Giai đoạn khởi phát, tăng sinh và phát triển của bệnh ung thư, hoặc các tác dụng phụ của quá trình hóa trị và xạ trị đều có liên quan đến sự mất cân bằng giữa ROS và hệ thống phòng vệ [r]
Trang 1BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-
Nguyễn Thanh Quang
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY
CỦA MỘT SỐ RAU XANH VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS VÕ THANH SANG
Tp Hồ Chí Minh – 2020
Trang 2LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin được cam đoan đề tài “Khảo sát hoạt tính ức chế tế bào ung thư
dạ dày của một số rau xanh Việt Nam” được tiến hành công khai, dựa trên sự
cố gắng nổ lực của bản thân dưới sự hướng dẫn nhiệt tình của thầy TS Võ Thanh Sang và sự hỗ trợ từ các phòng thí nghiệm của trường Đại học Văn Lang cũng như trường Đại học Nguyễn Tất Thành
Các số liệu nghiên cứu và kết quả trong đề tài là trung thực và hoàn toàn không sao chép hoặc sử dụng kết quả của bất kỳ đề tài nghiên cứu nào tương
tự Nếu phát hiện có sự sao chép kết quả của đề tài khác, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm
Tp Hồ Chí Minh, Ngày tháng năm 2020
Tác giả
Nguyễn Thanh Quang
Trang 3LỜI CÁM ƠN
Để hoàn thành luận văn Thạc sĩ này, trước tiên tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Võ Thanh Sang, người thầy đã định hướng, trực tiếp dẫn dắt
và cố vấn cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học Thầy cũng là người đã cho tôi rất nhiều bài học cả về chuyên môn lẫn cách làm việc thông qua các đề tài, dự án của mình và giúp tôi định hướng phát triển trong sự nghiệp Một lần nữa tôi xin gửi lời cám ơn đến thầy bằng tất cả tấm lòng và sự biết ơn của mình
Bên cạnh đó, tôi xin phép được gửi đến quý Thầy/Cô là Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình truyền đạt cho tôi các kiến thức chuyên môn hữu ích cũng như hỗ trợ tôi trong quá trình học tập và làm luận văn
Tôi cũng đồng thời xin gửi lời cám ơn đến PGS.TS Lê Thị Kim Oanh, Trưởng khoa Công nghệ, trường Đại học Văn Lang, TS Vũ Thị Quyền, Trưởng ngành Công nghệ Sinh học, khoa Công nghệ, trường Đại học Văn Lang cùng các anh chị là đồng nghiệp, là các Giảng viên, Nghiên cứu viên của trường Đại học Văn Lang và trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã luôn tạo điều kiện giúp tôi vượt qua những ngày tháng khó khăn trong công tác cũng như trong quá trình thực hiện luận văn
Ngoài ra, tôi chân thành gửi lời cám ơn đến các bạn sinh viên của trường Đại học Văn Lang và trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã luôn đồng hành bên cạnh, ủng hộ, động viên và hỗ trợ tôi hết mình trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thiện luận văn Thạc sĩ một cách hiệu quả nhất
Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến ba và mẹ của tôi, người đã đồng hành cùng tôi vượt qua bao lần vấp ngã để có được thành quả ngày hôm nay Con xin cám ơn ba mẹ
Tôi xin chân thành cám ơn tất cả mọi người./
Trang 4MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CÁM ƠN ii
MỤC LỤC 1
DANH MỤC HÌNH 4
DANH MỤC BẢNG 6
MỞ ĐẦU 7
Lý do chọn đề tài 7
Mục tiêu của đề tài 7
Đối tượng nghiên cứu 8
Phạm vi nghiên cứu 8
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 8
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9
1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ DẠ DÀY 9
1.1.1 Giới thiệu ung thư dạ dày 9
1.1.2 Tác động của ung thư dạ dày 9
1.1.3 Đặc điểm và phân loại bệnh 10
1.1.4 Các liệu pháp cho việc chữa trị 11
1.1.5 Khuyến nghị 11
1.2 TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH APOPTOSIS CỦA TẾ BÀO 12
1.3 SỰ OXY HÓA VÀ CÁC CHẤT KHÁNG OXY HÓA 13
1.3.1 Sự oxy hóa 13
1.3.2 Gốc tự do 14
1.3.3 Stress oxy hóa và các bệnh ở người 14
Trang 51.4 CÁC HỢP CHẤT PHENOLIC 16
1.5 CÁC LOẠI RAU XANH TRONG NGHIÊN CỨU 18
1.5.1 Rau sam 18
1.5.2 Rau diếp cá 20
1.5.3 Rau nhút 21
1.6 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 23
1.6.1 Các nghiên cứu ngoài nước 23
1.6.2 Các nghiên cứu trong nước 24
CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU CHUNG 26
2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU 27
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.3.1 Tách chiết 27
2.3.2 Xác định độ ẩm mẫu 28
2.3.3 Xác định hàm lượng tro toàn phần 29
2.3.4 Định lượng hợp chất phenol trong cao chiết 29
2.3.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa thông qua quét gốc DPPH 30
2.3.6 Khảo sát khả năng bắt gốc tự do bằng phương pháp ABTS+ 31
2.3.7 Khảo sát độc tính của cao chiết lên tế bào 32
2.3.8 Khảo sát hình thái tế bào ung thư 33
2.3.9 Khảo sát về khả năng ức chế di chuyển của tế bào ung thư 34
2.3.10 Đánh giá mức biểu hiện gene của các phân thử tính hiệu bằng Realtime PCR 34
2.3.11 Xử lý số liệu 35
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
Trang 63.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT CÁC LOẠI RAU 36
3.2 KẾT QUẢ VỀ ĐỊNH LƯỢNG HỢP CHẤT PHENOLIC TỔNG TRONG CAO ETHANOL TỪ CÁC LOẠI RAU 37
3.3 KẾT QUẢ SÀNG LỌC VỀ HOẠT TÍNH TIÊU DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY CỦA CAO ETHANOL TỪ CÁC LOẠI RAU 38
3.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT VỀ HÀM LƯỢNG PHENOLIC TỔNG TRONG CÁC CAO PHÂN ĐOẠN RAU NHÚT 41
3.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT VỀ HOẠT TÍNH TIÊU DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY CỦA CÁC CAO PHÂN ĐOẠN RAU NHÚT 43
3.6 KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI HÌNH THÁI TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY CỦA RAU NHÚT 46
3.7 KẾT QUẢ KHẢO SÁT VỀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ DI CHUYỂN CỦA TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY CỦA RAU NHÚT 48
3.8 KẾT QUẢ KHẢO SÁT VỀ SỰ THAY ĐỔI CÁC TÍN HIỆU NỘI BÀO LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƯỜNG CHẾT TẾ BÀO APOPTOSIS CỦA RAU NHÚT 49
3.9 KẾT QUẢ KHẢO SÁT VỀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA CAO CHIẾT ETHANOL VÀ CAO PHÂN ĐOẠN EtOAc TỪ RAU NHÚT 51
3.9.1 Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH 51
3.9.2 Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS+ 54
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57
4.1 KẾT LUẬN 57
4.2 KIẾN NGHỊ 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 58
PHỤ LỤC 70
Trang 7DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Các con đường tín hiệu liên quan đến hoạt hóa apoptosis [6] 12
Hình 1.2 Phân loại và cấu trúc hóa học của những nhóm chính của hợp chất phenolic 17
Hình 1.3 Rau sam (nguồn internet) 18
Hình 1.4 Rau diếp cá (nguồn internet) 20
Hình 1.5 Rau nhút (nguồn internet) 22
Hình 3.1 Đường chuẩn axit galic 37
Hình 3.2 Hàm lượng phenolic tổng của các loại rau 38
Hình 3.3A Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao chiết rau nhút 39
Hình 3.3B Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao chiết rau sam 39
Hình 3.3C Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao chiết rau diếp cá 40
Hình 3.4 Giá trị IC 50 đối với hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của các loại rau 40
Hình 3.5 Hàm lượng phenolic tổng trong các cao phân đoạn của rau nhút 42
Hình 3.6A Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao phân đoạn hexan từ rau nhút 44
Hình 3.6B Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao phân đoạn CH 2 Cl 2 từ rau nhút 44
Hình 3.6C Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao phân đoạn EtOAc từ rau nhút 45
Hình 3.6D Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao phân đoạn n-butanol từ rau nhút 45
Hình 3.7 Giá trị IC 50 đối với hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của các cao phân đoạn từ rau nhút 46
Hình 3.8A Hình thái tế bào ung thư dạ dày trước và sau khi xử lý cao phân đoạn EtOAc rau nhút 47
Trang 8Hình 3.8B Hình thái tế bào ung thư dạ dày trước và sau khi xử lý cao phân đoạn EtOAc rau nhút khi được nhuộm với chất chỉ thị huỳnh quang calcein-AM 47 Hình 3.9 Hoạt tính ức chế di chuyển của cao phân đoạn EtOAc từ rau nhút đối với
tế bào ung thư dạ dày 49 Hình 3.10 Khả năng hoạt hóa các gene tham gia con đường apoptosis của cao phân đoạn EtOAc từ rau nhút trên dòng tế bào ung thư dạ dày 50 Hình 3.11A Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH của vitamin C 52 Hình 3.11B Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH của cao tổng ethanol rau nhút 52 Hình 3.11C Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH của cao phân đoạn EtOAc rau nhút 53 Hình 3.12 Giá trị IC 50 đối với hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH của vitamin C, cao tổng ethanol và cao phân đoạn EtOAC rau nhút 53 Hình 3.13A Hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS+ của vitamin C 54 Hình 3.13B Hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS + của cao tổng ethanol rau nhút 54 Hình 3.13C Hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS + của cao phân đoạn EtOAc rau nhút 55 Hình 3.14 Giá trị IC 50 đối với hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS + của vitamin C, cao tổng ethanol và cao phân đoạn EtOAC rau nhút 55
Trang 9DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao và Vitamin C bằng phương pháp DPPH 31 Bảng 2.2 Bố trí thí nhgiệm khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao và Vitamin C bằng phương pháp ABTS+ 32 Bảng 3.1 Kết quả thu nhận cao chiết từ các loại rau 36 Bảng 3.2 Kết quả thu nhận cao phân đoạn từ rau nhút 42
Trang 10MỞ ĐẦU
Lý do chọn đề tài
Ung thư dạ dày hiện đang xếp vào loại ung thư phổ biến thứ tư và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong liên quan đến ung thư trên toàn thế giới Xu hướng gia tăng bệnh chủ yếu tập trung ở các nước châu Á và các vùng miền có thu nhập thấp Cho đến nay, hiệu quả điều trị ung thư dạ dày không mấy khả quan và tỷ lệ sống trung bình trong nhóm này vẫn còn dưới một năm Ung thư dạ dày là một bệnh phức tạp, đòi hỏi sự theo dõi và nghiên cứu liên tục về phòng ngừa, phát hiện sớm và các phác đồ điều trị mới Hiện nay, một
số phương pháp đã được sử dụng cho điều trị ung thư dạ dày, tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, đáp ứng với điều trị là rất yếu và gây ra nhiều tác dụng phụ Vì vậy, việc tìm kiếm phương pháp mới để hỗ trợ chữa trị ung thư là điều cần thiết cần phải liên tục nghiên cứu Xuất phát từ thực trạng đó, nhiều nghiên cứu trên cây thuốc và bài thuốc từ các hợp chất thiên nhiên mang lại tiềm năng lớn cho nhu cầu trị liệu ung thư lâu dài và an toàn Vì vậy, các sản phẩm có nguồn gốc thảo dược đang được khuyến khích để sử dụng nhằm phòng và hỗ trợ điều trị bệnh, trong đó có ung thư dạ dày Đặc biệt, Việt Nam được biết đến với nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú và đa dạng Từ lâu, nhiều cây cỏ và rau xanh đã được sử dụng trong dân gian để phòng và hỗ trợ kiểm soát bệnh, trong đó có ung thư dạ dày Tuy nhiên, cơ sở khoa học cho việc chứng minh cơ chế hoạt động của các dược liệu đó trong các bài thuốc dân gian đối với ung thư dạ dày vẫn còn chưa rõ ràng Xuất phát từ thực tế đó, đề tài luận văn “Khảo sát hoạt tính ức chế tế bào ung thư dạ dày của một số rau xanh Việt Nam” được
triển khai thực hiện
Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu chung
- Sàng lọc và đánh giá được hoạt tính ức chế sinh trưởng và tiêu diệt tế
bào ung thư dạ dày của một loại rau ăn trên mô hình thí nghiệm In-vitro
Mục tiêu cụ thể
Trang 11- Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao tổng và cao phân đoạn được sàng lọc
- Khảo sát khả năng tiêu diệt và ức chế di chuyển tế bào ung thư dạ dày của cao phân đoạn được sàng lọc
Đối tượng nghiên cứu
- Rau sam, rau diếp cá, rau nhút
- Tế bào ung thư dạ dày BGC-823 có nguồn gốc từ ngân hàng tế bào Học
viện Khoa học Trung Quốc, Thượng Hải, Trung Quốc
Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu trên 3 đối tượng rau ăn hàng ngày là rau sam, rau diếp cá và rau nhút được bán tại các cửa hàng rau sạch đạt tiêu chuẩn Việt Gap trên địa bàn quận 7, Tp Hồ Chí Minh
- Mô hình khảo sát hoạt tính kháng ung thư là mô hình In-vitro
- Thí nghiệm được tiến hành trong phòng thí nghiệm của trường Đại học Nguyễn Tất Thành và trường Đại học Văn Lang Tp Hồ Chí Minh
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Nghiên cứu này sẽ giúp chúng ta thấy được vai trò có lợi của một số loại rau đối với việc ức chế sự sinh trưởng và tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày, từ đó nhận thấy được vai trò và tác dụng của các loại rau ăn hàng ngày đối với việc phòng ngừa và hỗ trợ điều trị ung thư dạ dày
Kết quả nghiên cứu sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn và nghiên cứu lâm sàng để tiến đến sản xuất ứng dụng phục vụ nhu cầu cộng đồng trong việc phòng ngừa ung thư dạ dày
Trang 12CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ DẠ DÀY
1.1.1 Giới thiệu ung thư dạ dày
Ung thư dạ dày là một căn bệnh hiểm nghèo gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người bệnh trên toàn cầu Ung thư dạ dày hiện đang xếp vào loại ung thư phổ biến thứ tư và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong liên quan đến ung thư trên toàn thế giới [1] Mặc dù tỷ lệ tử vong đang có xu hướng giảm do chế độ dinh dưỡng được cải thiện, sự bảo quản thực phẩm tốt, sự phòng ngừa bệnh tốt hơn, sự chẩn đoán và điều trị sớm hơn, nhưng bệnh này vẫn có
xu hướng diễn tiến theo chiều hướng xấu Cho đến nay, ung thư dạ dày thường được chẩn đoán ở giai đoạn tiến triển của bệnh Về cơ bản, phương thức điều trị phổ biến vẫn là phẫu thuật cắt bỏ bằng hóa trị bổ trợ hoặc hóa trị trong các trường hợp thích hợp, giúp cải thiện khả năng sống sót [2] Tuy nhiên, hiệu quả điều trị ung thư dạ dày không mấy khả quan và tỷ lệ sống trung bình trong nhóm này vẫn còn dưới một năm [3] Ung thư dạ dày là một bệnh phức tạp, đòi hỏi sự theo dõi và nghiên cứu liên tục về phòng ngừa, phát hiện sớm và các phác đồ điều trị mới
Sự phân bố ung thư dạ dày thay đổi đáng kể giữa các khu vực địa lý Đặc biệt, các quốc gia châu Á chiếm phần lớn các trường hợp trên thế giới [4] Ngay
cả trong các khu vực có tỷ lệ người mắc bệnh cao, đa số người mắc bệnh là những người có thu nhập thấp [5]
Các yếu tố như môi trường và chế độ dinh dưỡng có liên quan đến sự phát triển của bệnh Những thực phẩm được bảo quản bằng muối nitrat, thực phẩm hun khói hoặc ngâm giấm có liên quan đến việc tăng nguy cơ phát triển
ung thư dạ dày [6] Nhiễm trùng niêm mạc mãn tính do vi khuẩn Helicobacter
pylori cũng được xem là nguyên nhân quan trọng gây ra ung thư dạ dày [7]
1.1.2 Tác động của ung thư dạ dày
Theo thống kê, 73% các trường hợp ung thư dạ dày được chẩn đoán ở các nước châu Á và gần 50% các trường hợp trên thế giới được phát hiện ở
Trang 13trường hợp mắc ung thư dạ dày [8] Đặc biệt, tỷ lệ mắc bệnh ở nam giới cao gấp đôi phụ nữ và tỷ lệ mắc bệnh tăng theo độ tuổi Ngay cả trong cùng một khu vực địa lý, một số nhóm dân tộc có nguy cơ mắc bệnh cao hơn đáng kể Ở Hoa Kỳ, người gốc Tây Ban Nha, người Mỹ gốc Phi và người Mỹ bản địa thường bị ảnh hưởng nhiều hơn người Mỹ da trắng [9] Tuy nhiên, tình trạng kinh tế xã hội cũng ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ mắc bệnh ung thư dạ dày
Tỷ lệ mắc ung thư dạ dày có thể được phân chia thêm theo vị trí của nó trong dạ dày như ung thư tại phần xa của dạ dày (noncardia) và ung thư phát sinh ở khu vực gần tim [10] Sự phân biệt giữa bệnh tim và bệnh noncardia rất quan trọng vì có biểu hiện gần giống nhau nhưng có nguyên nhân khác nhau
Nhìn chung, các quốc gia kém phát triển có tỷ lệ bệnh ung thư dạ dày cao hơn các nước phát triển Trong tất cả các quốc gia bị ảnh hưởng, ung thư
dạ dày noncardia có nhiều khả năng ảnh hưởng đến những người thuộc nhóm
thu nhập thấp [5] Tương tự, nguy cơ nhiễm Helicobacter pylori có liên quan
đến tình trạng thu nhập thấp, tình trạng quá tải và mất vệ sinh [10]
1.1.3 Đặc điểm và phân loại bệnh
Một số hệ thống phân loại dùng để xác định ung thư dạ dày nhưng thường được sử dụng nhất là phân loại Lauren Phân loại Lauren được định nghĩa theo hai loại bao gồm loại ruột và loại khuếch tán [11] Mỗi phân nhóm đại diện cho các đặc điểm lâm sàng và dịch tễ khác nhau Có rất ít trường hợp ung thư dạ dày hiển thị các đặc điểm của cả hai loại trên Sự khác biệt về hình thái giữa hai loại có liên quan đến các phân tử bám dính nội bào
Khuếch đại gene là một kiểu biểu hiện thường xuyên của sự thay đổi gene trong ung thư dạ dày Sự biểu hiện quá mức protein như vậy có thể được phát hiện bởi phân tích hóa mô miễn dịch Khuếch đại của thụ thể liên quan yếu tố tăng trưởng biểu bì 2 (HER2) được thấy trong các khối u đại trực tràng, phổi, dạ dày và buồng trứng [12] Trong ung thư dạ dày, biểu hiện quá mức HER2 được báo cáo ở 7-34% của khối u, đặc biệt là ở ngã ba thực quản dạ dày
và trong các tổn thương đường ruột [13] Sự biểu hiện quá mức của yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGFR) đã được chứng minh là một dấu hiệu cho dấu hiệu xấu