Nghiên cứu cố định urease trên bề mặt rắn - Võ Khôi Nguyên

Nghiên cứu cố định urease trên bề mặt rắn - Võ Khôi Nguyên.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME UREASE

1.1.1 Giới thiệu chung về enzyme urease [2, 7, 77, 92]

Urease có tên hệ thống là carbamine amidohydrolase, là enzyme xúc tác quá trình thủy phân urea thành ammonia và khí cacbonic Nó thuộc nhóm enzyme hydrolase (enzyme thủy phân)

Trong bảng phân loại enzyme theo quy ước quốc tế, urease mang mã số EC 3.5.1.5 trong đó: số 3 chỉ nhóm chính-hydrolase, số 5 chỉ nhóm phụ enzyme tác dụng lên liên kết C-

N, khác liên kết peptid, số 1 chỉ phân nhóm phụ cắt các amid thẳng (amidohydrolase), số 5 chỉ số thứ tự của urease trong phân nhóm phụ

Hình 1.1: Enzyme urease

Như vậy, từ tên kí hiệu quốc tế của urease, ta có thể biết được nó là enzyme thủy phân thuộc nhóm amidase, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết C-N, không phải liên kết peptid.

Urease lần đầu tiên được J.B.Sumner tách chiết và kết tinh từ đậu rựa (jack bean -

Canavalia ensiformis) vào năm 1926.

Hiện nay, urease từ đậu rựa là loại urease được sử dụng nhiều nhất

1.1.2 Cấu tạo

Bình thường urease tồn tại ở dạng tinh thể 8 cạnh, trong suốt không màu, có đường kính tùy phương pháp chiết tách và có khối lượng cũng như hình dạng khác nhau tùy vào nguồn thu nhận [7]

Hình 1.2: Tinh thể urease được J.B.Sumner tách chiết và kết tinh.

Urease là một enzyme cấu trúc bậc 4 Mỗi phân tử enzyme có từ 3 – 4 tâm hoạt động Các nghiên cứu đã chứng minh rằng có sự hiện diện của các nhóm –SH tại trung tâm hoạt động Các nhóm này đóng vai trò rất quan trọng đối với khả năng xúc tác của urease: góp phần trong việc hình thành phức chất enzyme – cơ chất, kết hợp cơ chất với các cofactor của enzyme, duy trì cấu trúc không gian của enzyme để đảm bảo hoạt lực xúc tác Các nghiên cứu cho thấy rằng hoạt tính của urease giảm khá nhiều nếu như các nhóm –SH

Ngoài ra, tại trung tâm hoạt động, người ta còn tìm thấy sự có mặt của 2 ion Ni2+ Hai ion này liên kết rất chặt chẽ với phân tử protein Tuy nhiên, trong môi trường acid với sự có mặt của EDTA nồng độ 1mM thì các ion này bị giải phóng khỏi liên kết, dẫn đến việc giảm hoạt tính của urease Các ion Ni2+ tạo liên kết với các acid amin và tạo ra bề mặt hoạt hóa làm tăng hoạt tính của enzyme [2,7,92].

Hình 1.3: Trung tâm hoạt động của enzyme urease

Về khối lượng phân tử, urease từ những nguồn khác nhau có phân tử lượng khác nhau Theo các kết quả nghiên cứu của Joseph và Evelyn, khối lượng phân tử urease được xác định bằng phương pháp lọc gel trên cột Agarose A_15m sẽ dao động trong khoảng 420.000 Da đến 540.000 Da [45]

1.1.3 Cơ chế xúc tác [2,7,92]

Hình 1.4: Cơ chế xúc tác của urease

Cơ chế xúc tác của enzyme urease được chấp nhận nhiều nhất hiện nay là cơ chế dựa trên vai trò khác nhau của 2 ion Ni2+ Trong đó, một ion sẽ liên kết và hoạt hóa urea, còn ion còn lại sẽ liên kết và hoạt hóa nước Dựa trên hình vẽ, ta nhận thấy, ban đầu ion

Ni2+ - 1 tạo liên kết với nguyên tử oxy trong nhóm carbonyl và nhóm OH- của nước là cầu nối giữa ion Ni2+ - 2 với nguyên tử C trong nhóm carbonyl của urea Ở giai đoạn sau, trong phức hợp enzyme – cơ chất sẽ diễn ra sự chuyển dịch điện tử và kết quả là ammoniac được giải phóng kết hợp với acid carbamic để tạo thành ammonia carbamate, kèm theo là sự tái cấu trúc lại trung tâm hoạt động của enzyme

Như vậy, vai trò của 2 ion kim loại Ni2+ là rất quan trọng trong việc tạo liên kết giữa enzyme với cơ chất ở giai đoạn tạo phức chất trung gian Đây chính là một cofactor của urease

Trong thực tế, nhiều nghiên cứu đã chứng minh, trong phản ứng thủy phân urea dưới sự xúc tác của enzyme urease, sản phẩm chính là ammonium carbamate NH4COONH2 Mặc

bản chất của dung dịch đệm sử dụng Các loại đệm phosphate và maleate sẽ tạo thuận lợi cho quá trình phân hủy tạo CO2 và NH3, ngược lại, ammonium carbamate bền trong đệm citrate và tris.

1.1.4 Cơ chất của enzyme urease [2,7,92]

Enzyme urease có tính đặc hiệu tuyệt đối đối với cơ chất urea Nghiên cứu của Jabri và cộng sự năm 1995 đã chứng minh rằng vận tốc phản ứng thủy phân urea dưới xúc tác của enzyme urease cao hơn phản ứng thủy phân không enzyme đến 1014 lần Ngoài ra, người ta nhận thấy urease cũng xúc tác phản ứng thủy phân một số cơ chất khác có cấu trúc gần giống với urea như semicarbazide, formamide, acetamide, methylurea, hydroxyurea, phenyl phosphorodiamidate, phosphoric triamide, diamidophosphate, phosphoramidate và một số amide, ester khác của acid phosphoric Tuy nhiên, tốc độ phản ứng thủy phân các cơ chất khác của enzyme urease thấp hơn nhiều so với cơ chất là urea

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme urease

1.1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [4]

Tốc độ của phản ứng enzyme trong một giới hạn nào đó phụ thuộc vào nồng độ cơ chất có trong môi trường Khi nào chưa bị bão hòa bởi cơ chất thì tốc độ phản ứng vẫn tỉ lệ thuận với nồng độ cơ chất

1.1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Phản ứng dưới sự xúc tác của enzyme cũng giống như các phản ứng hóa học khác nghĩa là khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng cũng tăng theo Tuy nhiên, vì enzyme có bản chất protein nên có thể bị biến tính nếu nhiệt độ vượt quá một giới hạn nào đó Vì vậy, mỗi enzyme sẽ có một nhiệt độ hoặc một khoảng nhiệt độ mà tại đó, năng lực xúc tác của nó là cao nhất Người ta gọi đó là nhiệt độ tối thích Topt cho enzyme hoạt động [4]

Đối với urease có nguồn gốc từ đậu rựa, theo các tác giả thì nhiệt độ tối thích vào khoảng 40 – 50oC Ở nhiệt độ này, hoạt tính của enzyme là lớn nhất Khi nhiệt độ vượt quá

65oC, hoạt tính của urease bị giảm và có thể mất hẳn khi nhiệt độ đạt 85oC Tuy nhiên,

nhiệt độ tối thích của urease không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nguồn thu nhận, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, pH, thời gian phản ứng… [2,7]

Urease ở dung dịch loãng không có cơ chất thường kém bền nhiệt nhất, còn ở dạng bột khô và có cơ chất thì khá bền nhiệt [2,7]

Ở nhiệt độ thấp, hoạt tính của urease giảm nhưng urease không bị biến tính

1.1.5.3 Ảnh hưởng của pH

pH ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme do pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của phân tử enzyme và cơ chất Nghiên cứu của Howell và Sumner về enzyme urease kết luận urease có pHopt = 6 khi nồng độ cơ chất urea 8% và bằng 7,5 khi nồng độ urea là 1% Điều này cho thấy giá trị pH tối ưu của urease không cố định và nó còn phụ thuộc vào nồng độ cơ chất, nhiệt độ cũng như vào nguồn thu nhận Ngoài ra, tính chất của dung dịch đệm cũng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme urease [2,4,7]

Theo các tài liệu nghiên cứu thì pH tối thích của urease nằm trong khoảng từ 6,4 – 7,6 Urease từ đậu rựa và hầu hết các loại vi sinh vật có pHopt dao động xung quanh giá trị 7,

urease từ tảo Spirulina maxima có pHopt khoảng 8,7, trong khi đó, các loại acid urease có giá trị pH tối thích từ 2 trở xuống [92]

1.1.5.4 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa, chất kìm hãm

Mỗi enzyme đều tồn tại một số hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ mà sự có mặt của chúng có khả năng kích thích hoặc kìm hãm hoạt động của enzyme, gọi là chất kích thích (chất hoạt hóa) và chất kìm hãm (chất ức chế) Tuy nhiên không có sự phân biệt rõ ràng chất ức chế và kìm hãm vì một chất có thể là kích thích với enzyme này nhưng là kìm hãm của enzyme khác hoặc ở nồng độ này là kích thích, nồng độ khác là kìm hãm [6]

 Chất hoạt hóa

Chất hoạt hóa là các chất có khả năng làm tăng hoạt động xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme chuyển từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động Các chất

là cầu nối giữa enzyme với cơ chất, hoặc là cầu nối giữa phần apoenzyme với coenzyme [4].

Hoạt tính của urease bị ức chế khi các nhóm –SH bị vô hoạt Do vậy, những chất có tác dụng phục hồi chức năng của các nhóm –SH tại trung tâm hoạt động như L-cystein thì có thể làm hoạt hóa urease [2,7,92]

Những nhóm –SH tại tâm hoạt động chịu sự oxy hóa dưới tác động của nhiều yếu tố, và sự oxy hóa này xảy ra với tốc độ đáng kể khi có mặt của các ion kim loại xúc tác như

Ag+, Cu2+, Hg2+… Khi dùng EDTA để hấp thụ các ion kim loại trong dung dịch sẽ làm cho tính ổn định của enzyme urease nói riêng và các enzyme chứa nhóm –SH trong tâm hoạt động tăng lên rất nhiều [2,7,92]

Khi nồng độ EDTA-Na2 thấp , EDTA sẽ hấp thụ các ion kim loại, nghĩa là một cách gián tiếp cũng là một chất hoạt hóa urease

Tuy nhiên, nếu nồng độ EDTA-Na2 đạt đến một ngưỡng nào đó, nó sẽ hấp thụ ion

Ni2+ tại trung tâm hoạt động của enzyme, làm ức chế urease Điều này cũng đồng nghĩa với việc EDTA là một chất kìm hãm [92]

 Chất kìm hãm

Chất kìm hãm là các chất có tác dụng chuyển enzyme từ trạng thái hoạt động sang trạng thái không hoạt động, hoặc từ trạng thái hoạt động mạnh sang trạng thái hoạt động yếu Các chất này tồn tại hai loại kìm hãm: cạnh tranh và không cạnh tranh [4]

 Kìm hãm cạnh tranh: xảy ra trong trường hợp chất kìm hãm có cấu trúc tương đồng với cơ chất, vì vậy cũng có khả năng kết hợp với enzyme, giảm mối liên kết giữa enzyme và cơ chất Như vậy, các hợp chất như hydroxyurea, dihydroxyurea, thiourea hay hydroxamic acid là những chất ức chế đặc hiệu cạnh tranh của urease Vì chúng có cấu tạo gần giống cơ chất (urea) nên chúng cũng có khả năng kết hợp với enzyme Do đó sự có mặt của chúng trong dung dịch làm giảm tốc độ phản ứng thủy phân urea Có thể làm giảm

tác dụng của những chất ức chế này bằng cách tăng nồng độ cơ chất urea [2,4,7,92].

 Kìm hãm không cạnh tranh: xảy ra trong trường hợp chất kìm hãm có khả năng kết hợp với enzyme hoặc cơ chất, có thể là ion kim loại cùng hóa trị với các ion kim loại là nhóm ngoại của enzyme Các ion kim loại như như Hg2+,

Cu2+, Pb2+, Mn2+… là những chất kìm hãm không cạnh tranh vì nó có hóa trị cùng với cofactor của urease là Ni2+ Các ion kim loại này sẽ tranh giành các liên kết với Ni2+, và do đó sẽ làm “khóa”ù trung tâm hoạt động của urease Urease rất nhạy cảm với sự có mặt của các ion kim loại vì ngoài tác dụng kìm hãm không cạnh tranh như trên, các ion kim loại còn có thể làm biến tính enzyme do chúng thúc đẩy phản ứng oxy hóa các nhóm –SH tại tâm hoạt động Sự kìm hãm urease của các ion kim loại giàm dần theo thứ tự sau:

1.1.6 Nguồn thu nhận enzyme urease [2,7,92]

Urease được các nhà khoa học tìm thấy khá sớm ở những nguồn nguyên liệu khác nhau

Năm 1980, Miquel tìm thấy urease ở nhiều loài vi sinh vật, nhất là các vi sinh vật trong đất, trong thực vật và một số ít ở động vật Ông đã tìm ra hơn 200 loài vi khuẩn, nhiều loại nấm men và ở đa số các loại thực vật bậc cao có khả năng sinh tổng hợp urease Các vi khuẩn có chứa urease tham gia vào quá trình đồng hóa urea thành muối amon có nhiều loài,

chúng có tên chung là Ureabacterium, hầu hết chúng thuộc 2 họ: Cocoaceae và Bacilaceae

Trong ngành cộng nghệ sinh học, C.Palacco và A.Havir cũng đưa ra phương pháp thu nhận enzyme từ nuôi cấy mô đậu.

Nguồn enzyme urease tự nhiên trong các cây họ đậu rất phong phú Các nhà khoa học đã tận dụng từ các nguồn này để trích ly ra enzyme urease và ứng dụng rộng rãi trong các ngành phân tích thực phẩm và y học

Bảng 1.1: Tính chất của một số loại urease từ các nguồn khác nhau (Liu và cộng sự, 1996) [30]

Nguồn enzyme Hoạt tính riêng (đơn vị/ml) Km (mmol/l)

1.1.7 Ứng dụng của enzyme urease

Enzyme urease hiện nay được ứng dụng nhiều trong các ngành nông nghiệp, thực phẩm, trong y học và các lĩnh vực phân tích khác

Trong nông nghiệp, urease được sử dụng để thúc đẩy quá trình thủy phân urea thành

NH3 cung cấp thành phần Nitơ cho cây trồng Quá trình thủy phân này được thực hiện bởi hệ

vi sinh vật trong đất do chúng sản sinh ra một lượng đáng kể enzyme urease

Trong ngành thực phẩm: urease đã được ứng dụng để phát hiện sự tồn tại của urea trong các loại sản phẩm thịt cá, nước giải khát, các sản phẩm lên men và các sản phẩm từ sữa Urea là một hợp chất không được phép có mặt trong thực phẩm Vì một nguyên nhân không mong muốn, hoặc do có chủ ý mà một lượng urea đã có mặt trong các sản phẩm thực phẩm Do đó mà các chế phẩm urease được sử dụng để phát hiện và, có thể định lượng

Trong y học, urease được sử dụng để xác định hàm lượng urea trong máu và nước tiểu của người Đây là phương pháp khá chính xác, ít tốn kém và dễ tiến hành Việc xác định hàm lượng urea trong máu và nước tiểu sẽ cho biết năng lực hoạt động của các hệ cơ quan, mà quan trong nhất là thận và hệ bài tiết Ngoài ra, urease còn được gắn trong các tiểu vi cầu dùng để loại urea của máu trong thận nhân tạo.

Trong công nghệ môi trường: urease dùng để phân tích hàm lượng các kim loại nặng trong các chất thải và trong nguồn nước

Trong lĩnh vực phân tích: urease được ứng dụng làm các điện cực urease để xác định hàm lượng urea trên dòng liên tục

1.2 SƠ LƯỢC VỀ ENZYME CỐ ĐỊNH [4]

1.2.1 Giới thiệu

1.2.1.1 Định nghĩa

Enzyme cố định có thể được hiểu theo 2 nghĩa:

 Nghĩa hẹp: enzyme không hòa tan là enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này được tách riêng với dung dịch tự do Pha enzyme không hòa tan trong nước và được gắn với các polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn

 Nghĩa rộng: các chất xúc tác cố định là các enzyme, tế bào, cơ thể sống ở trạng thái cho phép sử dụng lại Như vậy, theo nghĩa rộng, enzyme không hòa tan bao gồm cả enzyme được cố định vào một chất mang, cả enzyme có trong tế bào sống được cố định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần

Enzyme không hòa tan hay enzyme cố định thường là những enzyme hòa tan được gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau Nhờ quá trình gắn này mà enzyme từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan

 Hoạt tính riêng của enzyme cố định thường nhỏ hơn hoạt tính riêng của enzyme tự do cùng loại Sở dĩ có sự thay đổi về hoạt tính riêng của enzyme cố định là do những nguyên nhân sau đây:

o Do ảnh hưởng điện tích của chất mang: khi điện tích của chất mang có sự khác biệt với điện tích của enzyme thì khi gắn enzyme vào chất mang, cấu trúc không gian của enzyme có sự thay đổi ở mức độ nhất định Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chúng cũng giảm

o Do enzyme bị nhốt vào mạng lưới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến cho sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất gặp khó khăn

 Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten nhưng có một số sai khác nhất định:

o Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzyme và chất mang

o Xảy ra hiện tưởng cản trở sự khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng

 Enzyme cố định thường có tính bền nhiệt hơn enzyme tự do nhờ tác dụng che chở của các chất mang

 Enzyme cố định thường có pH tối ưu không trùng với pH tối ưu của enzyme tự do cùng loại

 Enzyme cố định có khả năng bảo quản tốt hơn enzyme tự do

 Enzyme cố định có thể tái sử dụng nhiều lần do có thể tách riêng enzyme ra khỏi cơ chất một cách dễ dàng sau phản ứng và độ bền của enzyme cố định cao hơn so với enzyme tự do

1.2.1.3 Ưu, nhược điểm của enzyme cố định [4]

Enzyme cố định có các ưu điểm sau:

 Enzyme cố định không lẫn vào trong sản phẩm cuối của phản ứng enzyme,

do đó nó không gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm, hay nói cách khác chúng ta không phải tốn chi phí cho việc tách enzyme ra khỏi sản phẩm

 Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang-enzyme ra khỏi dung dịch cơ chất

 Enzyme cố định tương đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzyme tự do

 Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phương pháp liên tục

Bên cạnh đó, enzyme cố định vẫn có một số nhược điểm như sau:

 Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzyme

 Trong đa số trường hợp, enzyme có thể bị giảm hoặc mất hoạt tính sau quá trình cố định

Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với lợi ích mà enzyme cố định đem lại Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu về cố định enzyme cũng như ứng dụng enzyme cố định vào sản xuất công nghiệp.

1.2.2 Các phương pháp cố định enzyme [4]

Các phương pháp cố định enzyme được chia thành 2 nhóm chính:

 Phương pháp hóa học:

o Gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị

o Gắn các phân tử enzyme lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị

 Phương pháp vật lý:

o Hấp phụ enzyme lên chất mang bằng liên kết vật lý như: lực mao quản, liên kết ion, lực Van der Waals…

Bảng 1.2: Ưu – Nhược điểm của các phương pháp cố định enzyme [4].

Phương pháp hóa học

Phương pháp gắn

enzyme lên chất mang

bằng liên kết cộng hóa

trị

- Liên kết giữa enzyme và chất mang là liên kết bền, do đó hạn chế được tối đa sự mất mát enzyme trong quá trình phản ứng

- Hoạt tính enzyme có thể bị giảm do những biến đổi về cấu trúc của enzyme trong quá trình cố định

Phương pháp gắn các

phân tử enzyme lại với

nhau bằng liên kết cộng

- Chi phí cao, thao tác thực hiện tương đối phức tạp

- Hoạt tính enzyme có thể bị giảm do những biến đổi về cấu trúc của enzyme trong quá trình cố định

Phương pháp vật lý

Phương pháp gắn

enzyme lên chất mang

bằng tương tác vật lý

- Thao tác thực hiện đơn giản

- Điều kiện tiến hành cố định enzyme ôn hòa nên không làm mất hoạït tính của enzyme trong quá trình cố định

- Có khả năng tái sử dụng chất mang

- Do lực tương tác giữa enzyme và chất mang yếu nên dễ xảy ra hiện tượng nhả hấp phụ trong quá trình sử dụng enzyme cố định do khuấy trộn hay do thay đổi nhiệt độ, pH của môi trường

Phương pháp nhốt

enzyme

- Thao tác đơn giản

- Không đòi hỏi phải có các nhóm tạo liên kết nên phù hợp với nhiều loại enzyme

- Hiệu quả cố định enzyme cao

- Có thể cố định đồng

- Chỉ thích hợp cho phản ứng với cơ chất có khối lượng phân tử nhỏ

1.3 TỔNG QUAN VỀ ENZYME UREASE CỐ ĐỊNH

1.3.1 Giới thiệu [92]

Nghiên cứu về enzyme urease cố định đã được tiến hành khá nhiều kể từ thập niên 1960 Nhiều loại chất mang ở các dạng và kích cỡ khác nhau, đặc biệt là các màng polymer đã được dùng để cố định urease Các chất mang đó có thể là các polymer sinh học như alginate, chitosan, các loại protein, cellulose và các dẫn xuất của nó Bên cạnh đó, cũng có rất nhiều nghiên cứu tìm hiểu phương pháp cố định trên những chất mang hữu cơ khác như polyacrylamide, các loại nylon, màng PVC, các chất liệu silica như TEOS (tetraethoxysilane), TMOS (tetramethoxysilane)… Những nghiên cứu trên đã góp phần mở rộng hiểu biết về enzyme urease cũng như phạm vi ứng dụng của nó trong các lĩnh vực khác nhau trong thực tế

1.3.2 Các phương pháp cố định enzyme urease.

Hiện nay, hầu hết các phương pháp cố định enzyme nêu trên đều có thể được áp dụng để cố định enzyme urease Tuy nhiên, tùy vào mỗi phương pháp cũng như tính chất của các chất mang mà hiệu quả cố định urease sẽ khác nhau Các nghiên cứu về phương pháp cố định enzyme urease được tiến hành với số lượng khá đáng kể và cũng đạt được một số thành công nhất định Có thể kể đến như sau: [92]

 Phương pháp cố định urease bằng liên kết cộng hóa trị trên vật liệu hỗn hợp gồm titanium (IV) chloride và silica được Martins áp dụng vào năm

1987 cho kết quả rất khả quan: khi được sử dụng ở nhiệt độ 37oC, hoạt tính của enzyme cố định hầu như không thay đổi so với enzyme tự do trong suốt hơn 1200 giờ Ngoài ra, pHopt của enzyme cố định cũng dịch chuyển từ 7.4 lên 8, còn nhiệt độ tối thích thì thay đổi từ 65oC lên 75oC Martins cũng thấy khả năng bảo quản cũng như độ bền nhiệt của urease cố định tăng lên rõ rệt

đầu của urease Bên cạnh đó, độ bền nhiệt của enzyme cố định cũng tăng lên đáng kể nhưng các thông số khác như KM và pHopt cho thấy không có sự thay đổi đáng kể Urease cố định trong các hạt PMG được nhồi trong các cột của bình phản ứng có thể giữ được 80% hoạt tính ban đầu trong vòng 1 năm.

 Phương pháp cố định urease lên chất mang là màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị qua glutaraldehyde của Krajewska và cộng sự (1990) giữ lại được hơn 94% hoạt tính so với enzyme tự do Bên cạnh đó, các tính chất khác của enzyme cố định được cải thiện đáng kể như tính bền nhiệt, độ bền ở pH thấp, khả năng tái sử dụng và khả năng bảo quản…[17]

 Urease cố định trên chất mang là sợi tổng hợp từ acrylamide và poly (ethylene terephthalate) sau khi được hoạt hóa bằng glutaraldehyde (Elcin và Sacak, 1996) có độ bền khi sử dụng và khả năng tái sử dụng rất cao với khoảng hơn 85% hoạt tính ban đầu được giữ lại sau 90 ngày

Bảng 1.3: Một số phương pháp cố định enzyme urease

Phương pháp hóa học

Liên kết cộng hóa trị Chitosan, tác nhân liên kết là glutaraldehyde Krajewska và cộng sự, 1990 [17]

Krajewska và cộng sự, 2005 [18]Krajewska, 2000 [19]

Nylon, tác nhân liên kết là glutaraldehyde Pietta và cộng sự, 1990 [65]

George và cộng sự, 1996 [79]Anita và cộng sự, 1997 [10]Nhựa Amberlite MB_1, tác nhân lên kết là glutaraldehyde Anita và cộng sự, 1997 [9]Organosilane, tác nhân liên kết là glutaraldehyde Airoldi, 2003 [26]

Polymethylglutamate, tác nhân liên kết là glutaraldehyde Kubo và cộng sự, 1986 [42]Phương pháp vật lý

Nhốt trong gel

Boubriak và cộng sự, 1995 [64]

Mourzina, 2003 [41]

Polymer của polyacrylamide và carrageenan Kara và cộng sự, 2006 [34]

Vật liệu silica (phương pháp sol-gel) Craith và cộng sự, 1997 [22]

Lee và cộng sự, 2002 [74]Sahney và cộng sự, 2005 [72]Ilangovan và cộng sự, 2006 [68]Nhốt enzyme trong hệ sợi Composite của cellulose acetate và TiO2 Hatayama và cộng sự, 1995 [40]

1.3.3 Tính chất của enzyme urease cố định

1.3.3.1 Hoạt độ xúc tác của enzyme urease cố định

Các nghiên cứu về enzyme cố định nói chung và về enzyme urease cố định nói riêng đều cho thấy hoạt tính riêng của enzyme sau cố định giảm đi so với enzyme tự do

 Nghiên cứu của Rao và cộng sự cố định enzyme urease trên chất mang là một copolymer của gelatin và poly (HEMA) (1995) cho kết quả hoạt tính riêng của enzyme cố định chỉ còn lại 75% so với hoạt tính của enzyme urease tự do [60]

 Nghiên cứu của Turmanova và cộng sự về việc cố định urease lên màng trao đổi ion (2005) với màng là polymer của acid acrylic và lớp phim polyethene mỏng cho thấy hoạt tính của urease sau cố định còn lại khoảng 80% so với enzyme tự do [75]

Nguyên nhân xảy ra hiện tượng giảm hoạt tính riêng của enzyme khi cố định trên chất mang có thể là do: [4]

 Khi gắn enzyme vào chất mang, dưới ảnh hưởng của điện tích ở chất mang, hình thể của phân tử enzyme sau khi cố định bị thay đổi làm cho khả năng xúc tác của enzyme cũng bị thay đổi

 Khi gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị, một số hóa chất sử dụng trong quá trình cố định có thể làm vô hoạt bất thuận nghịch enzyme

 Tương tác protein-protein giữa các phân tử enzyme đã cố định làm biến đổi một phần cấu trúc không gian của phân tử enzyme, do đó hoạt độ xúc tác cũng giảm

 Đối với trường hợp enzyme cố định trên chất mang bằng phương pháp nhốt

năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme (nhất là các cơ chất có kích thước lớn), do đó hoạt lực của enzyme cố định giảm.

Nhìn chung enzyme urease cố định cũng như các loại enzyme cố định khác vẫn giữ được tính đặc hiệu của mình Thêm vào đó, nhờ liên kết với chất mang mà chúng có độ bền vững lớn đối với các tác động khác nhau Như vậy, đứng trên quan điểm thực tế, sự giảm hoạt độ hoàn toàn có thể được bù lại bằng tính chất này [4]

1.3.3.2 Tính chất động học của enzyme urease cố định

Kết quả của hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng urease cố định cũng tuân theo định luận Michaelis – Menten [4]

Tuy nhiên, các thông số động học của urease cố định như KM, Vmax có thể bị biến đổi Cũng theo kết quả của các nghiên cứu này thì đối với urease cố định, hằng số KM

thường có khuynh hướng tăng còn Vmax lại có khuynh hướng giảm so với urease tự do

 Krajewska đã có nhiều công trình nghiên cứu cố định urease trên chất mang là chitosan Năm 1990, nghiên cứu cố định urease lên chitosan của tác giả cùng các cộng sự cho thấy: Km của enzyme cố định là 26.4 mmol/lit

so với enzyme tự do là 5.04 mmol/lit, trong khi đó, Vmax của enzyme cố định lại giảm khoảng 1.5 lần so với enzyme tự do Một nghiên cứu khác của tác giả vào năm 2005 cũng cho kết quả Km của enzyme cố định tăng

so với enzyme tự do [17]

 Nghiên cứu của Hatayama và cộng sự (1995) cố định urease bằng phương pháp nhốt trong hệ sợi tổng hợp từ cellulose acetate và TiO2 cũng cho thấy

Km của urease cố định có giá trị là 8.10-1mol/lit, cao hơn nhiều so với Km

của urease tự do (có giá trị 9,4.10-4 mol/lit), trong khi đó, Vmax của urease cố định là 7,2 10-5 mol/phút/g, thấp hơn urease tự do (2,7.10-3 mol/phút/g) [40]

 Nghiên cứu chế tạo biosensor sử dụng urease cố định bằng phương pháp

bò và glutaraldehyde của Lee và cộng sự (1999) cho kết quả là hằng số Michealis – Menten Km của urease cố định lần lượt là 4.95 và 6.5 mM cao hơn so với urease tự do là 1.69 mM [90].

 Nghiên cứu cố định urease trên các chất mang khác nhau như hỗn hợp chitosan – alginate và hỗn hợp poly(acrylamide-co-acrylic acid)/κ-carrageenan của Kara và cộng sự (2006) cho thấy: Km của enzyme cố định lớn hơn enzyme tự do (4.3 mmol và 3.30 mmol của enzyme cố định so với 3.03 mmol của enzyme tự do), trong khi đó Vmax của enzyme tự do là 0.0182 mM/phút lớn hơn enzyme cố định lần lượt là 0.0104 và 0.0099 mM/phút [31]

Nguyên nhân của sự thay đổi các thông số động học của urease cố định có thể là do: [4]

 Sự khác biệt về hiện tượng phân bố chất hòa tan trong môi trường có enzyme cố định với sự phân bố chất hòa tan trong môi trường có enzyme tự do Hiện tượng này xảy ra khi sử dụng các chất mang có tích điện để cố định enzyme Sự có mặt của các chất mang có điện tích sẽ gây ra hiện tượng tập trung cơ chất tại bề mặt chất mang nếu cơ chất tích điện ngược dấu với chất mang và ngược lại Kết quả của sự tương tác này dẫn đến sự phân bố nồng độ chất hòa tan ở môi trường gần enzyme khác với nồng độ chất hòa tan ở môi trường trong dung dịch Nếu cơ chất và chất mang tích điện trái dấu, cơ chất sẽ tập trung nhiều trên bề mặt chất mang, kết quả dẫn đến ái lực biểu kiến của enzyme và cơ chất sẽ tăng và ngược lại

 Những thay đổi về cấu trúc không gian của enzyme khi có mặt chất mang Khi enzyme gắn lên chất mang sẽ gây ra những biến đổi hình thể của enzyme cũng như sẽ tạo ra sự cản trở không gian giữa enzyme và cơ chất

do có mặt chất mang, làm giảm khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất,

 Những hạn chế về mặt khuếch tán khi có mặt chất mang, đặc biệt là trong trường hợp chất mang dạng khuôn gel hoặc màng bao vi thể Vận tốc khuếch tán cơ chất và các chất hòa tan khác phụ thuộc vào kích thước lỗ mao quản và kích thước phân tử của cơ chất Tuy nhiên, để làm tăng vận tốc khuếch tán, chúng ta có thể gia tăng sự khuấy đảo môi trường hoặc giảm kích thước hạt gel [4].

1.3.3.3 Aûnh hưởng của nhiệt độ đến enzyme urease cố định

Cũng như enzyme tự do, nhiệt độ là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính cũng như các tính chất khác của enzyme urease cố định Nhiều nghiên cứu về enzyme urease cố định đã kết luận rằng nhờ liên kết với chất mang mà urease cố định có tính bền nhiệt tốt hơn so với enzyme tự do Bên cạnh đó, nhiệt độ tối ưu của enzyme cố định cũng có xu hướng chuyển dịch lên những nhiệt độ cao hơn tùy vào loại enzyme urease và phương pháp cố định [4]

 Nghiên cứu của Rao và cộng sự về cố định urease đậu rựa lên màng polymer từ gelatin và poly(HEMA) (1995) cho thấy nhiệt độ tối ưu của urease cố định dịch chuyển từ 60oC lên 70oC, trong khi đó độ bền nhiệt của urease cố định tại các nhiệt độ khác nhau thì cao hơn so với urease tự do trong cùng điều kiện [60]

(a)

Hình 1.5: (a) Nhiệt độ tối ưu của enzyme urease tự do và cố định

(b) Độ bền nhiệt của urease tự do và cố định

○Urease tự do ●Urease cố định

 Nghiên cứu của Chen và Chiu về cố định urease từ đậu rựa trên bề mặt của các hạt chitosan xốp (1999) cho kết quả tại nhiệt độ 70oC trong đệm

pH 7, enzyme cố định bền hơn so với enzyme tự do, cụ thể là enzyme tự

do bị mất đi một nửa hoạt tính ban đầu sau 70 phút, trong khi đó, cần đến

175 phút thì urease cố định mới bị mất đi một nửa hoạt tính ban đầu Nghiên cứu cũng cho thấy Topt của urease cố định tăng từ 60oC lên 70oC [48]

Hình 1.6: Độ bền nhiệt của enzyme urease tự do và cố định tại nhiệt độ 70 o C

trong đệm pH 7.

Hình 1.7: Nhiệt độ tối ưu của enzyme ureae tự do và cố định trong đệm pH 6.5

1.3.3.4 Aûnh hưởng của pH đến enzyme urease cố định

pH tối ưu của urease cố định, cũng như nhiều loại enzyme cố định khác, có thể thay đổi so với enzyme tự do pH tối ưu này có thể dịch chuyển về phía kiềm hay về phía acid sau khi cố định [4]

 Nghiên cứu của Turmanova và cộng sự về việc cố định urease lên màng trao đổi ion (2005) với màng là polymer của acid acrylic và lớp phim polyethene mỏng cho thấy pH tối ưu của urease tự do là 5.8, trong khi đó,

pH tối ưu của enzyme cố định là 6 [75]

Hình 1.8: Aûnh hưởng của pH đến enzyme cố định trên màng trao đổi ion

 Nghiên cứu cố định urease đậu rựa trên các chất mang khác nhau như hỗn hợp chitosan – alginate và hỗn hợp poly(acrylamide-co-acrylic acid)/κ-carrageenan của Kara và cộng sự (2006) cho thấy pH tối ưu của enzyme sau cố định dịch chuyển từ 7.5 lên 8 Thêm vào đó, hoạt tính của urease cố định trong điều kiện pH thấp cũng cao hơn so với urease tự do [34]

Hình 1.9: Aûnh hưởng của pH đến enzyme urease cố định.

Tuy nhiên, cũng có nhiều trường hợp mà pH tối ưu của enzyme cố định không có sự khác biệt so với enzyme tự do, chỉ có một số khác biệt là độ bền của enzyme cố định trong môi trường acid hoặc base tốt hơn so với enzyme tự do.

 Nghiên cứu của Chen và Chiu về cố định urease trên bề mặt của các hạt chitosan xốp (1999) cho thấy pH tối ưu của enzyme cố định là 7.5 và không có sự dịch chuyển so với enzyme tự do, nhưng hoạt tính của urease cố định tại các pH acid và base lại cao hơn so với urease tự do [48]

Nguyên nhân của sự chuyển dịch pHopt của enzyme sau cố định có thể là do: [4]

 Aûnh hưởng của trường tĩnh điện của chất mang

 Sự tương tác giữa các nhóm chức của chất mang với các nhóm chức của enzyme

1.3.3.5 Aûnh hưởng của thời gian bảo quản đến hoạt tính của urease cố định

Enzyme urease nói riêng và các enzyme cố định nói chung nhờ sự bảo vệ của chất mang chống lại các tác động bất lợi bên ngoài nên có khả năng bảo quản tốt hơn so với các enzyme tự do và có thể được tái sử dụng nhiều lần Hầu hết các nghiên cứu về enzyme urease cố định đều cho thấy kết quả như trên [4]

 Nghiên cứu cố định urease nhờ màng bao phospholipid liên kết với silica của Kallury và cộng sự (1993) cho thấy sau 42 ngày trong điều kiện bảo quản khô ở nhiệt độ phòng, hoạt tính của urease cố định hầu như không thay đổi so với ngay sau khi cố định

 Nghiên cứu cố định urease lên nylon và màng Amberlite MB-1 của Anita và cộng sự (1997) cũng cho kết quả khả năng bảo quản của enzyme cố định tốt hơn so với enzyme tự do: đối với màng nylon, sau 60 ngày ở điều kiện 4oC và trong đệm phosphate pH 6, hoạt tính urease cố định còn lại đến 76% hoạt tính ban đầu Còn đối với màng Amberlite MB-1, con số đó là 65% [9,10]

 Nghiên cứu chế tạo biosensor dùng urease cố định trong gel albumin huyết thanh bò của Milardovic và cộng sự (1999) cho thấy trong điều kiện bảo quản ở 6oC, đệm Tris – HCl pH 7.4, sau 45 ngày hoạt tính của urease cố định chỉ mất đi 20% so với hoạt tính ban đầu [80].

 Nghiên cứu của Teke và cộng sự (2007) về chế tạo điện cực dùng urease cố định trên gelatin cho thấy, hoạt tính của urease hầu như không thay đổi sau 14 lần sử dụng điện cực để phân tích urea, sau lần thứ 15 thì hoạt tính này cũng chỉ giảm 2% [56]

CHƯƠNG 2:

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Enzyme urease (EC 3.5.1.5)

Chế phẩm enzyme urease (carbamine amideohydrolase, EC 3.5.1.5) thu nhận từ đậu rựa do hãng Merck (Đức) cung cấp với các tính chất như sau:

 Họat tính xúc tác: 5 U/mg, trong đó, 1U được định nghĩa là lượng enzyme urease có khả năng xúc tác để chuyển hóa urea tạo thành 1 μmol NH3 sau

1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn

 Tính chất hóa lý:

o Dạng bột khô, màu từ trắng đến hơi vàng, không mùi

o Ít tan trong nước (20oC)

o pH của dung dịch nồng độ 5g/l ở 20oC: 6 – 7

o Khối lượng riêng: 410 kg/m3

2.1.2 Vật liệu cố định

2.1.2.1 Chitosan

Hình 2.1: Cấu tạo của chitosan

• Thông số hóa lý:

o Độ ẩm: 15.92%

o Độ tro: 2.0675% (theo khối lượng chất khô của nguyên liệu)

o Độ nhớt dung dịch 1%: 50.33 cp

o Chỉ số deacetyl hóa (chỉ số DD): 75%

o Phân tử lượng trung bình: 5.187x104 đvC

2.1.2.2 Gelatin

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng gelatin dạng bột khô của hãng Merck (Đức) với các chỉ tiêu chất lượng được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1: Chỉ tiêu chất lượng của gelatin (Meck)

Thành phần Giá trị

Hàm lượng SO2, % ≤0,004Hàm lượng Arsenic, % ≤0,00006

Hàm lượng H2O2, ppm ≤0,01

pH (1% gelatin :nước) 3,8-7,6

E coli, tế bào/10 gram 0

Salmonella, tế bào/10 gram 0

2.1.2.3 Chất tạo liên kết [94]

Mục đích của việc sử dụng chất tạo liên kết trong cố định enzyme urease là để

Hình 2.2: Công thức cấu tạo của glutaraldehyde

Glutaraldehyde có 2 nhóm chức aldehyde ở 2 đầu Hai nhóm này sẽ tạo liên kết với nhóm amin của chất mang và của enzyme, từ đó giữ enzyme cố định trên chất mang Một số tính chất hóa lý của glutaraldehyde được trình bày cụ thể trong bảng 2.2

Bảng 2.2: Một số tính chất hóa lý của glutaraldehyde

Công thức C5H8O2

Phân tử khối (đvC) 100.12Tỷ trọng (g/ml) 1.06Điểm nóng chảy (oC) -14Điểm sôi (oC) 187Trong nghiên cứu này, chúng tôi dùng glutaraldehyde nồng độ ban đầu 25% do hãng Merck cung cấp

2.1.3 Hóa chất

Trong nghiên cứu này, chúng tôi còn sử dụng một số hóa chất khác như urea,

NH4Cl, dung dịch HCl, NaOH, acid acetic… của hãng Hangzhou King Techina (Trung Quốc) và thuốc thử Nessler, đệm Tris, NiSO4 do hãng Merck (Đức) cung cấp

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Mục đích và nội dung nghiên cứu

Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số phương pháp cố định enzyme urease trên các loại chất mang khác nhau như chitosan, gelatin, lòng trắng trứng để tìm ra phương pháp thích hợp nhất và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của phương pháp cố định được chọn Bên cạnh đó, chúng tôi cũng khảo sát các tính chất và xác định các thông số hoạt động của enzyme urease cố định

Nội dung nghiên cứu của chúng tôi được trình bày cụ thể trong hình 2.3

Nghiên cứu chọn chất mang và phương pháp

cố định enzyme urease lên chất mang

Các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp cố

định enzyme urease lên màng chitosan bằng

liên kết cộng hóa trị

Khảo sát các tính chất của urease cố định

Liên kết cộng hóa trị

Gói trong khuôn gel

Chitosan Gelatin

Lòng trắng trứng Tính chất động học

Ảnh hưởng của pH Ảnh hưởng của nhiệt độ Độ bền bảo quản

Gelatin

Độ bền bền nhiệt

2.2.2 Khảo sát xác định phương pháp cố định enzyme urease

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sẽ tiến hành cố định enzyme urease theo 4 phương pháp:

• Phương pháp nhốt enzyme urease trong gel gelatin

• Phương pháp nhốt enzyme urease trong gel lòng trắng trứng (albumin)

• Phương pháp gắn enzyme lên chất mang gelatin bằng liên kết cộng hóa trị

• Phương pháp gắn enzyme lên chất mang chitosan bằng liên kết cộng hóa trị.Sau đó dựa vào hoạt tính của enzyme urease sau cố định trên chất mang, chúng tôi sẽ xác định được phương pháp cố định enzyme urease tốt nhất trong 4 phương pháp

2.2.2.1 Phương pháp cố định enzyme urease trong gel gelatin theo phương pháp nhốt

Pha dung dịch gelatin trong đệm phosphate nồng độ 60 mg/ml để trong bể điều nhiệt ở 60oC cho tan đều Sau đó, khuấy dung dịch gelatin trên máy khuấy từ, thêm 10 µl dung dịch glutaraldehyde trộn đều Bổ sung enzyme urease vào dung dịch gelatin ở trên với nồng độ 15 mg/ml Tạo màng trên ống thủy tinh bằng cách rút 30 μl dung dịch enzyme – gelatin tạo màng trên ống nghiệm với chiều cao 10 mm, để khô ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút, sau đó nhúng màng vào dung dịch glutaraldehyde 2.5%, lấy ra để khô và rửa lại bằng đệm để loại glutaraldehyde không liên kết, rửa lại màng bằng nước cất rồi bảo quản trong đệm phosphate ở 4oC (Hình 2.4)

Chuẩn bị dung dịch chất

tạo màng

Bổ sung enzyme

Tạo màng

Hong khô màng lần 1

Nhúng qua dung dịch glutaraldehyde 2.5%

Hong khô màng lần 2

2.2.2.2 Phương pháp cố định enzyme urease trong lòng trắng trứng bằng phương pháp nhốt.

Pha dung dịch albumin trong đệm phosphate nồng độ 0,1 mg/ml Sau đó, khuấy dung dịch albumin trên máy khuấy từ Bổ sung enzyme urease vào dung dịch albumin ở trên với nồng độ 10 mg/ml Tạo màng trên ống thủy tinh bằng cách rút 30 μl dung dịch enzyme – albumin tạo màng trên ống nghiệm với chiều cao 10 mm, để khô ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút, lấy ra để khô rồi bảo quản trong đệm phosphate ở 4oC

2.2.2.3 Phương pháp gắn enzyme lên chất mang chitosan bằng liên kết cộng hóa trị 2.2.2.3.1 Chuẩn bị màng chitosan

• Pha dung dịch chitosan nồng độ 1% trong dung dịch acid acetic 1%

• Rút 100 µl dung dịch chitosan tạo màng trên ống thủy tinh với chiều cao màng là 10 mm

• Hong khô màng ở 60oC rồi để màng khô trong 1 đêm

• Trung hòa màng bằng dung dịch NaOH 1% trong vòng 30 phút rồi rửa sạch bằng nước cất (có thể ngâm màng trong nước cất 30 phút)

• Ngâm màng trong dung dịch glutaraldehyde trong thời gian 60 – 90 phút Sau đó rửa và ngâm lại trong nước cất để loại bỏ các phân tử glutaraldehyde không liên kết

2.2.2.3.2 Cố định

• Pha dung dịch enzyme nồng độ 3 mg/ml trong đệm phosphate pH 5.6 có bổ sung EDTA nồng độ 10mM

• Ngâm màng trong dung dịch enzyme qua 24 giờ

• Sau 24 giờ, lấy màng ra để ráo rồi rửa lại bằng nước cất để loại các phân tử enzyme tự do

• Bảo quản trong đệm phosphate pH 7 ở 4 – 5oC.

2.2.2.4 Phương pháp gắn enzyme lên chất mang gelatin bằng liên kết cộng hóa trị 2.2.2.4.1 Tạo màng

• Chuẩn bị dung dịch gelatin nồng độ 60mg/ml trong đệm phosphate

• Rút 30 µl dung dịch gelatin để tạo màng trên ống thủy tinh với chiều cao màng là 10 mm

• Hong khô màng ở 60oC, sau đó để nguội và nhúng vào dung dịch glutaraldehyde 0.01% trong vòng 30 phút

• Rửa màng bằng nước cất để loại các phân tử glutaraldehyde tự do

2.2.2.4.2 Cố định

Tiến hành tương tự như với màng chitosan

Phương pháp cố định enzyme urease bằng cách tạo liên kết đồng hóa trị được trình bày tóm tắt trong hình 2.5

Tạo màng

Ngâm dung dịch glutaraldehyde 0.01%

Rửa màng lần 1

Ngâm trong dung dịch enzyme 24 giờ

Rửa màng lần 2

Bảo quản

Enzyme cố định

Hình 2.5: Sơ đồ phương pháp cố định enzyme urease bằng liên kết đồng hóa trị.

2.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme urease lên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị

Sau khi đã chọn chitosan làm chất mang để cố định enzyme urease, trong phần nghiên cứu này, chúng tôi sẽ khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme urease trên màng chitosan

2.2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của độ dày màng

Do điều kiện không cho phép nên chúng tôi vẫn chưa xác định được trực tiếp độ dày của màng Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ có thể tiến hành khảo sát ảnh hưởng của độ dày màng chitosan đến hoạt tính của enzyme urease cố định một cách gián tiếp thông qua thể tích rút dung dịch chitosan để tạo màng Trình tự thí nghiệm như sau:

• Tạo màng với các thể tích dung dịch chitosan khác nhau như: 30µL, 50µL, 100µL và150µL

• Các bước cố định enzyme sau đó được tiến hành như đã trình bày ở mục (2.2.2.2)

• Tiếp theo, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính của enzyme cố định ứng với từng nồng độ dung dịch glutaraldehyde khác nhau

2.2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch glutaraldehyde.

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sẽ xem xét ảnh hưởng của nồng độ dung dịch glutaraldehyde dùng để ngâm ống thủy tinh trước khi cố định enzyme Trình tự thí nghiệm như sau:

• Sau khi tạo màng chitosan, ống thủy tinh sẽ được ngâm vào các dung dịch glutaraldehyde có nồng độ 0.005%, 0.01%, 0.05% và 0.1% trong thời gian 60 phút

• Các bước cố định enzyme sau đó được tiến hành như đã trình bày tại mục (2.2.2.2)

• Tiếp theo, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính của enzyme cố định ứng với từng nồng độ dung dịch glutaraldehyde khác nhau

2.2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm màng trong dung dịch glutaraldehyde.

Mục đích của chúng tôi trong thí nghiệm này là khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm ống thủy tinh trong dung dịch glutaraldehyde đến hiệu quả của quá trình cố định enzyme urease lên màng chitosan Thí nghiệm được tiến hành như sau:

• Ống thủy tinh sau khi được tạo màng sẽ được ngâm vào dung dịch glutaraldehyde 0.01% trong các khoảng thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút và

120 phút

• Các bước cố định sau đó cũng được tiến hành như đã trình bày ở mục (2.2.2.2)

• Tiến hành xác định hoạt tính của enzyme cố định ứng với từng thời gian ngâm dung dịch glutaraldehyde khác nhau để tìm ra thời gian ngâm tốt nhất

2.2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch enzyme urease dùng để cố định

Theo các nghiên cứu đã tiến hành trước đó thì pH của dung dịch enzyme cố định sẽ ảnh hưởng đến tính chất của glutaraldehyde, từ đó có thể làm tăng hoặc giảm khả năng tạo liên kết đồng hóa trị giữa glutaraldehyde và phân tử enzyme Trong thí nghiệm này, chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch enzyme cố định lên hiểu quả của phương pháp cố định Thí nghiệm được tiến hành như sau:

• Các bước tạo màng chitosan cho ống thủy tinh được tiến hành như mục (2.2.2.2) đã trình bày

• Tiến hành pha hai loại dung dịch urease: loại thứ nhất được pha trong đệm phosphate 1/15 M, EDTA 10 mM có pH 7.4 là pH tối thích của enzyme urease tự do Loại thứ hai được pha trong đệm phosphate nồng độ như trên nhưng với

pH là 5.6 và pH 5.2

• Các bước cố định cũng được tiến hành như đã trình bày ở mục (2.2.3.2)

• Tiến hành xác định hoạt tính của enzyme cố định ứng với từng pH dung dịch

2.2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian cố định

Hiệu quả của phương pháp cố định phụ thuộc vào lượng enzyme tạo được liên kết đồng hóa trị thông qua glutaraldehyde với chất mang và lượng enzyme liên kết này phụ thuộc vào thời gian nhúng ống thủy tinh vào dung dịch enzyme urease Trong thí nghiệm này, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm ống thủy tinh trong dung dịch enzyme đến hiệu quả của phương pháp cố định Chúng tôi tiến hành thí nghiệm như sau:

• Việc tạo màng chitosan trên ống thủy tinh được tiến hành theo các bước như mục (2.2.2.2)

• Ngâm ống thủy tinh trong dung dịch enzyme nồng độ 3 mg/ml pha trong đệm Chúng tôi lấy các mẫu ống thủy tinh ra khỏi dung dịch enzyme cố định sau các khoảng thời gian 6 giờ, 18 giờ, 24 giờ và 30 giờ

• Các bước xử lý sau được tiến hành như đã trình bày trong mục (2.2.3.2)

• Tiến hành xác định hoạt tính của enzyme cố định ứng với từng thời gian cố định khác nhau để tìm ra thời gian thích hợp

2.2.4 Xác định hiệu suất cố định enzyme urease cố định lên chất mang chitosan bằng liên kết cộng hóa trị

Chúng tôi tính hiệu suất cố định urease theo trình tự sau:

 Xác định hoạt tính của urease tự do A (U/mgbột) TD

 Xác định hoạt tính của urease cố định A (U/mgbột) CD

 Xác định hệ số chuyển đổi hoạt tính:

TD

CD

A K A

= (2.1)

 Tính hàm lượng protein có trong dung dịch enzyme ban đầu P2

(µgprotein/mgbột)

 Tính hàm lượng protein có trong dung dịch enzyme còn lại sau cố định P1

pH, thời gian phản ứng… và thay đổi nồng độ cơ chất urea trong khoảng 0-4.5% rồi so sánh hoạt tính của urease ở những nồng độ đó Từ kết quả thực nghiệm thu được, chúng tôi tiến hành tính toán xác định giá trị các thông số động học của phản ứng enzyme là Km

và Vmax Tiến hành tương tự với enzyme urease tự do để kiểm chứng

Xác định hoạt tính của enzyme tự do và cố định ứng với từng nồng độ urea khác nhau Vẽ đồ thị Michaelis Menten (tốc độ thủy phân urea V theo nồng độ cơ chất [S]), đồ thị Lineweaver-Burk (1/V theo 1/[S]) để xác định Vmax, Km và nồng độ cơ chất [S] mà tại đó hoạt tính enzyme urease là cao nhất

2.2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến enzyme urease cố định trên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị.

Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme cố định cũng như độ bền nhiệt của nó Chúng tôi cũng song song khảo sát enzyme cố định và enzyme tự do để có sự so sánh Chúng tôi cố định các yếu tố như nồng độ enzyme, nồng độ urea, pH dung dịch phản ứng, thời gian phản ứng, cho nhiệt độ dung dịch phản ứng thay đổi từ 30 oC đến 80oC và xác định hoạt tính enzyme urease cố định và tự do ứng với mỗi nhiệt độ

2.2.5.3 Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme cố định.

Với thí nghiệm này, chúng tôi giữ enzyme urease cố định và tự do ở nhiệt độ 55oC và lấy mẫu enzyme sau mỗi 30 phút để xác định hoạt tính và đánh giá sự giảm hoạt tính của enzyme urease cố định và enzyme urease tự do theo thời gian

Sự vô hoạt enzyme dưới tác dụng của nhiệt độ được biểu diễn theo phương trình (3.4) [4,15]

k: Hằng số tốc độ vô hoạt enzyme (phút-1)

Ao: Hoạt độ riêng của enzyme tại thời điểm ban đầu (U/mg protein enzyme)

A: Hoạt độ riêng còn lại của enzyme sau thời gian gia nhiệt t (U/mg protein enzyme)

Lấy logarit phương trình (3.7) ta được phương trình:

Trong thực nghiệm, để đơn giản, người ta có thể thay giá trị hoạt độ riêng của