• Kỹ thuật PCR hay còn được gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase được Kary Mullis phát minh vào năm 1983... Kỹ thuật này được phát minh nhờ sự phát hiện ra Taq polymerase, là mộ[r]
Trang 1CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG
(SH3014)
1
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Trang 2CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI
(10 TIẾT)
2
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Trang 3PCR
Polymerase Chain Reaction
3
Trang 4Sự phát minh ra kỹ thuật PCR
• Kỹ thuật PCR hay còn được gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase được Kary Mullis phát minh vào năm 1983
• Hai năm sau (1985), phát minh này được chính thức công bố trên tạp chí khoa học quốc tế
• Với công trình này, Kary Mullis được tặng giải thưởng Nobel hóa học năm 1993
“Sự phát minh của kỹ thuật này xứng đáng được coi là một bước ngoặt hay một kỹ thuật mang tính cách mạng thúc đẩy sự phát triển của Công nghệ sinh học hiện đại” (J Watson)
4
Trang 5Kỹ thuật PCR là một phương pháp cho phép nhân nhanh số lượng lớn một đoạn DNA
5
Khái niệm
Phương pháp này có độ nhạy rất cao và ngày nay đã
trở thành một công cụ nghiên cứu đầu tay trong phần
lớn các phòng thí nghiệm có liên quan đến gen và DNA
thuộc các lĩnh vực khoa học sinh học, nông nghiệp, môi
trường, y tế, dược phẩm, pháp y …
Trang 6• Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme DNA polymerase để nhân bản một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide (primer) tương hợp với hai đầu 3’ ở hai mạch đơn của đoạn DNA
Kỹ thuật này được phát minh nhờ sự phát hiện
ra Taq polymerase, là một DNA polymerase từ vi
khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước
nóng
6
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
Trang 77
Sự tái bản DNA trong cơ thể sống
Trang 8• DNA khuôn: mang trình tự cần nhân
lên
(mồi xuôi và mồi ngược)
• Polymerase chịu nhiệt
• Mg2 +: cofactor của enzyme
của dung dịch phản ứng cho phù hợp
với hoạt động của enzyme
8
Thành phần của PCR
Trang 9Có 3 giai đoạn chính trong một phản ứng PCR và
động hóa nhờ Thermo cycler, là thiết bị có khả năng tăng và giảm nhiệt độ của ống phản ứng trong thời gian ngắn
1 Biến tính (denaturation): hai sợi của chuỗi xoắn kép
được duỗi xoắn và tách nhau rnhờ nhiệt cao (94-95 o C)
2 Gắn mồi (primer annealing): Nhiệt độ phản ứng được
giảm xuống (55-50 o C) để các mồi gắn vào các sợi DNA tương ứng theo nguyên tắc bổ sung của các base
3 Kéo dài (extension): Phản ứng trùng hợp phân tử DNA
được thực hiện nhờ enzyme DNA polymerase
(65-75 o C) để kéo dài mạch tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung với sợi khuôn từ đầu 3’ – 5
9
Các giai đoạn trong phản ứng PCR
Trang 10Chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 bước được lặp đi lặp lại nhiều lần Nhờ vậy, trong vài giờ ta có thể thu được hàng triệu bản copy của một đoạn DNA nào đó,
đủ cho các mục đích thí nghiệm khác nhau
10
Chu kỳ phản ứng PCR
Hçn hîp ph¶n øng PCR
G§
1
G§
2
G§
3
B¾t ®Çu chu kú míi (2) Nh¾c ®i nh¾c l¹i n chu kú
Thêi gian (phót)
Chu kỳ nhiệt:
Bước 1: 94 o C, 30 giây Bước 2: 94 o C, 15 giây Bước 3: 55 o C, 30 giây Bước 4: 72 o C, 1.5 phút Bước 5: lặp lại từ bước 2-4 trong 35 lần
Bước 6: 72 o C, 10 min Bước 7: 4 o C f- bảo quản Bước 8: Kết thúc