Bệnh xảy ra ở phía Bắc nhiều hơn 66% ở trẻ em dưới 15 tuổi

Véctơ truyền bệnh là C tritaeniorhynchus , C gelidus, C fuseocephala Lợn và trâu bò

là ổ chứa Giữa miền Bắc và Nam Thái Lan có những đặc điểm dịch tễ học giống nhau về quần thể dân cư, trồng lúa nước, mật độ lợn, lượng mưa, nhiệt độ Nhưng miền Bắc tỷ lệ mắc cao hơn Thái Lan đã nghiên cứu và giải thích có thể là :

+ Chủng virut VNNB ở miền Nam tính độc lực đối với người thấp hơn

+ Miền Nam Thái Lan sốt xuất huyết Dengue lưu hành rộng rãi, có lẽ vậy mà miễn dịch chéo với Dengue vì cùng nhóm Flavivirus

Về mặt virut học: các chủng virut viêm não phân lập ở miền Nam Thái Lan,

Malaysia và Singapore có cấu trúc gen khác với các chủng phân lập được ở miền Bắc Thái Lan Có thể có mối liên quan về vùng địa lý, loại hình gen của những chủng virut VNNB lưu hành Một nghiên cứu khác ở 995 trẻ em ở tuổi đến trường ở miền Nam Thái Lan thì chỉ có 21% trẻ có mang kháng thể Trong khi đó ở miền Bắc Thái Lan gần 80% trẻ em 10-14 tuổi có mang kháng thể Theo dõi từ 1977-1983 ở Thái Lan cho thấy tỷ lệ mắc ở miền Nam là 2,09/100.000 dân ở miền Bắc là 9,02/100.000 dân Thái Lan đã xản xuất được văcxin VNNB và đang đưa vào chương trình TCMR quốc gia và tỷ lệ mắc hàng năm đã giảm xuống đáng kể [33, 34, 122]

10 Các biện pháp phòng chống bệnh viêm não Nhật Bản

10.1 Phòng chống vectơ

Ngày nay việc sử dụng nhiều hóa chất để diệt muỗi đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu Hãng Sumitomo chemical ở Nhật Bản đã nghiên cứu màn olyset để đuổi muỗi và diệt muỗi mà không độc cho người đó là chất permethrin đang được sử dụng rỗng rãi ở các nước có mật độ muỗi cao [158, 164, 174]

- Hàn Quốc phun feritrothion giảm 80% C tritaeniorhynchus trưởng thành

- Các hóa chất diệt ấu trùng : CNP (P-nitro-phenyl 2,4,6 trichlophenyl-P, Nitrophenyl ether, dichlorophenyl-P, nitrophenyl ether Nhưng việc sử dụng hóa chất cũng còn hạn chế do:

+ Phạm vi phun thuốc quanh nhà và chồng gia súc, còn muỗi C tritaeniorhynchus

bay xa và ở cao nên không thể diệt hết

+ Phun hóa chất trên ruộng lúa để diệt ấy trùng chỉ có tác dụng 1-2 tuần cho nên rất tốn kém

+ Các hóa chất có gốc lân hữu cơ và carbamate đã bị vectơ kháng thuốc

- Thái Lan đã sử dụng nhiều hóa chất phun diệt muỗi đều không có hiệu quả lâu dài và rất tốn kém

- Dùng bẫy đèn hoặc bẫy siêu âm để gần chuồng gia súc cũng góp phần trừ muỗi culex

- Theo Igarashi nhận xét: Phải chấp nhận phương pháp phun hóa chất rộng rãi để diệt côn trùng trên đồng ruộng cũng đã làm giảm mật độ muỗi ở Nhật Bản nhưng là diệt côn trùng nói chung chứ không phải là diệt véc tơ truyền bệnh VNNB

- Ở Việt Nam, là nước 90% nông nghiệp do đó đã có ruộng lúa nước thì có vectơ truyền viêm não, theo như phân tích trên thì việc diệt vectơ bằng hóa chất là hoàn toàn không thực tế và không có hiệu quả với điều kiện kinh tế nước ta hiện nay

10.2 Văcxin phòng bệnh

Sau khi phân lập được virut VNNB năm 1935 nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu văcxin phòng bệnh cho động vật và cho người Họ nhận thấy rằng, số súc vật còn sống sót sau khi phải trải qua những vụ dịch lớn như dịch viêm não ở ngựa miền Tây nước Nga Điều đó có nghĩa là có thể chúng có đủ miễn dịch để thử thách với các virut hoang dại Văcxin virut sống giảm độc lực, văcxin bất hoạt đã sớm ra đời để tiêm phòng cho lợn, ngựa Các văcxin này độ an toàn và công hiệu đủ dùng cho súc vật Đặc biệt ở Trung Quốc, đã gây miễn dịch tích cực ở các trại chăn nuôi lợn và đã góp phần giảm tỷ lệ mắc bệnh ở các vùng có lưu hành VNNB [16, 78, 173, 177, 178]

11 Những nghiên cứu về văcxin dự phòng bệnh VNNB

11.1 Sự ra đời và phát triển của văcxin viêm não

Mitamura và cộng sự (1936), Takanouchi và cộng sự (1938) đã nghiên cứu văcxin VNNB từ chuột được gây nhiễm virut VNNB và bất hoạt bằng formalin Sau đó Takaki

và Takanouchi thử công hiệu của văcxin này Kết quả đã phát hiện kháng thể trung hòa ở chuột sau khi tiêm văcxin Những nghiên cứu tiếp của Mitamura trên thực địa lâm sàng trên người và nhận xét có đáp ứng miễn dịch ở vùng không lưu hành dịch và đáp ứng miễn dịch kém hơn ở vùng lưu hành dịch [90, 111]

Năm 1944, tác giả Ku thông báo về văcxin bất hoạt thử trên ngựa đáp ứng kháng thể tốt, hiệu giá kháng thể trung hòa cao

Năm 1946-1949, hợp tác nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ và Nhật về công hiệu của văcxin VNNB do Nhật Bản sản xuất Họ đã chọn vùng có lưu hành dịch là Okayama để thử nghiệm Kết quả thống kê cho thất tỷ lệ mắc giảm 1/3 đến 1/4 Tại thời điểm này công nghệ sản xuất văcxin VNNB là một loại văcxin thô từ não chuột sau khi gây nhiễm, nghiền đồng nhất thành hỗn dịch sau đó bất hoạt bằng formalin Văcxin này gây ra nhiều phản ứng phụ đáng kể và gây viêm não dị ứng sau khi tiêm văcxin vì protein của não chuột chưa được loại bỏ

Năm 1954, những tiến bộ trong khoa học sinh học ngày càng phát triển, yêu cầu chất lượng cho các loại văcxin trong đó có văcxin VNNB cao hơn Các nhà khoa học Nhật Bản nghiên cứu tìm cách loại bỏ bớt protein của não chuột, chính là chất gây ra các phản ứng phụ viêm não dị ứng Bộ Y tế Nhật Bản đã thiết lập hệ thống kiểm định văcxin Văcxin VNNB được đưa ra thử nghiệm thực địa tại 4 vùng có lưu hành dịch: Tokyo, Toyama, Shiga, Osaka và 2 vùng không có lưu hành dịch Saporo và Kitami để đánh giá đáp ứng miễn dịch và phản ứng phụ Văcxin có đáp ứng miễn dịch nhưng tỷ lệ phản ứng phụ cao làm cho các nhà nghiên cứu rất quan tâm đến hàm lượng protein trong văcxin [111, 113]

Năm 1957, công nghệ sản xuất và chất lượng văcxin đã được cải thiện một bước, hàm lượng protein trong văcxin được qui định là 0,2mg/ml Với các tiêu chuẩn này văcxin VNNB vẫn chưa đạt độ tinh khiết vì vậy nhiều trường hợp phản ứng phụ nghiêm trọng đã xảy ra

Năm 1962 tại Nhật Bản có 2 nhóm nghiên cứu về văcxin VNNB đó là “Biken” ở Osaka và Nisseiken ở Tokyo Họ đã nghiên cứu tinh chế văcxin bằng siêu ly tâm để loại

bỏ protein tạp và đã giảm được hàm lượng protein trong văcxin xuống 10 lần (từ 0,2mg/ml xuống 0,02mg/ml)

Năm 1965, Nhật Bản lại tiếp tục nghiên cứu nhằm giảm tối đa hàm lượng protein trong văcxin điều chế từ não chuột Trước hết loại bỏ lipoprotein bằng protaminsulfate Bất hoạt bằng formalin và cuối cùng tinh chế bằng siêu ly tâm Từ đó chất lượng văcxin VNNB được cải thiện về tính an toàn cũng như công hiệu Dựa vào những nghiên cứu này tác giả Takaku đã hoàn thiện qui trình sản xuất văcxin VNNB bằng phương pháp hóa, lý Đạt độ tinh khiết rất cao 10-25µg/ml Và các phản ứng phụ không đáng kể, chúng chỉ xảy ra ở một số cơ thể quá mẫn Văcxin này có hiệu quả bảo vệ cao và rất an toàn khi tiêm cho trẻ em

Từ năm 1959 đến 1981, một trường phái khác ở Trung Quốc đã nghiên cứu sản xuất văcxin sống giảm độc lực từ chủng virut độc lực Bằng cách cấy truyền 110 lần trên

tế bào phôi gà sau đó tiếp tục cấy truyền trên tế bào thận chuột đất 100 lần nhưng vẫn còn yếu tố gây độc tế bào thần kinh Chủng virut này tiếp tục được lựa chọn bằng phương pháp tạo đám hoại tử và có được chủng 12.1.7 [192]

Năm 1973, Yu và cộng sự sử dụng chủng 2.8 cũng bắt nguồn từ chủng 12.1.7 và tiếp tục giảm độc lực bằng tia cực tím

Năm 1974, Chen và Wang chọn lọc chủng virut thuần khiết về di truyền bằng kỹ thuật tạo đám hoại tử để có được một chủng cho sản xuất văcxin Sau đó đã sản xuất thử nghiệm và đánh giá thực địa trên 8000 trẻ em sống ở vùng không có lưu hành dịch Kết quả cho thấy 50% có đáp ứng kháng thể

Năm 1981, Yu và cộng sự lại tiếp tục chuyển chủng này bằng đường tiêm dưới da cho chuột sơ sinh và đã đạt được 1 chủng giảm độc lực cao đó là chủng 12.4 Sau đó tác giả tiếp tục lựa chọn, thuần khiết để cuối cùng có được 1 chủng nhân lên mạnh hơn và tính miễn dịch mạnh hơn trên tế bào so với chủng ban đầu [183, 192]

Song song với việc nghiên cứu văcxin sống giảm độc lực, Li và cộng sự đã nghiên cứu văcxin bất hoạt từ tế bào nuôi, loại văcxin này an toàn nhưng khả năng bảo vệ thấp

Từ 1968, qui trình công nghệ sản xuất văcxin từ não chuột của Takaku là công nghệ được coi là công nghệ tiên tiến nhất Thử nghiệm thực địa được tiến hành ở nhiều nơi Riêng Thái Lan đánh giá rộng rãi trên trẻ em và có đáp ứng kháng thể 91% Văcxin này được tiêm phòng trong các quần thể dân cư ở một số nơi như Nhật Bản, Đài Loan, Trung Quốc và Thái Lan và đạt hiệu quả cao đặc biệt không có các phản ứng phụ đáng kể cũng như không có trường hợp nào viêm não dị ứng sau khi tiêm văcxin

Năm 1971, Viện BIKEN được chỉ đạo của Giáo sư Fukai (nguyên Chủ tịch Hiệp Hội nghiên cứu Văcxin và Sinh phẩm của Nhật Bản) đã nghiên cứu tinh chế văcxin để đạt độ tinh khiết với hàm lượng protein ≤80µg/ml Đây cũng là hàm lượng tiêu chuẩn của

protein cho phép trong văcxin VNNB sản xuất từ não chuột theo phương pháp hóa lý của Takaku Cho đến nay phương pháp tinh chế này vẫn là tiên tiến nhất được TCYTTG công nhận Còn văcxin thế hệ 2 bằng phương pháp công nghệ gen cho đến nay có rất nhiều tác giả nghiên cứu nhưng cũng chỉ dừng lại ở mức nghiên cứu thử nghiệm [63]

11.2 Những nước đã ứng dụng qui trình công nghệ sản xuất văcxin từ não chuột (chủng sản xuất là Nakayama và Beijing- 1)

- Nhật Bản: có 7 hãng sản xuất với tổng số 11 triệu liều/năm (Biken, Chiba, Denka, Katetsu-ken, Kitasato, Saika-ken và Takeda) Riêng Biken hàng năm sản xuất 2 triệu liều xuất khẩu Đây là hãng sản xuất văcxin nổi tiếng trên thế giới về chất lượng, khả năng bảo vệ cao và rất an toàn

- Ấn Độ: Viện nghiên cứu Trung ương (Central research Institute), nhưng đã dừng sản xuất từ năm 1998

- Hàn Quốc: Hãng Korea Green Cross Corporation (KGCC)

- Đài Loan: Viện nghiên cứu Quốc gia về Y học dự phòng (National Institute of Preventive Medicine)

- Thái Lan: Tổ chức Dược chính phủ (GPO)

- Việt Nam: VABIOTECH No1- Viện VSDTTƯ (NIHE) Việt Nam tiếp nhận công nghệ sản xuất văcxin VNNB từ năm 1989 của Viện Biken, thuộc Trường Đại học Osaka-Nhật Bản

11.3 Những nghiên cứu sản xuất văcxin trên tế bào nuôi

Trung Quốc là nước đầu tiên nghiên cứu sản xuất văcxin trên tế bào, hiện nay Nhật Bản cũng đã nghiên cứu thành công công nghệ này

Sau nhiều năm nghiên cứu, các tác giả Yu và Lee của Trung Quốc đã tạo được một chủng VNNB giảm độc lực SA 14-14-2, chủng này nhân lên tốt trên tế bào thận chuột đất vàng tiên phát (PHK) SA 14-14-2 được dùng để sản xuất văcxin VNNB sống giảm độc lực Trung Quốc đã gây miễn dịch cho lợn ở các trại chăn nuôi để hạn chế ổ dịch virut viêm não gần người Ngày nay văcxin sống giảm độc lực trên tế bào PHK (thận chuột đất tiên phát) đã dùng cho người và thấy có khả năng bảo vệ đến gần 70% [98, 100] Tuy nhiên về mặt an toàn thì còn phải được chứng minh đầy đủ

Từ năm 1994, Viện sản xuất các chế phẩm sinh học Chengdu, Vũ Hán, Lanzhou bắt đầu ứng dụng công nghệ này để sản xuất và đưa ra sử dụng ở một số nơi tại Trung Quốc

Văcxin bất hoạt được nuôi cấy trên tế bào thận chuột đất vàng tiên phát đã sử dụng chủng Beijing-3 (P3) và sản xuất tại Viện sản xuất các sản phẩm sinh học Bắc Kinh, Thượng Hải, Vũ Hán và Thành Đô Loại văcxin bất hoạt này rất an toàn nhưng hiệu quả bảo vệ chỉ < 70%

Tại Việt Nam, từ thập kỷ 70 tác giả Đỗ Quang Hà cũng đã nghiên cứu sản xuất thử văcxin VNNB từ tế bào thận lợn tiên phát, nhưng đã thử nghiệm thực địa không có đáp ứng miễn dịch

11.4 So sánh hiệu quả của hai loại văcxin viêm não

Tìm hiểu về hiệu quả của 2 loại văcxin VNNB bất hoạt sản xuất từ não chuột và trên tế bào nuôi Bảng dưới đây cho chúng ta 1 số thông tin về hai loại văcxin này:

Bảng 2: So sánh hiệu quả của 2 loại văcxin VNNB bất hoạt

Tiêu chuẩn so sánh Văcxin bất hoạt từ não

chuột Văcxin bất hoạt trên tế bào nuôi

6 Chấp nhận của

TCYTTG

Đã được chứng nhận của TCYTTG

Chưa được TCYTTG chấp nhận

So sánh văcxin sản xuất từ não chuột và trên tế bào ta thấy: việc nuôi và cung cấp chuột phải được tổ chức và quản lý tốt Chuột phải đạt tiêu chuẩn chất lượng để sản xuất văcxin Một não chuột 3-4 tuần tuổi chỉ được 1-3 liều văcxin Vì vậy muốn sản xuất được nhiều văcxin thì phải có một hệ thống nghiên cứu và chăn nuôi chuột Cả chuỗi công đoạn sản xuất văcxin thô cần phải đầu tư nhà xưởng, thiết bị và nhân lực do đó sản lượng

bị hạn chế Còn văcxin trên tế bào nuôi, tổ chức hậu cần không phức tạp, nguồn nguyên liệu đầu là tế bào thận chuột đất được nhân lên trên chai Roux hoặc chai plastique nhiều tầng và gây nhiễm virut VNNB chủng Beijing 1 Như vậy, cứ 1 chai tế bào có thể thu ít nhất là 100ml văcxin trong đó 1 não chuột chỉ được 2,5ml văcxin Trung Quốc là một nước rất đông dân, muốn đảm bảo đủ văcxin để sự phòng VNNB thì chỉ có phương pháp sản xuất trên tế bào đạt sản lượng cao và giá thành rẻ, tuy rằng khả năng bảo vệ thấp nhưng đáp ứng được nhu cầu trước mắt cho nhân dân Trung Quốc

Những năm cuối thập kỷ 90 của thế kỷ trước, nhiều nhà sản xuất trên thế giới đã nghiên cứu về văcxin trên tế bào Vero như Aventis, Biken Nhật Bản, Viện văcxin và

huyết thanh Bắc Kinh Đã nghiên cứu văcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt, tinh khiết và bước đầu đánh giá về tỷ lệ bảo vệ trên thực địa cao >80% Có lẽ đây là 1 hướng để cải tiến qui trình công nghệ trong tương lai

Đồng thời hướng nghiên cứu văcxin VNNB tái tổ hợp cũng được nhiều nhà khoa học rất quan tâm, song việc nghiên cứu tái tổ hợp với Pox virus, varicella virus, Bacculovirus… thì còn chưa đạt được Các nghiên cứu trên dừng lại ở phòng thí nghiệm

vì hiệu quả rất thấp [88, 86, 89, 97, 105, 154, 156, 157, 169, 195]

Hiện tại có 3 loại văcxin đang sản xuất và sử dụng rộng rãi:

- Văcxin bất hoạt sản xuất từ não chuột

- Văcxin bất hoạt trên nuôi cấy tế bào

- Văcxin sống giảm độc lực trên nuôi cấy tế bào

11.4.1 Văcxin bất hoạt sản xuất từ não chuột

Loại văcxin này được sản xuất ở một số nước ở Châu Á và cho đến nay cũng chỉ

có loại văcxin này có mặt trên thị trường quốc tế Nhìn lại vào những năm 1940 khi mới bắt đầu nghiên cứu sản xuất văcxin này ở dạng thô, chứa toàn bộ protein não chuột và hàm lượng Myelin rất cao do đó tỷ lệ gây viêm não dị ứng cũng cao Ngày nay công nghệ tinh chế cải thiện rất nhiều đã làm giảm tối đa protein Myelin (<2ng/ml) và 2 chủng virut VNNB dùng để sử dụng sản xuất văcxin là Nakayama và Beijing-1 Văcxin đã thử nghiệm ở Thái Lan, nơi có lưu hành nhiều tuýp VNNB khác nhau đều có đáp ứng kháng thể, mặt khác thử nghiệm chéo trên chuột với các chủng virut VNNB lưu hành ở Châu Á cho thấy chủng Beijing-1 là chủng có diện chéo rộng với tất cả các chủng lưu hành ở các vùng khác nhau Vì lý do này mà 1 số hãng sản xuất văcxin viêm não đã thay chủng Nakayama bằng chủng Beijing-1 trong sản xuất văcxin từ não chuột [41]

Văcxin VNNB sản xuất từ não chuột được tiêm dưới da liều 0,5ml cho trẻ ≤3 tuổi, 1ml cho trẻ >3 tuổi Dựa vào các nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy trẻ <1 tuổi vẫn còn kháng thể của mẹ truyền

Theo khuyến cáo của TCYTTG về văcxin VNNB: Liều sơ chủng 2 mũi cách nhau 1-2 tuần 1 số thí nghiệm thực địa ở một vài nước Châu Á sau sơ chủng có 95% trẻ em được bảo vệ Nhóm đối chứng cũng đạt được 91% Tỷ lệ chuyển dịch huyết thanh không

bị giảm khi được tiêm bổ sung để kích thích miễn dịch Tuy nhiên chương trình sơ chủng

có khác nhau giữa các nước ở Châu Á Hơn nữa, khoảng cách tối đa và số liều bổ sung cũng có nơi còn chưa thực hiện đầy đủ vì vậy hiệu quả cũng khác nhau ở từng địa phương Nhiều nước ở Châu Á đã chấp nhận chương trình sơ chủng gồm 2 liều và trong vòng 4 tuần Sau đó 1 năm tiêm bổ sung mũi 3 và tiếp tục 3 năm tiêm nhắc lại 1 lần Tuy

nhiên, sau nhiều lần tiêm nhắc lại cũng chưa được xác định đầy đủ là bao nhiêu lần Nếu tiêm đầy đủ thì mũi 3 lúc trẻ 2 tuổi, mũi 4 là 5 nuổi và tiếp tục là 8 tuổi, 11 tuổi vấn đề này cần nghiên cứu để xác định cần tiêm bổ sung bao nhiêu liều?

80% đối tượng tiêm văcxin theo phác đồ sơ chủng 2 liều tuy nhiên 1 số tác giả nghiên cứu cho thấy hiệu quả kháng thể trung hòa giảm xuống trong vòng 6-12 tháng đến mức dưới khả năng bảo vệ (<1/10 lần) với binh lính của Mỹ thì phác đồ tiêm 3 liều sơ chủng ngày 0, ngày 7 và ngày 30 cho thấy 100% có chuyển dịch huyết thanh với hiệu giá kháng thể trung hòa cao và tồn lưu ở mức cao trong 3 năm

Các tác dụng phụ ở các đối tượng tích lũy chưa được xác định, mặc dù dị ứng với gelatin có chứa trong văcxin dùng làm chất bền vững cũng có nghi ngờ trong 1 số trường hợp Các phản ứng như trên có thể xảy ra muộn từ 12-72 giờ sau khi tiêm văcxin

Loại trừ những người quá mẫn với văcxin này, thì không có trường hợp nào chống chỉ định để tiêm văcxin VNNB (cho binh lính Mỹ)

11.4.2 Văcxin VNNB bất hoạt điều chế từ tế bào

Loại văcxin này sản xuất tại Trung Quốc, chủng virut VNNB P3, có đáp ứng kháng thể với nhiều chủng virut viêm não khác trên chuột và nhân lên rất tốt trên tế bào thận chuột đất vàng tiên phát Văcxin bất hoạt bằng formalin và gây miễn dịch cho trẻ em đạt 80% đáp ứng kháng thể Giá văcxin rẻ và mỗi năm cung cấp 90 triệu liều đáp ứng đủ nhu cầu cho Trung Quốc Nhưng rồi Trung Quốc lại nghiên cứu thay thế 1 loại văcxin sống giảm độc lực trên nuôi cấy tế bào để có hiệu quả hơn

11.4.3 Văcxin sống giảm độc lực

Trung Quốc nghiên cứu sử dụng chủng SA14-14-2 là chủng giảm độc lực và không gây ảnh hưởng thần kinh Thử nghiệm tại 1 vùng không lưu hành dịch cho thấy có đáp ứng kháng thể 83-100% ở trẻ em 6-7 tuổi Trẻ lớn hơn tiêm 2 liều cách nhau 1-3 tháng đạt 94-100% có đáp ứng miễn dịch Các phản ứng phụ thông báo rất ít gặp phải Giá văcxin này tại Trung Quốc rất rẻ Hiện nay hàng năm sản xuất 40 triệu liều cho trẻ

em Trung Quốc sử dụng Chưa theo dõi đầy đủ về mức độ an toàn cũng như tính đột biến gen của virut viêm não trong loại văcxin này, đây chính là điều cần quan tâm [60, 184]

11.4.4 Nghiên cứu tính miễn dịch của văcxin VNNB sản xuất từ chủng Nakayama và Beijing-1

Trong thập kỷ 80 của thế kỷ trước, toàn bộ văcxin VNNB đều được sản xuất từ chủng Nakayama NIH Những nghiên cứu về các chủng phân lập được ở các vùng khác nhau của Nhật Bản chia ra thành 3 nhóm kháng nguyên: Nakayama NIH, JaGAr-01 và nhóm mang tính kháng nguyên giữa 2 nhóm này Bằng kỹ thuật ức chế ngưng kết hồng

cầu hấp phụ (absorption haemagglutination inhibition test), trung hòa hấp phụ (absorption neutralization test) hoặc sử dụng kỹ thuật ngăn ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination Inhibition-HI) Vì vậy, trong vùng có lưu hành dịch với các chủng khác nhau Hiệu quả bảo vệ của văcxin chủng Nakayama đã được đưa ra tranh luận giữa các nhà nghiên cứu chọn chủng sản xuất đạt hiệu quả cao

Năm 1984 thử nghiệm văcxin viêm não do trường đại học Osaka nghiên cứu sử dụng chủng Beijing-1, tính kháng nguyên giống JaGAr-01 Sau đó so sánh tính miễn dịch giữa Nakayama và Beijing-1 Kết quả cho thấy Beijing-1 có miễn dịch trội hơn và diện miễn dịch chéo với các chủng rộng hơn Cũng trong nghiên cứu này cho thấy đáp ứng kháng thể trung hòa (NT) với kháng nguyên cùng loại cao hơn kháng nguyên khác loại ví dụ: Beijing-1 + Beijing-1 → hiệu giá kháng thể trung hòa 2,31 và 2,32 nhưng với Nakayama 1,51 và 1,85 với JaGAr-01 là 1,86 Nakayama + Nakayama → hiệu giá kháng thể trung hòa 2,61 và 2,31 nhưng với Beijing-1 1,8 và 1,55 [83, 84]

Theo Kitano và cộng sự: có thể Beijing-1 tạo ra đầy đủ các kháng thể trung hòa kháng lại tất cả các epitop của cả Beijing-1 và Nakayama Những kết quả này đã được xác định và tập hợp số liệu của 7 nhà sản xuất tại Nhật Bản

Tác giả Kitano và cộng sự chỉ chọn các đối tượng huyết thanh 1 (-) từ 3-13 tuổi: tiêm 2 liều cách nhau 1-2 tuần và liều thứ 3 sau 1 tháng Đánh giá hiệu giá kháng thể trung hòa trung bình thử nghiệm trên 4 chủng virut VNNB Nakayama, JaGAr-01, Mie 44-1 và Beijing-1 Kết quả hiệu giá kháng thể trung hòa thấp nhất là chủng Mie 44-1 (chỉ đạt 1,4-1,6) Chủng JaGAr-01 chỉ số trung hòa <2 (là chủng có tính kháng nguyên giữa Nakayama và Beijing-1) Nakayama trung hòa Nakayama kết quả trội nhất 2,61-2,62 (n=26); Beijing-1 trung hòa Beijing-1 là 2,5-2,7 n=87 (đáp ứng cùng loại) Ngược lại Nakayama + Beijing-1 chỉ đạt 1,68 nhưng Beijing-1 + Nakayama đạt 1,92 và Beijing-1 đáp ứng cao với cả JaGAr-01 1,86 và Mie 44-1 là 1,41 [83, 84]

Mũi bổ sung thứ 3 thì hiệu giá kháng thể trung hòa Beijing-1 + Beijing-1 tăng lên

>3,5 Beijing-1 + Nakayama tăng 2,5 Chủng Beijing-1 có động lực kháng thể tăng rất rõ rệt

Thử nghiệm thực địa văcxin bất hoạt từ chủng Beijing-1 do Viện NIH, Nhật Bản thực hiện: 121 người tình nguyện sau khi tiêm miễn dịch cơ bản cho đáp ứng miễn dịch với chủng Beijing-1 là 97,6% và Nakayama là 83,1% và 89,5% trong 2 nhóm thử Sau khi tiêm văcxin 1 tháng tỷ lệ chuyển dịch huyết thanh Beijing-1 là 100% và Nakayama 88,9% và 97,2% Với chủng Beijing-1 chỉ số trung hòa trung bình 2,86 sau miễn dịch cơ bản và sau mũi bổ sung là 3,55 [83, 84]