Luận văn tốt nghiệp về việc sử dụng kit thu nhanh trong phân tích urea

Luận văn tốt nghiệp về việc sử dụng kit thu nhanh trong phân tích urea.

KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT THỬ NHANH

TRONG PHÂN TÍCH UREA

SVTH : TRỊNH THỊ THANH TÂM MSSV : 60302440

CBHD : TS TRẦN BÍCH LAM BỘ MÔN KỸ THUẬT THỰC PHẨM

TP Hồ Chí Minh, 01/2008

HƯỚNG DẪN

PHẢN BIỆN

LỜI CẢM ƠN



Trước hết, em xin gởi lời cám ơn đến thầy cô trường Đại học Bách Khoa, đặc biệt làcác thầy cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quýbáu cho chúng em trong suốt gần năm năm ngồi trên ghế giảng đường đại học

Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cô Trần Bích Lam đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ

em rất nhiều để em có thể hoàn thành tốt luận văn này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn các bạn lớp HCTP03 đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gianlàm luận văn Chúc các bạn luôn vui vẻ và thành công trong cuộc sống

SinhviênTrịnhThị ThanhTâm

MỤC LỤC

TRANGBÌAA i

LỜICẢMƠNN ii

MỤCLỤCC iii

DANHSÁCHHÌNHVẼÕ vii

DANHSÁCHBẢNGBIỂUU ix

LỜIMỞĐẦUU 1

CHƯƠNG1 2 1 1.1 Enzyme urease (EC 3.5.1.5) 3

1.1.1 Danh pháp quốc tế và phân loại 3

1.1.2 Tính chất vật lý của enzyme urease 3

1.1.3 Tính chất hóa lý của enzyme urease 6

1.1.4 Trung tâm hoạt động 6

1.1.5 Cơ chế xúc tác 9

1.1.6 Cơ chất của urease 10

1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của urease 12

1.2 Các phương pháp thu nhận urease 23

1.2.1 Nguồn thu nhận 23

1.2.2 Một số phương pháp tách chiết và tinh chế enzyme 26

1.3 Các phương pháp xác định hoạt tính urease 27

1.3.1 Xác định hoạt tính urease dựa trên việc định lượng NH3được giải phóng 29

1.3.2 Xác định hoạt tính urease bằng cách định lượng CO2được giải phóng 30

1.4 Ứng dụng của enzyme urease 31

1.4.1 Trong nông nghiệp 31

1.4.2 Trong thực phẩm 31

1.4.3 Trong phân tích hóa sinh 31

1.4.4 Trong công nghệ môi trường 32

1.4.5 Trong y học 32

1.5 Tổng quan về urea 32

1.5.1 Cấu tạo hóa học của urea 32

1.5.2 Phát hiện 33

1.5.3 Công dụng 34

1.5.4 Mức độ nguy hiểm 35

1.5.5 Các nguồn phát sinh urea 35

1.5.6 Các phương pháp xác định urea 39

1.6 Kit thử nhanh trong phân tích urea 46

1.6.1 Tình hình các loại kit thử nhanh ở Việt Nam [52] 46

1.6.2 Các loại kit phân tích urea 47

CHƯƠNG2 50 2 2.1 Nguyên liệu 51

2.1.1 Hóa chất 51

2.1.2 Dụng cụ 51

2.2.5 Phương pháp chọn thể tích chấm enzyme phù hợp 58

2.2.6 Phương pháp nghiên cứu lượng enzyme urease thích hợp cho lên kit 59

2.2.7 Phương pháp khảo sát giới hạn phát hiện của kit, xây dựng thang màu bán định lượng urea và đường chuẩnpH 60

2.2.8 Phương pháp xác định thời gian hiện màu của kit 60

2.2.9 Phương pháp xác định thời gian sử dụng của kit 60

2.2.10 Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong mẫu thực 61

2.2.11 Các phương pháp xử lý số liệu 61

CHƯƠNG3 62 3 3.1 Khảo sát các loại chất chỉ thị màu 63

3.2 Khảo sát lượng chất chỉ thị thích hợp cho lên kit 65

3.3 Khảo sát dung môi pha urease 68

3.3.1 Khảo sát hoạt tính của enzyme urease theo phương pháp Nessler 68

3.3.2 Khảo sát dung môi dùng để pha urease 70

3.4 Khảo sát lượng enzyme thích hợp cho lên kit 72

3.4.1 Khảo sát thể tích chấm enzyme urease lên kit 72

3.4.2 Khảo sát nồng độ dung dịch enzyme urease cho lên kit 72

3.5 Khảo sát giới hạn phát hiện của kit, xây dựng thang màu bán định lượng urea và đường chuẩnpH 76

3.5.1 Xác định khả năng phát hiện của kit 76

3.5.2 Xây dựng thang màu bán định lượng urea 77

3.5.3 Xây dựng đường chuẩnpH để định lượng urea 78

3.6 Khảo sát thời gian hiện màu của kit 83

3.7 Khảo sát thời gian sử dụng của kit 85

3.8 Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong mẫu thực 87

3.8.1 Sữa 87

3.8.2 Nước mắm 89 3.8.3 Thủy sản 90

CHƯƠNG4 95 4

4.1 Kết luận 96 4.2 Kiến nghị: 97

TÀI LIỆU THAMKHẢOO 98

DANH SÁCH HÌNH VẼ

Chương 1: TỔNG QUAN

Hình 1.1: Tinh thể urease được J.B.Summer chiết tách và kết tinh 4

Hình 1.2: Khối lượng phân tử của urease qua cột lọc gel Agarose A_15m 4

Hình 1.3: Cấu trúc của enzyme urease 6

Hình 1.4: Trung tâm hoạt động của urease 8

Hình 1.5: Urease từ K.aerogenes và từ Bacillus pasterrii 8

Hình 1.6: Cơ chế xúc tác của enzyme 9

Hình 1.7: Cơ chế xúc tác của urease 10

Hình 1.8: Công thức cấu tạo của một số cơ chất chứa phospho của urease 11

Hình 1.9: Đồ thị biểu diễn vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất 12

Hình 1.10: Đồ thị hoạt tính urease theo pH trong 3 loại đệm nồng độ M/8 14

Hình 1.11: Ảnh hưởng của chất kìm hãm cạnh tranh và không cạnh tranh 16

Hình 1.12: Cơ chế ức chế của hydroxamic acid với urease 17

Hình 1.13: Công thức hóa học của các α-hydroxyketones (1–13) and α – diketones (14–20) 19

Hình 1.14: Ảnh hưởng của các hợp chất thiols, urea và acid boric tới khả năng ức chế urease của dịch chiết tỏi trước khi ủ 21

Hình 1.15: Động học của sự ức chế urease bởi dịch chiết tỏi ở các nồng độ khác nhau 21

Hình 1.16: Cấu trúc phân tử urease của Helicobacter Pylori 23

Hình 1.17: Các loại đậu chứa enzyme urease 25

Hình 1.18: Cấu trúc phân tử của urea 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Hình 3.1: Màu sắc của chỉ thị trong nước cất (pH = 6.5) 64

Hình 3.2: Màu sắc của chỉ thị trong nước máy (pH = 6.8) 64

Hình 3.3: Vị trí chất chỉ thị và enzyme urease trên kit 66

Hình 3.4: Kit thử với các nồng độ phenol red khác nhau trước khi nhúng dung dịch urea 66

Hình 3.5: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thị PR trên kit sau khi nhúng urea 66

Hình 3.6: Kit thử với các nồng độ phenol red khác nhau sau khi nhúng dung dịch urea 2% 67

Hình 3.7: Kit thử sau khi dung dịch urea chạy hết kit 67

Hình 3.8: Kit thử trắng sau khi dung dịch urea chạy hết kit 68

Hình 3.9: Đồ thị NH 3 chuẩn dùng để xác định hoạt tính urease 69

Hình 3.10: Biểu đồ so sánh hoạt tính urease trong các loại dung môi 71

Hình 3.11: Khảo sát khả năng phát hiện của kit chấm 30µl urease 4% trong dung dịch urea ở các nồng độ: 1 – 0ppm, 2 – 1000ppm, 3 – 800ppm, 4 – 600ppm 74

Hình 3.12: Khảo sát khả năng phát hiện của kit chấm 60µl urease 4% trong dung dịch urea ở các nồng độ: 1 – 0ppm, 2 – 1000ppm, 3 – 800ppm, 4 – 600ppm, 5 – 400ppm, 6 – 200ppm, 7 – 100ppm, 8 – 50ppm 75

Hình 3.13: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thị trên kit sau khi nhúng dung dịch urea ở các nồng độ: 1 – 0ppm, 2 – 50ppm, 3 – 40ppm, 4 – 30ppm, 5 – 20ppm, 6 – 10ppm, 7 – 5ppm 76

Hình 3.14: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thị trên kit sau khi nhúng dung dịch urea ở các nồng độ: 1 – 0ppm, 2 – 50ppm, 3 – 100ppm, 4 – 200ppm, 5 – 400ppm, 6 – 600ppm, 7 – 800ppm, 8 – 1000ppm 77

Hình 3.15: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thị trên kit sau khi nhúng dung dịch urea 0.5% và 1%78 Hình 3.16: Các bước định tính sự có mặt urea trong mẫu thử 78

Hình 3.17: Đồ thị đường chuẩn biểu diễn sự thay đổi của pH theo nồng độ urea trong nước 80

Hình 3.18: Đồ thị đường chuẩn biểu diễn sự thay đổi của pH theo nồng độ urea trong nước mắm 81

Hình 3.19: Đồ thị đường chuẩn biểu diễn sự thay đổi của pH theo nồng độ urea trong sữa 83

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Bảng 1.1: Thành phần amino acid của urease đậu nành và đậu rựa 5

Bảng 1.2: K m và v max của enzyme urease 13

Bảng 1.3: Giá trị pH opt ở các loại đệm 14

Bảng 1.4: Ảnh hưởng của các ion lên hoạt tính urease 18

Bảng 1.6: Hàm lượng urease trong các loại đậu 25

Bảng 1.7: Các phương pháp để xác định hoạt tính enzyme 28

Bảng 1.8: Tính chất hóa lý của urea 33

Bảng 1.9: Thành phần hóa học của sữa bò tươi và sữa tổng hợp 36

Bảng 1.10: Xác định hàm lượng urea theo phương pháp Rappoport 43

Bảng 1.11: Xác định hàm lượng urea theo phương pháp Perkins 45

Bảng 1.12: Các loại kit thử nhanh chế tạo bởi Tổng cục Kỹ thuật (Bộ Công an) 47

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bảng 2.1: Khoảng chuyển màu và màu sắc của các chất chỉ thị 53

Bảng 2.2: Khảo sát phản ứng hiện màu trong dung dịch NH 4 OH 53

Bảng 2.3: Khảo sát nồng độ chất chỉ thị thích hợp cho lên kit 54

Bảng 2.4: Phương pháp lập đường NH 3 chuẩn 57

Bảng 2.5: Phương pháp chọn thể tích chấm enzyme phù hợp 59

Bảng 2.6: Phương pháp nghiên cứu lượng enzyme thích hợp cho lên kit 59

Bảng 2.7: Phương pháp khảo sát giới hạn phát hiện của kit 60

Bảng 2.8: Phương pháp xác định thời gian sử dụng của kit 61

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Bảng 3.1: Khoảng chuyển màu và màu sắc của các chất chỉ thị 65

Bảng 3.2: Xây dựng đường chuẩn NH 3 68

Bảng 3.3: Kết quả đo hoạt tính enzyme urease 69

Bảng 3.4: Hoạt tính của urease trong các dung môi khác nhau 70

Bảng 3.5: Khảo sát thể tích chấm enzyme urease lên kit 72

Bảng 3.6: Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong dung dịch urea ở các nồng độ khác nhau 73

Bảng 3.7: Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong dung dịch urea ở các nồng độ khác nhau khi tăng số lần chấm urease lên kit 74

Bảng 3.8: Khảo sát khả năng phát hiện của kit khi thay đổi lượng urease/kit 75

Bảng 3.9: Các thông số chế tạo của kit 76

Bảng 3.10: Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong các dung dịch urea có nồng độ thấp 77

Bảng 3.11: Khảo sát sự thay đổi pH của dung dịch urea trước và sau khi cho urease 79

Bảng 3.12: Khảo sát sự thay đổi pH của nước mắm chứa urea trước và sau khi cho urease 80

Bảng 3.14: Khảo sát sự thay đổi pH của sữa chứa urea trước và sau khi cho urease 82

Bảng 3.15: Khảo sát thời gian hiện màu của kit 84

Bảng 3.16: Khảo sát hoạt tính của urease trên kit theo thời gian 86

Bảng 3.17: Khảo sát sự có mặt của urea trong sữa 88

Bảng 3.18: Khảo sát sự thay đổi pH của các mẫu nước mắm 90

Bảng 3.19: Khảo sát khả năng phát hiện urea của kit trong thủy sản 93

LỜI MỞ ĐẦU

“Ăn ngon mặc đẹp” là nhu cầu không thể thiếu của con người Thực phẩm hiện nay đòihỏi không chỉ ngon mà còn phải bắt mắt, thu hút người tiêu dùng, do đó mà ngành công nghệsau thu hoạch ra đời với mục đích tạo ra giá trị cho thực phẩm như bảo toàn giá trị dinh dưỡng,tăng giá trị cảm quan, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, tiện dụng…Các giá trị này khôngtách rời nhau; có tác động tăng hay bù trừ nhau nhưng tổng thể phải tạo ra giá trị gia tăng chosản phẩm Tuy nhiên, ở một số loại thực phẩm mà giá trị cảm quan hay dinh dưỡng đóng vaitrò quan trọng thì người bán đã sử dụng những thủ thuật không được phép sử dụng như phunhóa chất để làm bóng trái cây, ngâm thịt gia súc hay gia cầm trong dung dịch hàn the, ướpurea cho thủy sản để nhìn bề ngoài trông tươi lâu hơn, cho urea vào trong nước mắm để làmtăng độ đạm…Những thủ thuật “hàng chợ” này không chỉ đánh lừa người tiêu dùng trong việcmua các sản phẩm thực phẩm không còn tươi ngon, không đủ chất dinh dưỡng mà còn có nguy

cơ ảnh hưởng tới sức khỏe

Hiện nay, công tác kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm còn nhiều bất cập, thiếu phươngtiện, chưa được tiến hành rộng rãi, vì vậy người tiêu dùng cần chủ động tránh mua thực phẩmkém chất lượng, không an toàn Một biện pháp dễ thực hiện dành cho mọi người là sử dụng kitthử nhanh để kiểm tra sự có mặt của một hóa chất độc hại trong thực phẩm ngay khi vừa muavề vì đơn giản, dễ sử dụng, giá thành rẻ và thời gian phát hiện ngắn Kit thử nhanh cũng làphương tiện giúp cho công tác kiểm tra nhanh chất lượng thực phẩm ở cấp cơ sở

Hiện nay, trên thị trường có bán nhiều loại kit thử nhanh nhưng đa phần là các kit ngoạichưa phù hợp lắm với điều kiện của Việt Nam, khi sử dụng phải đong, đo hóa chất từ các lọnhỏ đóng sẵn, vì vậy không loại trừ được sai số chủ quan do người sử dụng gây ra Trong sốcác kit nội bán trên thị trường chưa có loại kit dùng để phân tích urea trong thực phẩm Với lý

do đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu chế tạo kit thử nhanh dùng trong phân tích urea trongkhuôn khổ bài luận văn này

Nội dung nghiên cứu gồm 2 phần chính:

 Chế tạo kit thử nhanh dùng để phân tích urea dựa trên nguyên tắc sử dụng enzymeurease để thủy phân đặc hiệu urea

 Ứng dụng kit thử để phân tích urea trong các mẫu thực

CHÖÔNG 1

TOÅNG QUAN

1.1 Enzyme urease (EC 3.5.1.5)

1.1.1 Danh pháp quốc tế và phân loại [2]

 Số 1: chỉ phân nhóm phụ cắt các amid thẳng (amidohydrolase)

 Số 5: chỉ số thứ tự của urease trong phân nhóm phụ

1.1.2 Tính chất vật lý của enzyme urease

Urease là enzyme lần đầu tiên được J.B.Sumner tách chiết và kết tinh từ đậu rựa (jack

bean – Canavalia ensiformis) vào năm 1926 [37] Và chính công trình nghiên cứu này đã đoạt

giải Nobel vào năm 1946 đồng thời cũng đăït nền tảng đầu tiên cho các công trình nghiên cứuvề urease sau này

Urease là các tinh thể có 8 cạnh, không màu, trong suốt, quan sát được qua kính hiển vi vàcó đường kính d = 4 – 30µm tùy theo phương pháp chiết tách

Hình 1.1: Tinh thể urease được J.B.Summer chiết tách và kết tinh [37]

Khối lượng phân tử của urease được 2 nhà nghiên cứu Joseph và Evelyn xác định bằngphương pháp lọc gel trên cột Agarose A_15m đối với urease đậu rựa và đậu nành Brasil và sosánh với các protein đã biết trước khối lượng phân tử [17] Kết quả cho thấy urease từ đậunành có 2 peak ứng với 2 phân tử lượng khác nhau đó là 540.000 Da và 420.000 Da, trong khiđó urease từ đậu rựa chỉ xuất hiện 1 peak duy nhất với phân tử lượng là 480.000 Da

giống nhau ở những nguồn khác nhau đã giải thích cho sự khác nhau về khối lượng phân tửnhư đã nói ở trên.

Bảng 1.1: Thành phần amino acid của urease đậu nành và đậu rựa [17]

a – Dữ liệu do Joseph và Evelyn khảo sát

b – Dữ liệu để so sánh (do Staples và Reithel khảo sát).

Enzyme urease có cấu trúc bậc 4 Theo nghiên cứu của Kunio TAKISHIMA, TatsukoSUGA, Gunji MAMIYA (1988), enzyme urease đậu rựa có 840 acid amine Khối lượng phântử tương đối của 1 tiểu đơn vị protein là 90770 Da, từ đó suy ra phân tử urease gồm có 6 tiểuđơn vị Có 13 trong số 25 histidine nằm tập trung trong vùng acid amine 479 đến 607 do đóvùng này có thể chứa nikel Cys-592, acid amine cần thiết cho hoạt tính của enzyme cũngnằm trong vùng giàu histidine này [23]

Hình 1.3: Cấu trúc của enzyme urease

1.1.3 Tính chất hóa lý của enzyme urease

Theo Sumner, các tinh thể urease hòa tan dễ dàng trong dung dịch ammonia loãng vàdung dịch kiềm loãng, có thể hòa tan hoặc đông tụ trong dung dịch muối loãng và acid hữu cơtùy thuộc nồng độ acid [37]

Sumner và Hand đã xác định được điểm đẳng điện của urease nằm trong khoảng pH =5.0 – 5.1 Tại điểm đẳng điện, độ hòa tan của urease là cực nhỏ

Urease cũng mang những đặc tính của protein như:

 Tan trong nước và dung dịch muối loãng

 Không đi qua được màng thẩm tích vì có kích thước phân tử lớn

 Tan khi có lớp áo nước và tích điện, tủa khi mất lớp áo nước và trung tính

 Bị biến tính dưới tác dụng của các yếu tố như acid, kiềm đặc, các ion kim loại nặng vànhiệt độ cao…Khi đó, urease mất tính xúc tác sinh học, mất khả năng hòa tan trongnước, mất khả năng kết tinh và các tính chất hóa lý khác nhau (độ nhớt, sức căng bềmặt…), biến đổi hình dạng và kích thước, dễ bị phân hủy bởi protease

 Dễ bị tủa thuận nghịch trong các dung môi hữu cơ như ethanol, acetone…hoặc muốiammonium sulfate, sodium chloride

 Tính chất hóa lý của enzyme có thể thay đổi khi kết hợp với một số chất như cơ chất,

Trung tâm hoạt động của enzyme bao gồm các amino acid có nhóm hóa học hoạt độngmạnh Các nhóm hóa học hoạt động này có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức chấtenzyme – cơ chất Các gốc amino acid thường không nằm cạnh nhau trong chuỗi polypeptidenhưng do thực tế chuỗi polypeptide tồn tại ở trạng thái không gian (cấu trúc cấp ba và bốn)nên các amino acid thường tồn tại gần nhau Ngoài ra trong trung tâm hoạt động còn có mặtcủa ion kim loại Các ion kim loại có vai trò xúc tác rất lớn, có tác dụng liên kết giữa enzymevà cơ chất hoặc apoenzyme và coenzyme hoặc tham gia vào quá trình vận chuyển điện tử [2]Đặc điểm chung của các hydrolase là không có nhóm ngoại nên tâm hoạt động của chúngphải có các gốc acid amin đặc hiệu Tâm hoạt động của hydrolase thường chứa vòng imidazolcủa histidine và nhóm hydroxyl của serine Do cấu trúc bậc 3 của enzyme/protein mà vòngimidazol và nhóm hydroxyl này gần nhau hình thành nên liên kết hydro như hình vẽ sau:

Sumner chứng minh rằng urease là enzyme không có bất cứ cofactor hữu cơ nào mà cũngkhông có sắt, manganese hay phosphorus [37] Theo E Jabri, M.B Carr, R.P Hausinger, P.A.Karplus thì trung tâm hoạt động của urease có chứa 2 nguyên tử Ni Urease có độ tinh khiếtcao có khoảng 2g nguyên tử Ni trên 1 tiểu đơn vị Hai nguyên tử Ni liên kết với nhau thôngqua cầu nối carbamate Mỗi nguyên tử Ni được nối với 2 nguyên tử N trong vòng imidazole và

1 nhóm carboxylate, 1 phân tử H2O (hình 1.4) Và chính 2 nguyên tử Ni này đóng vai trò rấtquan trọng trong việc xúc tác phản ứng của urease Đó cũng chính là lí do mà urease còn đượcgọi là “Nikel dependent enzyme” [12]

Hình 1.4: Trung tâm hoạt động của urease (Ni: 2 quả cầu màu xanh) [9][39]

Tuy nhiên urease có các nguồn gốc khác nhau như urease từ vi khuẩn Bacillus pasteurii

trong trung tâm hoạt động chứa ion kim loại Zn2+[31], còn ở Klebsiella aerogenes có cofactor

là Cu2+[36] như hình bên dưới:

Hình 1.5: Urease từ K.aerogenes và từ Bacillus pasterrii

1.1.5 Cơ chế xúc tác

Năm 1913, hai nhà khoa học Leonom Michaelis và Maud Menten đưa ra mô hình độnghọc để giải thích phản ứng được xúc tác bởi enzyme Theo mô hình này, enzyme và cơ chất sẽkết hợp với nhau, tạo nên phức hợp enzyme – cơ chất (ES) Phức hợp ES sẽ lại được chuyểnhóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzyme (E) Enzyme được giải phóng lạithực hiện những phản ứng mới [2]

Hoạt động xúc tác của trung tâm hoạt động (TTHĐ) của enzyme có liên quan đến cơ chấtvà quan điểm được nhiều nhà khoa học chấp nhận là thuyết trung tâm hoạt động củaKoshland Theo thuyết này, trung tâm hoạt động của enzyme chỉ được tạo thành khi có sự tácđộng cảm ứng của cơ chất, định hướng thích hợp để cơ chất gắn chính xác vào và thực hiệnquá trình xúc tác

Hình 1.6: Cơ chế xúc tác của enzyme

Đối với enzyme urease, cơ chế của quá trình xúc tác phản ứng theo phương trình:

Cụ thể xảy ra ở trung tâm hoạt động như sau:

Hình 1.7: Cơ chế xúc tác của urease

Theo sơ đồ trên ta thấy: ban đầu phân tử urea sẽ tấn công và tạo liên kết với 2 nguyên tử

Ni đồng thời có 2 phân tử H2O được giải phóng ra Tiếp theo là sự sắp xếp lại của các điện tử,hình thành những mối liên kết mới tại trung tâm hoạt động Cuối cùng là sự tái cấu trúc ởtrung tâm hoạt động của urease với sự tham gia của 2 phân tử nước, đẩy gốc carbamate rangoài đồng thời giải phóng 1 phân tử NH3 Như vậy, vai trò của 2 ion kim loại Ni là rất quantrọng trong việc tạo liên kết giữa enzyme với cơ chất ở giai đoạn tạo phức chất trung gian.Đây chính là một cofactor của urease

Một số tác giả cho rằng vai trò của 2 nguyên tử Ni khác nhau Một nguyên tử Ni giữnhiệm vụ liên kết và hoạt hóa phân tử urea, nguyên tử Ni còn lại giữ nhiệm vụ liên kết vàhoạt hóa phân tử nước ái nhân [6]

1.1.6 Cơ chất của urease

 Phenyl phosphorodiamidate (Ar = Ph, PPD) (hình 1.d)

 N-(3-methyl-2-butenyl)phosphoric triamide (Alk = (H3C)2C=CH, MBPT) (hình 1.e)Trong đó urea là cơ chất đặc hiệu của urease với năng lượng hoạt hóa là 8700 hoặc

11700 calories/g.mol ở 25oC còn đối với các cơ chất như hydroxyurea hoặc dihydroxyurea thìvận tốc nhỏ hơn 120 lần Phân tử urea rất bền Trong khoảng pH = 2 – 12, sự phân hủy ureakhông enzyme trong dung dịch không phụ thuộc pH và có chu kỳ bán hủy là 3.6 năm ở 38oC.Người ta chứng minh rằng phản ứng này là phản ứng khử mà sản phẩm duy nhất là ammoniavà acid cyanic Tốc độ khử tăng khi pH > 12 và giảm khi pH < 2 Nếu có sự tham gia củaenzyme, enzyme sẽ chuyển phản ứng khử thành phản ứng thủy phân và điều này nói lên vaitrò quan trọng của Ni2+ như 1 acid Lewis trong tính chất hóa học của urease Hay nói cáchkhác enzyme đã chống lại sự phân hủy và tạo điều kiện cho urea bị nước hay ion OH– tấncông để tạo ra carbamate

Hình 1.8: Công thức cấu tạo của một số cơ chất chứa phospho của urease

1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của urease

1.1.7.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: [1][37]

Nói chung trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồngđộ enzyme: V = k [E], V: vận tốc phản ứng, [E]: nồng độ enzyme

Tuy nhiên, dung dịch enzyme urease loãng dễ bị mất hoạt tính hơn dung dịch có nồng độcao với điều kiện là enzyme phải được bảo quản lạnh Cũng có trường hợp khi nồng độenzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm

1.1.7.2 Aûnh hưởng của nồng độ cơ chất, mô hình Michaelis_Menten: [1][53]

Phương trình Michaelis_Menten:

]S[K

]S[vv

Trong đó: Km: hằng số Michaelis, là hằng số ái lực của enzyme đối với cơ chất hay nồng

độ cơ chất đủ làm cho tốc độ phản ứng đạt đến ½ tốc độ cực đại, đặc trưng củamỗi loại enzyme đối với mỗi loại cơ chất

vmax: vận tốc phản ứng đạt cực đại

[S]: nồng độ cơ chất

Hình 1.9: Đồ thị biểu diễn vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất

 Nếu [S] >> Km thì: v = vmax: tức vận tốc phản ứng đạt cực đại, không phụ thuộc [S].Như vậy [S] đã đủ lớn đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng [S], v cũng không tăng theo.

 Nếu [S] = Kmthì v = vmax/2: vận tốc phản ứng bằng nửa vận tốc cực đại Hoặc ta cũngcó thể xác định Km và Vmax theo phương trình được viết lại từ phương trình trên nhưsau:

]S[

1v

Kv

1v

1

max m max i

Một số giá trị Kmvà vmaxcủa urease trong các nghiên cứu được cho bảng sau:

Bảng 1.2: K m và v max của enzyme urease [53]

Nguồn gốc pH Nhiệt độ ( o C) Dung dịch đệm K m (mol/l) v max

1.1.7.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Giống như phản ứng hóa học, khi nhiệt độ tăng, vận tốc chuyển động của các phân tửtăng, sự tiếp xúc giữa các phân tử cũng tăng nên vận tốc phản ứng tăng Tuy nhiên do bảnchất enzyme là protein nên nhiệt độ cao sẽ làm biến tính protein, enzyme mất hoạt tính [1]

Do đó, mỗi enzyme sẽ tồn tại một nhiệt độ mà ở đó hoạt tính cao nhất, gọi là nhiệt độ tối thích

topt Theo các nghiên cứu từ đậu rựa (jack bean) thì nhiệt độ toptvào khoảng 45-50oC, khi nhiệtđộ vượt quá 65oC thì hoạt tính urease bị giảm và có thể mất hẳn khi nhiệt độ đạt 85oC [17].Tuy nhiên nhiệt độ topt của urease không cố định, mà nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như:nguồn thu nhận, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, pH, thời gian phản ứng…

Người ta đã thấy rằng độ bền nhiệt của urease tăng khi có mặt cơ chất hoặc chất ổn định,chất hoạt hóa như L_cysteine, 2_mercaptoethanol Urease ở dung dịch loãng không có cơ chấtthường kém bền nhiệt nhất, còn ở dạng bột khô và có cơ chất thì khá bền nhiệt [9] Ở nhiệt độthấp, hoạt tính của urease giảm nhưng không bị biến tính

1.1.7.4 Ảnh hưởng của pH và dung dịch đệm: [1][16]

Enzyme rất nhạy cảm với sự biến đổi pH của môi trường do pH ảnh hưởng đến sự phân

ly ion của phân tử cơ chất Do đó mỗi enzyme có một pH mà hoạt tính của nó đạt cực đại, gọilà pH tối thích (pHopt) Khi pH càng xa pHoptthì hoạt tính càng giảm

Trong đệm phosphate, urease hoạt động tốt trong khoảng pH 5 – 9, trong đệm citrate là

pH 4 – 8.5, trong đệm acetate là pH dưới 3 – 7.5 Hoạt tính cao nhất của urease theo nghiêncứu của Stacey F Howell and James B Sumner là với dung dịch urea 1% trong đệm citrateM/8 pH 6.5 [16]

Như vậy, hoạt tính của urease phụ thuộc vào dung dịch đệm, giá trị pH, nồng độ urea,nhiệt độ, nồng độ muối…

Bảng 1.3: Giá trị pH opt ở các loại đệm [16]

Nồng độ urea (%) Loại đệm pH opt

2.5

AcetateCitratePhosphate

6.46.56.90.1

AcetateCitratePhosphate

6.76.77.6

1.1.7.5 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa, chất ức chế:

Mỗi enzyme đều tồn tại một số hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ mà sự có mặt của chúng cókhả năng kích thích hoặc kìm hãm hoạt động của enzyme, gọi là chất kích thích (chất hoạthóa) và chất kìm hãm (chất ức chế) Tuy nhiên không có sự phân biệt rõ ràng chất ức chế vàkìm hãm vì một chất có thể là kích thích với enzyme này nhưng là kìm hãm của enzyme kháchoặc ở nồng độ này là kích thích, nồng độ khác là kìm hãm [1]

 Cơ chế tác dụng của chất hoạt hóa: [1][2]

Các chất hoạt hóa có thể là chất biến enzyme từ trạng thái không hoạt động sang trạngthái hoạt động, có thể là các chất dị lập thể dương hoặc các chất có khả năng biến tiềnenzyme không hoạt động sang hoạt động mạnh Các chất này có thể là các anion, các ion kimloại từ ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng tuần hoàn Mendeleev, các chất hữu cơ có cấu trúcphức tạp, có thể đóng vai trò nhóm ngoại của các enzyme 2 cấu tử hoặc tham gia vào cấu tạocủa coenzyme, hoặc là nối giữa enzyme với cơ chất, hoặc là cầu nối giữa phần apoenzyme vớicoenzyme

Theo các nghiên cứu thì nhóm –SH (sulfuhydryl) của cysteine là nhóm chức năng thườngcó mặt trong trung tâm hoạt động của phân tử urease nên những chất có tác dụng phục hồinhóm chức năng này đều có tác dụng làm hoạt hóa urease như glutation dạng khử hayL_cysteine Nhóm –SH chịu sự oxy hóa dưới tác động của nhiều yếu tố trong đó có oxy khôngkhí Tuy nhiên sự oxy hóa tự nhiên bởi oxy phân tử chỉ xảy ra với tốc độ đáng kể khi có mặtion kim loại xúc tác đặc biệt là sắt và đồng Khi dùng EDTA để kết hợp những vết kim loạinày trong dung dịch thường làm tăng tính ổn định của urease nói riêng và các enzyme chứanhóm –SH nói chung Như vậy, bằng cách gián tiếp, EDTA–Na2 cũng là một chất hoạt hóaenzyme Do đo,ù trong tinh sạch enzyme, để bảo vệ urease khỏi các kim loại tạp người tathường dùng EDTA

 Cơ chế tác dụng của chất ức chế:

Các chất kìm hãm ngược lại là các chất có tác dụng biến enzyme từ trạng thái hoạt độngsang không hoạt động, hoặc từ trạng thái hoạt động mạnh sang hoạt động yếu Các chất nàycó thể là dị lập thể âm, tồn tại hai loại kìm hãm: cạnh tranh và không cạnh tranh [1][2]

Người ta chứng minh rằng cơ chế và tính chất động học của hoạt động ức chế đối vớienzyme urease từ vi khuẩn và đậu rựa là như nhau

Những chất ức chế mạnh nhất enzyme urease bao gồm phosphoroamides,acetohydroxamic acid và kim loại nặng trong đó các hợp chất thiols có tính ức chế yếu hơn[10][36][50] Trong những chất ức chế được đề cập ở trên thì acetohydroxamic được nghiêncứu nhiều nhất vì tính hiệu quả và không độc của nó, thường được sử dụng trong việc chữa cácbệnh gây ra bởi vi khuẩn sinh urease.

Hình 1.11: Ảnh hưởng của chất kìm hãm cạnh tranh và không cạnh tranh

 Ức chế cạnh tranh: xảy ra trong trường hợp chất kìm hãm có cấu trúc tương đồng với

cơ chất, vì vậy cũng có khả năng kết hợp với enzyme, giảm mối liên kết giữa enzyme và cơchất [1][2]

Đối với urease thì hydroxyurea, dihydroxyurea, thiourea hay hydroxamic acid là nhữngchất ức chế đặc hiệu cạnh tranh của urease Vì chúng có cấu tạo gần giống cơ chất nên chúngcũng có khả năng kết hợp với enzyme Do đó sự có mặt của chúng trong dung dịch làm giảmtốc độ phản ứng thủy phân urea Có thể làm giảm tác dụng của những chất ức chế này bằngcách tăng nồng độ cơ chất urea

Ví dụ đối với hydroxamic acid, cơ chế ức chế như sau:

Cụ thể như sau:

Hình 1.12: Cơ chế ức chế của hydroxamic acid với urease [9]

Hydroxamic acid do có cấu tạo gần giống urea nên nó tấn công vào trung tâm hoạtđộng của urease là 2 quả cầu Ni và đã “khóa” chặt 2 quả cầu này

Trong nhóm các chất ức chế cạnh tranh enzyme urease còn có phosphoroamides,acetohydroxamic acid, acid boric, sodium tetraborate…

 Ức chế không cạnh tranh: xảy ra trong trường hợp chất ức chế có khả năng kết hợp

với enzyme hoặc cơ chất

 Ion kim loại [38]

Các ion kim loại như Hg2+, Cu2+, Pb2+, Mn2+… là những chất ức chế không cạnhtranh vì nó có hóa trị cùng với cofactor của urease là Ni2+ Các ion kim loại này sẽ tranh giànhcác liên kết với Ni2+, và do đó sẽ làm “khóa”ù trung tâm hoạt động của urease

Bảng 1.4: Ảnh hưởng của các ion lên hoạt tính urease [38]

Dấu (–) biểu thị sự mất hoạt tính hoàn toàn của urease

Theo bảng trên, với hàm lượng AgNO30.002mg/ml đã làm mất hoạt tính của urease, đốivới HgCl2là 0.004mg/ml và đối với Cu2+là 0.01mg/ml Sự vô hoạt urease của các ion kim loạiđược trình bày theo dãy sau:

Ag+> Hg2+> Cu2+> Zn2+> Cd2+> UO22+> Au3+> Pb2+> Co2+> Ni2+> Ce2+> Mn2+

Trong đó Ag+có tác dụng ức chế urease cao nhất, có lẽ nó tác dụng với nhóm –SH củaCys592 nằm ở trung tâm hoạt động của enzyme Các chất hoạt hóa hay bảo vệ urease (nhưprotein, acid amin, gum arabic) liên kết với các ion kim loại này, vì thế bảo vệ được nhóm –

SH của enzyme

 Một số α–hydroxyketones (hợp chất có chứa nhóm –COCH(OH)–) [43]

Theo nghiên cứu của Toru Tanaka và cộng sự [43], khi khảo sát 13 loại hydroxyketones và 7 loại α – diketones như sau:

α-Hình 1.13: Công thức hóa học của các α-hydroxyketones (1–13) and α – diketones (14–20)

Kết quả cho thấy với nồng độ 400µg/ml thì các α-hydroxyketones như 2,2'-thenoin(10), furoin (9), 2-hydroxy-1-phenylethanone (5) và acetol (1) thể hiện tính ức chế Tác dụngức chế này phụ thuộc vào thời gian tiền ủ với urease và bị khóa hoàn toàn bởi2_mercaptoethanol (2-ME), dithiothreito (DTT), tuy nhiên trong đó chỉ có (5) và (9) bị khóabởi NiCl2và phụ thuộc vào nồng độ Ngược lại, đối với hydroxyurea và acetohydroxamic acid,tính ức chế không bị ảnh hưởng bởi 2-ME và DTT nhưng bị ảnh hưởng bởi NiCl2

Tính ức chế của α-hydroxyketones được cho là do liên kết với Cysteine nằm ở trungtâm hoạt động Điều này cũng có nghĩa là α–hydroxyketones có thể ức chế các enzyme SHkhác như alcohol dehydrogenase, amylase…Bên cạnh đó, tác dụng giảm sự ức chế của NiCl2

đối với (5), (9), hydroxyurea và acetohydroxamic acid được cho là do liên kết với trung tâmkim loại của enzyme

 Dịch chiết tỏi : [4]

Tỏi được sử dụng như là một dược thảo từ hàng ngàn năm nay Ngày nay, những sảnphẩm từ tỏi như nước cốt tỏi tươi, dịch chiết trong nước và cồn, bột tỏi sấy lạnh và dầu tỏi làđối tượng của nhiều nghiên cứu hóa học, dược lý và lâm sàng Tỏi được biết tới vì công dụngkháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa mạnh Tỏi là tác nhân kháng khuẩn mạnh, là chất

ức chế vi khuẩn Gram dương lẫn Gram âm như các loài Escherichia, Salmonella,

Streptococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Proteus và Helicobacter pylori [5][33][40] Trong

đó, Helicobacter Pylori, vi khuẩn có khả năng kháng nhiều loại kháng sinh, lại nhạy cảm với

dịch chiết tỏi ở nồng độ khá thấp Bên cạnh đó, nó ngăn ngừa sự kết tụ máu giúp giảm hiệuquả lượng serum cholesterol, triglicerydes và hạ thấp áp suất thị giác [5][33] Những lợi íchcho sức khỏe này của tỏi là từ hợp chất sulfur có hoạt tính sinh học cao [7][14][23] Thànhphần chính của dịch chiết tỏi tươi trong nước là alk(en)yl thiosulfinates được tạo ra từalk(en)ylcysteine sulfoxides trong phản ứng xúc tác enzyme sau khi dập tỏi theo 2 phươngtrình sau:

Đầu tiên pyruvate, ammonia và alk(en)yl sulfenic acid RS(O)H được tạo ra sau đóalk(en)yl sulfenic acid ngưng tụ nhanh chóng thành thiosulfinates R–S(O)S–R (R có thể là cácnhóm: methyl, 1–propenyl hoặc 2–propenyl/allyl) 60–80% thiosulfinates là diallylthiosulfinate hay allicin

Theo [4], dịch chiết tỏi có khả năng ức chế hoạt tính của enzyme urease và thành phầngây ức chế chủ yếu là thiosulfinates Sự mất hoạt tính này tỷ lệ với lượng alk(en)ylthiosulfinates có trong dịch chiết, thời gian ủ với enzyme nhưng không phụ thuộc vào loạinhóm alk(en)yl trong thiosulfinates Dịch chiết tỏi nên được bảo quản ở 4oC để duy trì khảnăng ức chế vì thiosulfinates không bền và biến đổi theo thời gian thành các hợp chất bền hơnnhư polysulfides và thiosulphonates) [7]

Khi nghiên cứu khả năng phục hồi và bảo vệ hoạt tính của enzyme urease khỏi sự vôhoạt bởi tỏi của các hợp chất thiols (monothiols: cysteine, 2-ME, glutathione và dithiol: DTT)trước và sau thời gian urease ủ với dịch chiết tỏi trong 15 phút, Adam và cộng sự đã cho kết

Hình 1.14: Ảnh hưởng của các hợp chất thiols, urea và acid boric tới khả năng ức chế urease

của dịch chiết tỏi trước khi ủ.

Sau 15 phút urease ủ với dịch chiết tỏi, sự có mặt của DDT có thể phục hồi hoạt tínhcủa urease, lượng hoạt tính phục hồi được phụ thuộc vào thời gian DDT ủ với enzyme, nhưngcác monothiols không có khả năng này Ngoài ra, acid boric và urea cũng có thể bảo vệ hoạttính của urease khỏi sự ức chế của tỏi nhưng yếu hơn Acid boric đồng thời là chất ức chế cạnhtranh enzyme urease, có tính thuận nghịch, khả năng ức chế trung bình (Ki= 0.12m [43]) Cấutrúc hoạt động nhất của acid boric là B(OH)3, kích thước nhỏ nên nó dễ dàng liên kết với ion

Ni2+ do đó khóa trung tâm hoạt động của enzyme, bảo vệ enzyme khỏi sự vô hoạt củathiosulfinates Kết quả này cũng cho thấy sự vô hoạt urease bởi thiosulfinates xảy ra ở trungtâm hoạt động của enzyme

Tiến hành nghiên cứu động học của của cơ chế ức chế urease bởi tỏi, Adam và cộng sựthấy rằng đồ thị semi-log biểu diễn hoạt tính còn lại có 2 pha, pha nhanh có 30% hoạt tính banđầu bị mất và pha chậm có 70% hoạt tính ban đầu bị mất Mỗi pha có động học bậc 1 như đồthị dưới đây:

Hình 1.15: Động học của sự ức chế urease bởi dịch chiết tỏi ở các nồng độ khác nhau

Đồ thị log trên được biễu diễn từ phương trình sau:

t k slow t

k fast t

slow fast A ee

A

Trong đó: At– hoạt tính còn lại của urease so với ban đầu ở thời điểm t (%)

Afast, Aslow– biên độ tính theo phần trăm hoạt tính bắt đầu của pha nhanhvà pha chậm (%)

kfast, kslow– hằng số vận tốc bậc 1 của pha nhanh và pha chậmKhi nồng độ thiosulfinates trong dịch chiết tỏi tăng thì giá trị kfast và kslow tăng theonhưng giá trị biên độ Afastvà Aslowgần như không thay đổi

Động học 2 pha như trên cũng đã được tìm thấy trong các nghiên cứu về sự ức chế

enzyme urease từ 2 loài thực vật khác là Cajanus cajan và Citrullus vulgaris) bởi

5.5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid, p-chloromercuribenzoate, N-ethylmaleimide, acetohydroxamicacid và các kim loại nặng [29][30][41][42] Các urease trên cũng giống như urease đậu rựa lànhững homohexameric protein chứa 1 gốc cysteine/tiểu đơn vị ở trung tâm hoạt động Các tácgiả cho rằng tính chất 2 pha là kết quả của khả năng phản ứng khác nhau của các gốc cysteinenày Sáu nhóm –SH được chia thành 2 nhóm, 1 nhóm phản ứng nhanh hơn và 1 nhóm phản ứngchậm hơn Đối với urease đậu rựa, nhóm –SH thuộc về Cys592 nằm trên vành di động gầntrung tâm hoạt động [10]

Kết quả của Adam và cộng sự cho thấy tính chất ức chế bất thuận nghịch và phụ thuộcvào thời gian đối với enzyme urease đậu rựa bởi dịch chiết tỏi là do phản ứng của nhóm –SHnằm ở trung tâm hoạt động của urease với thiosulfinates Rabinkov, Miron, Konstatinovski,Wilchek, Mirelman và Weiner (1998) đã nghiên cứu chi tiết cơ chế phản ứng của diallylthiosulfinate với nhóm –SH trong mô hình chứa L_cysteine S-allylmercaptocysteine (Cys-S-S-All) được tạo ra và được chứng minh bằng NMR và SM [34] Nói tóm lại, sự ức chế ureaseđậu rựa bởi thiosulfinates được cho là do phản ứng giữa nhóm –SH (Cys592) ở trung tâm hoạtđộng của urease và gốc sulfur của –S(O)-S- trong thiosulfinates dẫn tới sự hình thành của hợp

Kết quả nghiên cứu về urease đậu rựa cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu về cácenzyme chứa nhóm thiol khác Rabinkov và cộng sự (1998) đã nghiên cứu ảnh hưởng củaallicin lên hoạt tính của các protein chứa nhóm thiol là papain và dehydrogenase và thấy rằngsự ức chế có tính chất bất thuận nghịch và phụ thuộc vào thời gian, nguyên nhân là do sự liênkết với nhóm –SH của enzyme Gupta và Porter (2001) đã chứng minh rằng sự ức chế enzymesqualene monooxygenase bởi dịch chiết tỏi tươi cũng có tính chất bất thuận nghịch và phụthuộc vào thời gian, nguyên nhân cũng là do sự liên kết chất ức chế với nhóm –SH ở trung tâmhoạt động của enzyme [15].

Ngoài ra còn có các chất ức chế không cạnh tranh enzyme urease khác nhưlansoprasole, rabeprazole, α,β – unsaturated ketones [44], biscoumarin [20] …Hoạt động ứcchế phụ thuộc vào thời gian tiền ủ với urease

1.2 Các phương pháp thu nhận urease

1.2.1 Nguồn thu nhận

Urease được các nhà khoa học tìm thấy khá sớm ở những nguồn nguyên liệu khác nhau

1.2.1.1 Vi sinh vật: [4][37]

Năm 1980, Miquel tìm thấy urease ở nhiều loài vi sinh vật, nhất là trong các vi sinh vậtđất, trong thực vật và một số ít ở động vật Ông đã tìm ra ở hơn 200 loài vi khuẩn, nhiều loạinấm men và ở đa số các loại thực vật bậc cao Các vi khuẩn có chứa urease tham gia vào quá

trình đồng hóa urea thành muối amon có nhiều loài, chúng có tên chung là Ureabacterium, hầu hết chúng thuộc 2 họ: Cocoaceae và Bacilaceae [37] Một số vi khuẩn sinh tổng hợp urease là Helicobacter Pylori, Klebsiella aerogenses, Proteus mirabilis, Yersinia

enterocolitica, Bacillus pasteurii, Escherchia coli, Staphylococcus…

Hình 1.16: Cấu trúc phân tử urease của Helicobacter Pylori

Helicobacter Pylori được cho là một trong những nguyên nhân chính của bệnh loét dạ

dày và tá tràng cũng như ung thư dạ dày Những nghiên cứu in vivo và in vitro gần đây đã

chứng minh rằng Helicobacter pylori có khả năng kháng lại nhiều loại chất kháng sinh nhưng

lại nhạy cảm với dịch chiết tỏi ở nồng độ khá thấp Sivam, Lampe, Ulness, Swanzy, and Potter

(1997) đã khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết tỏi tan trong nước đối với H pylori và

thấy rằng nồng độ ức chế thấp nhất của dịch chiết tỏi là 40mg thiosulfinates/ml Cellini, Di

Campli, Masulli, Di Bartolomeo, and Allocati (1996) đã thử trên 16 mẫu phân lập H pylori

bệnh phẩm và đưa ra nồng độ dịch chiết tỏi cần thiết để ức chế sự phát triển của vi khuẩn là 2– 5mg/ml Kết quả này thu được từ các nghiên cứu dạ dày sau khi tiêu thụ một tép tỏi cỡ trung

bình H pylori là một vi khuẩn hiếm khi “thống trị” trong dạ dày người Một điều thú vị là

chúng có thể sống sót và phát triển trong môi trường acid của dạ dày bằng cách sinh ra mộtlượng dư thừa enzyme urease (chiếm 10 – 15% tổng số protein theo khối lượng) có tác dụngthủy phân urea có trong dịch vị Ammonia sinh ra từ phản ứng này tạo ra môi trường kiềm cụcbộ ở đó vi khuẩn được bảo vệ khỏi điều kiện acid bất lợi

1.2.1.2 Động vật: [37]

Năm 1922, Przylecki tìm thấy urease trong gan của động vật thân mềm, trong một số loài

ấu trùng và loài giáp xác Ngoài ra urease còn được tìm thấy ở con Sam (Limulus polyphemus),

ở ấu trùng của ruồi Lucilia sericata, dịch tiêu hóa của trâu, bò, dê và chó…

1.2.1.3 Thực vật: [18]

Các loại cây họ đậu như đậu rựa, đậu nành, đậu ngự, đậu rằn đều có chứa một lượngđáng kể urease Trong các loại đậu kể trên thì đậu rựa (jack bean) chứa một lượng urease rấtlớn, tới gần 20% trọng lượng chất khô của hạt

Đậu rựa có nguồn gốc từ Ấn Độ Ở nước ta, giống đậu rựa được trồng nhiều ở miền Bắc,

ở miền Nam có giống đậu rựa leo Hạt đậu rựa độc, ăn say do trong hạt có chứa chấtConcanavalin là chất độc Nó phân lập immunoglobulin và glucoprotein trong máu, làm giảmkhả năng hấp thu chất dinh dưỡng qua ruột non Vì lí do trên nên ở nước ta đậu rựa ít được

Nguồn enzyme urease tự nhiên từ các cây họ đậu này khá phong phú nên ngay từ rấtsớm các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu trích ly enzyme urease từ chúng và ứngdụng rộng rãi trong các ngành phân tích thực phẩm và y học.

Năm 1916, Mateer và Marshall kiểm tra hàm lượng urease trong 13 loại cây họ đậu vàlấy lượng enzyme urease trong đậu nành làm chuẩn thì lượng urease trong các loại đậu khácnhư sau:

Bảng 1.5: Hàm lượng urease trong các loại đậu

Tên thông thường Tên thông thường Lượng urease

Glycine max L. Đậu nành (soybean) 1

Canavalia ensiformis Đậu rựa (jack bean) 15

Canavalia gladiata Đậu kiếm (sword bean) 5

Dolichos biflorus Đậu ngựa (horse gram) 1/5

Lupinus albus Đậu lupin 1/50

Phaseolus aureus (Vigna radiata) Đậu xanh 1/350

Hình 1.17: Các loại đậu chứa enzyme urease

1.2.2 Một số phương pháp tách chiết và tinh chế enzyme[1][2]

Các enzyme thường có trong các tế bào động thực vật và vi sinh vật và một số enzymengoại bào sẽ có trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật để tách chiết chúng ra có các cách nhưsau:

 Nghiền tế bào (phá vỡ tế bào): có thể dùng phương pháp vật lý, hóa học hoặc sinh học.

 Phương pháp vật lý: các phương pháp xay nghiền ở nhiệt độ thấp hay dùng Nitơ lỏng.

Khi đó nước trong tế bào bị kết tinh và tăng lực ma sát khi xay nghiền phá vỡ màng tếbào

 Phương pháp hóa học: xử lý tế bào bằng các dung môi có khả năng hòa tan màng tế

bào Phần lớn người ta có thể chọn các dung môi hữu cơ hòa tan được chất béo hoặc xửlý kiềm

 Phương pháp sinh học: hay còn gọi là phương pháp tự phân (autolyse) Sử dụng

lyxosom trong tế bào để giải phóng các enzyme phá hủy tế bào hoặc bổ sung các chếphẩm enzyme phá vỡ màng tế bào

 Trích ly enzyme:

Tùy loại enzyme người ta sẽ chọn dung môi thích hợp để trích ly Phần lớn dung môi làcác muối loãng hay là dung dịch đệm có pH xác định

 Kết tủa enzyme:

Sử dụng các dung môi khác nhau để kết tủa enzyme Các tác nhân này phải là các tácnhân biến tính thuận nghịch protein để sau khi kết tủa có thể hòa tan lại được Bao gồm:

 Muối trung tính: từng loại protein có thể kết tủa bởi các nồng độ muối khác nhau Cácmuối trung tính thường được chọn là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4, MgCl2, NaCl Phươngpháp này còn gọi là phương pháp diêm tích

 Dùng pH đẳng điện (pI): mỗi protein dễ bị kết tủa bởi pH đẳng điện riêng

Sau đó ly tâm, thu kết tủa enzyme và sấy ở nhiệt độ không quá 40oC.

 Loại tạp chất có phân tử lượng nhỏ:

Bằng phương pháp thẩm tích, dùng các màng bán thấm bằng vật liệu có kích thước lỗmàng nhỏ có thể cho các chất có phân tử lượng nhỏ đi qua do chênh lệch áp suất và giữ lại cácchất có phân tử lượng lớn

 Loại protein tạp:

Dùng phương pháp sắc ký, gồm sắc ký hấp phụ hoặc sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel.Hoặc dùng phương pháp điện di: dùng điện trường để tách các protein tích điện khác nhau

 Làm đặc – tiêu chuẩn hóa sản phẩm:

Dùng sấy thăng hoa hoặc các chế phẩm lỏng được siêu lọc và phải tiêu chuẩn hóa sảnphẩm: chế phẩm phải có hoạt tính riêng nhất định

1.3 Các phương pháp xác định hoạt tính urease

E + S  [ES]  E + P

Trong enzyme học, người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xácđịnh gián tiếp thông qua xác định mức độ hoạt động (hoạt tính) của enzyme đó Về nguyêntắc, có thể chia ra 3 nhóm phương pháp sau:

 Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhấtđịnh ứng với một nồng độ enzyme xác định

 Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sảnphẩm ứng với một nồng độ enzyme nhất định

 Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biếnthiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm

Bảng 1.6: Các phương pháp để xác định hoạt tính enzyme

Nhóm Các thông số cố định Các thông số thay đổi

2 Lượng S mất đi (hay lượng P tạo thành)

Lượng S mất đi (hay lượng P tạo thành) Nồng độ EĐể dễ dàng cho việc nghiên cứu, người ta đã đưa ra các khái niệm: [2]

 Đơn vị enzyme quốc tế (International Units): là lượng enzyme có khả năng xúc tác

làm chuyển hóa được một µmol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn

 Katal (Kat): là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được 1 mol cơ chất

sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn

 Hoạt tính riêng của chế phẩm (specific activity): bằng số lượng đơn vị hoạt độ có

trong 1 đơn vị thể tích protein (đối với chế phẩm lỏng) hoặc trong 1 đơn vị khối lượngprotein (đối với chế phẩm rắn)

Hoạt tính riêng của chế phẩm enzyme nói lên mức độ tinh khiết của chế phẩmenzyme Trong quá trình tinh chế, hoạt tính riêng sẽ tăng lên đáng kể

 Hoạt tính toàn phần của chế phẩm enzyme (total activity): là tổng số đơn vị hoạt độ

có trong chế phẩm

Trong quá trình tinh chế, hoạt tính toàn phần của chế phẩm sẽ bị giảm đó là sự thấtthoát trong quá trình xử lý