Vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH) là một nhóm các vi sinh vật quang tự dƣỡng, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có nhiều ứng dụng trong một số lĩnh vực nhƣ: sản xuất các chất có hoạt tín[r]
Trang 1BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-
Trần Thị Thu Quỳnh
TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO KHÔNG NO OMEGA-6, 7, 9 TỪ SINH KHỐI
VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Hà Nội - 2020
Trang 2BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-
Trần Thị Thu Quỳnh
TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO KHÔNG NO OMEGA-6, 7, 9 TỪ SINH KHỐI
VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hà Nội - 2020
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài: “Tối ưu hóa điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 từ sinh khối vi khuẩn tía quang hợp” là do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Hoàng Thị Yến
và GS TS Đặng Diễm Hồng Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn chính xác, trung thực Mọi thông tin nội dung tham khảo trong báo cáo đều được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm
và nguồn gốc
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này!
Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Trang 4LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian học tập và nghiên cứu, để hoàn thành luận văn này, trước
tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Hoàng Thị Yến
- cán bộ Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và GS TS Đặng Diễm Hồng - nguyên trưởng Phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam, là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, lên ý tưởng, định hướng nghiên cứu, tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện
đề tài nghiên cứu này
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ths Lê Thị Thơm, Ths Lưu Thị Tâm - cán bộ Phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, nhiệt tình giúp đỡ em trong các thí nghiệm khi gặp những khó khăn và cũng truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý giá trong công tác nghiên cứu Sinh học
Luận văn được thực hiện bằng kinh phí của Đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất omega 6, 7, 9 từ vi khuẩn tía quang hợp ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm” do TS Hoàng Thị Yến làm chủ
nhiệm thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến của Bộ Công thương, năm 2017-2020
Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám đốc, các thầy, cô giáo thuộc Khoa Công nghệ sinh học và Phòng Đào tạo, Quản lý Khoa học và Hợp tác quốc tế của Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện, hướng dẫn, truyền đạt cho em rất nhiều kiến thức trong quá trình học tập tại Học viện
Xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã động viên, là hậu phương vững chắc giúp em có động lực học tập
Em xin chân thành cảm ơn!
Học viên
Trần Thị Thu Quỳnh
Trang 5DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng Việt
MUFA Monounsaturated fatty acid Axit béo không bão hào
một nối đôi
PUFA Polyunsaturated fatty acid Axit béo không bão hòa đa
nối đôi SFA Saturated fatty acid Axit béo bão hòa
UFA Unsaturated fatty acid Axit béo không bão hòa
OD Optical density Mật độ quang
TFA Total fatty acid Axit béo tổng số
HUFA Highly unsaturated fatty acid Axit béo không bão hòa cao EPA Eicosapentaenoic acid Eicosapentaenoic acid
DHA Docosahexaenoic acid Docosahexaenoic acid
DPA Docosapetaenoic acid Docosapetaenoic acid
ARA Arachidonic acid Arachidonic acid
ACP Acyl carrier protein Protein mang acyl
Trang 6DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Phương pháp xác định hàm lượng kim loại nặng trong mẫu
Bảng 2.2 Phương pháp xác định chỉ tiêu vi sinh vật có trong dầu sinh
Bảng 3.1 Hàm lượng sinh khối khô, lipid và omega-3, 6, 7, 9 của
VKTQH khi nuôi trong bể quang sinh thể tích 1m3 38 Bảng 3.2 Thành phần axit béo của hỗn hợp MUFAs và PUFAs với tỷ
Bảng 3.3 Hiệu suất thu hồi MUFAs, PUFAs và chỉ số iot của mẫu thu
Bảng 3.4 Phân tích chỉ tiêu cảm quan, hóa lý của mẫu dầu sinh học
Bảng 3.5 Kết quả phân tích hàm lượng omega-6, 7, 9 55 Bảng 3.6 Kết quả phân tích dư lượng urê, kim loại nặng trong dầu
sinh học giàu axit béo omega-6, 7, 9 56 Bảng 3.7 Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật 56
Trang 7DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh
Hình 3.2 Ảnh hưởng của chất xúc tác lên hiệu suất tách chiết TFA từ
Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối/ dung môi lên hiệu suất tách
Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian lên hiệu suất tách chiết TFA từ
Hình 3.5 Ảnh hưởng của điều kiện khuấy trộn lên hiệu suất tách chiết
Hình 3.6 Hiệu suất tách chiết SFAs (A) và MUFAs, PUFAs (B) ở các
Hình 3.7 Hiệu suất tách chiết SFAs (A) và MUFAs, PUFAs (B) ở các
tỷ lệ TFA: urê : methanol khác nhau 47 Hình 3.8 Hiệu suất tách SFAs (A) và MUFAs, PUFAs (B) ở các nhiệt
Hình 3.9 Sơ đồ quy trình tách chiết và làm giàu axit béo không no
Hình 3.10 Hình ảnh minh họa quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo
omega-6, 7, 9 bằng phương pháp tạo phức urê 53
Trang 8MỤC LỤC
Trang LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
1.1 TỔNG QUAN VỀ LIPID, AXIT BÉO KHÔNG NO MỘT NỐI
ĐÔI (MUFAs) VÀ ĐA NỐI ĐÔI (PUFAs) (DẠNG OMEGA-6, 7, 9) 6
1.1.2 Giới thiệu về MUFAs và PUFAs (dạng omega-6, 7, 9) 7
1.2 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP (VKTQH) 13
1.2.4 Khả năng sinh tổng hợp axit béo không no của VKTQH 17 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH DẦU 19
1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU OMEGA-6, 7, 9 TRÊN THẾ GIỚI
1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 25 1.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt nam 27 CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
Trang 92.2 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 29
2.3.1 Phương pháp chuyển vị ester trực tiếp từ sinh khối để tạo ra hỗn
2.3.2 Tối ưu các thông số của quá trình tách chiết TFA 31 2.3.3 Làm giàu hỗn hợp axit béo omega-6, 7, 9 trong dầu vi khuẩn tía
2.3.4 Phương pháp phân tích thành phần axit béo của dầu 33 2.3.5 Phương pháp xác định trạng thái cảm quan 34 2.3.6 Phương pháp xác định chỉ số axit 34
2.3.8 Phương pháp xác định hàm lượng urê 35 2.3.9 Phương pháp xác định hàm lượng các kim loại nặng trong dầu
2.3.10 Phương pháp xác định vi sinh vật trong dầu sinh học 37
3.1 HÀM LƯỢNG SINH KHỐI KHÔ, LIPID VÀ THÀNH PHẦN AXIT BÉO (OMEGA-6, 7, 9) CỦA SINH KHỐI HỖN HỢP 2 CHỦNG VKTQH SẢN XUẤT TRONG BỂ QUANG SINH THỂ
3.2 TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG TÁCH CHIẾT TFA TỪ
3.2.1 Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng 39 3.2.2 Kết quả xác định ảnh hưởng của chất xúc tác 40 3.2.3 Kết quả xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi
3.2.4 Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian phản ứng 42 3.2.5 Kết quả xác định ảnh hưởng của điều kiện khuấy trộn 43
Trang 103.3 TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÀM GIÀU OMEGA-6, 7, 9 TỪ HỖN HỢP AXIT BÉO TỔNG SỐ THU ĐƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP
3.3.1 Kết quả xác định ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp TFA: urê trong
3.3.2 Kết quả xác định ảnh hưởng của tỷ lệ TFA: urê: methanol trong
3.3.3 Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ kết tinh trong quá
3.3.4 Kết quả nghiên cứu tăng hiệu suất thu hồi các omega-6, 7, 9
3.4 QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO KHÔNG NO OMEGA-6, 7, 9 TỪ SINH KHỐI VKTQH 50 3.5 KẾT QUẢ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG DẦU SINH HỌC OMEGA-6, 7, 9 TÁCH CHIẾT ĐƯỢC SAU QUÁ TRÌNH LÀM
3.5.1 Kết quả xác định chỉ tiêu cảm quan, hóa lý 54 3.5.2 Kết quả xác định thành phần axit béo 55 3.5.3 Kết quả xác định dư lượng urê, kim loại nặng 55 3.5.4 Kết quả chỉ tiêu vi sinh vật có trong dầu sinh học omega-6, 7, 9 56
KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
Trang 11MỞ ĐẦU
Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (thực phẩm chức năng) giàu omega-3, 6, 7,
9 đã được chứng minh là có vai trò rất quan trọng trong việc giảm nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, giảm cân, tiêu hóa, giữ ẩm cho da, tóc và móng tay, giảm đau dây thần kinh, đái tháo đường Omega-3, 6, 9 có nhiều trong các loại dầu động, thực vật như dầu oliu, dầu đậu nành, dầu hạt hướng dương, dầu cá thu, cá hồi, cá basa Tuy nhiên, omega-7 lại rất khan hiếm trong cả giới động vật và thực vật Chúng chủ yếu được chiết xuất từ cây hắc mai biển
và dầu macadamia Hiện nay các loài vi tảo biển hoặc các loài vi khuẩn sinh dầu có thể là nguồn nguyên liệu thay thế cho việc sản xuất các axit béo không
no này
Vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH) là một nhóm các vi sinh vật quang
tự dưỡng, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có nhiều ứng dụng trong một số lĩnh vực như: sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao, sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc, gia cầm và nuôi trồng thuỷ sản, xử lý nước thải, sản xuất phân bón sinh học Thành phần axit béo của VKTQH không lưu huỳnh chứa hàm lượng các axit béo không bão hòa một nối đôi (monounsaturated fatty acid - MUFAs) và đa nối đôi (polyunsaturated fatty acid - PUFAs) (dạng omega-3, 6, 9 và đặc biệt là omega-7) khá cao Hàm lượng lipit ở VKTQH (chiếm khoảng 20 - 40% sinh khối khô – SKK) thấp hơn khi so với vi tảo Tuy nhiên, công nghệ nuôi trồng chúng lại đơn giản hơn nhiều so với vi tảo cũng như không đòi hỏi môi trường nuôi nghiêm ngặt để
sản xuất axit béo Thành phần axit béo của Rhodobacter sphaeroides có nhiều
C16 - C18, thích hợp cho sản xuất diesel sinh học Ngoài ra, thành phần axit
béo từ R sphaeroides chủ yếu bao gồm các axit béo không bão hòa, được sử
dụng làm thực phẩm bổ sung vào thức ăn cho người như omega-6, 7, 9 Trong
đó, axit vaccenic (C18:1, omega-7) chiếm 60% so với axit béo tổng số - total
fatty acid - TFA là nguồn axit béo omega-7 chính có vai trò quan trọng trong việc duy trì sức khỏe của da và màng tế bào của người Ngoài ra, hàm lượng
omega-7 (C18: 1, omega-7) của các loài thuộc chi Rhodovulum cũng đạt đến
60 - 80% so với TFA
Trang 12Hai chủng VKTQH Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 và R
sphaeroides VTN.2 được phân lập tại Việt Nam có các đặc điểm: sinh trưởng
mạnh (với mật độ quang đo tại bước sóng 660nm - ∆OD660 >1,2); lipit tổng số cao (đạt đến 20% SKK) và hàm lượng omega-6, 7, 9 cao (chiếm 80% so với TFA) có tiềm năng sử dụng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe giàu omega-6, 7, 9 Tuy nhiên, hàm lượng axit béo cũng như hiệu suất của quá trình tách chiết các axit béo từ sinh khối VKTQH lại phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường nuôi và điều kiện tách chiết Hiện nay chưa có nghiên cứu về tách chiết omega trên đối tượng VKTQH Chính vì vậy, chúng
tôi tiến hành thực hiện luận văn với tiêu đề “Tối ưu hóa điều kiện tách chiết
và làm giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 từ sinh khối vi khuẩn tía quang hợp” Luận văn được thực hiện với mục tiêu và nội dung nghiên cứu
như sau:
Với mục tiêu:
Có được điều kiện thích hợp cho tách chiết axit béo tổng số (TFA) từ sinh khối khô VKTQH và làm giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 bằng phương pháp tạo phức với urê
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Tối ưu điều kiện của phản ứng tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH;
- Tối ưu điều kiện làm giàu omega-6, 7, 9 từ TFA thu được bằng phương pháp tạo phức với urê;
- Xây dựng quy trình tách chiết và làm giàu axit béo không no omega-6,
7, 9 từ sinh khối khô VKTQH;
- Phân tích đánh giá chất lượng dầu sinh học omega-6, 7, 9 tách chiết
được
Trang 13CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 TỔNG QUAN VỀ LIPID, AXIT BÉO KHÔNG NO MỘT NỐI ĐÔI
(MUFAs) VÀ ĐA NỐI ĐÔI (PUFAs) (DẠNG OMEGA-6, 7, 9)
1.1.1 Giới thiệu về lipid
Lipid là những hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phổ biến trong tế bào của các cơ thể sống Lipid trong thực phẩm có thể được cung cấp từ cả động vật
và thực vật Lipid có nguồn gốc thực vật như bơ thực vật, dầu tinh luyện, shortening, đậu nành, đậu lạc, vừng Lipid có nguồn gốc động vật như: trứng, thịt, cá, thuỷ sản Các lipid có nguồn gốc động vật gọi là mỡ, lipid có nguồn gốc thực vật gọi là dầu Chúng có thành phần hoá học và cấu tạo khác nhau nhưng có tính chất chung là không hoà tan trong nước mà hoà tan trong các dung môi hữu cơ như: ether, cloroform, n-hexan, benzen… Lipid là hợp phần cấu tạo quan trọng của các màng sinh học tế bào, là nguồn cung cấp năng lượng (37,6.106
J/kg), nguồn cung cấp các vitamin A, D, E, F và K cho
cơ thể sống [1]
Trong thực phẩm, lipid có rất nhiều loại như: phospholipid, triglycerid, cholesterol, glycolipid, lipoprotein và sáp với 2 nhóm chính là: lipid đơn giản cấu tạo bao gồm hydro (H), carbon (C), oxy (O) và lipid phức tạp có tạo phức ngoài C, H, O còn có các thành phần khác như P, S Những hợp chất thuộc
về lipid tồn tại trong tự nhiên rất đa dạng như: các hydrocacbon bậc cao, ancohol, aldehyde, axit béo và sản phẩm thứ cấp của chúng như glycerid, sáp, phospholipid, glucolipid, sulfolipid [1]
Lipid có nhiều dạng cấu trúc khác nhau Tuy nhiên, thường có chung một nguyên tắc trong cấu trúc phân tử lipid bao gồm hai phần: một phần là các đuôi mạch hydrocarbon kị nước, phần kia là tổ hợp nhóm các chất ưa nước (gọi là đầu phân cực) Cấu trúc đa dạng của lipid được bắt nguồn từ các axit béo khác nhau tham gia vào trong thành phần của nó Cho đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện được hơn 500 axit béo khác nhau bởi mức độ và đặc điểm phân nhánh của mạch hydrocacbon, số lượng và vị trí các nối đôi trong mạch, vị trí và số lượng các nhóm chức, độ dài của mạch
Trang 14hydrocacbon… Các axit béo có mặt trong thành phần lipid thực vật, động vật trên cạn thường có từ 16 đến 20 nguyên tử cacbon trong phân tử Trong khi ở sinh vật biển thành phần lipid đa phần chứa các axit béo mạch dài từ 20 đến
26, thậm chí đến 30 nguyên tử carbon [1]
Axit béo được chia thành axit béo bão hòa và axit béo không bão hòa Các axit béo không bão hòa gồm axit béo không bão hoà đơn (monounsaturated fatty acid - MUFAs) có một nối đôi trong phân tử và axit béo không bão hoà đa nối đôi (polyunsaturated fatty acid - PUFAs) có hơn một nối đôi trong phân tử
1.1.2 Giới thiệu về MUFAs và PUFAs (dạng omega-6, 7, 9)
Các axit béo không bão hoà MUFA và PUFA đã được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực dinh dưỡng và dược phẩm Đây là các axit béo không thay thế bởi cơ thể con người không thể tự tổng hợp được mà phải lấy từ thức ăn bên ngoài [2] MUFAs và PUFAs có 3 vai trò sinh học chủ yếu Đầu tiên là tham gia vào sự điều hoà trao đổi lipid, vận chuyển và hướng tới các mô Thứ hai là tham gia vào thành phần cấu trúc nên thành tế bào Ngoài ra, một số PUFAs còn đóng vai trò là cơ chất cho việc tổng hợp các phân tử có hoạt tính sinh học như prostaglandin, thromboxan và leukotrien [3] Các PUFAs được chia làm 2 nhóm chính là omega-3 và omega-6 Ngoài ra, còn có omega-7, 9 [4]
Tên gọi của omega dựa vào liên kết đôi đầu tiên tại vị trí carbon Mạch hydrocarbon có 2 đầu: một đầu là nhóm methyl và một đầu là nhóm cacboxyl Chúng được phân loại theo vị trí của liên kết đôi đầu tiên tính từ gốc methyl hay gốc cacboxyl Để chỉ vị trí nối đôi đầu tiên trên mạch cacbon được tính từ đầu methyl người ta có thể sử dụng ký hiệu “n” hoặc “ω” Các liên kết đôi trong MUFA, PUFAs cũng có thể được tính từ gốc carboxyl và được ký hiệu “Δ” Những nhóm omega-6, omega-7 hay omega-9 có liên kết đôi đầu tiên tương ứng tại vị trí cacbon số 6, 7 hay 9 [2]
Các axit béo omega-6 là một họ các axit béo không no đa nối đôi, chúng có nối đôi C=C ở vị trí carbon thứ 6 tính từ đầu methyl của chuỗi axit