Sự lai hóa phân tử có thể hiểu theo một nghĩa khái quát là một chiến lược thiết kế các phối tử một cách hợp lý để làm xuất hiện các cấu trúc của chất mẫu hoặc dựa trên sự nhận biết các[r]
Trang 1gfd
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-o0o -
NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM, KHÁNG UNG THƢ CÁC HỢP CHẤT LAI COXIB –
COMBRETASTATIN
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
HÀ NỘI - 2021
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌCVÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-
NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM, KHÁNG UNG THƯ CÁC HỢP CHẤT LAI COXIB –
COMBRETASTATIN Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số : 9.44.01.14
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS TS Ngô Quốc Anh
2 PGS.TS Vũ Đình Hoàng
HÀ NỘI - 2021
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và các cộng sự Các kết quả nghiên cứu không trùng lặp và chưa từng công bố trong tài liệu khác
Hà Nội, ngày tháng năm 2021
Tác giả
Nguyễn Thị Thúy Hằng
Trang 4LỜI CẢM ƠN
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngô Quốc Anh và PGS.TS
Vũ Đình Hoàng những người thầy đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo truyền động lực, niềm đam mê cũng như nhiệt huyết khoa học cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án
Tôi xin trân thành cảm ơn các thầy cô đã giảng dạy và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa học, Học viện Khoa học và Công nghệ, các phòng chuyên môn, các cán bộ nghiên cứu phòng Nghiên cứu và phát triển dược phẩm – Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã ủng hộ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án
Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn ở bên, động viên tôi hoàn thành bản luận án này
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Thị Thúy Hằng
Trang 5MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN 3
LỜI CẢM ƠN 4
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 8
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1 Khái niệm hợp chất lai 3
1.2 Tổng quan về các chất lai chống ung thư 3
1.2.1 Các hợp chất lai chống ung thư dựa trên chất ức chế tubulin 3
1.2.2 Các chất lai chống ung thư dựa trên các hợp chất isatin 4
1.2.3 Các chất lai chống ung thư dựa trên nhóm chất coumarin 5
1.2.4 Các chất lai chống ung thư dựa trên nhóm chất steroid 5
1.2.5 Các chất lai chống ung thư dựa trên pyrrolo benzodiazepin 6
1.2.6 Một số chất lai theo cơ chế khác 7
1.3 Khái niệm và vai trò tubulin 7
1.4 Các chất lai chống ung thư dựa trên chất ức chế tubulin 8
1.4.1 Hợp chất lai dựa trên cấu trúc combretastatin (1) 9
1.4.2 Thuốc lai dựa trên cấu trúc colchicin (2) 10
1.4.3 Thuốc lai dựa trên cấu trúc podophyllotoxin 11
1.4.4 Hợp chất lai dựa trên cấu trúc chalcon 12
1.4.5 Thuốc lai dựa trên cấu trúc taxol 13
1.4.6 Thuốc lai dựa trên cấu trúc vinca alkaloid 14
1.5 Các hợp chất lai combretastatin 15
1.5.1 Tổng quan hợp chất combretastatin 15
1.5.2 Các chất lai combretastatin 21
1.6 Tổng quan về cơ chế COX2 và pyrazol 25
1.6.1 Tổng quan về cơ chế COX2 25
1.6.2 Các hợp chất pyrazol 26
1.6.3 Các hợp chất lai pyrazol 27
Trang 61.7 Mục tiêu của luận án 29
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 31
2.1 Hóa chất và thiết bị 31
2.1.1 Hóa chất và dung môi 31
2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 31
2.2 Các phương pháp nghiên cứu 31
2.2.1 Phương pháp tổng hợp hữu cơ 31
2.2.2 Tinh chế và xác định cấu trúc 32
2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 32
2.3 Tổng hợp các hợp chất lai coxib - combrestatin 32
2.3.1 Tổng hợp các dẫn chất este của chất lai este coxib - combretastatin 32
2.3.1.1 Con đường tổng hợp các dẫn chất este của hợp chất lai hóa coxib - combrestatin 32
2.3.1.2 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất este của chất lai coxib- combrestatin33 Phản ứng được tổng hợp theo sơ đồ sau: 33
2.3.1.3 Quy trình tổng hợp các dẫn chất este của chất lai coxib - combrestatin 33
2.3.1.4 Kết quả của quy trình tổng hợp 34
2.3.2 Tổng hợp hợp chất lai coxib - combrestastatin chứa nhóm CF 3 35
2.3.2.1 Con đường tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF 3 35
2.3.2.2 Phản ứng tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF 3 36
2.3.2.3 Quy trình tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF 3 36
2.3.2.4 Kết quả của quy trình tổng hợp 36
2.3.3 Tổng hợp các dẫn chất axit của hợp chất lai coxib - combretastatin 37
2.3.3.1 Con đường tổng hợp các dẫn chất axit của chất lai coxib - combrestatin 37
2.3.3.2 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất axit của chất lai coxib - combrestatin 38
2.3.3.3 Quy trình tổng hợp các dẫn chất axit của chất lai coxib - combretastatin 39
Trang 72.3.3.4 Kết quả của quy trình tổng hợp 40
2.4 Nghiên cứu hoạt tính sinh học 40
2.4.1 Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào (HT-29, Hep-G2, MCF7 ) và khả năng ức chế sản sinh NO 40
2.4.1.1 Nghiên cứu hoạt tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) 40
2.4.1.2 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế nitric oxide 40
2.4.2 Nghiên cứu hoạt tính ức chế PGE2 42
2.4.3 Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis 43
2.5.3.1 Nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis của hoạt chất nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342 43
2.5.3.2 Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis qua Flow cytometry 43
2.5.3.3 Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis bằng caspase 3 44
2.4 Nghiên cứu docking phân tử 44
CHƯƠNG 3: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 47
3.1 Thiết kế cấu trúc và hoạt tính sinh học của phân tử lai 47
3.1.1 Thiết kế cấu trúc phân tử lai 47
3.1.2 Thiết kế hoạt tính sinh học phân tử lai 48
3.2 Tổng hợp các hợp chất lai coxib - combretastatin 49
3.3 Hoạt tính sinh học các hợp chất lai coxib - combretastatin 72
3.3.1 Sàng lọc hoạt tính sinh học các hợp chất lai coxib - combretastatin 73
3.3.2 Nghiên cứu cơ chế kháng viêm và kháng ung thư 78
3.3.2.1 Nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2 78
3.3.2.2 Phân tích chu kỳ tế bào 79
3.3.2.3 Nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis của hai chất 82 và 102 81
3.4 Nghiên cứu docking phân tử 88
3.5 Thảo luận 95
KẾT LUẬN 96
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 98
TÀI LIỆU THAM KHẢO 99
Trang 8DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
ESI-MS Electrospray Ionization Mass
Resonance Spectroscopy
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
13
C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon
13
Trang 9Rt Room temperature Nhiệt độ phòng
TMS-N3 Trimetylsilyl azid
t-BuOH tert-Butanol
i-PrOH Iso Propanol
1,4-phthalazinediyl diete
Et3SiH Trietyl silan
BF3.OEt2 Bo triflo etyl ete
Et2O Dietyl ete
Trang 10NaH Natri hydrua Kiềm NaH
Pd(PPh3)4 triphenylphosphine)palladium
dimethylsilane
Ac2O Acetic anhydrit
DMSO-d6 Dimethylsulfoxide-d6
IC50 The half maximal inhibitory
concentration
Nồng độ tác dụng ức chế 50% sự tăng sinh dòng tế bào thử nghiệm
Trang 11HepG2 Human Hepatocellular
MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 Dòng tế bào ung thư vú
Trang 12DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1 Vị trí nhóm thế của các chất lai dạng este coxib - combretastatin 34
Bảng 2.2 Thống kê các chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3 37
Bảng 2.3 Vị trí nhóm thế của các chất lai dạng axit coxib - combretastatin 38
Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp các chất este từ chất 79 đến chất 98 50
Bảng 3.2 Kết quả tổng hợp các chất 65, 102 62
Bảng 3.3 Kết quả tổng hợp các dẫn chất axit từ chất 103 đến chất 122 62
Bảng 3.4 Tác dụng gây độc tế bào của các hợp chất lai hóa dạng este đối với ba dòng tế bào ung thư HT-29, Hep-G2, MCF-7 và ức chế sản xuất NO 73
Bảng 3.5 So sánh tác dụng gây độc tế bào của các hợp chất lai hóa dạng axit và dạng este đối với tế bào ung thư MCF-7 và ức chế sản xuất NO 76
Bảng 3.6 Các chất lai có hoạt tính sinh học nổi trội gây độc tế bào MCF7 78
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của các hợp chất thử nghiệm đến việc sản xuất PEG2 trong các đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bằng LPS 79
Bảng 3.8 Phần trăm tế bào theo pha của các hợp chất được thử nghiệm với MCF7 80
Bảng 3 9 Phần trăm sự ngưng tụ hoặc phân mảnh của nhân tế bào do hợp chất 102 và 82 gây ra 82
Bảng 3.10 Hoạt tính caspase - 3 của 102 và 82 84
Bảng 3.11 Tỉ lệ tế bào apoptosis 85
Bảng 3.12 Lựa chọn mô hình cấu trúc COX-2 và tubulin tương ứng sử dụng cho chương trình docking 88
Bảng 3.13 Tập hợp các hợp chất được thiết kế với điểm kết nối tương ứng trên hai mô hình protein (kcal/mol) 90
Bảng 3.14 Tương tác bộ hợp chất, phối tử trên COX-2 (ID: 3LN1) và mô hình protein tubulin (ID: 1Z2B) 94
Trang 13DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Các chất ức chế tubulin sử dụng trong thuốc lai chống ung thư 4
Hình 1.2 Isatin và một số hợp chất lai 5
Hình 1.4 estradiol (13) và một số hợp chất lai 6
Hình 1.5 PBD và một số hợp chất lai 6
Hình 1.6 Một số hợp chất lai theo cơ chế khác 7
Hình 1.7 a) Các vị trí liên kết với tubulin 8
b) Cấu trúc và các quá trình trùng hợp, phân rã của microtubule [30] 8
Hình 1.8 Cấu trúc của một số chất phân lập từ C caffrum 9
Hình 1.9 Cấu trúc của một số chất lai combretastatin 10
Hình 1.10 Cấu trúc của một số chất lai 11
Hình 1.11 Cấu trúc của một số chất lai 12
Hình 1.12 Cấu trúc của một số chất lai 13
Hình 1.13 Cấu trúc của một số chất lai taxol 13
Hình 1.14 Cấu trúc của một số chất lai vinca alkaloid 15
Hình 1.15 Cấu trúc stilben 15
Hình 1.16 Cấu trúc combretastatin A-4 phosphate (42), combretastatin A-1 phosphate (43) 16
Hình 1.17 Tổng hợp các hợp chất mô phỏng combretastatin 17
Hình 1.18 Các thành viên đại diện của nhóm combretastatin 18
Hình 1.19 Cấu trúc khung combretastatin (55) và cấu trúc isocombretastatin (56) 18
Hình 1 20 Combretastatin độc tế bào theo cơ chế tubulin 20
Hình 1.21 Mô hình liên kết CA4 (đỏ) và COL (xanh dương) với tubulin 20
Hình 1.22 Lai Combretstatin A-4 – Steroid (21, 22) 22
Hình 1.23 Lamellarrin T và combretstatin A-4 23
Hình 1.24 Lamellarrin D (62) và combretstatin A-4 (1) 24
Hình 1.25 Lai Combretastatin-isocombretastatin (30) 24
Hình 1.27 các hợp chất lai pyrazole - imidazopyrazole 28
Hình 1.28 Tổng hợp KSS-19 (72) 28
Trang 14Hình 1.29 Chất lai quinoline–pyrazole (73) 29
Hình 1.30 Chất lai pyrazole–thiadiazole (74) 29
Hình 2.1 Con đường tổng hợp các hợp chất lai ghép dạng este 33
Hình 2.2 Tổng hợp dẫn chất este của hợp chất lai hóa coxib - combrestastatin 33
Hình 2.3 Công thức cấu tạo các hợp chất 79-98 35
Hình 2.4 Con đường tổng hợp hợp chất lai 36
Hình 2.5 Tổng hợp hợp lai hóa coxib - combretastatin dang triflo 36
Hình 2.6 Công thức cấu tạo các hợp chất 43, 102 37
Hình 2.7 Con đường tổng hợp các hợp chất lai ghép dạng axit 37
Hình 2.8 Tổng hợp khung lai ghép coxib - combretastatin dạng axit 38
Hình 2.9 Công thức cấu tạo các hợp chất 103-122 40
Hình 3.1 Cấu trúc của celecoxib, Combretastatin A4 và hợp chất lai coxib - combretastatin 47
Hình 3.2 Đánh giá mức độ biểu hiện PGE-2 của các hợp chất 102, 96, 81, 82, 94, Celecoxib ở nồng độ 20 µM trên đại thực bào RAW-264,7 sau 48 giờ xử lý 79
Hình 3.3 Phân tích chu kỳ tế bào của các hợp chất được thử nghiệm bao gồm 102, 96, 81, 82, 94 tại nồng độ 10 µM và Celecoxib (65) tại nồng độ 30 µM trên MCF-7 81
Hình 3.4 Hình ảnh tế bào MCF7 được nhuộm Hoechst 33342 dưới tác động của các mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau 83
Hình 3.5 Tác động của mẫu nghiên cứu đến quá trình apoptosis tế bào thông qua Alexa Fluor® 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit Các mẫu thử được phân tích bằng hệ thống flowcytometry Trục x thể hiện mức độ nhuộm mầu FITC-Anexin V, trục y thể hiện mức độ nhuộm mầu PI theo đơn vị Log 86
Hình 3.6 Các dạng liên kết hydro của các hợp chất với protein COX-2 (PDB ID: 3LN1) và tubulin (PDB ID: 1Z2B) (A) chất 102 với COX-2; (B) Chất lượng 102 với tubulin; (C) chất 82 với COX-2; (D) Hợp chất 82 với tubulin 91
Hình 3.7 Vị trí gắn kết 2D của các hợp chất được thiết kế với protein COX-2 PDB ID: 3LN1) và tubulin (PDB ID: 1Z2B) (A) hợp chất 102 với COX-2; (B) hợp chất 102 với tubulin; (C) hợp chất 82 với COX-2; (D) hợp chất 82 với tubulin 93
Hinh 3.8 Hình ảnh stereo các mẫu chất 94
Trang 16MỞ ĐẦU
Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cách vô
tổ chức và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nhiều vị trí khác nhau (di căn) Theo thống
kê của tổ chức Ung thư toàn cầu GLOBOCAN năm 2018 hiện cả nước có hơn 300.000 người sống chung với ung thư, có 164.671 ca mới, 114.871 người tử vong do bệnh này Toàn cầu hiện có khoảng 23 triệu người mắc, trong đó mỗi năm có hơn 14 triệu người mắc mới và 8 triệu 2 trăm nghìn người tử vong Tổ chức Y tế thế giới (WHO) xếp Việt Nam nằm trong 50 nước thuộc top 2 của bản đồ ung thư
Hiện nay, các thuốc đang sử dụng thường theo cơ chế tác dụng đơn lẻ, còn nhiều tác dụng phụ và bắt đầu có biểu hiện kháng thuốc, dẫn đến sự cần thiết tiếp tục nghiên cứu phát triển các loại thuốc ung thư mới Gần đây việc phát triển các thuốc chống ung thư có nhiều đích tác dụng đang là vấn đề thời sự nhờ hiệu quả vượt trội hơn so với một mục tiêu duy nhất [1-2] Hơn nữa, nghiên cứu lâm sàng cũng chỉ ra, sự kết hợp của nhiều loại thuốc với nhiều các cơ chế tác dụng khác nhau thu được hiệu quả cao cho các bệnh nhân kháng thuốc [3] Do đó, thiết kế các hợp chất lai kháng ung thư với nhiều hơn một đích tác dụng là một xu hướng mới Các hợp chất lai có khả năng tác động đồng thời lên nhiều đích tác dụng nhờ trong cấu trúc của chúng có sự kết hợp nhiều phân tử thuốc riêng lẻ hoặc các đặc điểm cấu trúc hóa học của các phân tử thuốc này
Trong số các chất gốc có hoạt tính sinh học nổi trội được chú ý, nhóm chất kháng ung thư theo cơ chế ức chế tubulin đặc biệt được quan tâm Các chất ức chế vi ống như taxol, colchicin, chalcon, combretasatin, phenstatin, podophyllotoxin và vinca alkaloid được coi là các chất gốc tiềm năng và thu được các hợp chất lai cho kết quả đầy hứa hẹn Ngoài ra, celecoxib là một pyrazol kháng viêm điển hình theo cơ chế COX2 và gần đây cũng được biết đến với một số hoạt tính mới đó là ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư không liên quan với COX2 [4-5] Do đó, việc thiết kế và tổng hợp các hợp chất lai coxib – combretastatin hướng tới mục tiêu tìm ra một phân tử lai
Trang 17mới có sự tích hợp được hoạt tính nổi trội của hai chất gốc ban đầu Luận án với tiêu
đề “Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính kháng viêm, kháng ung thƣ các hợp chất lai
coxib – combretastatin” góp phần tìm ra các loại thuốc mới chống ung thư đa đích
sinh học