Nghiên cứu Quy trình phân tích hàm lượng Carbaryl, Dimethoate va Vit C trong dưa leo

Nghiên cứu Quy trình phân tích hàm lượng Carbaryl, Dimethoate va Vit C trong dưa leo.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN



1.1 Thuốc bảo vệ thực vật:

1.1.1 Một số khái niệm cơ bản về thuốc bảo vệ thực vật: [16]

Thuốc bảo vệ thực vật bao gồm các chế phẩm dùng để trừ sinh vật gây hại,các chế phẩm có tác dụng điều hòa sinh trưởng thực vật, các chế phẩm có tác dụngxua đuổi hoặc thu hút các sinh vật gây hại tài nguyên thực vật đến để tiêu diệt

Tên thuốc: do nhà sản xuất đặt tên để phân biệt sản phẩm của hãng này vớihãng khác

Hoạt chất: là thành phần chính của thuốc, quyết định đặc tính và công dụngcủa thuốc Cùng một hoạt chất có thể có nhiều tên thương mại khác nhau

Các chất phụ gia: giúp thuốc phân bố đều khi pha chế, bám dính tốt và loangtrải đều trên bề mặt cây trồng khi phun Cùng một hoạt chất nhưng hiệu quả thuốccó thể khác nhau là do bí quyết về các chất phụ gia của mỗi nhà sản xuất khácnhau

Tính độc: biểu thị bằng LD50 là liều lượng cần thiết gây chết 50% cá thể thínghiệm (chuột bạch) tính bằng đơn vị mg/kg thể trọng LD50 càng nhỏ thì độ độccàng cao

Hiện nay, thuốc bảo vệ thực vật được phân loại theo tính độc như sau:

+ Vạch màu đỏ trên nhãn là thuốc độc nhóm I, rất nguy hiểm

+ Vạch màu vàng là thuốc độc nhóm II, cảnh báo có hại

+ Vạch màu xanh da trời là thuốc độc nhóm III, lưu ý cẩn thận

+ Vạch màu xanh lá cây là thuốc độc nhóm IV, ít độc

Dưới đây là bảng phân loại các loại thuốc theo độ độc thông qua các chỉ sốLD50 qua da, qua miệng và LC50 qua hô hấp:[7]

Bảng 1.1: Bảng phân loại các nhóm thuốc bảo vệ thực vật

Nhóm I(Danger)

Nhóm II(Warning)

Nhóm III(Caution)

Nhóm IV(Caution)LD50 qua

>5000mg/kgLC50 qua

1.1.2 Một số lưu ý khi sử dụng thuốc bảo vệ thực vật: [16]

Đọc kỹ nhãn thuốc trước khi sử dụng

Thực hiện theo nguyên tắc 4 đúng:

- Đúng thuốc: Chọn thuốc thích hợp đối với từng đối tượng gây hại

- Đúng lúc: Chọn thời điểm phun để phòng trừ dịch hại hiệu quả vớilượng thuốc sử dụng ít nhất

- Đúng liều lượng: Theo hướng dẫn trên nhãn hay tài liệu kỹ thuật

- Đúng phương pháp: Đảm bảo phun đủ lượng nước thuốc cho đơn vịvà phun đúng vào nơi dịch hại ẩn nấp, gây hại

Phối hợp thuốc: Sử dụng pha trộn một số loại thuốc để có hiệu quả cao hơnkhi dùng riêng lẻ

Luân phiên các loại thuốc: Sử dụng luân phiên các cơ chế tác động khácnhau để tránh hiện tượng kháng thuốc

An toàn khi sử dụng thuốc: Nên đọc kỹ và tuân theo các hướng dẫn an toànđược ghi trên nhãn

Thời gian cách ly: Là thời gian từ lần phun thuốc sau cùng đến khi thuhoạch Mỗi loại thuốc đều có thời gian cách ly khác nhau và được ghi trên nhãn

1.2 Carbaryl: [8]

Carbaryl là hoạt chất thuộc nhóm thuốc bảo vệ thực vật Carbamate, dùng đểdiệt trên 100 loài sâu bọ trên các loại cây khác nhau như các cây họ citrus, cây ănquả, cây bông, cỏ… Hiện nay, Carbaryl là loại thuốc trừ sâu được sử dụng phổ biếnvới nhiều tên thương mại như Sevin, Carbamine, Denapon, Dicarbam, Hexavin,Karbaspray, Ravyon, Septene, Tercyl, Tricarnam và Union Carbide 7744 … Trongđó nó thường được bán với tên thương mại là Sevin Carbaryl được đưa ra thịtrường từ năm 1958

Danh pháp quốc tế của Carbaryl là 1-naphthyl N-methylcarbamate(theoIUPAC), 1- naphthalenyl methylcarbamate (theo CAS)

Công thức hóa học: C12H11NO2

Công thức cấu tạo:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Carbaryl

1.2.1 Tính chất vật lý: [14]

Carbaryl ở dạng tinh thể rắn thay đổi từ không màu tới màu trắng hay xámtùy thuộc vào độ tinh khiết của hợp chất, thường không mùi Carbaryl bền vớinhiệt, ánh sáng và môi trường acid Nó không bền trong môi trường kiềm, khônggây ăn mòn kim loại và các vật liệu bao gói

Phân tử lượng: 201,23 đvC

Độ hòa tan trong nước: 40 mg/L ở 30oC, 32 mg/L ở 20oC

Độ hòa tan trong các dung môi hữu cơ: acetone (200 - 300 g/kg), methanol(79,6 g/kg), dichloromethan (242,6 g/kg), hexan (0,214g/kg)

Nhiệt độ nóng chảy:142oC (độ tinh khiết 99,1%)

Nhiệt độ hoá hơi: 193oC

Tỉ trọng ở 20 C: 1,232.

Độ ổn định: Carbaryl bền ở pH vùng acid (pH 5) Khi pH tăng thì độ bềngiảm xuống, thời gian bán hủy do thủy phân của Carbaryl ở pH 7 là 12 ngày, pH 9là 3,2 giờ Ở pH 5, Carbaryl không bị thủy phân, nhưng có thể bị phân hủy bởi các

vi sinh vật Thời gian bán hủy do quang phân trong môi trường nước là 21 ngày.Thời gian bán hủy trong môi trường đất hiếu khí là 4 ngày, còn đất yếm khí là 72ngày

Sản phẩm chính của quá trình phân hủy Carbaryl là CO2 và 1- naphthol, chấtnày có thể tiếp tục bị phân hủy và tạo thành CO2

1.2.2 Độc tính: [18]

Carbaryl thuộc nhóm độc loại II, LD50 qua miệng đối với chuột là 250 – 850mg/kg, qua đường hô hấp đối với chuột LC50 > 200mg/L Carbaryl gần như khônggây độc đối với một số loài chim hoang dã LD50 đối với vịt trời và gà lôi >2000mg/kg, đối với chim cút là 2230mg/kg, đối với chim bồ câu là 1000 – 3000mg/kg

Carbaryl dễ dàng được hấp thụ qua đường hô hấp và đường miệng, nhưng ít

bị hấp thụ hơn qua tiếp xúc với da Khi tiếp xúc trực tiếp có thể gây bỏng da hoặcmắt Hít vào hay nuốt phải Carbaryl với lượng nhất định có thể gây ngộ độc cho hệthần kinh, hệ hô hấp, gây ra các triệu chứng nôn mửa, co thắt dạ dày, đau đầu, hônmê, rối loạn thần kinh, suy hô hấp… Dấu hiệu nhiễm độc tăng nhanh sau khi hấpthụ và cũng nhanh chóng kết thúc sau khi không còn tiếp xúc nữa Khi bị hấp thụvào cơ thể người, nó sẽ nhanh chóng được bài tiết ra theo nước tiểu (bài tiếtkhoảng 85% trong vòng 24h sau khi hấp thụ vào cơ thể)

1.2.3 Liều lượng sử dụng: [19]

Tùy vào loại nông sản và sâu hại mà liều sử dụng quy ra Carbaryl nguyênchất dao động trong khoảng từ 0,25 đến 10 kg/ha Đối với dưa leo, liều lượng sửdụng quy ra Carbaryl nguyên chất là 0,5 kg/ha, thời gian cách ly tối thiểu kể từ lầnphun cuối cùng đến lúc thu hoạch là 2 ngày Dư lượng tối đa cho phép theoFAO/WHO là 3 ppm Lượng Carbaryl hấp thụ vào cơ thể người qua đường tiêu hóacho phép là 0,01mg/ kg thể trọng/ ngày

1.2.4 Các yếu tố làm giảm hàm lượng Carbaryl: [20]

Ngoài các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định, làm giảm hàm lượng củaCarbaryl như đã nêu trong phần 1.2.1 thì việc rửa sạch bằng nước hay gọt vỏ giúpgiảm dư lượng Carbaryl trên các loại rau quả khoảng 40%, chế biến bằng nhiệt làmgiảm từ 45 – 90%, thời gian bảo quản trái cây đóng hộp 12 tháng làm giảm 50 –70%

1.2.5 Các phương pháp phân tích dư lượng Carbaryl:

 Phương pháp quang phổ so màu [9]: Trích Carbaryl bằngdichloromethane CH2Cl2, loại pha nước bằng natri sulfate Na2SO4 Sau đó, mẫuđược cho phản ứng tạo màu với KOH 0,1N trong methanol CH3OH, axit aceticCH3COOH, đồng thời cùng với thuốc thử màu p-nitrobenzen diazoniumtetrafluorborate Tiến hành đo độ hấp thu tại bước sóng 475 nm, lượng Carbaryltrong mẫu tiến hành phân tích từ 0,1 – 1 mg/mẫu và ngưỡng phát hiện (LOD) củaphương pháp khoảng 0,03 mg/mẫu

 Phương pháp sắc ký khí (GC): [10]

Carbaryl được trích bằng CH2Cl2 , tách pha nước bằng dung dịch muối NaClvà muối Na2SO4 khan Dịch trích được cô quay đến khô và tráng lại bằng hexan,sau đó được cho qua cột làm sạch Sử dụng cột Florisil được rửa giải với trình tựnhư sau: 6 mL hỗn hợp hexan/aceton (4/1), 5 mL hexan, dịch trích Carbaryl và saucùng là 6 mL hỗn hợp hexan/aceton (4/1) Thu dịch rửa giải và cô quay đến khô,tráng lại bằng 0,5 mL hexan Dư lượng được xác định bằng thiết bị sắc ký khí cộtmao quản HP-5 MS (hãng Agilent, USA) kích thước 30 m x 0,25 mm x 0,25 mm lớpphim, sử dụng Heli làm khí mang Điều kiện vận hành: 70oC trong 2 phút, tăngnhiệt độ cứ 25oC/phút đến 150oC, sau đó tăng cứ 3oC/phút đến 200oC, rồi 8oC/phútđến 280oC, giữ ở nhiệt độ này trong 10 phút Nhiệt độ injector được giữ ở 220oC.Đầu dò khối phổ MS: nhiệt độ nguồn ion (ion source temperarture): 230oC, nhiệtđộ bề mặt (interface temperature): 280oC

 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp: [15]

Carbaryl được trích bằng methanol, làm sạch bằng cột Nuchar Celite vàdùng hỗn hợp Toluen – CH3CN (1:3) để rửa giải Sau khi qua cột, mẫu được pha

loãng và tiến hành phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp, pha đảo Sử dụng cột DupontZorbax ODS: 25 cm x 4,6 mm (id) x 6 µm Đầu dò UV: bước sóng 280 nm Phađộng: acetonitrile/nước Thời gian lưu Carbaryl: 6,5 phút

1.3 Dimethoate: [21]

Dimethoate là hoạt chất thuộc nhóm thuốc bảo vệ thực vật lân hữu cơ, đượcsử dụng chủ yếu để trừ nhện và các loại sâu bọ hút chích như rầy, rệp, bọ xít, bọtrĩ… hại lúa, rau, đậu, bông, mía, thuốc lá, chè, cafe, cây ăn quả… Dimethoate cócông thức cấu tạo như trên hình 1.2

Dimethoate có tên gọi theo danh pháp quốc tế là O,O-dimethyl methylcarbamoylmethyl – phosphorodithioate (theo CAS), còn theo IUPAC là 2-dimethoxyphosphinothioylthio-N-methylacetamide, số CAS: 60-51-5 Công thứchoá học là C5H12NO3PS2

Nhiệt độ nóng chảy: 45 – 48oC

Dimethoate tan khá nhiều trong nước và trong các dung môi hữu cơ nhưchloroform, benzene, toluene, rượu, ester, ketone, methylen chloride, acetone vàetanol Tan ít trong carbon tetrachloride, diethyl ete, hexan Không tan trong xăngete Độ tan trong nước ở 20oC là 23,8g/L, trong acetone là 140g/100mL, trongethanol là 150g/100mL, trong toluene là 100g/100mL

Dimethoate tương đối bền trong môi trường acid và trung tính (pH =2 – 7),thuỷ phân nhanh trong môi trường kiềm, ăn mòn Fe.

Dimethoate là chất bảo vệ thực vật tương đối dễ phân huỷ trong tự nhiên, bịphân hủy nhanh khi gia nhiệt đến nhiệt độ >800C Sự phân huỷ này tạo ra các khíđộc hại carbondioxide, carbon monoxide, methyl mercaptane, pentoxide phospho

Trong điều kiện đất ẩm và có oxy không khí, thời gian bán hủy củaDimethoate là 2,4 ngày Trong nước, sự phân hủy Dimethoate phụ thuộc nhiều vàogiá trị pH của dung dịch Trong môi trường kiềm, Dimethoate thủy phân khá nhanh.Trong dung dịch đệm pH 9, Dimethoate thủy phân với thời gian bán hủy 4,4 ngày.Tuy nhiên tốc độ phân hủy chậm lại khi pH dung dịch giảm xuống Thời gian bánhủy của Dimethoate trong dung dịch đệm pH 5 và 7 lần lượt là 156 và 68 ngày

Trong động vật cũng như trong thực vật, cơ chế biến đổi của Dimethoate làgiống nhau Nó bị oxi hoá thành O,O-dimethyl-phosphorothioate và hydro hóathành O,O-dimethyl-phosphorodithioate, - phosphorothioate, -phosphat Sự oxi hoádimethoate tạo nên hợp chất omethoate, một chất độc và là chất ức chế enzymecholinesterase mạnh

1.3.2 Độc tính của Dimethoate: [22]

Độc tính của Dimethoate được đánh giá ở mức độ trung bình, thuộc nhómđộc II Với thời gian nhập liệu dài, ADI là 0,02mg/kg thể trọng/ngày Nồng độ caonhất được chấp nhận của Dimethoate trong nước uống là 0,02mg/L

LD50 qua miệng đối với chuột đực là 387mg/kg, chuột cái 160mg/kg, thỏ300mg/kg, lợn 350mg/kg, gà 108mg/kg, chim cút 84 mg/kg…

1.3.3 Liều lượng sử dụng: [21]

Chế phẩm sữa 40 – 50% hoạt chất dùng từ 1 – 2L/ha lúa, rau màu

Sau khi phun Dimethoate vào rau quả, phải để một thời gian sau mới thuhoạch và đem tiêu thụ Thời gian cách li đối với các loại rau là từ 7 – 10 ngày, câyăn quả là khoảng 14 ngày

Dư lượng tuyệt đối của Dimethoate đối với các loại rau là 2ppm (TCVN

5624 – 1991)

1.3.4 Các phương pháp phân tích Dimethoate:

 Phương pháp sắc ký khí:[12,13] Dimethoate được trích bằng acetone.Thêm NaCl vào dịch trích, đem lắc và tách pha Cho dichloromethane và Na2SO4vào pha hữu cơ Sau đó dịch trích được lọc qua lớp bông thủy tinh và lớp Na2SO4 rồiđem cô quay chân không ở 40oC Tráng bình bằng isooctane và dung dịch được choqua cột nhồi silicagel Thêm toluene vào dịch lọc và tiếp tục cho hỗn hợp qua cột.Thực hiện thêm 2 lần nữa rồi đem phân tích trên thiết bị sắc ký khí với cột maoquản DB – 210, 30m  0,32mm i.d, 0,5m film Nhiệt độ buồng bơm mẫu 200oC,nhiệt độ cột: 160oC, nhiệt độ detector: 250oC Giữ nhiệt độ ban đầu trong 1 phút,sau đó tăng nhiệt độ 16oC/phút tới 200oC, giữ nhiệt độ này trong 7 phút

 Phương pháp sắc ký lỏng: [23]

Dimethoate được trích bằng dichloromethane, loại nước bằng Na2SO4 Phahữu cơ được cô quay đến khô, sau đó tráng bình bằng methanol/nước tỉ lệ 6/4, sauđó đánh siêu âm và lọc qua màng trước khi phân tích với thiết bị sắc ký

Thiết bị sắc ký HPLC Hewlett Packard HP 1100 với đầu dò UV , sử dụngcột Phenomenex Shpereclon ODS2, 5m, 120 mm  4,6mm Bước sóng đầu dò210nm Pha động acetonitrile/dung môi A tỉ lệ 1/9 (theo thể tích) Với dung môi Ađược pha như sau: hòa tan 11,32g H3PO4 và 32,86g KH2PO4 bằng 1000mL nước cất,loại dùng cho HPLC Trộn dung dịch vừa chuẩn bị với nước theo tỉ lệ 9 : 1 (theothể tích), ta được dung môi A

 Phương pháp sắc ký bản mỏng: [21]

Dimethoate được trích ly bằng acetone và n – hexane, sau đó làm sạch bằngcách cho qua cột Florisil Xác định dư lượng Dimethoate trên sắc kí bản mỏng bằngcách so sánh Rf và màu sắc vết màu với vết Dimethoate chuẩn sau khi phun thuốchiện màu đặc hiệu

Hệ dung môi rửa giải: ete etylic/petroleum ete tỉ lệ 1/1 (theo thể tích)

Hệ dung môi triển khai sắc kí: n- hexan/aceton tỉ lệ 7/3 (theo thể tích)

Dung dịch thuốc thử hiện màu: cân 0,2g palladi clorua vào bình định mức100mL Hoà tan và định mức đến vạch bằng dung dịch HCl 0,01N

1.4 Vitamin C : [1]

Vitamin C tồn tại trong tự nhiên dưới 3 dạng phổ biến là acid ascorbic, aciddehydroascorbic và dạng liên kết ascorbigen Nó chỉ tồn tại ở dạng L trong các sảnphẩm thiên nhiên Cho tới nay người ta phát hiện thấy 14 đồng phân và đồng đẳngcủa vitamin C có hoạt tính chống bệnh hoại huyết và 15 chất đồng phân không cóhoạt tính Các chất này phân biệt nhau bởi số lượng nguyên tử cacbon, sự sắp xếpcủa các nhóm nguyên tử ở các nguyên tử bất đối và dạng khử hoặc dạng oxy hóa.Công thức cấu tạo của vitamin C cho thấy nó là một dẫn xuất của đường

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Vitamin C

1.4.1 Tính chất vật lý: [1,24]

Danh pháp quốc tế (theo IUPAC): enediol

2-oxo-L-threo-hexono-1,4-lactone-2,3-Công thức phân tử: C6H8O6

Phân tử lượng: 176,14g/mol

Nhiệt độ nóng chảy: 190 – 192oC (374 – 378F)

Acid ascorbic tinh khiết tồn tại ở dạng tinh thể, không màu hoặc có màutrắng, thường không có mùi, có vị chua acid, tan vô hạn trong nước, ít tan trongethanol, không tan trong ether và chloroform

Acid ascorbic bị hoá đen khi để trực tiếp ngoài ánh sáng mặt trời Thậm chíkhi không có mặt ánh sáng thì acid ascorbic vẫn dễ dàng bị biến tính khi tiếp xúcvới độ ẩm trong không khí và sự phân huỷ này càng nhanh khi nhiệt độ môi trườngcàng cao

1.4.2 Nguồn gốc của Vitamin C: [1]

Vitamin C được tổng hợp dễ dàng ở thực vật Đa số động vật, trừ chuột bạch,khỉ và người, đều có khả năng tổng hợp Vitamin C từ đường glucose Sở dĩ ngườikhông có khả năng đó có lẽ vì thiếu các enzyme đặc hiệu xúc tác cho sự chuyểnhóa glucose thành Vitamin C

Vitamin C có nhiều trong các loại rau quả như cam, chanh, dâu, dưa leo, ớt,cà chua, rau cải… Còn trong các loại hạt ngũ cốc hoặc trong trứng, thịt hầu nhưkhông có vitamin C Hàm lượng vitamin C biến đổi phụ thuộc loài, vị trí trồng trọtvà các yếu tố như độ chiếu sáng, khí hậu… Bình thường lượng vitamin C giảm dầntừ phía vỏ ngoài vào bên trong ruột của quả

Bảng 1.2: Hàm lượng Vitamin C trong một số loại rau quả

Loại rau quả Hàm lượng Vitamin C

1.4.3 Vai trò của Vitamin C: [1]

Ở một số dịch quả, người ta nhận thấy Vitamin C có thể bị oxy hóa gián tiếpbởi enzyme phenoloxydase Chính vì vậy khi có mặt Vitamin C, dịch quả sẽ sẫm

màu chậm hơn Dựa vào tính chất chống oxy hóa của acid ascorbic, người ta thườngthêm nó vào dịch quả để ngăn cản quá trình sẫm màu

Tính chất chống oxy hóa của Vitamin C còn được sử dụng để bảo vệtocoferol và cả vitamin A ở thịt khi bảo quản Để giữ được Vitamin C, người tathêm một số chất ổn định, ví dụ đường saccharose, acid hữu cơ, sorbitol, glycerinehoặc một số hợp chất của anthocyane, flavonoide Các hỗn hợp thiên nhiên như cácflavin, carotenoide bảo vệ được Vitamin C tốt hơn so với các chất chống oxy hóathông thường khác

Khi cơ thể bị thiếu Vitamin C sẽ xuất hiện các triệu chứng bệnh lý như chảymáu ở lợi, răng, ở các lỗ chân lông hoặc các nội quan Vitamin C tham gia vào cácquá trình oxy hóa khử khác nhau của cơ thể Nó xúc tác cho sự chuyển hóa nhiềuhợp chất thơm thành các dạng phenol tương ứng Vitamin C còn liên quan với sựhình thành các hormone của tuyến giáp trạng và tuyến thượng thận Nó rất cầnthiết cho cơ thể để tăng sức đề kháng và chống lại các hiện tượng choáng hoặc ngộđộc bởi các hóa chất cũng như các độc tố của vi trùng

1.4.4 Các phương pháp phân tích hàm lượng Vitamin C:

 Định lượng Vitamin C bằng phương pháp chuẩn độ: [3]

Phương pháp sử dụng iod: dựa trên nguyên tắc Vitamin C có thể khử dungdịch iod, dựa vào lượng iod bị khử bởi Vitamin có trong mẫu, suy ra hàm lượngVitamin C Tiến hành như sau: nghiền nhỏ mẫu rau trong dung dịch HCl 5% Sauđó dùng nước cất chuyển toàn bộ dịch vào bình định mức, định mức đến vạch,khuấy đều, lọc Cho dịch lọc vào bình nón, chuẩn độ bằng dung dịch I2 có tinh bộtlàm chỉ thị màu Chuẩn độ đến khi bắt đầu xuất hiện màu xanh thì dừng lại

Phương pháp sử dụng 2,6 – dichlorophenol indophenol (DPIP): dựa trênnguyên tắc acid ascorbic sẽ khử chất chỉ thị màu DPIP thành một dung dịch khôngmàu Ở điểm trung hòa tất cả acid ascorbic, tất cả màu dư thừa không khử có màuhồng trong dung dịch acid Tiến hành như sau: nghiền mẫu rau trong dung dịch HCl1%, cho dịch nghiền vào bình định mức, thêm acid metaphosphoric HPO3 để loạiprotein, định mức đến vạch bằng HCl 1% Cho dịch chiết vào erlen, thêm vào đóamoni oxalat bão hòa, nước cất và chuẩn độ bằng DPIP cho đến khi xuất hiện màuhồng bền

 Phân tích bằng phương pháp HPLC: [2] phương pháp này được giới

thiệu trong nhiều tài liệu tham khảo và đã trở thành một bài thí nghiệm trong PTNHóa sinh, Bộ môn CN thực phẩm Cột sắc ký sử dụng là cột pha đảo ODS C18 Phađộng sử dụng là dung dịch đệm phosphate pH = 2,8 trộn với methanol theo tỷ lệthể tích 90/10, lưu lượng pha động qua cột 1 mL/phút Sử dụng đầu dò UV ở bướcsóng 245 nm Pha động được đánh siêu âm để đuổi khí hòa tan trước khi sử dụng,và được lọc bằng màng lọc 450 nm Xây dựng đường chuẩn với các mẫu acidascorbic tinh khiết với ba nồng độ khác nhau Mẫu rau quả được nghiền trong dungdịch đệm phosphate pH = 2,8 để trích Vitamin C ra, pha loãng theo tỷ lệ thích hợprồi phân tích như với các mẫu chuẩn Hàm lượng Vitamin C trong mẫu được xácđịnh bằng cách nội suy từ đường chuẩn

1.5 Dưa leo: [17]

Giới (regnum): thực vật

Ngành (divisio): Magnoliophyta,

Lớp (class): Magnoliopsida.

Bộ (order): Cucurbitales,

Họ thực vật (family): thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae)

Chi (genus): Cucumis.

Loài (species): C.sativus.

Tên khoa học: Cucumis sativus L

Tên tiếng Anh: Cucumber

Dưa leo là loại cây trồng phổ biến trong họ bầu bí Cucurbitaceae, là loại rau

ăn quả thương mại quan trọng, nó đđược trồng nhiều nơi trên thế giới và trở thànhthực phẩm của nhiều nước Những nước dẫn đđầu về diện tích gieo trồng và năng suấtlà: Trung Quốc, Nga, Nhật Bản, Mỹ, Hà Lan, Thổ Nhĩ Kỳ, Ba Lan, Ai Cập và TââyBan Nha

1.5.1 Đặc điểm của quả dưa leo:

Quả dưa leo có dạng hình trụ, dài, thịt quả dày, ngọt, được trồng từ cách đây

3000 năm ở vùng Tây Á Dưa leo xuất hiện ở Pháp vào khoảng thế kỷ thứ 9, ở Anhvào thế kỷ 14 và ở Bắc Mỹ vào khoảng giữa thế kỷ 16 Hiện nay dưa leo đượctrồng rất rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới

Khi chuyển từ non đến chín, quả có màu xanh đến xanh trắng, vàng hay nâuphụ thuộc vào màu gai quả Hạt có màu vàng, mỗi quả có 150 – 500 hạt

Hình 1.4:Quả dưa leo

1.5.2 Thu hoạch và bảo quản:

Quả từ 7 – 10 ngày tuổi là có thể thu hoạch Nên thu hoạch vào buổi sáng đểbuổi chiều tưới thúc phân Nhiệt độ tốt nhất để bảo quản dưa leo là 45÷500F, ở độẩm 90÷95% Khi đó, dưa leo có thể bảo quản 10÷14 ngày

1.5.3 Sử dụng dưa leo:

Dưa leo được sử dụng chủ yếu ở dạng tươi Dưa leo có vị ngọt, tính mát,công dụng thanh nhiệt, giải độc, có thể dùng để trị liệu các bệnh như đau họng,mắt đỏ Ngoài sử dụng trái tươi, sản phẩm chế biến của dưa leo thường tập trungvào 2 nhóm chủ yếu: muối mặn và muối chua

Tình hình sử dụng dưa leo ở một vài nước trên thế giới: ở Mỹ, việc tiêu thụ

dưa leo dạng muối chua đang giảm xuống mà chuyển sang sử dụng dưa leo tươi,chưa qua chế biến Năm 1999, ở Mỹ đã sử dụng khoảng 3 tỷ pound dưa leo trên

171000 ha đất sản xuất Theo FAO, trong năm 2005, Trung Quốc đã sản xuấtkhoảng 60% nhu cầu dưa leo của thế giới

Bảng 1.3: Thành phầân dinh dưỡng trong 100g dưa leo (luôn vỏ).

Thành phần Hàm lượng

Nguồn: USDA Nutrient database

1.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): [2]

1.6.1 Giới thiệu về phương pháp HPLC:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography –HPLC) là phương pháp sắc ký lỏng có hiệu quả tách cao hơn nhiều so với phươngpháp sắc ký lỏng cổ điển nhờ sử dụng các chất nhồi có kích thước rất nhỏ (5 – 10

µm) Ngoài ra, phương pháp HPLC còn có rất nhiều ưu điểm khác như tốc độnhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao (detector UV 10-9g, detector huỳnh quang và điệnhóa 10-12g), cột tách được sử dụng nhiều lần, khả năng thu hồi mẫu cao vì hầuhết các detector không phá hủy mẫu Lượng mẫu cho phép bơm vào cột tách trongphương pháp HPLC lớn hơn trong phương pháp sắc ký khí (Gas Chromatography)và đây cũng là một ưu điểm nữa của phương pháp HPLC.

1.6.2 Thiết bị HPLC:

Sơ đồ thiết bị HPLC được mô tả như trong hình 1.5 Thiết bị có thể chỉ gồmmột khối hay do nhiều khối riêng biệt ráp vào nhau Trong thiết bị HPLC cơ bản,hai bộ phận quan trọng nhất là bơm cao áp (pump) và đầu dò (detector) Các bộphận khác gồm có cột tách (column), hệ thống pha động (mobile phase) và bộ nạpmẫu (injector) Vì phải sử dụng bơm cao áp để đẩy pha động đi qua cột tách,phương pháp này trước kia còn được gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp

Hình 1.5: Sơ đồ thiết bị HPLC

 Bơm cao áp: loại bơm tốt nhất thường được dùng hiện nay là bơm

syringe lượng lớn Yêu cầu đối với bơm là tạo được dòng pha động liên tục, ổnđịnh Các loại bơm dùng cho sắc ký phân tích hiện nay có thể cho lưu lượng dòngpha động 0,1 – 10 mL/phút (đường kính trong của cột tách là 5mm) ở áp suất lênđến 300 – 400 bar

 Đầu dò (detector): Đầu dò sử dụng trong thiết bị HPLC rất đa dạng.

Các loại đầu dò thông dụng là đầu dò UV–VIS, đầu dò huỳnh quang, đầu dò dẫnnhiệt, đầu dò khúc xạ kế vi sai (RI)… Sự thay đổi về cường độ ánh sáng do sự hấpthu tia UV, sự phát xạ huỳnh quang, … sẽ được ghi nhận lại thông qua hai thông sốlà thời gian lưu và diện tích peak trên sắc ký đồ

 Bộ nạp mẫu: bộ nạp mẫu trong HPLC thường được thiết kế phù hợp

với hai kiểu bơm mẫu: bơm cùng với dòng dung môi hoặc bơm mẫu vào cột táchtrong điều kiện dòng dung môi ngưng lại không chịu áp suất, thường sử dụng khithiết bị phải làm việc ở áp suất rất cao

 Cột sắc ký: cột tách phổ biến nhất trong HPLC dài 12,5 – 25cm,

đường kính trong từ 2 – 4 mm (dùng cho mục đích phân tích)

Hầu hết cột tách dùng trong HPLC được chế tạo bằng thép không gỉ Trướckhi nhồi cột, làm sạch cột bằng HNO3 50% và rửa nhiều lần với nước, tráng bằngacetone, chloroform, tiếp tục bằng acetone và làm khô bằng khí N2 hoặc không khínóng Có thể nhồi cột bằng phương pháp khô khi hạt nhồi có kích thước lớn hơn20µm, hoặc phương pháp ướt với huyền phù (methanol, acetone, dioxane… hoặchỗn hợp của chúng với parafin, cyclohexanol…); nhồi cột bằng bơm cao áp khi hạtnhồi có kích thước bé (5 - 10µm)

 Bình chứa pha động: thường là chai thủy tinh, pha động trước khi đưa

vào sử dụng phải được lọc qua màng 0,45µm

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM



2.1 Thiết bị, dụng cụ:

- Hệ thống HPLC gồm bơm LC – 10AS, đầu dò quang phổ SPD – 6AV vàmáy ghi Chromatopac CR 6A

- Khi phân tích Carbaryl và Dimethoate sử dụng cột C18 của Phenomenex(USA), Gemini 5µm – 110Ao, 250 x 4.6mm, thuộc loại cột sắc ký pha đảo

- Khi phân tích Vitamin C sử dụng cột ET 250/8/4 Nucleosil® 120 – 5 C18thuộc loại cột sắc ký lỏng pha đảo còn gọi là cột ODS hay RP – 18 có nhóm alkyllà C18H37

- Máy quang phổ UV – VISSpectronic Genesys 8

- Máy đo pH

- Thiết bị đánh siêu âm Transsonic T660/H (Elma)

- Máy khuấy từ

- Thiết bị cô quay chân khôngHeidolph WB 2000

- Cân phân tích Sartorius một số lẻ và bốn số lẻ

- Bơm chân không (dùng để lọc chân không)

- Máy xay Magic Bullet

- Giấy lọc.

2.2 Hóa chất:

- Dimethoate (độ tinh sạch >98%), Vipesco

- Carbaryl (độ tinh sạch >98%), Bayer

- Vitamin C (độ tinh sạch > 98%)

- Acetonitrile (loại dùng cho HPLC của J.T.Baker (USA))

- Nước cất 2 lần

- Methanol (loại dùng cho HPLC của J.T.Baker (USA))

- Acetone (Trung Quốc)

- NaCl (Trung Quốc)

- KH2PO4 (Trung Quốc)

- H3PO4 (Trung Quốc)

2.3 Vận hành thiết bị:

2.3.1 Máy đo quang phổ hấp thu:

Mở công tắc điện, máy bắt đầu chế độ self – test, chờ cho máy hiện chữSET thì bắt đầu sử dụng được

Mở nắp, cho mẫu trắng, các mẫu thử, chuẩn vào các cell trong lòng máy.Đóng nắp lại

Nhấn phím [►] đến khi xuất hiện ký hiệu SET λxxx nm thì nhấn ENTER đểnhập bước sóng cần đo Khi giá trị λ nhấp nháy, nhập giá trị bước sóng mới, nhấnENTER để xác nhận

Nhấn phím có số tương ứng với cell chứa mẫu trắng, chờ cho máy quayxong, nhấn ZERO để thực hiện hiệu chỉnh về zero Màn hình xuất hiện dAr, chờđến khi xuất hiện 0.000 thì bắt đầu nhấn các phím có số tương ứng với mẫu cần đođể xác định độ hấp thu Giá trị độ hấp thu sẽ hiện trên màn hình LCD

2.3.2 Thiết bị sắc ký lỏng cao áp HPLC:

 Vận hành bơm:

Đặt giá trị áp suất cực đại (P.MAX), nhằm bảo vệ cột và các hệ thống khác.Khi áp suất vượt P.MAX bơm sẽ tự động tắt Giá trị P.MAX đặt 300kgf/cm2

Đặt giới hạn dưới của áp suất (P.MIN): mục đích là không cho không khí đivào hệ thống khi có sự cố hở trên hệ thống và để an toàn khi đo trong trường hợpdung môi thoát ra ngoài

Đặt lưu lượng pha động (FLOW RATE): 1mL/phút Để bảo vệ cột khôngnên đặt lưu lượng vượt quá giá trị trên trừ trường hợp cần rửa sạch hệ thống

Thay pha động: do pha động dùng để phân tích Carbaryl, Dimethoate vàVitamin C là khác nhau nên phải tiến hành thay pha động Thủ tục như sau:

- Chuẩn bị pha động mới, đặt đầu lọc hút vào

- Mở van xả (quay ngược chiều kim đồng hồ 180o), nhấn PURGE rửa hếtpha động cũ trong buồng bơm

- Nhấn PURGE hay PUMP để ngừng bơm, đóng van xả, đặt lưu lượng từ1mL/phút đến 1,5mL/phút

- Nhấn PUMP cho bơm chạy để thay pha động trong các phần còn lại cópha động đi qua

 Đầu dò (DETECTOR):

Detector SPD-6AV của hãng Shimadzu Nhật Bản thuộc loại detector hấp thutử ngoại và khả kiến (UV – VIS)

Đặt bước sóng đo khi phân tích:

+ Dimethoate: 204nm

+ Carbaryl: 220nm

+ Vitamin C: 245nm

Chọn mức đáp ứng (RESPOND) chuẩn (STD)

Khi cần quét đường nền, chỉnh độ hấp thu về mức 0, sử dụng nút ZERO

 Máy ghi CHROMATOPAC CR 6A:

Máy ghi Chromatopac CR 6A gồm các bộ phận: bàn phím để cài đặt chươngtrình với các phím điều khiển, bộ phận nối với detector thu nhận tín hiệu, bộ phậnnối cảm ứng để khởi động hệ thống chạy mẫu và hệ thống ghi, bộ phận in cảmứng, xử lý dữ liệu theo các chương trình cài đặt sẵn và in thành sắc ký đồ Cácthông số cần cài đặt cho máy ghi:

- ATTEN: thông số này có giá trị từ 0 đến 10, giá trị càng nhỏ thì khoảngbiểu diễn trên sắc ký đồ càng nhỏ Tăng giá trị ATTEN lên một đơn vị thì khoảngbiểu diễn trên sắc ký đồ tăng lên 2 lần Nói chung khi nồng độ thấp thì ta nên sửdụng ATTEN nhỏ, nếu nồng độ quá lớn mà đặt ATTEN nhỏ thì peak chỉ được biểudiễn một phần nhưng điều này không ảnh hưởng đến việc tính toán diện tích haychiều cao peak

- METHOD: (phương pháp) thông thường người ta sử dụng phương pháp

61 Trong phương pháp này máy ghi sẽ cho kết quả diện tích các peak dò được,đồng thời đánh dấu vị trí peak

- MIN.AREA (diện tích peak tối thiểu): chỉ những peak có diện tích lớnhơn hay bằng giá trị MIN.AREA mới được ghi diện tích

- STOP.TIME (thời gian ngừng ghi sắc ký đồ): muốn tự động ngừng ghisắc ký đồ sau thời gian nào đó thì đặt giá trị thời gian đó cho thông số STOP.TIME.Nếu không đặt thời gian ngưng ghi sắc ký đồ, nhấn phím STOP để ngừng

- SDEED (tốc độ giấy): thường dùng là 5mm/phút Tuy nhiên muốn tiếtkiệm giấy hoặc để peak có dạng sắc nhọn thì có thể giảm SPEED

 Chuẩn bị máy khi tiến hành phân tích:

Pha động trước khi bơm vào cột phải được loại khí bằng siêu âm Nhúng đầulọc vào bình pha động

Nhấn công tắc POWER của bơm, để điện ổn định trong 15phút Chờ áp suấtổn định, xoay van tháo ở vị trí mở (DRAIN 180o), nhấn nút rửa PURGE, khi đó bơmsẽ vận hành với vận tốc khoảng 10mL/phút

Nhấn PURGE hay PUMP để dừng bơm Đặt vận tốc dòng Xoay van tháo

180o để khóa chặt Nhấn PUMP, rửa đường ống trước cột bằng pha động trong 10phút

Gắn cột sắc ký vào, dùng pha động chạy không tải qua cột để rửa sạch cộttrong 30 phút Khi áp suất ổn định thì mở 2 module detector và máy ghi Liệt kêcác thông số trên máy ghi bằng lệnh SHIFTDOWN LIST WIDTH ENTER vàthay đổi các thông số nếu cần

Kiểm tra đường nền bằng lệnh SHIFTDOWN PLOT ENTER Trong quátrình kiểm tra nếu đường nền bị lệch thì vài phút lại nhấn ZERO trên detector mộtlần Đợi đường nền thẳng lặp lại lệnh SHIFTDOWN PLOT ENTER để chấm dứtkiểm tra Đến đây hệ thống đã sẵn sàng cho phân tích

 Chế độ chạy sắc ký đối với Carbaryl:

Bước sóng đầu dò: 220nm

Thể tích mẫu bơm vào: 20µl

Pha động: acetonitrile/nước tỉ lệ 55/45

Áp suất: 96 – 110kgf/cm2

 Chế độ chạy sắc ký đối với Dimethoate:

Bước sóng đầu dò: 204nm

Thể tích mẫu bơm vào: 20µl

Pha động: acetonitrile/nước tỉ lệ 55/45

Áp suất: 98 – 110kgf/cm2

 Chế độ chạy sắc ký đối với Vitamin C :

Bước sóng đầu dò: 245nm

Thể tích mẫu bơm vào: 20µl

Pha động: hệ đệm phosphate/methanol tỉ lệ 90/10

Áp suất: 90 – 100kgf/cm2

Cách pha dung dịch đệm: hòa tan 6,5g KH2PO4 trong 1L nước cất 2 lần,chỉnh pH đến 2,8 bằng H3PO4 Lọc qua màng 0,45µm.

2.4 Tiến trình thí nghiệm:

2.4.1 Khảo sát phổ hấp thu của Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C:

Tiến hành quét phổ dung dịch Carbaryl trong 55%Acetonitrile/45% nước,dung dịch Dimethoate trong 55%Acetonitrile/45% nước, dung dịch Vitamin C tronghệ đệm phosphate Sử dụng cuvette thạch anh và quy trình quét phổ tự động trongvùng bước sóng từ 190 nm đến 400 nm

2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của thành phần pha động ACN/nước lên thời gian lưu và diện tích peak của chuẩn Carbaryl, Dimethoate:

Phân tích chuẩn Carbaryl 10ppm, Dimethoate 10ppm với pha động là dungdịch acetonitrile/nước ở các tỷ lệ trộn thể tích: 85/15, 70/30, 55/45, 40/60 Tốc độdòng giữ cố định 1mL/phút Thể tích bơm mẫu 20µL Đầu dò UV khi phân tíchCarbaryl là 220nm, khi phân tích Dimethoate là 204nm

2.4.3 Xây dựng đường chuẩn xác định hàm lượng Carbaryl, Dimethoate trong dung dịch:

Để xây dựng đường chuẩn, các mẫu chuẩn Carbaryl với nồng độ từ 20ppm được chuẩn bị bằng cách pha loãng từ dung dịch gốc như sau:

1-Cân 0,05g Carbaryl hoà tan và định mức tới vạch 50mL bằng acetonitrile,thu được dung dịch gốc có nồng độ 1000ppm Pha loãng dung dịch gốc thành cácnồng độ mong muốn bằng nước cất:

Bảng 2.1: Cách pha chuẩn Carbaryl, Dimethoate:

Thể tích dung dịch

rút ra, mL

Bình định mức sửdụng, mL

Nồng độ dung dịch thuđược, ppm

11

50100

2010Từ dung dịch Carbaryl 10ppm:

Thể tích dung dịch

rút ra, mL

Bình định mức sửdụng, mL

Nồng độ dung dịch thuđược, ppm

551

102510

521

Các chuẩn Dimethoate được pha tương tự như trên, nhưng pha loãng dungdịch gốc thành các nồng độ mong muốn bằng hệ pha động 55/45

Hệ pha động là dung dịch acetonitrile/nước với tỷ lệ trộn Vacetonitrile/Vnước =55/45 Tốc độ dòng giữ cố định 1mL/phút Thể tích bơm mẫu 20µL Đầu dò UV khi

đo Carbaryl là 220nm, đo Dimethoate là 204nm Mỗi mẫu chuẩn được đo 3 lần, lấygiá trị trung bình của diện tích peak và thời gian lưu thu được

2.4.4 Xây dựng đường chuẩn xác định hàm lượng Vitamin C trong dung dịch:

Để xây dựng đường chuẩn, các mẫu chuẩn Vitamin C với nồng độ từ 20ppm được chuẩn bị bằng cách pha loãng từ dung dịch gốc như sau:

1-Cân 0.05g acid ascorbic hoà tan và định mức tới vạch 50mL bằng dung dịchđệm phosphate có pH 2,8, thu được dung dịch gốc có nồng độ 1000ppm Pha loãngdung dịch gốc thành các nồng độ mong muốn bằng đệm phosphate pH 2,8:

Bảng 2.2: Cách pha chuẩn Vitamin C:

Thể tích dung dịch

rút ra, mL

Bình định mức sửdụng, mL

Nồng độ dung dịch thuđược, ppm

11

50100

2010Từ dung dịch acid ascorbic 10ppm:

Thể tích dung dịch

rút ra, mL

Bình định mức sửdụng, mL

Nồng độ dung dịch thuđược, ppm

551

102510

521

Hệ pha động là dung dịch đệm phosphate và methanol với tỷ lệ trộn Vhệ đệm /Vmethanol = 90/10 (dung dịch đệm được pha bằng cách hoà tan 6,5g KH2PO4 trong 1Lnước cất 2 lần, chỉnh pH về 2,8 bằng H3PO4 rồi lọc bằng màng 0,45µm) Tốc độdòng giữ cố định 1mL/phút Thể tích bơm mẫu 20µL Đầu dò UV hoạt động ở bướcsóng 245nm Mỗi mẫu chuẩn được đo 3 lần, lấy giá trị trung bình của diện tíchpeak và thời gian lưu thu được

2.4.5 Khảo sát độ lặp lại, độ thu hồi mẫu qua cột HPLC của Carbaryl, Dimethoate và Vitamin C ở các nồng độ:

Mẫu sử dụng có nồng độ Carbaryl 1 ppm trong nước Phân tích mẫu này lặplại 3 lần, lấy giá trị trung bình và phương sai của thời gian lưu, diện tích peak saucột để xác định độ lặp lại của kết quả đo

Phân tích các mẫu Carbaryl có nồng độ 1 – 20ppm lặp lại 3 lần, lấy giá trịtrung bình của diện tích peak và thời gian lưu Sau đó cũng tiếp tục phân tích cácmẫu này nhưng để dòng pha động dẫn mẫu thẳng tớí đầu dò, không qua cột phântích Lấy giá trị trung bình của diện tích peak mẫu không qua cột Tỉ số giữa diệntích peak của mẫu qua cột và mẫu không qua cột nồng độ tương ứng là độ thu hồimẫu qua cột Công thức như sau:

100

1  

o

c A

A R

Trong đó:

+ Ac: diện tích peak mẫu qua cột

+ Ao: diện tích peak mẫu không qua cột

+ R1: độ thu hồi mẫu qua cột, %

Thực hiện thí nghiệm tương tự đối với Dimethoate và Vitamin C

2.4.6 Khảo sát số bậc trích ly đối với hàm lượng Carbaryl, Dimethoate:

Thực hiện thí nghiệm như sơ đồ hình 2.1 Dung dịch Carbaryl trong nướcđược tiến hành trích ly 3 bậc Phân tích dịch thu được ở mỗi bậc trích ly:

Thực hiện thí nghiệm tương tự đối với Dimethoate

Hình 2.1: Sơ đồ khảo sát số bậc trích ly đối với Carbaryl và Dimethoate.

25mL Carbaryl 20ppm

Lắc 50mL

acetone

Khuấy từ

5 – 7g NaCl

Dịch phân tích

actonitrile

Pha hữu cơ Cô quay chân không

Tráng bình Định mức 50mL

Dịch phân tích

Pha nước

acetone Lắc 2

NaCl

Pha hữu cơ

Pha nước Lắc 3 Tách pha 3 Cô quay chân không

Tráng bình

(1)

Nước

2.4.7 Qui trình trích Carbaryl, Dimethoate từ dưa leo:

Cân 100 g mẫu rau, xay nghiền nhỏ bằng 200 mL acetone, đem lắc trong 15phút Tiến hành lọc chân không qua giấy lọc 0,6mm, thu dịch lọc vào becher 250

mL Cân 25 - 30 g muối NaCl (tùy vào lượng nước có trong mẫu) cho vào dịchtrích, khuấy cá từ để hòa tan hoàn toàn muối Dịch sau khuấy từ được cho vào phễuchiết, thu lớp dung môi phía trên Sau đó, tiến hành cô quay chân không dịch trích

ở nhiệt độ 35oC, vận tốc quay: 120 vòng/phút Dịch sau cô quay được tráng lại bằngacetonitrile Định mức dịch trích bằng nước cất 2 lần, sử dụng bình định mức 100

mL, được đánh siêu âm để đuổi bọt khí và lọc lại bằng màng lọc 0,2µm (đườngkính: 13 mm, hãng Agilent) Tiến hành phân tích với thiết bị HPLC theo chế độ vậnhành như trên

2.4.8 Xác định độ thu hồi mẫu của quy trình phân tích Carbaryl, Dimethoate:

Độ thu hồi mẫu khi bổ sung chuẩn vào dịch trích: sử dụng 4 mẫu, mỗi mẫugồm 100g dưa leo Tiến hành trích mẫu, mẫu thứ nhất không bổ sung gì cả, cácmẫu còn lại sau khi lọc thu được dịch trích thì lần lượt bổ sung vào các dịch lọc 2,5;5; 10 mL dung dịch Carbaryl 100ppm Thực hiện các bước tiếp theo như trình bày ởtrên, sau đó phân tích bằng HPLC Xác định diện tích peak các mẫu không bổsung, có bổ sung Carbaryl trên rau và mẫu chuẩn Carbaryl có cùng nồng độ để xácđịnh độ thu hồi mẫu

Độ thu hồi mẫu khi bổ sung chuẩn lên dưa leo và để qua đêm: sử dụngcác mẫu: 100g dưa leo, 100g dưa leo có tẩm thêm 2,5; 5; 10 mL dung dịch Carbaryl100ppm Tiến hành trích mẫu, phân tích bằng HPLC, như đã mô tả ở trên Xác địnhdiện tích peak các mẫu không bổ sung, có bổ sung Carbaryl trên rau và mẫuCarbaryl trong nước có cùng nồng độ tương đương để so sánh xác định độ thu hồimẫu (Recovery):

100 ) ( 1

Trong đó: A1 – diện tích peak mẫu có bổ sung thêm Carbaryl

Ao – diện tích peak mẫu không bổ sung chuẩn

A – diện tích peak chuẩn bổ sung vào rau

R – độ thu hồi mẫu

Từ đó so sánh giữa độ thu hồi mẫu khi bổ sung chuẩn trực tiếp lên rau và khibổ sung vào dịch trích, kết luận ảnh hưởng của quá trình trích và lọc đến độ thu hồimẫu.

Thực hiện thí nghiệm tương tự cho Dimethoate

2.4.9 Xác định dư lượng Carbaryl, Dimethoate trong dưa leo:

Từ diện tích peak của các mẫu rau phân tích và phương trình đường chuẩn,xác định được dư lượng thuốc trên rau Tuy nhiên trong quá trình phân tích còn cótổn thất trong quá trình trích rau, tổn thất trên cột phân tích nên dư lượng thực tếtrên rau được xác định như sau:

f R R m

V k

Trong đó: DL – dư lượng thuốc thực tế trên rau (ppm)

A – diện tích peak của mẫu rau phân tích

k – hệ số góc của đường chuẩn

V – thể tích định mức (mL)

m – khối lượng mẫu phân tích (g)

R – độ thu hồi mẫu của quá trình trích rau (%) R1 – độ thu hồi qua cột của hoạt chất tương ứng (%)

f – hệ số pha loãng

2.4.10 Quy trình trích Vitamin C từ dưa leo:

Cân 25g dưa leo, đem nghiền bằng 50mL dung dịch đệm phosphate Sau đólọc chân không, thu dịch lọc, phần bã tiếp tục được trích ly bậc hai bằng 20mLdung dịch đệm và cũng tiến hành lọc chân không để thu dịch lọc Tất cả dịch lọcđược cho vào bình định mức và định mức 100mL bằng dung dịch đệm phosphate.Dịch chiết sau đó được đánh siêu âm để đuổi bọt khí và lọc lại bằng màng lọc 0,2

µm Tiến hành phân tích với thiết bị HPLC theo chế độ vận hành của Vitamin C đãtrình bày ở trên