Nghiên cứu sản xuất vacxin mẫu chuẩn quốc gia

Nghiên cứu sản xuất vacxin mẫu chuẩn quốc gia.

BỘ Y TẾ VIEN VACXIN VA CAC CHE PHAM SINH HOC

Đề tài cấp bộ

NGHIÊN CỨU SẲN XUẤT VACXIN

MẪU CHUẨN QUỐC GIA BACH HAU - UON VAN - HOGA

Nha Trang - 1999

2496

‹ø00 - 64 - 022( CÁ G4 [3 Revd

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

GS PTS Nguyễn Thị Kê

NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN

Nguyễn Thị Thế Yến (1) Huỳnh Ánh Hồng (1)

Nguyễn Thị Lan Phương (1) Hoàng Thị Hồng (2)

(1) VIỆN VẮC XIN VÀ CÁC CHẾ PHẨM SINH HỌC

(2) TRUNG TÂM KIỂM ĐỊNH QUỐC GIA SINH PHAM Y HOC

Cơ quan thực hiện

VIỆN VACXIN VÀ CÁC CHẾ PHẨM SINH HỌC

Dimethyl Sulfoxide (CH3).SO,

Diphtheria - Pertussis - Tetanus

(Bạch hầu - Ho gà- Uốn ván)

Effective Dose

(Liễu bảo vệ 50% súc vật thí nghiệm)

International Opacity Unit

(Đơn vị đo độ đục Quốc tế, 1 đơn vị tương đương

1 tỷ vi khuẩn Ho gà)

International Unit

(Đơn vị Quốc tế về công hiệu)

Lethal Dose (Liều gây chết 50% súc vật thí nghiệm)

Limes flocculation

Giới hạn lên bông

(Sế lượng độc tế và giải độc tố khi trộn với 1 đơn vị Quốc tế kháng độc tố làm xuất hiện hiện tượng lên bông Ramon trong thời gian ngắn nhất)

Số đơn vị lên bông trên miligam Nitơ Protein

Qui trình

Reference for Diphtheria vaccine

(Vac xin mẫu chuẩn Bạch hầu)

Reference for Pertussis vaccine

(Vắc xin mẫu chuẩn Ho gà)

Reference for Tetanus vaccine

(Vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván)

National Institute of Health and Environmental

Protection

(Viện Quốc gia Bảo vệ sức khoẻ và Môi trường

Hà Lan) Standard Deviation

(Độ lệch chuẩn)

Cầu nối đisulfit

Staten Serum Institute

(Vién huyét thanh Quéc Gia Dan Mach)

United Nations Children’s Fund

(Quy nhi déng Lién Hiép Quéc)

Vi khuẩn

Vắc xin Vắc xin mẫu chuẩn

World Health Organization

(Tổ chức Y tế thế giới)

33} 3k 3 3E 2k fe 3 fe fe s k2 dế dc k s2 3€ €

MỤC LỤC

PHAN THU I: ‘TONG QUAN TÀI LIỆU- -

L MOT S6 NGUYEN TAC CHUNG CO BAN KHI SẢN XUẤT VẮC XIN

MAU CHUAN

1.1 Mẫu chuẩn Quốc tế

1.2 Mẫn chuẩn quốc gia

I SAN XUAT VAC XIN MAU CHUAN HOGA

tu SAN XUAT VẮC XIN MẪU CHUẨN BẠCH HẦU

Iv SAN XUẤT VẮC XIN MAU CHUAN UỐN VÁN

Vv „CÁC YẾU TỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN CÔNG HIỆU CỦA VẶC XIN

PHAN THU I: VAT LIEU VA PHUONG PHÁP

1.2 Vắc xin mẫu chuẩn Quốc tế Hee L2 t.eerxerree

1.3 Kháng nguyên dùng để sản xuất vắc xin mẫu u chuẩn Bạch hau, Uốn

2.1 Phương pháp giám sát vi sinh các thiết bị và điều kiện sản xuất vắc

xin mẫu chuẩn

2.2 Sản xuất vắc xin mẫu chuẩn

2.2.1 Sản xuất vắc xin mẫu chuẩn Ho gà

2.2.2 Sản xuất vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu

2.2.3 Sản xuất vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván

2.3 Đông khô vắc xin mẫu chuẩn wee

2.3.1 Xác định điểm đông toàn phần c của vắc xin mẫu chuẩn Ho ga,

vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu và vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván

2.3.2 Khảo sát qui trình đông khô vắc xin mẫu chuẩn Ho gà

2.3.3 Khảo sát qui trình đông khô vắc xin mẫu chuẩn Bach hầu và

vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván -.s.14-22 122221<-e.12 +2

PHAN THỨ HI: KẾT -T QUÁ VÀ BÀN m————

1 1 Két qua san xuat va \ dong khô \ vắc xin mẫu chuẩn Ho ga- Bach hav-

Uốn ván _ _— HH re

1.1.1 Kết ¢ quả sản xuất và à đông khô y vắc xin mẫu chuẩn Ho gà

1111 Kết quả về sẵn xuất — — ,Ô

1.1.1.2 Kết quả kiểm tra chất lượng và tính ổ on 1 dink của vắc xin

mẫu chuẩn Ho gò theo thời gian và nhiệt độ bảo quản khác nhau Tre

1.113 Ding vắc xin mẫu ¡ chuẩn Ho gà Việt Nam và vắc xin

mẫu chuẩn Ho gà Quốc tế để kiểm tra đối chứng song song công hiệu nước cốt Ho gà và vắc xin DPT

1.1.2 Kết quả sản xuất và đông khô vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu

1.1.2.1 Kết quả về sản xuất “ 1Ä ,,Ô

1.1.2.2 Kết quả về chất lượng v và a tink 3 ổn 1 dinh của vắc xin mẫu

chuẩn Bạch hầu theo thời gian và nhiệt độ bảo quản 1.1.2.3 Sử dụng vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu Việt Nam đông khô

và vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu Quốc tế kiểm tra đối

chứng song song công hiệu thành phan Bạch hầu trong vde xin DPT Lạ HH TH HH TH H000 chi

1.1.3 Kết quả sản xuất và đông khô v vắc xin mẫu chuẩn Uốn v ván

1.1.3.1 Kết quả về sản xuất ¬- —-

1.13.2 — Kết quả kiểm tra chất lượng và ‘tinh bi on 1 dinh e của vắc xin

mẫu chuẩn Uốn ván theo nhiệt độ vò thời gian

1.1.3.3 Sử dụng vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván Việt Nam và vắc

xin mẫu chuẩn Uốn ván Quốc tế kiểm tra đối chúng song sơng công hiệu vắc xin Uốn ván

1.1.4 Kết vả sản xuất 5 lô vắc xin mẫu chuẩn

2.1 Bàn luận \ về kết q quả các íc thông s số ố kỹ thuật e của qui 1 trình đông

khô HH Hrentrerenrererreee ve svoveecuenssecesanenteee

2.1.1 "Đối v với vắc xin mẫu chuẩn Ho g ga a dong khô "

2.1.2 Vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu và vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván

2.2 Bàn luận về chất lượng và tính ổn định c của vắc xin mẫu chuẩn theo

thời gian và nhiệt độ bảo quản se ecrrrrseerrerxeerrrer

2.2.1 Bàn luận về công hiệu vắc xin mẫu chuẩn Hee

2.2.1.1 Công hiệu vắc xin mẫu chuẩn Ho gà đông khô

2.2.1.2 Công hiệu vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu dạng nước, 3 vắc

xin mẫu chuẩn Uốn ván dạng nước

2.2.1.3 Công hiệu vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu đông khô

2.2.1.4 Công hiệu vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván đông khô

2.2.2 Bàn luận về tính ổn định công hiệu vắc xin mẫu chuẩn giữ ở

2.3 Bàn luận về kết q quả sử ử dụng v vắc xin mẫu chuẩn Việt Nam để kiểm

tra vắc xin DPT và vắc xin TT song song đối chứng với vắc xin mẫu

chuẩn Quốc tế " HH ertrerrriesereeirer

2.4 Bàn luận về hiệu q quả kinh t tế của a đề t tài ài nghiên ct cứu

PHAN THỦ IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

ne DE NGHỊ

HÌNH ẢNH THIẾT BỊ SẲN XUẤT VÀ SAN PHẨM

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHẦN MỞ ĐẦU

A- ĐẶT VẤN ĐỀ

Vắc xin Bạch hầu - Ho gà - Uốn ván (DPT) là một sinh phẩm gồm 3

thành phần kháng nguyên: giải độc tố Bạch hầu tinh chế, giải độc tế Uốn

ván tinh chế và vi khuẩn Ho gà đã bất hoạt, được hấp phụ với tá chất là

phosphat nhôm hoặc hydroxyt nhôm để làm tăng khả năng miễn dịch của kháng nguyên

Ở nước ta, từ lâu Bộ Y tế đã phải nhập loại vắc xin này để cung cấp

cho chương trình tiêm chủng mở rộng (CTTCMR) Tháng 5 năm 1990

Viện Vắc xin Nha Trang ~ Đà Lạt (Viện Vắc xin) đã sản xuất thành công vắc xin DPT trên hệ thống nổi nuôi cấy tự động có dung tích lớn và đã được Bộ Y tế cho phép đưa ra sử dụng rộng rãi để phòng bệnh Bạch hầu,

Ho gà và Uốn van cho tré em trong CTTCMR

Để đánh giá chất lượng vắc xin, ngoài việc kiểm tra tính vô khuẩn,

an toàn, hóa học thì còn phải xác định công hiệu Công hiệu của thành phân Ho gà trong vắc xin DPT được xác định qua khả năng bảo vệ của chuột nhất trắng khi thử thách với chủng độc Công hiệu của thành phần

Uốn ván được xác định qua khả năng bảo vệ của chuột nhất trắng và công

hiệu của Bạch hầu được xác định qua khả năng bảo vệ của chuột lang khi thử thách với độc tố Việc xác định công hiệu của vắc xin thử nghiệm được

tiến hành song song với vắc xin mẫu chuẩn

Như vậy, vắc xin mẫu chuẩn là vật phẩm không thể thiếu được trong

quá trình xác định công hiệu của vắc xin Vắc xin mẫu chuẩn này, từ lâu

Viện Vắc xin nhận trực tiếp từ các phòng thí nghiệm nước ngoài như Viện

Quốc gia bảo vệ sức khoẻ và môi trường Hà Lan (RIVM), Viện Human

(Hungary) hoặc xin của Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) Việc xin vắc xin mẫu chuẩn như vậy gây trở ngại rất nhiễu cho sản xuất, nghiên cứu vì

số lượng ít và bị động Điều cần thiết đối với vắc xin mẫu chuẩn là mẫu chuẩn phải được làm từ điểu kiện địa phương, chính nơi sản xuất ra vắc xin

dé [25][26]

Xuất phát từ yêu cầu trên, chúng tôi tiến hành để tài “Nghiên cứu

sản xuất vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu - Ho gà - Uốn Ván” để dùng cho

nghiên cứu và đánh giá chất lượng vắc xin DPT, vắc xin TT sẵn xuất tại

Viện Vắc xin.

B-

1

2

MUC TIEU CUA DE TAI:

Xây dựng qui trình sản xuất và đông khô các loại vắc xin mẫu chuẩn

Bạch hầu - Ho gà - Uốn Ván

Sản xuất được vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu - Ho gà - Uốn ván để góp

phần tạo cơ sở mang tính pháp lý trong việc đánh giá chất lượng vắc xin

Để thực hiện được mục tiêu trên các nội dung cần phải tiến hành

nghiên cứu là:

Nghiên cứu xây dựng qui trình sẩn xuất và đông khô các loại vắc xin

mẫu chuẩn Bạch hầu - Ho gà - Uốn Ván

Kiểm tra chất lượng các lô vắc xin mẫu chuẩn đã sắn xuất được

Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin theo thời gian và nhiệt độ bảo

quản Phối hợp cùng TTKĐQG sinh vật phẩm Y học thẩm định chất lượng vắc xin mẫu chuẩn

Sử dụng vắc xin mẫu chuẩn đã sản xuất, kiểm định công hiệu các thành phần Bạch hầu, Ho gà, Uốn ván đối chứng song song với vắc xin mẫn chuẩn Quốc tế

PHẦN THỨ I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I MỘT SỐ NGUYEN TAC CO BAN KHI SAN XUAT VAC XIN MAU

CHUAN

Để sản xuất vắc xin mẫu chuẩn, TCYTTG có nhiều hướng dẫn [25]

[26] Từ việc định nghĩa thế nào là một sinh vật phẩm chuẩn, cách chọn,

điều chế sinh vật phẩm chuẩn, tính đồng nhất, tính ổn định, đến cách đóng ống, lọ, đông khô, bảo quần, dán nhãn và cuối cùng là cách xác định đơn

vị công hiệu của chúng

1.1 Vắc xin mẫu chuẩn Quốc tế

Đối với vắc xin mẫu chuẩn Quốc tế, TCYTTG có những khuyến cáo

tại các phòng thí nghiệm địa phương [29]

Các sinh vật phẩm chuẩn dùng để chẩn đoán, nhận dang vi sinh vat,

không dùng để định lượng nên không cần có đơn vị Quốc tế, nhưng phải

có tính ổn định cao

Phương pháp điều chế: để điều chế sinh vật phẩm chuẩn điều thiết

yếu đầu tiên là tính đổng nhất và thành phân của vắc xin mẫu chuẩn phải giống loại định thử nghiệm Khi dùng chất bảo quản chống vi sinh vật gây nhiễm nên chọn loại không ảnh hưởng đến chế phẩm khi làm khô, hoặc không bị thăng hoa khi làm khô Chất bảo quản thường được sử dụng là merthiolate Những chất thêm vào hay chất pha loãng chế phẩm đều chọn chất không gây giảm và ảnh hưởng đến hoạt tính sau này,

Dong ống: vắc xin mẫu chuẩn có thể đóng vào ống hay lọ và đậy nút cao su Trong quá trình đóng ống nên chú ý đến tính đồng nhất của

mẫu Để chắc chắn về tính đông nhất, các ống nên đóng từ một lọ đổng nhất và trong một điều kiện thao tác như nhau Nhiệt độ và tốc độ khuấy trong khi đóng ống phải ổn định Tránh nhiễm vi sinh vật, hóa chất hay

Đông khô: Gồm ba giai đoạn (xem hình 7 - phụ lục 1)

* Làm đông: đối với vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu, Ho gà, Uốn ván nên

làm đông ở —50°C hoặc thấp hơn để chắc chắn sản phẩm hoàn toàn đông trước khi đưa vào làm khô Điều này sẽ giúp duy trì được hoạt tính của sản

phẩm, do vậy phải đo nhiệt độ bằng dụng cụ chính xác Để an toàn cho

sản phẩm, nhiệt độ làm đông phải luôn luôn thấp hơn điểm kết tỉnh sản phẩm đó trong lạnh Trong quá trình đông khô, cần phải tránh tạp nhiễm

Nếu lượng sản phẩm trong mỗi đơn vị phân liều lớn, cân phải có biện pháp làm tăng bể mặt tiếp xúc của sản phẩm

* Làm khô: trong quá trình đông khô, tất cả mọi ống chịu một quá trình

đồng nhất Sản phẩm được làm khô bằng cách dùng máy gia nhiệt liên tục,

nếu không có thì phải bảo đẩm nhiệt độ không lên tới mức cao nhất làm ảnh hưởng đến sản phẩm Tùy kinh nghiệm từng quy trình và cần phải th thử nghiệm để biết chắc chắn sản phẩm được làm khô tốt

Quá trình làm đông, làm khô và quá trình hàn kín diễn ra ngay trong

một máy là tốt nhất, nếu không có điều kiện cần phải chuyển từ hệ thống

đông khô sang hệ thống hàn kín thì sản phẩm phải luôn được đặt trong

'bình hút ẩm có P;O; khô

* Hàn: sản phẩm được hàn trên giàn nhiều lỗ, dưới áp lực chân không

hoặc sau khi đã nạp đây khí trơ (nitơ hay argon) Khí trơ phải sạch, khô, được lọc qua màng lọc và tuyệt đối không còn Oxy Hàn xong phải kiểm

tra độ kín bằng máy dò chân không Nếu hàn bằng khí trơ có thể kiểm tra

bằng cách nhận chìm ống vào dung dịch xanh methylen trong vài phút; những ống nứt, hở sẽ nhuộm màu

Dán nhãn: khi lưu hành vắc xin mẫu chuẩn phải có đầy đủ các thông tin :

« Tên TỔ CHỨC Y TẾ THẾ GIỚI “TCYTTG”

e Tên của sinh vật phẩm chuẩn, nên kèm theo số thứ tự của các lần sản xuất (ví dụ: lần 1, lần 2 .v.v)

e© Năm TCYTTG thiết lập sinh vật phẩm chuẩn này

se Mã số,

e _ Số đơn vị quốc tế

e_ Điều kiện bảo quản

e Tên và địa chỉ nơi cấp phát

Nhớ ghi câu “Không được dùng cho người”

Ví dụ nhãn cho vắc xin mẫu chuẩn Ho gà Quốc tế cụ thể được ghi như sau:

TỔ CHỨC Y TẾ THẾ GIỚI

PHÒNG THÍ NGHIỆM SINH VẬT PHẨM CHUẨN QUỐC TẾ

VIỆN HUYẾT THANH QUỐC GIA ĐAN MẠCH, DK-2300

COPENHAGEN S DEMARK

VAC XIN MAU CHUAN HO GA QUOC TE

46 IU/ống

- GIO Ở +5°C HAY DƯỚI +5°C

— KHONG DUOC DUNG CHO NGUOI

Các tiêu chuẩn chất lượng: vắc xin mẫu chuẫn phải được kiểm tra về nhận dạng, công hiệu, tính ổn định, độ ẩm tổn dư và độ tạp nhiễm

Công hiệu: sản phẩm phải kiểm tra công hiệu Để biết chắc vắc xin mẫu

chuẩn có công hiệu và không bị mất trong quá trình xử lý, sử dụng Công hiệu cần phải được xác định ở nhiều thời điểm và nhiệt độ bảo quản khác

nhau

Độ ẩm tôn dự: độ ẩm phẳn ảnh quá trình làm khô tốt hay chưa tốt Không

có phương pháp nào kiểm tra độ ẩm tỏ ra chính xác tuyệt đối Phương

pháp Karl Fischer thường được sử dụng Chú ý đến trường hợp mất công hiệu đo độ ẩm quá cao (như trường hợp vắc xin dại và một vài loại vắc _ xin khác)

Tính vô khuẩn: tính vô khuẩn là điều kiện tối cần cho tính ổn định lâu dài của sản phẩm

Tính ổn định: thử nghiệm tính Ổn định là yêu cầu cần thiết đầu tiên Qua

tính ổn định ước tính được thời gian sử dụng, lưu trữ và phân phát đến các phòng thí nghiệm khác nhau

Hồ sơ: toàn bộ hỗ sơ của quá trình sản xuất và kiểm định phải được lưu trữ Phải kiểm tra thường xuyên số sản phẩm còn, số sản phẩm lưu hành

và báo cáo hàng năm cho TCYTTTG

Đối với vắc xin mẫu chuẩn Quốc tế, ngoài những khuyến cáo trên TCYTTG còn khuyến cáo việc hợp tác Quốc tế để nghiên cứu, tổ chức

đánh giá vắc xin mẫu chuẩn, xin lập chuẩn Quốc tế

1.2 Vắc xin mẫu chuẩn quốc gia

Đối với vắc xin mẫu chuẩn quốc gia, TCYTTG khuyến cáo về

nguyên tắc chung không có gì khác với vắc xin mẫu chuẩn Quốc tế, song

cần thiết phải có sự tham gia của đơn vị sản xuất và Trung tâm Kiểm định

Quốc Gia Chuẩn quốc gia được quy về đơn vị Quốc tế (IU) khi so trực

tiếp với chuẩn Quốc tế

Tài liệu mới nhất của TCYTTG [27] năm 1995 có khuyến cáo: Mỗi

quốc gia, tùy điều kiện riêng để sản xuất vắc xin mẫu chuẩn và có các phương pháp sản xuất khác nhau Điều bắt buộc vắc xin mẫu chuẩn tối

thiểu phải đạt được 3 tiêu chuẩn chung sau đây:

Thành phần: vắc xin mẫu chuẩn phải có thành phần giống vắc xin dùng

để thử nghiệm

Tính ổn định: vắc xin mẫu chuẩn phải ổn định khi giữ trong điều kiện

thích hợp

Số lượng: số lượng mỗi lô sản xuất đủ dùng cho nhu cầu trong nhiều năm

Theo Vander de Dark [24] công hiệu vắc xin mẫu chuẩn sau một

năm phải đạt:

- GIÁ TRỊ TRUNG BÌNH CÔNG HIỆU SAU 1 NĂM = GIÁ TRỊ

TRUNG BÌNH CÔNG HIỆU NĂM TRƯỚC TRỪ 1⁄4 ĐỘ LỆCH

CHUAN, VAC XIN DAT YEU CAU

- GIÁ TRỊ TRUNG BÌNH CÔNG HIỆU SAU 1 NĂM = GIÁ TRI

TRUNG BINH NAM TRUGC TRU 1/2 BO LECH CHUAN, VAC XIN

KHONG DAT YEU CAU

Có nhiều quy định chung về sản xuất mẫu chuẩn, nhưng qui trình sản xuất cụ thể cho từng loại vắc xin mẫu chuẩn, tùy từng nơi có những

phương pháp khác nhau và thành phân khác nhau

I SẲN XUẤT VẮC XIN MẪU CHUẨN HO GÀ

Vac xin mẫu chuẩn Ho gà Quốc tế lần đầu tiên sản xuất vào năm

1957, chứa 52 mg trọng lượng khô, đạt 34,7 IU/ống Vắc xin mẫu chuẩn quốc tế mang ký hiệu 66-302 được Seagroat and Sheffield [23] công bố

phương pháp sản xuất như sau:

Dùng chủng mang ký hiệu 13560 LạS; và 27 (N.LH) do Pearl Kendrick phân lập được và có thành phân kháng nguyên là 1, 2, 3, 5 do

Grace Eldering xác định để sản xuất vắc xin mẫu chuẩn Quốc tế

Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường BG có chứa than hoạt tính Sau khi nuôi cấy vi khuẩn được gặt trong dung dịch đệm M/15 Sorensen —

pH=?, với đậm độ180 đơn vị độ đục (OU) Sau đó vi khuẩn được pha loãng với dung dịch đệm M/15 Sorensen theo tỷ lệ 10/8

Dung dịch này được đóng vào 3000 ống, mỗi ống 2 ml và được

Campbell đông khô Sản phẩm mang mã số 66/302, Năm 1968 sản phẩm được gửi tới phòng sinh vật phẩm chuẩn Copenhagen và sau đó mẫu này được gửi tới 11 phòng thí nghiệm trên thế giới để xác định công hiệu của

vắc xin Ho gà [23] Mỗi ống chứa khoảng 25 mg trọng lượng khô vắc xin Công hiệu được xác định trên mỗi ống là 46 IU/ ống [21]

Ở Úc, vắc xin mẫu chuẩn Ho gà đuợc sản xuất vào năm 1993 và

mang ký hiệu SS546, là chế phẩm gồm 3 thành phần (Bạch hầu, Uốn ván,

Ho gà), hỗn hợp với Dextran Chế phẩm được cho vào ống vô trùng, đông khô và hàn dưới điều kiện chân không [1 1]

Ở Hungary, vắc xin mẫu chuẩn Ho gà được sản xuất từ các chủng

41405, 324E, 358E, CN2894, CN2896, CN2897 và được mang ký hiệu

HSPV Mỗi chủng được cấy trên môi trường đặc, ở 35°C trong 72 giờ Canh cấy 72 giờ được gặt trong đệm muối phosphat (PBS), có pH=7,2, và

merthiolat 0,02 % Sau đó các chủng được hỗn hợp lại với nhau, với thể

tích và đậm độ tương đương cho mỗi thành phần Tá chất được sử dụng là dextran Vắc xin được đóng ống, đông khô Kết quả nghiên cứu về tính ổn định của vắc xin cho thấy, sau 10 năm công hiệu vẫn không bị giảm [9]

Như vậy việc sản xuất vắc xin mẫu chuẩn Ho gà không nhất thiết phải theo một khuôn mẫu nào Tùy vào điểu kiện từng nơi, phương pháp sản xuất có khác nhau song các thành phần trong vắc xin mẫu chuẩn Ho

gà phẩi giống với vắc xin được thử nghiệm

II SẢN XUAT VAC XIN MAU CHUAN BACH HAU

Vac xin mẫu chuẩn Bạch hầu hấp phụ Quốc tế lần đầu tiên được sản xuất vào năm 1955 chứa 75 mg trọng lượng khô của giải độc tế Bạch hầu hấp phụ với gel alumin hydroxid, đạt 132 TU/ếng Năm 1978 vac xin mẫu

chuẩn Bạch hầu hấp phụ lần thứ hai mang mã số 13-204 Vắc xin này được

sản xuất từ giải độc tố Bạch hầu tỉnh chế sản xuất tại Viện SSI [21] Giải

độc tố Bạch hầu tinh chế có độ sạch đạt 2100 Lf/mg NP Giải độc tố được hấp phụ vào gel alumin hydroxid, có thêm Haemacel, sau đó phân phối vào ống và đông khô

Mỗi ống chứa 100 LÝ giải độc tố, lmg Al””, 26 mg Haemacel khô Đơn vị quốc tế được xác định cho mỗi ống là 132 TU [21]

Yenny S Chaerani và cộng sự, tại Viện BIOFARMA -Indonesia đã

sản xuất vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu dạng nước Yenny sử dụng phương

pháp xác định công hiệu vắc xin Bạch hầu trên tế bào vero thay thế cho

phương pháp dùng chuột lang Kết quả đạt được 173 IU/ml [30] Tài liệu

về sản xuất vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu ở các phòng thí nghiệm khác

nhau, tại các quốc gia khác nhau trên thế giới rất khó tìm vì gần như mỗi

§

phòng thí nghiệm, mỗi nhà sản xuất có cách sẵn xuất riêng của mình và không ai công bế

Iv SAN XUAT VAC XIN MAU CHUAN UON VAN

Vac xin mẫu chuẩn Uốn ván hấp phụ Quốc tế lần đầu tiên được sản xuất vào năm 1965 chứa 80 mg trọng lượng khô của giải độc tế Uốn ván hấp phụ với gel alumin hydroxid, đạt 120 TU/ống Năm 1981 hai mau vac

xin dự tuyển vắc xin mẫu chuẩn quốc tế là TEXA-1 và TEXA-2 Hai vắc

xin mẫu chuẩn này được gửi đến các phòng thí nghiệm khác nhau trên thế

giới để tiến hành thử nghiệm Các thử nghiệm được tiến hành trên chuột

lang và chuột nhắt trắng Kết quả cho thấy vắc xin dự tuyển Uốn ván Quốc tế ký hiệu TEXA-2 có tính ổn định nhiệt cao Ở thử nghiệm trên chuột lang vắc xin đạt công hiệu 340 IU/ ống Ở thử nghiệm trên chuột nhắt trắng đạt công hiệu 170 1U/ ống [12]

Kết quả công hiệu của vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván Quốc tế ký hiệu

TEXA-2 được trình bày cụ thể ở bảng 1

BANG 1: KET QUA THU NGHIEM VAC XIN MAU CHUAN UON VAN QUOC TE

(TEXA2) TREN CHUOT LANG VA CHUOT TRANG [22]

trên chuột lang chuột nhất trắng

AT” (AI(OH); ), có thêm 22,5mg Haemacel [12][29]

V CÁC YẾU TỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN CÔNG HIỆU CỦA VẮC XIN

MAU CHUAN

Khi nói đến các yếu tố có liên quan đến chất lượng vắc xin mẫu

chuẩn, người ta để cập đến chất lượng kháng nguyên, đến tá chất đưa vào

đông khô, quá trình đông khô và giống chuột sử dụng cho kiểm định Ở

đây chúng tôi chỉ để cập đến ảnh hưởng của tá chất đưa vào đông khô, quy

trình đông khô, và giống chuột đến công hiệu của sản phẩm

* Tá chất: tá chất đông khô đóng vai trò quan trọng trong kỹ thuật đông khô vì

nó bảo vệ sản phẩm trong quá trình đông khô, chủ yếu là giai đoạn lâm đồng

Do đó việc chọn một tá chất phù hợp cho sinh phẩm đông khô là cần thiết [16] Chẳng hạn đối với vắc xin BCG người ta đã sử dụng nhiều tá chất để đông khô

như: lactoza, glucoza, gelatin, dextrin, pepton, hoặc sử dụng những hỗn hợp tá

chất như lactoza+muối, lactoza+sacaroza [3] Qua quá trình nghiên cứu cuối

cùng người ta chọn glutamat natri là tá chất thích hợp vì vắc xin BCG sau khi đông khô có tính ổn định cao

Riêng đối với vắc xin mẫu chuẩn Ho gà, theo một số tác giả, dùng tá chất dextran là thích hợp cho việc đông khô [9][11] Với tá chất này vắc xin mẫu chuẩn sau 10 năm, công hiệu vẫn ổn định

* Chuá trình đông khô: từ năm 1940, một số tác giả đã mô tả chỉ tiết về kỹ thuật

đông khô [13][14]{201129] và sau đó nhiễu nơi, nhiều tác giả đã tiến hành đông

khô vi khuẩn sống cũng như vi khuẩn đã bất hoại

Tốc độ làm động liên quan đến quá trình hình thành cấu trúc tỉnh thể của huyển dịch vắc xin khi nó được chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn

Quá trình đông chậm [3][31] được mô tả ở hình 9 (xem phụ lục1) Khi

nhiệt độ vắc xin đạt từ 0°C đến 10°C, huyền dịch vắc xin vẫn còn nằm ở trạng thái lỏng (A) và điểm đông bắt đầu hình thành (B) Các điểm đông phát triển với số lượng lớn, kích cỡ nhỏ và phân bố đều trong huyền địch vắc xin (C) Tại

D vắc xin đã đông toàn phần, có một cấu trúc tinh thể mịn và xốp Cấu trúc này

tạo điều kiện cho quá trình thăng hoa và vắc xin có dạng vật lý đẹp sau khi đông

khô

Quá trình đông nhanh [3][11] được mô tả ở hình 8 (xem phụ lucl) Khi

nhiệt độ vắc xin đạt 0°C thì một vài điểm đông được hình thành (A) và các điểm

đông bắt đầu phát triển lớn đẩn (B) Số lượng điểm đông ít, kích cỡ điểm đông

lớn và các điểm đông chiếm 80-90% thể tích của huyển dịch (C) Tại điểm D, vắc xin được đông hoàn toàn

Trên hình 8 và 9, điểm D thể hiện điểm đông toàn phần Điểm đông này

tùy thuộc vào nhiệt độ đông toàn phần của tá chất sử dụng để đông khô cho từng

loại vắc xin Nhiệt độ đông toàn phần phải thấp hơn nhiệt độ tan chảy để bảo dam an toàn cho vắc xin trong quá trình thăng hoa không bị tan trổ lại Một trong những phương pháp xác định nhiệt độ đông toàn phần của vắc xin là phương

pháp đo điện trở suất Phương pháp này được tiến hành ngay trên máy đông khô

Trong quá trình đông khô, không có một nguyên tắc chung nào để sử dụng cho tất cả các loại sinh phẩm làm đông Các thông số kỹ thuật ứng

10

dụng cho từng loại sinh phẩm tùy thuộc vào tính chất của sinh phẩm và

thiết bị đông khô Vì vậy mỗi cơ sở sản xuất cần phải nghiên cứu để xác

định các thông số kỹ thuật này Trong quá trình nghiên cứu cần dựa trên

các nguyên lý cơ bản sau:

- Những kích cỡ điểm đông lớn thường gây trở ngại cho quá trình thăng hoa vì cấu trúc này hình thành một lớp màng cứng trên bể mặt vắc

- Những kích cỡ điểm đông bé, mịn và xốp tạo điều kiện cho việc

thăng hoa dễ dàng và vắc xin có dạng vật lý đẹp, hoàn nguyên tốt Các

cấu trúc tinh thể trên phụ thuộc vào nhiều yếu tố: như tính chất của sinh

phẩm, điều kiện của thiết bị và quan trọng hơn cả là tốc độ làm đông

Những thiết bị đông khô có công suất nhỏ dùng để nghiên cứu

thường là thiết bị tự động hóa dùng để xác định tốc độ làm đông và nhiệt

độ đông toàn phần của vắc xin Những thiết bị đông khô với công suất lớn

có hai bộ phận làm đông và làm khô tách rời nhau Vì vậy trong quá trình

đông khô cần thiết phải thăm đò từng thông số một Thăm dò tốc độ làm đông và nhiệt độ đông toàn phần trên bộ phận máy làm đông; tốc độ thăng

hoa, áp lực chân không được thăm dò trên máy làm khô

Trong giai đoạn thăng hoa, áp lực chân không và nhiệt độ cũng có

ảnh hưởng đến chất lượng vắc xin Vai trò của nhiệt lượng trong quá trình

thăng hoa được minh họa ở hình 1

Phần khô của Chuyển hoá hơi nước Phần khô của

sinh phẩm Thăng hoa , sinh phẩm

[” Tiết điện thăng hoa Ì-

Phần đông sinh Phần đông sinh

phẩm phẩm

Trong quá trình đông khô, sản phẩm khô từ trên xuống và từ ngoài vào trong của lọ chứa Do đó hơi nước thăng hoa phải đi xuyên qua phần

khô của sản phẩm với tốc độ thay đổi tùy thuộc vào độ xốp (cấu trúc tinh thể) và bể dày của phân khô Để kích thích và duy trì tốc độ thăng hoa, áp lực chân không cần được điều chỉnh hạ xuống song song với nhiệt lượng

gia tăng [16]

Lượng nước khi thăng hoa càng lớn sẽ giải phóng theo một lượng nhiệt lớn Nhiệt lượng này có thể làm tan trở lại và hủy hoại một phần sản phẩm, nếu như chúng không được giải phóng nhanh ra khỏi sản phẩm Do vậy, khi dùng nhiệt để kích thích quá trình thăng hoa phải kèm theo mức

độ chân không phù hợp

Ở cuối giai đoạn đông khô nhiệt độ kích vẫn duy trì và nhiệt độ vắc xin tự động nâng lên dẫn Trong những trường hợp cần thiết có thể cung cấp thêm nhiệt lượng để kích thích tách các phân tử nước còn lại bên trong

vắc xin, vì các phân tử nước này thường bám rất chặt bên trong sản phẩm

Nhiệt độ kích ở giai đoạn này liên quan đến nhiệt độ sau cùng và tính ổn

định của vắc xin sau đông khô Nhiệt độ này cần thiết phải được điều chỉnh trong khoảng +30°C đến +50°C để vắc xin không bị hủy hoại

Ding lọ để đông khô sản phẩm cũng ảnh hưởng đến độ ẩm của sản

phẩm trong quá trình lưu giữ [15] M.Le Meste và cộng sự trong nghiên cứu năm 1985 đã cho thấy điểu này Các nút cao su đóng vai trò quan

trọng trong quá trình truyền nước vào lọ Vì vậy để vắc xin mẫu chuẩn được bảo đảm các tiêu chuẩn một cách tốt nhất nên đông khô vắc xin mẫu

chuẩn trong ống hơn là trong lọ

* Giống chuột: vắc xin mẫu chuẩn còn bị ảnh hưởng bởi các giống chuột

đưa vào kiểm tra công hiệu Z.Csizer và cộng sự trong nghiên cứu năm

1973 cho thấy cùng một mẫu chuẩn, nhưng khi tiến hành kiểm tra công hiệu trên các giống chuột khác nhau cho kết quả khác nhau [9][17]

12

- Chẳng sản xuất vắc xin Ho gà: sử dụng hai chẳng, ở dạng đông khô do

Viện (RIVM) Bilthoven - Hà lan cung cấp

* Bordetella.pertussis số 134, chứa các ngưng kết nguyên 1, 3, 7

* Bordetella.pertussis số 509, chứa các ngưng kết nguyên 1, 2, 5, 7,

1.1.2 Ching thử thách

Chủng được nhận từ viện RIVM, Hà Lan, mang mã số 18323, chứa các ngưng kết nguyên 1, 2, 3, 5, 7 Được kiểm tra và đông khô lại với số

lượng lớn Khi dùng để thử thách có thể sử dụng chủng ở dạng tươi, hay

dạng giữ trong nitơ lỏng Chủng được kiểm tra LDso liên tục qua các lần thử nghiệm

1.1.3 Độc tố thử thách

Độc tố Bạch hầu và Uốn ván đông khô sản xuất tại Viện vắc xin lô

DTx 01 (Diphtheria Toxin) va TTx 01 (Tetanus Toxin)

1.2 Vắc xin mẫu chuẩn Quốc tế

Vắc xin mẫu chuẩn Ho gò Quốc tế: mang mã số 66/302 có 46 TU/ếng

Vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván Quốc tế: mang mã số 12-383

Véie xin mau chuẩn Bạch hểu Quốc tế: mang mã số 13-204

Các loại VXMC này được nhận từ Trung Tâm mẫu chuẩn Quốc tế

1.3 Kháng nguyên dùng để sản xuất vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu-Uốn

ván

- Giải độc tố Bạch hau 1612 (3000 Lf/m]) và lô 21 (3200 Lf/ml)-được sản

xuất từ chủng PW No 8 2000 do Viện Human — Hungary cung cấp

- Giải độc tố Uốn ván lô 22 (1500 Lf/ml) dude sản xuất từ chủng

Clostridium tetani, ky hiéu 49205Y-IV, do Vién Human-Hungary cung

cấp

13

1.4 Môi trường

- Môi trường Bordet-Gengou, môi trường thạch máu (xem phụ lục 3)

- Dung dịch PBS, dung dịch Casein 1% (xem phụ lục 3)

- Môi trường Thioglycolate, môi trường Jensen (xem phu luc 3)

— Máy đông khô hiệu Ustfroid - Pháp

— Máy đóng ống tự động hiệu Bausch + Strobel - Đức

— Máy hàn ống tự động hiệu ES 100 Kumabe - Nhật Bản

— Nồi lên men 300 lít hiệu Chemap - Thụy Sĩ

— Nôi lền men 600 lít hiệu Engineering - Đức

sản xuất theo phương pháp đặt đĩa thạch của TCYTTG qui định Khu vực

giám sát gồm các tủ cấy vô trùng, phòng đóng ống, và phòng hàn ống 2.2 Sản xuất vắc xin mẫu chuẩn

2.2.1 Sản xuất vắc xin mẫu chuẩn Ho gà

Chúng tội theo phương pháp sản xuất của Viện Human — Hungary,

có nghiên cứu và điều chỉnh

Phương pháp sản xuất được tiến hành cụ thể như sau:

- Các ống chủng và dao cưa được sát trùng bằng cồn 70°

- Cắt ống chủng Khi mở ống chủng tránh không khí xâm nhập Ổ ạt vào miệng ống

14

- Hút vài giọt nước muối sinh lý, hoặc môi trường casein 1% cho vào ống

chủng, lắc đều thành huyền dịch

- Hút huyễển địch này cho vào đĩa thạch Bordet-Gengou có 30% máu cừu

Để tủ ấm 35°C, trong 48 giờ

- Vi khuẩn mọc trên mặt thạch tạo thành một lớp mịn, bóng

- Dùng que cấy thủy tỉnh uốn cong đâu, lấy một vệt cấy chuyển sang thạch BG ống Để tủ ấm 35°C trong 6 giờ

- Sau 6 giờ, gặt chủng bằng nước muối sinh lý, và cấy chuyển sang chai

đẹt (chai Roux) Mỗi chai cho vào khoảng 2-3 ml huyền dịch chủng và

láng đều trên mặt thạch Để tủ ấm 35°C trong 48 giờ

- Gặt chủng với nước muối sinh lý Lọc thô với vải mỏng vô trùng

- Ly tâm lạnh ở 4°C, 4000 vòng/ phút/ 30 phút, bổ nước nổi Rửa xác vi

khuẩn với dung dịch PBS có thêm 0,01% merthiolat

- Ly tâm lần hai, hoàn nguyên lại trong dung dịch PBS, giữ chủng ở đậm

độ 400 tỷ/ml ở 4°C trong 14 ngày và kiểm tra vô trùng

- Hỗn hợp hai chủng 134 và 509 theo tỷ lệ 1:1, thêm dextran 3%

- Dung dịch vắc xin được khuấy đều bằng máy khuấy từ trong điều kiện

vô trùng

- Dùng bơm tiêm bán tự động Cornwall, phân phối vắc xin vào ống thủy

tỉnh trung tính 2 ml Mỗi ống đóng 0,2 mi vắc xin Vắc xin sau khi phân

vào ống được đông khô

2.2.2 Sản xuất vắc xin mẫu chuẩn Bạch hau

Sơ đồ 1: Qui trình sản xuất vic xin mẫu chuẩn Bạch hầu

2.3 Đông khô vắc xin mẫu chuẩn

Thep phương pháp đông khô chung trên máy USIFROID của Pháp

Qui trình được chia làm hai công đoạn kế tiếp nhau: công đoạn làm

đông và công đoạn làm khô vắc xin Ở công đoạn làm khô chia thành hai gia1 đoạn:

Lầm khô cấp I (tách nước tự do): nước tự do thăng hoa từ trạng thái kết tỉnh sang trạng thái hơi, và ngưng tụ trên bể mặt của giàn ngưng tụ

Làm khô cấp II (tách nước liên kết): các phân tử nước liên kết còn lại

trong vắc xin thăng hoa và được ngưng tụ trên bể mặt giần ngưng tụ

2.3.1 Xác định điểm đông toàn phân của vắc xin mẫu chuẩn Ho gà,

vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu và vắc xin mẫu chuẩn Uốn vấn

- Thành phần trong Iml vắc xin mẫu chuẩn Ho gà:

Xác định điểm đông toàn phân của dung dịch bằng thiết bị chuyên

biệt của máy đông khô Thiết lập mối tương quan giữa nhiệt độ làm đông

và điện trở suất và vẽ đổ thị xác định điểm đông toàn phần của dung dịch 2.3.2 Khảo sát qui trình đông khô vắc xin mẫu chuẩn Ho gà

- Khảo sát tốc độ làm đông của vắc xin mẫu chuẩn Ho gà

Xác định nhiệt độ và vận tốc quạt theo thời gian làm đông tương

ứng với 6 QT làm đông sau:

* Có 3 qui trình với vận tốc quat 3 m/s và thời gian làm đông 4 giờ

e_ Nhiệt độ ban đầu: QT1: -10°C ; QT2: -15°C; QT3: -20°C

18

e©_ Nhiệt độ hình thành điểm đông —30°C

se Nhiệt độ đông toàn phần —40°C

* Có 3 qui trình với vận tốc quạt 1,8 m⁄s và thời gian làm đông 4 giờ

e_ Nhiệt độ ban đầu: QT4: -10°C ; QT5: -15°C; QT6: -20°C

e_ Nhiệt độ hình thành điểm đông —30°C

e Nhiét d6 đông toàn phần —40°C

Đánh giá kết quả hình thái tinh thể của 6 QT ở 2 tốc độ quạt chọn

qui trình làm đông có hình thái tỉnh thể đạt yêu cầu và đông khô 6 lô thí

nghiệm theo qui trình đã chọn

* Đánh giá hình dạng vật lý, độ ẩm tổn dư, công hiệu ở mỗi qui trình

Thí nghiệm được làm lại 3 lần, số mẫu trong một lô thí nghiệm gồm

100 ống vắc xin mẫu thử và 900 ống tá chất dextran 3%

2.3.3 Khảo sát qui trình đông khô vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu va

‹ ° x x ^^ 4

vắc xin mầu chuẩn Uốn ván

- Khảo sát tốc độ làm đông của vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu và vắc xin mẫu chuẩn Uốn vấn

Xác định nhiệt độ và vận tốc quạt theo thời gian làm đông tương

ứng với 6 qui trình làm đông sau:

*# Có 3 qui trình với vận tốc quạt 1,8 m/s và thời gian làm đông 4 giờ

« Nhiệt độ ban đầu: QT7: -8°C ; QT8: -12°C; QT9: -16°C e©_ Nhiệt độ hình thành điểm đông -24°C

e Nhiệt độ đông toàn phần —30°C

* Có 3 qui trình với vận tốc quạt 3 m⁄s và thời gian làm đông 4 giờ

e Nhiệt độ ban đầu: QT10: -§°C ; QT11: -12°C; QT12: -16°C e© Nhiệt độ hình thành điểm đông -24°C

e Nhiét d6 đông toàn phần —30°C

Đánh giá kết quả hình thái tinh thể của 6 QT ở 2 tốc độ quạt 3m/⁄s

và 1,Ñ8m⁄s, chọn qui trình có hình thái tinh thể đạt yêu cầu và đông khô 3

lô thí nghiệm của vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu và 3 lô thí nghiệm của vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván theo qui trình đã chọn

* Đánh giá hình dạng vật lý, độ ẩm tổn dư, công hiệu của vắc xin mẫu

chuẩn Bạch hầu và vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván

Thí nghiệm được làm lại 3 lần, số mẫu trong một lô thí nghiệm gồm

100 ống vắc xin mẫu thử và 900 ống tá chất dextran 3%

Sơ đô 3: Đông khô vắc xin mẫu chuẩn

HAN ONG TRONG CHAN KHONG

VAC XIN DONG KHO

BAO QUAN KIỀM TRA CHẤT LƯỢNG

20

2.4 Kiểm tra vắc xin mẫu chuẩn

2.4.1 Kiểm tra vô trùng (xem phụ bản 4)

2.4.2 Kiểm tra trọng lượng khô (xem phụ bản 4)

2.4.3 Kiểm tra độ ẩm tôn dư (xem phụ bản 4)

2.4.4 Kiểm tra công hiệu theo thường quy của Trung tâm Kiểm định

Quốc gia [6]

2.4.4.1 Phương pháp kiểm tra công hiệu của vắc xin mẫu chuẩn Ho gà

sau đông khô

Hoạt tính miễn dịch của vắc xin Ho gà được xác định bằng phương pháp so sánh liễu bảo vệ 50% (EDap) của vắc xin mẫu (vắc xin mẫu chuẩn

Ho gà Quốc tế) và liễu bảo vệ 50% vếc xửt thử (vắc xin mẫu chuẩn Ho gà

Việt Nam) Các kết quả thu được xử lý theo phương pháp thống kê Probit

Analysis

- Pha vắc xin mẫu và vắc xin thử

+ Vắc xin mẫu chuẩn Ho gà Quốc tế

Một ống vac xin mau chuẩn Quốc tế có 46 1U, được pha loãng trong

+,6ml nước muối sinh lý Như vậy mỗi mi chứa 10 1U (dung dịch A*) Từ

dung dịch A* pha loãng thành A =1/10 A* sau đó pha tiếp 2 độ pha loãng

Cách pha như sau :

Ký hiệu độ pha Đậm độ Cách pha

+ Vac xin m4u chuẩn Ho gà Việt Nam (vắc xin thử)

Đầu tiên cho vào ống vắc xin Iml nước muối sinh ly để hoàn nguyên, sau đó pha tiếp ba độ pha bậc 5:

* Tiêm niễn dịch

Dùng chuột nhắt trắng có trọng lượng từ 10-14g (chuột giống đực hoặc cái, nếu không thì phải chia đều số chuột đực cái trong các nhóm)

Mỗi độ pha của vắc xin mẫu và vắc xin thử được tiêm cho các nhóm

chuột (mỗi nhóm từ 20-22 con) Tiêm màng bụng, mỗi con 0,5ml Bốn

nhóm đối chứng, mỗi nhóm từ 10-12 con nuôi song song với chuột miễn

dịch

* Cách pha vì khuẩn để kiểm tra liều LD;ạ và để thử thách

+ Chuẩn bị chủng 18323 tươi

Dùng chủng B.Periussis 18323 đông khô LDsạ không lớn hơn 1000

vi khuẩn Từ ống đông khô, chủng được nuôi cấy trên môi trường Bordet - Gengou có tỷ lệ máu cừu là 30%, Gặt chủng đời 2 hoặc đời 3 sau 20-22 gIỜ

Vi khuẩn được gặt trong dung dịch 1% casein thủy phân Pha loãng

vi khuẩn để có 10 IOU/ml Đo độ đục bằng bộ đo độ đục chuẩn Quốc tế

Các độ pha loãng tiếp theo được pha như sau:

Liều tiêm là 0,01 mi Số vi khuẩn/ 0,01 ml

Trong khi pha vi khuẩn cũng như khi tiêm chuột, các ống vi khuẩn

phải để trong đá lạnh Thời gian để trong đá lạnh không được quá 150

phút, kể từ khi pha cho đến khi tiêm xong

+ Chuẩn bị chủng giữ trong nitơ lổng [18]

Giai đoạn đầu chuẩn bị chủng thử thách 18323 giữ trong nitơ lỏng, cũng giống như phân chuẩn bị chủng tươi, nhưng chủng ở đậm độ 1x10" vi

khudn/ ml (dung dich B)

Pha dung dich 10% DMSO trong casamino-acid (100 ml) Cho ty tr

99 ml dung dịch casamino-acid/DMSO (+4°C) vào 1ml huyển dịch vi

khuẩn ở đậm độ 1x10'' vi khuẩn/ ml (dung dịch B) Trong suốt quá trình

pha bình cầu được lắc nhẹ liên tục và làm lạnh trong đá

Đậm độ cuối cùng của huyền dịch này là 1x10 vi khuẩn/ ml

Huyễn dịch được cho vào những ống nhựa “nunc tubes”, mỗi ống 0,5 mỉ

và được làm lạnh trong đá Các ống này được cho vào các phễu bằng thép

không rỉ, và giữ trong bình nitơ lỏng Chú ý bình nitơ luôn luôn phải được làm đầy

Mỗi khi thử thách lấy ra 1 ống, làm tan chảy qua vòi nước thường và

pha chế như phân trên (phần chủng 18323 tươi )

* Xác định lều LD¿ạ theo phương pháp Reed va Muench

Sử dụng 4 độ pha loãng để tiêm (10.000 VK ; 2000 VK; 400 VK;

va 80 VK) Mỗi độ pha tiêm cho 10 chuột Tiêm vào não Hằng ngày quan sát số chuột trong từng nhóm hàng ngày Theo đõi chuột trong 14 ngày,

đếm số chuột sống, chết của từng ngày

+ Tiêm thử thách

Sau 14-17 ngày tiêm miễn dịch, chuột được thử thách bằng cách

tiêm vi khuẩn Ho gà vào não

e Đối với chuột thí nghiệm, thử thách ở độ pha (D) có 100.000 VK

(100x10°)

e Đối với chuột chứng, tiêm các độ pha E, F, G và H tương ứng với 10.000 VK; 2.000 VK; 400 VK và 80 VK

© Sau thử thách 3 ngày, các nhóm chuột thí nghiệm chỉ giữ lại mỗi nhóm

đúng 16 con để theo dõi

e Quan sát và đếm chính xác số chuột sống, chết từng nhóm và tính

LDao

+ Xác định hoạt tính của vắc xin Ho gà

Hoạt tính miễn dịch của vắc xin được đánh giá bằng cách so sánh

các đại lượng EDs theo phương pháp Probit-Analysis của WHO [27]

2.4.4.2 Phương pháp kiểm tra công hiệu vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu

Công hiệu của thành phần Bạch hầu trong vắc xin DPT được xác

định bằng phương pháp so sánh liễu bảo vệ 50% (EDso) của vắc xin mẫu

(vac xin mau chuẩn Bạch hầu Quốc tế) và vắc xử: thử (vắc xin mẫu chuẩn

Bạch hầu Việt Nam) Các kết quả thu được xử lý theo phương pháp thống

kê Probit - Analysis trên máy tính đã được TCYTTG chấp thuận

* Pha vắc xin mẫu và vắc xin thử

+ Vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu Quốc tế

Một ống vắc xin mẫu chuẩn Bạch hần Quốc tế chứa 132 IU/ ống

Cho 8,25 ml nước muối sinh lý vào I ống vắc xin, để mỗi ml chứa 16 IU

(dung dịch A) Mỗi lần thí nghiệm cần sử dụng 4 ống mẫu chuẩn (8,25 ml

‘x 4 = 33 ml ) Ty dung dich A pha tiếp 3 độ pha loãng bậc 2: 8 IU/ml; 4

1Ữ/ml; 2 IU/ml Cách pha như sau :

+ Vac xin mau chuẩn Bạch hầu Việt Nam

e© Vắc xin mẫu chuẩn Bạch hâu dạng đông khô (vắc xin thử)

Đầu tiên cho vào ống vắc xin 25ml nước muối sinh lý để hoàn nguyên

(dung dịch A), sau đó pha tiếp ba độ pha loãng bậc 2: B, C, D

e Vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu Việt Nam dạng nước (vac xin thử)

Vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu dạng nước được pha loãng bậc 2 trực

tiếp như sau:

* Tiêm miễn dich

Chuột lang có trọng lượng từ 250-2§0g được chia thành nhiều nhóm, chuột đực, cái riêng từng nhóm (nếu không thì phải chia đều số chuột đực

cái trong các nhóm)

Mỗi độ pha của vắc xin mẫu và vắc xin thử được tiêm cho các nhóm chuột (mỗi nhóm từ 12-15 con) Tiêm dưới da, mỗi con 1ml

* Tiêm thử thách

28 ngày sau khi têm miễn dịch, chuột được thử thách với độc tố

Bạch hầu DTx 01 Liễu thử thách: 50 LDzo Độc tố được pha trong dung

địch Jensen Theo đõi chuột trong vòng 4 ngày, ghi lại số chuột sống, chết từng ngày Liều LD¿o của độc tế được theo dõi qua chứng: liễu 0,5 LDaạ; 1 LDso; 2 LDsp M6i dam độ sử dụng 4 chuột lang

Chứng 2 LDso : Chuột chết hết

Chứng 1 LDạo: Tối thiểu có một con chết, nhưng không được chết cả 4 con

Chứng 0,5 LDao: Không có chuột chết

2.4.4.3 Phương pháp kiểm tra công hiệu vắc xin mẫu chuẩn Uén van

_Céng hiệu của vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván được xác định bằng phương pháp so sánh liễu bảo vệ 50% (EDao) của vắc xin mẫu (vắc xin

mẫu chuẩn Uốn ván Quốc tế) và vắc xử: thử (vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván

Việt Nam) Các kết quả thu được xử lý theo phương pháp thống kê Probit -

Analysis trên máy tính đã được WHO chấp thuận

- Pha vắc xin mẫu và vắc xin thử

+ Vắc xin mầu chuẩn Uốn ván Quốc tế

I1 ống vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván Quốc tế có chứa 170 IU/ ống Lấy 1 ống vắc xin mẫu chuẩn cho thêm 4,25ml nước muối sinh lý để có 40

IU/ml (dung dich A*)

Từ dung dich A* pha tiếp 3 độ pha lofng bac 2: 20 IU/ml; 10 IU/ml; S1U/ml

Cách pha như sau :

Ký hiệu độ pha Đâm độ Cách pha

* Vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván Việt Nam (vắc xin thử)

+ Vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván dạng đông khô

Đầu tiên cho vào ống vắc xin 9 ml nước muối sinh lý để hoàn

nguyền ( dung dịch A*), sau đó pha tiếp ba độ pha loãng bậc 2:

* Vac xin mầu chuẩn Uốn ván Việt Nam dạng nước

Vắc xin mẫu chuẩn Uốn ván dạng nước được pha loãng bậc 2 trực

tiếp như sau:

xin mẫu và vắc xin thử được tiêm cho các nhóm chuột (mỗi nhóm từ 16-20

con) Tiêm dưới da, mỗi con 0,5m],

- Tiêm thử thách

28 ngày sau khi tiêm miễn dịch, chuột được thử thách với độc tố

Uốn ván ký hiệu VN lot 01 Liễu thử thách:100 LDzo, độc tố được pha

trong dung dịch Jensen Liều LD¿o của độc tố được theo đõi qua chứng với các liều 0,5 LDap; 1 LDso; 2 LDso Mỗi đậm độ sử dụng 4 chuột nhất trắng

có trọng lượng từ 14-16 g Theo dõi chuột trong vòng 4 ngày, ghi lại số

chuột sống, chết từng ngày

Chứng 2LDaạ: Chuột chết hết

Chứng 1 LD¿o: Tối thiểu có một con chết, nhưng không được chết cả 4 con

Chứng 0,5 LDao: Không có chuột chết

2.4.5 Kiểm tra công hiệu vắc xin mẫu chuẩn sau sản xuất (cả vắc

xin đông khô và dạng nước)

Với phương pháp trên các vắc xin mẫu chuẩn Ho gà, Bạch hầu, Uốn ván sản xuất tại Viện vắc xin sau khi sản xuất được kiểm tra công hiệu để đánh giá hoạt tính miễn dịch của vắc xin

2.4.5.1 Kiểm tra tính ổn định công hiệu vắc xin mẫu chuẩn sau mỗi năm bảo quản ở ~20°C

Vắc xin mẫu chuẩn sau khi sản xuất được bảo quản ở -20°C đối với

vac xin đông khô và +4°C đối với vắc xin dạng nước Hàng năm phải

kiểm tra công hiệu để đánh giá hoạt tính miễn dịch của vắc xin

2.4.5.2 Kiểm tra tính ổn định công hiệu của vắc xin mẫu chuẩn ở 37°C

Để có thể xác định tính ổn định công hiệu của vac xin mau chuẩn ở

37°C vắc xin được đặt trong tủ ấm 37°C trong thời gian 1 tuần, 2 tuần, 4

tuần, 6 tuân, § tuần

2.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU (theo phương pháp Probit - Analysis)

Công hiệu tính bằng phương pháp Probit - Analysis với phần mềm

chương trình WHO [27] Các số liệu được xử lý theo chương trình phần

mềm Statgrafic để tìm số trung bình nhân (geometric mean), độ lệch chuẩn (standard deviation-SD), hoặc có thể xử lý theo phần mểm

Microsoft Excel

PHẦN THỨ II KET QUA VA BAN LUAN

L KET QUA

1.1 Kết quả sản xuất và đông khô vắc xin mẫu chuẩn Ho gà - Bach hầu

— Uốn ván

1.1.1 Kết quả sản xuất và đông khô vắc xin mẫu chuẩn Ho gà

1.1.1.1 Kết quả về sẵn xuất: Từ kết quả nghiên cứu chúng tôi rút ra

được qui trình sản xuất vắc xin mẫu chuẩn Ho gà sau:

Sơ đề 4: Qui trình sẵn xuất vắc xin mẫu chuẩn Ho gà

Giữ ở 4°C trong 14 ngày

- Kết quả xác định các thông số kỹ thuật của qui trình đông khô vắc xin

mẫu chuẩn Ho gà

* Xác định điểm đông toàn phần của vắc xin mẫu chuẩn Ho gà:

Điểm đông toàn phần của VXMC Ho gà đậm độ 200 tỷ TBVK/ml là-36°C Điểm đông toàn phân của VXMC Ho gà đậm độ 300 tỷ TBVK/ml là-38°C

* Xác định nhiệt độ và vận tốc quạt theo tốc độ làm đông

Xác định nhiệt độ và tốc độ quạt ở 3m⁄s và 3 1,8m/s theo thời gian làm đông tương ứng với nhiệt độ ban đầu được thay đổi trong quá trình Hình thành điểm đông, hình thành tỉnh thể và đông toàn phan theo 6 QT làm đông sau:

+ Ởó 3 QT với vận tốc quạt 3 m⁄s và thời gian làm đông 4 giờ, tổng thời gian đông khô 28 giờ

e© Nhiệt độ ban đầu: QT1: -10°C ; QT2: -15°C; Q13: -20°C

se _ Nhiệt độ hình thành điểm đông —30°C

«© Nhiệt độ đông toàn phần —40°C

+ Có 3 QT với vận tốc quạt 1,8 m⁄s và thời gian làm đông 4 giờ, tổng

thời gian đông khô 28 giờ

e Nhiệt độ ban đầu: QT4: -10°C ; QT5: -15°C; QTE: -20°C

e_ Nhiệt độ hình thành điểm đông -30°C

« _ Nhiệt độ đông toàn phần —40°C

BẰNG 2: MỐI LIÊN QUAN CỦA VẬN TỐC QUẠT VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN

HINH THAI TINH THE CUA VAC XIN MẪU CHUẨN HO GÀ SAU 4 GIỜ

Kết quả bảng 2 cho thấy với vận tốc quạt 3m/s và 1,8m⁄s, hình thái

tinh thể của 5 QT (QT 1, QT 2, QT 3, QT 4, QT 6) không đạt tiêu chuẩn để

tiến hành đông khô Chỉ có QT5 ở vận tốc quạt 1,&m⁄s, cho hình thái tỉnh thể mịn, màu trắng đục, đạt tiêu chuẩn để tiến hành đông khô Từ QT5

chúng tôi đã ứng dụng đông khô lô RP3 với số lượng 650 ống vắc xin mẫu

ống, thấp nhất 18,78 IU /ống

* Độ ẩm tần dư của vắc xin mẫu chuẩn Ho gà sau đông khô

Để hàn vắc xin đông khô, Viện vắc xin có sử dụng hai phương pháp hàn:

- _ Phương pháp hàn dưới điều kiện chân không

- Phuong pháp hàn với nitơ

Vắc xin sau khi đông khô được hàn bằng hai phương pháp Sau đó lấy mẫu và tiến hành kiểm tra độ ẩm tổn dư Kết quả sau kiểm tra được trình bày bảng 4

BANG 4: DO ẨM TON DU CUA VAC XIN MAU CHUAN HO GA

điều kiện chân không 3 0,55

Kết quả bảng 4 cho thấy, với phương pháp hàn vắc xin dưới điều kiện chân không có độ ẩm tổn dư 0,57 + 0,02 Phương pháp hàn vắc xin

dưới điều kiện nitơ có độ ẩm tổn dư 2,92 +0,11

Sơ để 5: Qui trình đông khô vắc xin mẫu chuẩn Ho gà

ĐÓNG TOÀN PHAN - Thời gian: Ì giờ 20

THANG HOA ị “A suất chân không;10)-10” Torr :

(Tach nước tự đo) - Thời gian duy trì: 12 giờ ị

Từ kết quả nghiên cứu gui trình sản xuất và đông khô của vắc xin mẫu

chuẩn Ho gà, chúng tôi tiến hành sản xuất lô vắc xin mẫu chuẩn Ho gà ký

hiệu RP3 với số lượng 650 ống

1.1.1.2 Kết quả kiểm tra chất lượng và tính ổn định của vắc xin mẫu

chuẩn Ho gà theo thời gian và nhiệt độ bảo quản khác nhau

- Kết quả kiểm tra vô trùng vắc xin mẫu chuẩn Ho gà thành phẩm sau khi đông khô

Vắc xin mẫu chuẩn Ho gà san khi đông khô được tiến hành kiểm tra

vô trùng Qua kiểm tra vắc xin đạt yêu câu vô trùng Vì vậy chúng tôi tiến hành kiểm tra các tiêu chuẩn khác như trọng lượng khô, độ ẩm, công hiệu

và tính ổn định

- Trọng lượng khô của vắc xi mẫu chuẩn Ho gà sau đông khô

Vắc xin mẫu chuẩn sau khi đông khô, được tiến hành kiểm tra tính đồng nhất về hàm lượng vắc xin bằng cách cân trọng lượng khô Kết quả được trình bày ở bảng 5

_ BẰNG 5: KẾT QUÁ TRỌNG LƯỢNG KHÔ CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN

HO GÀ SAU ĐÔNG KHÔ (n=10)

Kết quả (mg/ống)

21,9 20,7 21,3 20,2 21,0 21,3 20,9 20,6 21,4 21,1

Ở bảng 5 cho thấy trọng lượng khô trung bình 21,4 mg/ống và độ

lệch chuẩn 0,48 Ông cao nhất đạt 21,9 mg, ống thấp nhất đạt 20,2 mg

32

Tính ổn định công hiệu vắc xin mẫu chuẩn Ho gà đông khô được bảo

quản ở —20°C sau 6 đông khô, 12 tháng, 24 tháng, 36 tháng, 48 tháng

và 60 tháng

BẢNG 6: KẾT QUẢ CÔNG HIỆU VẮC XIN MẪU CHUẨN HO GÀ TRONG

QUA TRINH THEO DOI TU SAU DONG KHO DEN 60 THANG *

*Công hiệu trung bình của n lần thí nghiệm

** Số liệu do Viện Vắc xin phối hợp với TTKĐQG kiểm tra

- Tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn Ho gà đông khô ở 37°C sau thời

gian 1 tuân, 2 tuân, 4 tuần, 6 tuần và 8 tuân

BẰNG 7: CÔNG HIỆU VẮC XIN MẪU CHUẨN HO GÀ Ở 37°C TRONG QUÁ

TRÌNH THEO DỐI TỪ 1 TUẦN -8 TUẦN

* Công hiệu trung bình của n lần thí nghiệm

1.1.1.3 Dùng vắc xim mẫu chuẩn Ho gà Việt Nam và vắc xin mẫu

chuẩn Ho gà Quốc tế để kiểm tra đối chứng song song công hiệu nước cốt