nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký để phân tích thành phần alkaloid, flavonoid của lá, tâm sen và các chế phẩm

Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần alkaloid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp HPLC-PDA ..... Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID

CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

TP Hồ Chí Minh – Năm 2015

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID

CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM

Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

Mã số: 62.72.04.10

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả đượctrình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì côngtrình nào khác

Người cam đoan,

Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ

.

MỤC LỤC

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Thực vật học về Sen 4

1.2 Hóa học về Sen 7

1.3 Chiết xuất- phân lập các alkaloid, flavonoid trong lá và tâm Sen 12

1.4 Các phương pháp phân tích thành phần alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen 16 1.5 Tác dụng sinh học của lá, tâm Sen 19

1.6 Công dụng của Sen 21

1.7 Chất đối chiếu 22

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Nguyên vật liệu – Dung môi, hóa chất, thuốc thử – Trang thiết bị 25

2.3 Địa điểm nghiên cứu 28

2.4 Phương pháp nghiên cứu 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 47

3.1 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen 47

3.1.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá và tâm Sen 47

3.1.2 Chiết cao chiết toàn phần alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen 48

3.1.3 Phân lập alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen 48

3.1.4 Xác định độ tinh khiết các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen 60

3.1.5 Xác định cấu trúc các chất phân lập được 61

3.2 Thiết lập một số chất đối chiếu alkaloid, flavonoid phân lập từ lá, tâm Sen 80

.

3.3 Xây dựng qui trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời alkaloid, flavonoid

có trong lá và tâm Sen 853.4 Ứng dụng các qui trình định tính, định lượng để phân tích các alkaloid,flavonoid có trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen 104

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 108

4.1 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc cấu trúc các alkaloid, flavonoid phân lập

từ lá và tâm Sen 1084.2 Qui trình định tính, định lượng đồng thời alkaloid, flavonoid có trong

lá và tâm Sen 1174.3 Ứng dụng qui trình định tính, định lượng để phân tích các alkaloid, flavonoid

có trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm từ lá, tâm Sen 1244.4 Đặc tính điểm chỉ của lá và tâm Sen 127

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

.

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitrile

ASEAN Association of Southeast Asian Nations

(Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á)

CĐC Chất đối chiếu

CE Capillary electrophoresis (Điện di mao quản)

Corr Area Corrected Area (Diện tích pic được chuẩn hóa)

CTAB Cetyltrimethylammonium bromide

CZE Capillary Zone Electrophoresis (Điện di mao quản vùng)

d doublet (đỉnh đôi)

DVT Dấu vân tay

DĐVN IV Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ IV

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DSC Differential Scanning Calorimetry (Quét nhiệt vi sai)

DMSO Dimethylsulfoxide

ĐDĐ Điện di đồ

DTAB Dodecyltrimethylammonium bromide

ESI Electrospray Ionization (Ion hóa phun mù electron)

EOF Electro-osmotic flow (Dòng điện thẩm)

FCPC Fast centrifugal partition chromatography (Sắc ký phân bố

ly tâm nhanh)

GLP Good Laboratory Practices (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc)

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng

hiệu năng cao)

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation

ICH International Conference on Harmonization

IR Infrared (Hồng ngoại)

.

ILMAE Ionic liquids based microwave- assisted extraction (chiết hỗ trợ vi sóng dựa trên pha lỏng ionic)

J Coupling constant (Hằng số ghép)

LC-MS Liquid Chromatography–Mass Spectrometry

(Sắc ký lỏng ghép khối phổ)

LDL Low density lipoprotein

LOD Limit of detection

LOQ Limit of quantitation

MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography (Sắc ký mixen điện động)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 (Tế bào ung thư vú dòng MCF-7)

MS Mass Spectrometry (Khối phổ)

NACE Non aqueous capillary electrophoresis

NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân)

PDA Photo Diode Array (Dãy diod quang)

PE Petroleum ether (ether dầu hỏa)

PCRS Primary Chemical Reference Standard (Chất đối chiếu hóa học sơ cấp)

PTN Phòng thí nghiệm

RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

s singlet (Đỉnh đơn)

SKĐ Sắc ký đồ

SCRS Secondary Chemical Reference Standard

(Chất đối chiếu hóa học thứ cấp)

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SFE Supercritical Fluid Extraction (Chiết bằng lưu chất siêu tới hạn)

SKLM Sắc ký lớp mỏng

TEA Triethylamin

TGA Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhiệt trọng lượng)

THF Tetrahydrofuran

UV-Vis Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến)

VLC Vacuum Liquid Chromatography (Sắc ký cột chân không)

.

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Vị trí phân loại của chi Nelumbo 4

Bảng 1.2 Các alkaloid khung aporphin có trong lá Sen 8

Bảng 1.3 Các alkaloid khung benzylisoquinolin có trong lá Sen 8

Bảng 1.4 Các alkaloid khung benzylisoquinolin có trong tâm Sen 10

Bảng 1.5 Các alkaloid khung bisbenzylisoquinolin có trong tâm Sen 11

Bảng 1.6 Tóm tắt các nghiên cứu phân lập alkaloid, flavonoid lá, tâm Sen 12

Bảng 1.7 Tóm tắt các nghiên cứu định lượng alkaloid, flavonoid lá và tâm Sen 16

Bảng 2.1 Nơi thu hái nguyên liệu lá và tâm Sen loài Nelumbo nucifera G 26

Bảng 2.2 Nơi thu hái nguyên liệu lá Sen loài N Lutea Willd và Victoria regia 26

Bảng 2.3 Các chế phẩm có chứa lá và tâm Sen 26

Bảng 2.4 Khảo sát dung môi chiết alkaloid, flavonoid từ lá, tâm Sen 30

Bảng 2.5 Điều kiện tiến hành VLC phân đoạn A2 và tủa F từ lá Sen 33

Bảng 2.6 Điều kiện tiến hành sắc ký cột cao A3, cao N lá Sen 34

Bảng 2.7 Điều kiện tiến hành sắc ký cột phân đoạn NP5, NP8, cao EF tâm Sen 34

Bảng 2.8 Điều kiện tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 phân đoạn F1, F6, F8 35 Bảng 2.9 Các điều kiện dung môi hai pha không đồng tan dự kiến thăm dò cho FCPC phân đoạn P-2 36

Bảng 3.1 Kết quả chiết cắn toàn phần từ lá, tâm Sen 47

Bảng 3.2 Kết quả chiết alkaloid, flavonoid toàn phần từ lá, tâm Sen 47

Bảng 3.3 Tổng kết các alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ lá Sen 48

Bảng 3.4 Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao A2, lá Sen 50

Bảng 3.5 Kết quả thu hứng LN-1 từ phân đoạn A2-1 50

Bảng 3.6 Kết quả thu hứng LN-2, LN-8 từ phân đoạn A2-2 50

Bảng 3.7 Kết quả thu hứng LN-2, LN-3 từ phân đoạn A2-3 51

Bảng 3.8 Kết quả thu hứng LN-4 từ phân đoạn A2-8 51

Bảng 3.9 Kết quả thu hứng LN-6, LN-7 từ phân đoạn A2-6 51

Bảng 3.10 Kết quả thu hứng LN-5 từ phân đoạn A2-11 và A2-12 52

Bảng 3.11 Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao A3 lá Sen 52

.

Bảng 3.12 Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao N lá Sen 52

Bảng 3.13 Kết quả sắc ký cột silica gel trên tủa F, lá Sen 53

Bảng 3.14 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F1 53

Bảng 3.15 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F-2,3 54

Bảng 3.16 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F-7 54

Bảng 3.17 Kết quả thu hứng LF-2 và LF-4 từ F7-3 54

Bảng 3.18 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F8 54

Bảng 3.19 Tổng kết các alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ lá Sen 55

Bảng 3.20 Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn NP5, tâm Sen 57

Bảng 3.21 Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn NP8, tâm Sen 57

Bảng 3.22 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn P 58

Bảng 3.23 Kết quả FCPC phân đoạn P-2 58

Bảng 3.24 Kết quả Sephadex LH-20 của phân đoạn n-Bu 58

Bảng 3.25 Kết quả các phân đoạn sau SPE từ n-Bu II 59

Bảng 3.26 Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao EF, tâm Sen 59

Bảng 3.27 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn EF-8, tâm Sen 59

Bảng 3.28 Độ tinh khiết các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen 60

Bảng 3.29 Dữ liệu phổ UV, MS của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 61

Bảng 3.30 Dữ liệu phổ 13C- NMR của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 61

Bảng 3.31 Dữ liệu phổ 1H- NMR của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 62

Bảng 3.32 Dữ liệu phổ 13C và 1H-NMR của LN-5 63

Bảng 3.33 Dữ liệu phổ UV, MS của LN-8, LN-9 64

Bảng 3.34 Dữ liệu phổ 13C và 1H- NMR của LN-8, LN-9 64

Bảng 3.35 Dữ liệu phổ UV, IR, MS của EN-1, EN-2, EN-3 65

Bảng 3.36 Dữ liệu phổ 13C và 1H- NMR của EN-1, EN-2, EN-3 66

Bảng 3.37 Dữ liệu phổ UV, IR, MS của các alkaloid EN-4, EN-5 67

Bảng 3.38 Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của EN-4 67

Bảng 3.39 Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của EN-5 69

Bảng 3.40 Dữ liệu phổ UV, IR, MS của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 74

Bảng 3.41 Dữ liệu phổ 13C-NMR của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 75

.

Bảng 3.42 Dữ liệu phổ 1H-NMR của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 75

Bảng 3.43 Dữ liệu phổ UV, MS của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 76

Bảng 3.44 Dữ liệu phổ 13C-NMR của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 76

Bảng 3.45 Dữ liệu phổ 1H-NMR của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 77

Bảng 3.46 Dữ liệu phổ UV, MS của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 78

Bảng 3.47 Dữ liệu phổ 13C-NMR của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 78

Bảng 3.48 Dữ liệu phổ 1H-NMR của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 79

Bảng 3.49 Kết quả khảo sát hàm ẩm bằng phương pháp TGA và nhiệt độ nóng chảy, độ tinh khiết bằng phương pháp DSC (n=3) 81

Bảng 3.50 Bảng tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết HPLC-PDA của 06 CĐC 82

Bảng 3.51 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC của 06 CĐC 82

Bảng 3.52 Kết quả xác định miền giá trị, độ đúng, độ chính xác của qui trình phân tích các nguyên liệu thiết lập CĐC 82

Bảng 3.53 Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký các nguyên liệu thiết lập CĐC 83

Bảng 3.54 Tóm tắt các chỉ tiêu chất lượng và phương pháp thử của các CĐC 84

Bảng 3.55 Kết quả đánh giá đồng nhất lô của quá trình đóng lọ các CĐC 84

Bảng 3.56 Kết quả đánh giá liên PTN của các nguyên liệu thiết lập CĐC 85

Bảng 3.57 Kết quả xác định giá trị ấn định của các CĐC sau khi đóng gói 85

Bảng 3.58 Kết quả khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian, độ đúng qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid trong mẫu nguyên liệu lá sen (NN-1a) bằng phương pháp CE-PDA/MS 90

Bảng 3.58 Kết quả khảo sát đặc tính điểm chỉ các alkaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen bằng phương pháp SKLM 100

Bảng 3.59 Kết quả khảo sát đặc tính điểm chỉ các alkaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen bằng phương pháp SKLM 101

Bảng 3.60 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần alkaloid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp HPLC-PDA 102

.

Bảng 3.61 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần

flavonoid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp HPLC/PDA 102

Bảng 3.62 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần

alkaloid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA 103

Bảng 3.63 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần

flavonoid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC/PDA 103

Bảng 3.64 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần

flavonoid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp CE/PDA 104

Bảng 3.65 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần

flavonoid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp CE/PDA 104

Bảng 3.66 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần

alkaloid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp CE-PDA/MS 104

Bảng 3.67 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần

alkaloid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp CE-PDA/MS 105

Bảng 3.68 Kết quả xác định hàm lượng các alkaloid (mg/100 mg) có trong mẫu

nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo nucifera; Nelumbo lutea và Victoria regia bằng

phương pháp CE-PDA/MS và HPLC-PDA 106

Bảng 3.69 Kết quả xác định hàm lượng của các alkaloid (mg/100 mg) có trong

07 mẫu chế phẩm từ lá Sen loài N nucifera bằng phương pháp CE-PDA/MS và

HPLC-PDA 106

Bảng 3.70 Kết quả xác định hàm lượng các flavonoid (mg/100mg) có trong mẫu

nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo nucifera; Nelumbo lutea và Victoria regia bằng

phương pháp CE-PDA và HPLC-PDA 107

Bảng 3.71 Kết quả xác định hàm lượng của các flavonoid (mg/100 mg) có trong

06 mẫu chế phẩm từ lá Sen loài N nucifera bằng phương pháp CE-PDA và

HPLC-PDA 107

Bảng 4.1 Độ dịch chuyển trên phổ 13C và 1H để phân biệt 05 alkaloid

LN-1, LN-2, LN-3, LN-4, LN-5 114 Bảng 4.2 Độ dịch chuyển trên phổ 13C và 1H để phân biệt 05 alkaloid

EN-1, EN-2, EN-3, EN-4, EN-5 115

.

Bảng 4.3 Độ dịch chuyển trên phổ 13C và 1H để phân biệt 04 alkaloid

EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 116 Bảng 4.4 Độ dịch chuyển trên phổ 13C và 1H để phân biệt 02 alkaloid

LN-9, LN-10 117 Bảng 4.5 Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng alkaloid cao nhất có trong

lá Sen (N nucifera) Việt Nam 127

Bảng 4.6 Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng alkaloid cao nhất có trong

tâm Sen (N nucifera) Việt Nam 127

Bảng 4.7 Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng flavonoid cao nhất

có trong lá Sen (N nucifera) Việt Nam 127

Bảng 4.8 Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng flavonoid cao nhất có

trong tâm Sen (N nucifera) Việt Nam 127

.

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh loài Sen hồng và Sen trắng 4

Hình 3.1 SKLM của 09 alkaloid phân lập từ lá Sen 49

Hình 3.2 SKLM của cao A1, A2, A3 lá Sen 49

Hình 3.3 SKĐ 06 lần tiêm mẫu thu hứng LN2, LN8 51

Hình 3.4 SKLM 08 flavonoid phân lập từ lá Sen 53

Hình 3.5 SKLM các alkaloid phân lập từ tâm Sen 56

Hình 3.6 SKLM các phân đoạn NP5, NP8, P tâm Sen 56

Hình 3.7 Cấu trúc hóa học của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 62

Hình 3.8 Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của LN-5 63

Hình 3.9 Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của LN-8, LN-9 65

Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của EN-1, EN-2, EN-3 67

Hình 3.11 Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của EN-4 69

Hình 3.12 Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của EN-5 70

Hình 3.13 Cấu trúc hóa học của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 75

Hình 3.14 Cấu trúc hóa học của LF-1, LF-5, LF-6, LF-7, LF-8, TF-1 77

Hình 3.15 Cấu trúc hóa học của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 79

Hình 3.16 Điện di đồ của hỗn hợp chuẩn 07 alkaloid và mẫu thử dịch chiết toàn phần alkaloid lá sen ở điều kiện thích hợp 87

Hình 3.17 Điện di đồ CE-MS của mẫu hỗn hợp chuẩn 07 alkaloid (TIC) và mẫu thử lá Sen NN-1a (TIC/EIC) ở điều kiện thích hợp 87

Hình 3.18 Phổ MS của nuciferin, 2-O-nornuciferin, norarmepavin, armepavin trong mẫu thử lá Sen, tương ứng điện di đồ CE-MS 89

Hình 3.19 Kiểm tra độ tinh khiết pic pronuciferin 90

Hình 3.20 Điện di đồ mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn phần lá Sen, hỗn hợp 07 chuẩn alkaloid và mẫu thử thêm hỗn hợp chuẩn 90

Hình 3.21 Điện di đồ mẫu hỗn hợp chuẩn 08 flavonoid và mẫu thử dịch chiết flavonoid toàn phần lá Sen 91

.

Hình 3.22 SKĐ mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn phần lá Sen, hỗn hợp 04 chuẩn

alkaloid ở điều kiện sắc ký thích hợp 92

Hình 3.23 Sắc ký đồ mẫu pha động (a), mẫu hỗn hợp chuẩn (b), dung môi pha mẫu (c),mẫu thử lá Sen (d), mẫu thử thêm chuẩn (e) 93

Hình 3.24 Phổ UV-Vis của nuciferin trong (1) mẫu chuẩn, (2) mẫu thử lá Sen, (3)mẫu thử thêm chuẩn và kiểm tra độ tinh khiết pic nuciferin 93

Hình 3.25 SKĐ hỗn hợp 06 chuẩn flavonoid (1), mẫu thử dịch chiết flavonoid

toàn phần lá Sen (2), ở điều kiện sắc ký thích hợp 94

Hình 3.26 Điện di đồ mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn phần tâm Sen, hỗn hợp 09

chuẩn alkaloid ở điều kiện điện di thích hợp 95

Hình 3.27 Điện di đồ CE-MS của mẫu hỗn hợp chuẩn 09 alkaloid (TIC) và mẫu

thử tâm Sen NN-1a (TIC/EIC) ở điều kiện điện di thích hợp 96

Hình 3.28 Phổ MS của isoliensinin N2’-oxyd, isoliensinin N2-oxyd, isoliensinin,pronuciferin trong mẫu thử tâm Sen, tương ứng điện di đồ CE-MS 97

Hình 3.29 Điện di đồ mẫu thử dịch chiết flavonoid toàn phần tâm Sen, hỗn hợp 06

chuẩn flavonoid ở điều kiện điện di thích hợp 98

Hình 3.30 Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp 07 chuẩn alkaloid và mẫu thử dịch chiết alkaloid toànphần tâm Sen ở điều kiện sắc ký thích hợp 99

Hình 3.31 Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp 06 chuẩn flavonoid và mẫu thử dịch chiết flavonoidtoàn phần tâm Sen ở điều kiện sắc ký thích hợp 100

.

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ trình tự các nội dung nghiên cứu 29

Sơ đồ 2.2 Chiết xuất cao toàn phần và các phân đoạn alkaloid, flavonoid từ lá Sen bằng chiết phân bố lỏng-lỏng 31

Sơ đồ 2.3 Chiết xuất cao toàn phần và các phân đoạn alkaloid, flavonoid từ tâm Sen bằng chiết phân bố lỏng-lỏng 32

Sơ đồ 2.4 Chiết xuất cao N từ cắn B bằng phương pháp tạo tủa với TT Bertrand 33

Sơ đồ 3.2 Qui trình chiết alkaloid toàn phần mẫu nguyên liệu lá Sen 87

Sơ đồ 3.3 Qui trình chiết flavonoid toàn phần mẫu nguyên liệu lá Sen 91

.

MỞ ĐẦU

Có nhiều con đường để tạo ra thuốc phục vụ điều trị và chăm sóc sức khỏecon người, trong đó các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên là một lĩnh vực được cácnhà nghiên cứu phát triển dược phẩm trên thế giới quan tâm, nghiên cứu bởinhiều lợi thế của chúng Có nhiều cách tiếp cận trong phát triển thuốc có nguồn gốc

tự nhiên Đó là phát hiện các hoạt chất và phát triển chúng theo các tiêu chuẩn củadược phẩm hiện đại phương tây và chứng minh tác dụng của dược liệu, bài thuốccủa y học cổ truyền như là một thể thống nhất như nó vốn có và dùng các kỹ thuậthiện đại để đảm bảo, nâng cao hiệu quả điều trị của chúng Với xu hướng này,những cây thuốc lâu nay được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, trong y học cổtruyền, bên cạnh việc được đánh giá tác dụng trị liệu, đang rất được quan tâmnghiên cứu về thành phần hóa học cũng như các phương pháp theo dõi, đánh giáthành phần, hàm lượng các chất chính, để có thể đánh giá, đảm bảo chất lượng, tiêuchuẩn hóa cho các sản phẩm, sử dụng trong chăm sóc sức khỏe một cách an toàn,hiệu quả và khoa học

Việt Nam được thiên nhiên ban tặng một thảm thực vật xanh rộng khắp trênmọi miền đất nước, là điều kiện rất thuận lợi trong việc nghiên cứu và phát triển cácthuốc có nguồn gốc dược thảo Trong kho tàng cây thuốc Việt Nam, cây Sen

(Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae) đã gắn liền với cuộc sống tâm linh

cũng như thường nhật của người Việt Sen tượng trưng cho sự tinh khiết và trườngthọ, nhưng cũng hết sức bình dị và hữu dụng trong cuộc sống hàng ngày Sen có ởkhắp mọi miền đất nước, nhưng phổ biến nhất có lẽ ở vùng Miền tây Nam bộ mànổi tiếng nhất là ở Đồng Tháp Mười, nơi được xem là xứ sở Sen Sen là một trong

số ít các dược thảo mà tất cả các bộ phận đều được sử dụng và đều là những vịthuốc quí, có giá trị Danh y Hải Thượng Lãn Ông đã viết: “Cây mọc từ dưới bùnđen mà không ô nhiễm mùi bùn, đượm khí thơm trong lành của trời đất nên củ, lá,hoa, tua, vỏ quả, ruột đều là thuốc hay” Từ xưa nhân dân ta đã biết dùng ngó Sen,quả Sen làm thực phẩm Lá Sen, tâm Sen, gương Sen, nhị Sen dùng làm thuốc cổ

.

truyền để điều trị mất ngủ, hồi hộp, cao huyết áp, tiêu chảy mãn tính, cảm nắng, béophì, di tinh, cầm máu[1],[3],[8]

Các nghiên cứu dược lý đã chứng minh dịch chiết lá Sen có nhiều hoạt tính

sinh học in vivo như: an thần [45], chống béo phì [66], [103], , giảm cholesteroltrong máu [33], [38], [78], chống oxy hóa [27],[70], hạ đường huyết [25],[65], chống lại sựphát triển của tế bào ung thư [64]…Dịch chiết tâm Sen có hoạt tính an thần [104],

hạ đường huyết[25],[96], hạ huyết áp[88], chống loạn nhịp tim [30],[108], ức chế kết tậptiểu cầu [100], kháng HIV [99]

Các hoạt tính sinh học này ít nhiều đều liên quan đến

sự hiện diện của thành phần alkaloid và flavonoid có trong lá, tâm Sen

Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học chiết tách và phân tích, trên thế giới đã cónhững công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và phân tích định tính,định lượng một số thành phần alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen Trong lĩnh vựcphân tích cũng đã có một vài nghiên cứu của các tác giả Trung quốc và Ấn độ ứngdụng phương pháp HPLC, CE để định lượng một vài chất trong số các thành phầnchính của Sen trong dược liệu, chế phẩm hay dịch sinh học

Tại Việt Nam hiện nay, việc sử dụng lá, tâm Sen trong điều trị bệnh ngày càngtrở nên phổ biến Thế nhưng các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học,cũng như các phương pháp định tính, định lượng các chất chính có trong lá, tâm Senbằng các phương pháp phân tích hóa lý hiện còn rất hạn chế Do đó, việc nghiêncứu thành phần hóa học alkaloid, flavonoid và thiết lập các chất đối chiếu phục vụcho việc định tính, định lượng alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học trong lá, tâmSen Việt Nam là một việc làm cấp thiết

Với những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký để phân tích thành phần alkaloid, flavonoid của lá, tâm Sen và các chế phẩm”

được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu sau:

1 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Senbằng phương pháp sắc ký và phổ nghiệm

2 Thiết lập và xây dựng tiêu chuẩn một số alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học

để dùng làm chất đối chiếu phục vụ cho công tác kiểm nghiệm

.

.

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 THỰC VẬT HỌC VỀ SEN

1.1.1 Chi Nelumbo và vị trí phân loại của chi

Chi Nelumbo thuộc họ Sen- Nelumbonaceae trước đây được xếp cùng với

họ Súng- Nymphaeaceae Tuy nhiên, ngày nay được tách ra riêng thành họ Sen,

với một chi duy nhất là Nelumbo với hai loài Nelumbo nucifera Gaertn., (Sen hồng,

phổ biến ở Việt Nam và một số nước Châu Á như Trung quốc, Ấn độ, Srilanka,

Nhật Bản, Thái Lan, Úc) và Nelumbo lutea Willd (Sen trắng, phổ biến ở

Đông Bắc Mỹ )[1],[8]

Theo hệ thống phân loại APG II năm 2003 và của Amen Takhtajan năm 2009 [14],

vị trí phân loại của chi Nelumbo được trình bày trong Bảng 1.1.

Bảng 1.1 Vị trí phân loại của chi Nelumbo

1.1.2 Cây Sen - Nelumbo nucifera

Loài Sen Nelumbo nucifera Gaertn., có một số đồng danh khác là: Nelumbium nelumbo (L.) Druce, Nelumbium nuciferum Gaertn., Nelumbium speciosum Willd.

Trong tiếng Việt, Sen còn được biết với tên là Sen hồng, Liên Trong tiếng Anh,Sen được gọi với tên thông dụng nhất là lotus nhưng còn được biết với các tên khácnhư Chinese water - lily, Indian lotus, Egypian bean.[3]

Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbo lutea Willd.,

Hình 1.1 Hình ảnh loài Sen hồng và Sen trắng (nguồn: Wikipedia)

.

có gai nhỏ, đính ở giữa phiến lá, mép lá uốn lượn Hoa rất đẹp, rộng tới 20 – 30 cm,màu hồng tím, trắng có mùi thơm Hoa đều, lưỡng tính Lá đài 4 - 5, cánh hoa nhiều,hướng lên và trải ra, nhị nhiều bao phấn hai ô, nứt theo kẽ dọc Nhiều lá noãn chứatrong một đế hoa loe ra thành hình nón ngược gọi là gương Sen, mỗi lá noãn có1-2 tiểu noãn Quả bế màu xanh hình bầu dục, rời nằm sâu trên gương Sen chứa

15 - 25 quả bế, chứa một hạt không nội nhũ

Hạt màu trắng, dài 1,3 - 1,5 cm, phần ngoài mỏng và cứng, màu lục tía, phần giữamềm chứa tinh bột màu trắng ngà và bên trong là lá mầm dầy có màu xanh sẫm(tâm Sen) Tâm Sen gồm rễ mầm, thân mầm, chồi mầm và 2 lá đầu tiên; rễ mầmkhông rõ; thân mầm màu xanh, dài 3 - 4 mm, tiết diện bầu dục, nhẵn bóng, 2 láđầu tiên, 1 to, 1 nhỏ, cuống lá mầm màu xanh, hình móc câu, tiết diện đa giác, dài1,8 - 2 cm, phiến lá mầm hai mép cuộn vào giữa tạo thành một đoạn dài 6-7 mm

Các loài trong chi Nelumbo có hoa giống với các loài hoa Súng trong họ

Nymphaeaceae (họ Súng) Tuy nhiên, lá của các loài Sen có thể phân biệt được với

lá của các loài trong họ Súng do có hình khiên (lá tròn), trong khi đó Nymphaeaceae

có vết khía hình chữ V đặc trưng từ mép lá vào tâm của lá Quả ở trung tâmchứa hạt của các loài cũng có đặc trưng phân biệt và được gọi là bát Sen [1],[3],[7],[8]

1.1.2.2 Sinh thái - phân bố

Trong thời kỳ cổ đại, Sen đã từng là loại cây mọc phổ biến dọc theo bờ sông Nile ở

Ai Cập cùng với một loài hoa súng có quan hệ họ hàng gần gũi có tên gọi dài dòng

là hoa Sen xanh linh thiêng sông Nile (Nymphaea caerulea) Từ Ai Cập, Sen đã

được đem đến vùng lãnh thổ Assyria và sau đó được trồng rộng rãi khắp các vùng

Ba Tư, Ấn Độ và Trung Quốc

.

Hiện nay, Sen được phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Á, Úc và Châu Mỹ,hiếm hoặc đã tuyệt chủng tại Châu Phi Do ưa khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệtđới, nên Sen cũng được trồng nhiều ở hầu hết các nước khu vựcĐông Nam Á đến Nam Á như: Campuchia, Thái Lan, Malysia, Ấn Độ và các tỉnhphía nam Trung Quốc [3]

Ở Việt Nam, chỉ có một loài mọc hoang dại chủ yếu ở vùng Đồng Tháp Mười thuộctỉnh Đồng Tháp và An Giang Theo nhân dân địa phương cây Sen mọc trong trạngthái tự nhiên đã có từ lâu đời Bên cạnh quần thể hoang dại, Sen cũng là cây trồngquen thuộc ở các tỉnh đồng bằng và trung du, suốt từ Nam đến Bắc, dùng làm thuốc,thức ăn và làm cảnh Sen được trồng nhiều nhất ở Đồng Tháp Mùa hoa: tháng 5 - 6,mùa quả: tháng 7 – 9 [8]

1.1.2.3 Đặc điểm vi học

Lá: Biểu bì trên gồm một lớp tế bào hình chữ nhật nhỏ, mặt ngoài có núm lồi lên,

có lỗ khí Biểu bì dưới giống biểu bì trên, nhưng tế bào dài hơn, vách hóa mô cứng,cutin dày Mô mềm giậu có một lớp tế bào xếp sát biểu bì trên, chạy từ phiến láxuyên qua gân giữa Mô dày góc gồm nhiều tế bào đa giác gần tròn, xếp thành đámsát biểu bì dưới Ở giữa gân có 2 bó libe gỗ to, những bó libe gỗ nhỏ xếp rải rácxung quanh Mỗi bó libe gỗ có sợi bao bọc, gỗ phía trên, libe phía dưới, bao quanh

là 1- 2 lớp tế bào hình đa giác, kích thước nhỏ, hóa mô cứng thành vòng [7]

Bột dược liệu

Bột lá Sen: có màu lục nhạt, soi kính hiển vi quan sát thấy các đặc điểm sau [6]:Mảnh biểu bì trên gồm nhiều tế bào hình nhiều cạnh, kích thước không đều, màng ítngoằn ngoèo, mang lỗ khí ở dạng biến thiên Màng phía ngoài biểu bì có nhiều númlồi lên Núm nhìn phía dưới mặt là những vòng tròn nhò, rải rác có những núm bịtách khỏi biểu bì, hình ba cạnh hay hình chuông Mảnh biểu bì dưới gồm tế bàomàng ngoằn ngoèo Sợi màng hơi dày, khoang rộng kèm mảnh mạch Mảnh mạchvạch, mạch xoắn, mạch mạng Tinh thể calci oxalat hình cầu gai, đường kính 20- 36

µm Mô mềm chứa diệp lục Bột tâm Sen: Bột màu vàng xanh, mảnh mô mềm chứa

hạt tinh bột Hạt tinh bột hình cầu hoặc hình trứng, đường kính 4- 6 µm [2],[7]

.

1.1.2.4 Bộ phận dùng – thu hái và chế biến

Tất cả các bộ phận dùng của cây Sen đều có giá trị sinh học cao, được dùng làmthuốc trong y học cổ truyền và được đưa vào Dược điển một số nước [7],[8]

Lá Sen (Folium Nelumbinis): lá bánh tẻ, thu hái vào mùa thu, bỏ cuống, phơi khô Quả (Fructus Nelumbinis): thu hái lúc quả chín (liên thạch), hạt còn màng

đỏ bên ngoài (liên nhục) Tâm Sen (Plumula Nelumbinis): chồi mầm trong hạt Sen (liên tâm) Gương Sen (Receptaculum Nelumbinis): đã lấy quả đem phơi khô (liên phòng) Tua Sen (Stamen Nelumbinis): bỏ hạt gạo ở đầu, phơi khô (liên tu) Thân rễ (Nodus Nelumbinis rhizomatis) còn gọi là liên ngẫu hay ngó Sen,

thu hái quanh năm

1.2 HÓA HỌC VỀ SEN

1.2.1 Hóa học của lá Sen

Lá Sen chứa nhiều hợp chất khác nhau trong đó nhóm alkaloid và flavonoid đượcxem là hai thành phần chính chiếm tỉ lệ tương đối lớn và cho tác dụng sinh họcchủ yếu Ngoài ra, các hợp chất khác như: tanin, saponin, đường khử, các acidhữu cơ (acid palmitic, acid citric, acid tartric, acid succinic, acid ascorbic,…),

các terpen steroid (β-sitostenon, stigmasta-4,22-dien-3-on,…), các tinh dầu trans-caryophyllen, trans-isolimonen, 4-methyl-1-isopropyl-3-cyclohexen-1-ol,camphor, 2-acetylen-1-alcohol, chất béo, sáp, chất nhày cũng được tìm thấy trong

Alkaloid khung aporphin: các alkaloid có cấu trúc aporphin chiếm phần lớn về tỉ lệ

cũng như số lượng trong alkaloid toàn phần của lá Sen Các alkaloid đã biết thuộcnhóm này được trình bày ở Bảng 1.2

.

Bảng 1.2 Các alkaloid khung aporphin có trong lá Sen[7], [8],[10], [114], [117]

Alkaloid khung proaporphin: alkaloid thuộc nhóm này chỉ có một alkaloid là

pronuciferin (C19H21NO3) Chất này có thể chuyển thành nuciferin trongmôi trường acid.[17], [43]

Alkaloid khung benzylisoquinolin: alkaloid thuộc nhóm này trong lá Sen được biết

với 04 alkaloid điển hình là armepavin, N-norarmepavin, N-methyl coclaurin

Alkaloid khung bisbenzylisoquinolin: alkaloid thuộc nhóm này trong lá Sen được

biết với neferin, isoliensinin với hàm lượng thấp Cấu trúc hai chất này được trìnhbày ở Bảng 1.5[7]

N H

Ngoài ra, trong lá Sen còn có cepharadion B và lysicamin [114]

Liriodenin Lysicamin Cepharadion B

Tính chất của một số alkaloid chính trong lá Sen [114], [116]

Nuciferin: dạng base, là tinh thể hình lăng trụ không màu, tnc: 163-164 oC,góc quay cực ở 27o là +145 o (c = 0,67 %; EtOH), phát huỳnh quang xanh lục sáng

ở 245 nm Phổ UV có ba cực đại hấp thu trong dung môi EtOH lần lượt là

311 nm, 271 nm và 232 nm với giá trị logɛ lần lượt là 3,83; 4,32 và 4,36

N-nornuciferin: dạng base là một chất lỏng như dầu, dạng muối chlorid là tinh thể

không màu, tnc: 156 – 157 oC, góc quay cực ở 27 o là +144 o (c = 0,5 %; EtOH) Phổ

UV có ba cực đại hấp thu trong dung môi EtOH lần lượt là 311 nm, 271 nm, 230

nm với giá trị logɛ lần lượt là 3,67; 4,43 và 4,37

N-norarmepavin: kết tinh ở dạng muối oxalat là tinh thể hình kim không màu,

tnc: 209 – 210 o C, αD27= + 20 o (c= 0,2 %; MeOH) Phổ UV có ba cực đại hấp thu

trong dung môi EtOH lần lượt là 254 nm, 283 nm, 227 nm

1.2.1.2 Thành phần flavonoid

Hàm lượng flavonoid toàn phần của lá Sen từ 0,67-0,89 % có khi lên đến1,64 % tùy theo điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng Có khoảng 16 flavonoid đã đượcxác định trong lá Sen Flavonoid trong lá Sen thuộc các nhóm flavonol, flavon,catechin, leucoanthocyanidin, trong đó hàm lượng cao nhất được tìm thấy là

quercetin 3-O-β-D-glucuronid [7], [8]

Nhóm flavonol: Chiếm tỉ lệ lớn trong các flavonoid với hàm lượng nhiều hơn của

các aglycon như: myricetin, quercetin, kaempferol, isorhamnetin và các glycosid

với đường glucosyl, rhamnosyl như: myricetin 3-O-β-D-glucopyranosid, quercitrin,

isoquercitrin, hyperin, rutin, kaempferol 3-O-β-D-glucosepyranosid,

.

isorhamnetin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl, isorhamnetin 3-O-β-D-glucopyranosid, isorhamnetin 3-O-α-D-lyxopyranosyl-O-β-D-glucopyranosid.[7], [99], [118], [39]

Nhóm flavon: Các dẫn chất flavon chiếm tỉ lệ nhỏ với hàm lượng thấp của luteolin

và luteolin O-β-D- glucopyranosid [109]

Nhóm catechin: Các dẫn chất catechin điển hình là catechin [7], [29], [39]

Nhóm leucoanthocyanidin: Các dẫn chất leucocyanidin điển hình là

leucodelphenidin, leucocyanidin chiếm hàm lượng rất thấp trong lá Sen [7]

1.2.2 Hóa học của tâm Sen

Hầu hết các nghiên cứu về thành phần hóa học của tâm Sen đều tập trung vào cácalkaloid, là thành phần chính chiếm tỉ lệ lớn và được cho là có nhiều tác dụng sinhhọc nhất trong tâm Sen Chỉ có một vài công trình nghiên cứu về thành phầnflavonoid và các chất khác trong tâm Sen như: asparagin, tanin, triterpen,đường khử, các acid hữu cơ [7], [8]

1.2.2.1 Thành phần alkaloid của tâm Sen

Tâm Sen có hàm lượng alkaloid toàn phần khoảng từ 0,85 - 0,96 % và thay đổitheo điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng Có khoảng 12 alkaloid được biết trong tâm Sen,bao gồm các alkaloid khung bisbenzylisoquinolin, tetrahydroisoquinolin,benzylisoquinolin, aporphin, proaporphin Hàm lượng alkaloid cao nhất trong tâmSen, được tìm thấy là isoliensinin hoặc neferin tùy vùng khí hậu và thổ nhưỡng[7],[8]

Alkaloid khung benzylisoquinolin: Các alkaloid thuộc nhóm này được trình bày

Tính chất của một số alkaloid phân lập từ tâm Sen [34],[36],[110]

Neferin: Công thức phân tử: C38 H44N2O6 Khối lượng phân tử: 624,77 Bột kết tinhmàu trắng, tnc: 60 – 61 oC Góc quay cực: -100 o (c = 0,24 %; MeOH).

Neferin dạng base tan nhiều trong dung môi hữu cơ kém phân cực, kém tantrong nước, max: 282 nm (MeOH)

Liensinin: Công thức phân tử: C37H42N2O6 Khối lượng phân tử: 610,74 Dạng rắnmàu trắng vô định hình, tnc: 95 – 99 o C Góc quay cực: +15,85 o (c = 0,88 %;

aceton) Liensinin dạng base tan nhiều trong dung môi hữu cơ kém phân cực,kém tan trong nước, max: 278 nm (MeOH)

Isoliensinin: Công thức phân tử: C37H42N2O6 Khối lượng phân tử: 610,74.Dầu không màu hoặc tinh thể vàng nhạt tnc: 69 – 71 oC Góc quay cực: +50,68 o

(c = 0,30 %; aceton) Isoliensinin dạng base tan nhiều trong dung môi hữu cơ

kém phân cực, kém tan trong nước, max: 284 nm (MeOH)

.

1.2.2.2 Thành phần flavonoid

Cho đến nay, mới chỉ có một vài nghiên cứu về thành phần flavonoid trong tâm Sen.Các flavonoid được biết trong tâm Sen thuộc nhóm flavonol (rutin, kaempferol,

hyperin) và nhóm catechin (catechin) [16],[24]

1.3 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC THÀNH PHẦN ALKALOID VÀ FLAVONOID TRONG LÁ, TÂM SEN

Đã có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới về chiết xuất và phân lập cácalkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, từ những kỹthuật đơn giản đến phức tạp, như được trình bày trong Bảng 1.6

Bảng 1.6 Tóm tắt các nghiên cứu về chiết xuất phân lập alkaloid, flavonoid trong

lá và tâm Sen

Phân lập alkaloid từ lá Sen loài Nelumbo lutea Willd.

Nuciferin, armepavin,

N-norarmepavin, N-nornuciferin

Phân lập nuciferin và N-nornuciferin

bằng sắc ký cột cổ điển (pha tĩnh: alumina trung tính, pha động: benzen- aceton).

Phân lập (-)-N-norarmepavin bằng 2

phương pháp: kết tinh dưới dạng muối oxalat và sắc ký cột (pha tĩnh: alumina trung tính, pha động: aceton- methanol) Phân lập được (±)-armepavin bằng sắc

ký lớp mỏng chế hóa kết hợp sắc ký cột

với điều kiện sắc ký như phân lập

(-)-N-norarmepavin.

Phân lập alkaloid từ lá Sen loài Nelumbo nucifera Gaertn.

3 [63] Nuciferin, nor-nuciferin, roemerin Sắc ký cột cổ điển pha thuận

5 [46] Pronuciferin, liriodenin, annonain,

demethyl coclaurin

Sắc ký cột cổ điển pha thuận

Sắc ký lớp mỏng điều chế với bản mỏng silica gel G và hệ dung môi khai triển toluen-aceton-cồn tuyệt đối-amoniac (45:45:7:3)

8 [99] (R)-Coclaurin, N-methyl coclaurin,

(S)-Norcoclaurin

Sắc ký cột với với các loại pha tĩnh khác nhau: Dianion HP20, Sephadex LH- 20, MCI-gel CHP20P Hệ dung môi rửa giải

.

Nuciferin, liriodenin, 2-hydroxy-1-methoxyaporphin, pronuciferin, dehydroroemerin, dehydronuciferin, roemerin

Kết hợp phương pháp chiết phân bố, nhựa trao đổi ion và sắc ký cột cổ điển

Nuciferin, dehydronuciferin,

N-nornuciferin, O-nornuciferin,

roemerin,

Chiết bằng lưu chất siêu tới hạn CO 2

(2 giờ, 70 o C, áp suất 30 Mpa)

cơ trên như là chất lưu giữ và HCl 5 mM vào pha nước như là chất rửa giải.

cơ trên như là chất lưu giữ (retainer),

và HCl 5 mM vào pha nước như

là chất rửa giải

Phân lập flavonoid từ lá Sen loài Nelumbo nucifera Gaertn.

1 [119] Quercetin, myricetin,

kaemferol-3O-glc, isoquercitrin, luteolin 7-O-glc Sắc ký cột cổ điển

2 [82] Isoquercitrin, hyperosid, astragalin.

HPLC điều chế với cột Symmetry Prep C18, pha động: nước-acetonitril, tốc độ dòng 5 mL/phút

3 [66] Catechin, quercetin, isoquercitrin,

hyperosid, rutin, astragalin. Sắc ký cột cổ điển pha thuận

Isoquercitrin: 6 mg (96 %) Hyperosid: 9,1 mg (97,5 %) Astragalin: 3 mg (98,3 %)

HSCCC: Hệ thống hai pha EtOAc- MeOH- H 2 O (1:5:1:5) Xác định

n-hexan-độ tinh khiết bằng HPLC/PDA

5 [78] Quercetin 3-O-D-GlcA, rutin Sắc ký cột cổ điển pha thuận

6 [81] Quercetin 3-O-D-GlcA: 6,1 mg HSCCC: Hệ thống hai pha

.

(97 %) Astragalin: 20,2 mg (95,4 %)

Phân lập alkaloid từ tâm Sen loài Nelumbo nucifera Gaertn.

1 [18] Liensinin, kết tinh dưới dạng

muối liensinin perchlorat

Sắc ký cột cổ điển pha thuận

2 [61] Isoliensinin, kết tinh dưới dạng

muối isoliensinin HCl

Sắc ký cột cổ điển pha thuận

3 [32] Nuciferin, pronuciferin, lotusin Phương pháp chiết phân bố lỏng- lỏng

kết hợp sắc ký cột pha thuận cổ điển

4 [35] Lotusin, demethyl coclaurin Dịch chiết n-butanol được nạp lên cột trao

đổi cation Amberlit CG-50

5 [85] Isoliensinin, neferin,

methylcorypallin

Chiết phân bố lỏng - lỏng kết hợp sắc ký cột pha thuận cổ điển dùng pha tĩnh Al 2 O 3 với hệ dung môi benzen - chloroform

Lotusin, nuciferin, neferin, pronuciferin, liensinin và isoliensinin

Chiết phân bố lỏng - lỏng kết hợp sắc ký cột pha thuận cổ điển

7 [114] Liensinin perclorat và

isoliensinin hydroclorid.

Chiết phân bố lỏng - lỏng kết hợp sắc ký cột pha thuận cổ điển

8 [95] Neferin, isoliensinin Sắc ký cột nhanh (FC) pha tĩnh silica gel,

hệ dung môi: benzen- EtOAc-TEA (7:2:1)

Liensinin (100 mg), isoliensinin (95 mg), neferin (350 mg) với độ tinh khiết trên

95 %

Sắc ký ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) với

hệ dung môi hai pha sử dụng EtOAc-CCl 4 MeOH-H 2 O (1:6:4:1)

-10 [54] Neferin với độ tinh khiết

12 [106] Neferin, liensinin, isoliensinin Sắc ký cột trao đổi ion trên 3 loại nhựa

(AKS-W, AB-8 và H21)

.

13 [56] Neferin, liensinin, isoliensinin Chiết hỗ trợ vi sóng dựa trên chất lỏng ionic

14 [57] Liensinin, isoliensinin, neferin Tinh khiết hóa dịch chiết tâm Sen qua 2 cộttrao đổi ion AKS –W và D72

ethanol 50 %

16 [87] Pronuciferin Chiết bằng lưu chất siêu tới hạn CO2 kết hợp

sắc ký cột cổ điển

pha thuận cổ điển

Neferin (58,4 mg), liensinin (18,4 mg), isoliensinin (19,6 mg)

Sắc ký ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) với

hệ dung môi hai pha:

n-hexan-EtOAc-MeOH- H 2 O (5:8:4:5)

Liensinin (118 mg), isoliensinin (151 mg), neferin (572 mg, độ tinh khiết trên

95 %)

Sắc ký ngược dòng tốc độ cao, hệ dung môi hai pha n-hexan-EtOAc-MeOH-H2 O (5:5:2:8) với pha hữu cơ thêm triethylamin

10 mM và pha nước thêm HCl 5 mM.

(Nelumbo nucifera Gaertn.):

Chiết xuất các cao alkaloid, flavonoid toàn phần

- Thu alkaloid toàn phần: hầu hết các nghiên cứu đều tiến hành chiếtnguyên liệu Sen ban đầu theo phương pháp cổ điển là chiết ngâm lạnh, ngấmkiệt hoặc chiết hồi lưu (HRE) với MeOH, EtOH (70 – 96 %) hoặc với cồn acid

để thu alkaloid toàn phần dạng muối, sau đó tiến hành kiềm hóa (NH4OH,

NaOH) và chiết phân bố với chloroform, ether, n-butanol và cô dưới áp suất

giảm Một số trường hợp làm ẩm dược liệu với kiềm (NH4OH) và chiết trực tiếpbằng dung môi hữu cơ để thu alkaloid toàn phần dạng base

- Thu flavonoid toàn phần: thường được chiết bằng MeOH, EtOH (70 – 96 %)hoặc có thể tẩm nguyên liệu với H2SO4 2 % sau đó chiết với EtOAc để thu đượchầu hết các dạng của flavonoid Sau đó làm bay hơi MeOH (cồn) hay EtOAc

để thu được cao đặc

- Một số nghiên cứu đã áp dụng các phương pháp chiết hiện đại hơn nhằmcải thiện hiệu suất chiết, rút ngắn thời gian chiết cũng như thu những phân đoạnchứa alkaloid hay flavonoid sạch hơn như:

.

o Chiết bằng lưu chất siêu tới hạn [87],[46]

Phân lập các alkaloid, flavonoid từ cao toàn phần

Sau khi thu được các alkaloid, flavonoid toàn phần, nhiều phương pháp đã được

áp dụng cho việc phân lập các thành phần chính này trong đó phương pháp sắc kýđược sử dụng phổ biến với các loại pha tĩnh khác nhau như: silica gel, SephadexLH-20, Diaion HP-20, trao đổi ion, silica gel pha đảo,… với các hệ dung môitriển khai khác nhau từ phân cực trung bình đến phân cực

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID TRONG LÁ VÀ TÂM SEN.

Để phân tích thành phần alkaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen phương phápphân tích thể tích, sắc ký lớp mỏng, UV-Vis đến các phương pháp hiện đại hơn nhưsắc ký lỏng hiệu năng cao với các loại đầu dò khác nhau hay phương pháp điện dimao quản đã được áp dụng và được trình bày trong Bảng 1.7

Bảng 1.7 Tóm tắt các nghiên cứu định tính và định lượng alkaloid, flavonoid trong

lá và tâm Sen

Định tính và định lượng alkaloid trong lá Sen loài Nelumbo nucifera

1 [2] Alkaloid toàn phần Phương pháp chuẩn độ thể tích acid –base

Phương pháp SKLM- mật độ quang kế

- Silica gel GF 254 có chứa NaOH 0,5 %

- Hệ dung môi CHCl 3 - EtOAc-MeOH-H 2 O (30:40:20:10)

Nuciferin, Roemerin

Áp dụng để kiểm soát chất lượng nguyên liệu

quercetin, rutin, quer

Áp suất đầu phun: 45 psi

Định tính và định lượng alkloid tâm Sen loài Nelumbo nucifera

.

- Nhiệt độ cột: 40 o C; tốc độ dòng: 1 mL/phút

Phương pháp HPLC tạo cặp ion

- Khí khô N 2 ở 300 o C, kiểu positive

8 [93] Nuciferin, rutin, hyperosid

Điện di mao quản với đầu dò điện hóa

- Cột mao quản dài 52 cm, đường kính trong 25 µm

- Điện thế: 15 kV

- Dung dịch đệm: Na 2 B 4 O 7 50 mM và NaH 2 PO 4 100 mM (pH = 7,25)

- Giới hạn phát hiện của nuciferin, rutin, hyperosid lần lượt là 0,02; 0,05 và 0,04 μg/mL

Kiểm soát hàm lượng ba alkaloid có trong các bài thuốc dân gian.

- Pha động: H 2 O-ACN (46∶54) pH 11 điều chỉnh bằng ethylendiamin)

- Sử dụng nội chuẩn tetrahydropalmatin

13 [94] Lotussin, liensinin,

isoliensinin, neferin

Phương pháp điện di mao quản vùng

- Dung dịch đệm natri acetat 80 mM và ammonium acetat 40 mM trong MeOH (pH 5,4)

- Dùng chuẩn nội ephedrin, LOD: 1,5 ppm

Định tính và định lượng flavonoid trong tâm Sen loài Nelumbo nucifera

14 [19] Định lượng catechin, rutin,

kaempferol, hyperin

- Phương pháp MEKC, đầu dò điện hóa

- Hệ đệm borat 60 mM (pH 8,0) chứa SDS

20 mM Điện thế: 16 kV Giới hạn phát hiện: 6,90 x 10 -8 g/mL.

Qua các tài liệu nghiên cứu phân tích định tính, định lượng các alkaloid, flavonoid

có trong lá, tâm Sen trên nhận thấy:

Phân tích định tính

Từ phản ứng hóa học với các thuốc thử đặc trưng để định tính alkaloid vàflavonoid toàn phần, đến việc ứng dụng kỹ thuật SKLM cho việc sơ bộ định tínhtừng thành phần riêng lẻ dựa vào Rf

Kỹ thuật HPLC với thông số thời gian lưu (tR) và kỹ thuật điện di mao quản vớithông số thời gian di chuyển (tM ) cũng đã được sử dụng như một giá trị định tínhcho mỗi chất trong cùng điều kiện sắc ký hay điện di xác định

Thêm vào đó, một số công bố đã sử dụng đầu dò khối phổ (MS) ghép nối với hệthống sắc ký lỏng, giúp định tính mỗi alkaloid, flavonoid có trong các nền mẫuphức tạp (tâm và lá Sen) với độ nhạy, độ chính xác và tính đặc hiệu cao hơnthông qua việc xác định số khối đặc trưng của mỗi chất

Tuy nhiên, chưa có công trình sử dụng phương pháp điện di mao quản ghép nốiđầu dò khối phổ để định tính alkaloid, flavonoid với độ nhạy, tính đặc hiệu,

độ chính xác cao cho một lượng nhỏ mẫu phân tích ban đầu (10-20 nL)

.

Phân tích định lượng

Phương pháp chuẩn độ thể tích acid – base có tính chọn lọc, độ chính xác,

độ nhạy kém như đã được một vài tác giả ứng dụng để định lượng alkaloidtoàn phần có trong lá Sen qui về nuciferin hay tâm Sen qui về neferin

Phương pháp bán định lượng như TLC-scanning cũng đã được ứng dụng đểđịnh lượng neferin và isoliensinin trong tâm Sen hay nuciferin trong lá Sen, phươngpháp này có cải thiện về độ nhạy và tính đặc hiệu nhưng độ chính xác vẫn thấp.Phần lớn các nghiên cứu còn lại các tác giả đều sử dụng phương phápHPLC/PDA hay LC/PDA/ESI-MS để định lượng các alkaloid, flavonoid trong lá vàtâm Sen Việc xây dựng qui trình định lượng đồng thời một vài alkaloid, flavonoidtrong lá, tâm Sen bằng LC/PDA/MS đảm bảo gần như hoàn toàn các yêu cầu về độnhạy, tính đặc hiệu, độ chính xác, độ đúng Tuy nhiên, với yêu cầu định lượng đồngthời từ sáu thành phần trở lên trong nền mẫu phức tạp như dịch chiết lá, tâm Sen thìphương pháp LC sẽ gặp nhiều khó khăn trong việc xử lý mẫu nếu không sử dụng

hỗ trợ kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) nhằm cải thiện tốt độ phân giải giữa các pic,nhưng ngược lại độ chính xác, tỉ lệ phục hồi của qui trình định lượng cũng

bị giảm theo Do đó, phương pháp điện di mao quản được áp dụng để cải thiện độphân giải do cơ chế tách chủ yếu dựa vào điện tích của các chất Thêm vào đó,phương pháp này có thể tách tốt các đồng phân, tiêu tốn lượng rất nhỏ dung môi,mẫu phân tích và thời gian phân tích nhanh mà vẫn thỏa mãn những yêu cầu về tínhđặc hiệu, độ chính xác và độ đúng nên đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứuđịnh lượng alkaloid, flavonoid có trong lá tâm Sen trong những năm gần đây Tuy nhiên, hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào ứng dụng kỹ thuậtCE/PDA/MS để định tính và định lượng alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen đểtăng độ nhạy, tính đặc hiệu Đây là một trong mục tiêu mà nghiên cứu trong luận án

sẽ hướng tới

.

1.5 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SEN

1.3.1 Tác dụng sinh học của lá Sen

Tác dụng trên lipid máu

Hiệu quả cải thiện bệnh tăng lipid máu ở người uống dịch chiết nước lá Sen:

Kết quả cho thấy dịch chiết nước lá Sen có hiệu quả rất tốt trong việc giảm lipidmáu ở nhóm dùng thuốc mà không có tác dụng phụ nào [33]

Hiệu quả chống béo phì của dịch chiết nước lá Sen ở chuột Dịch chiết lá Sen làm

ức chế hoạt động của men α-amylase và lipase; điều hòa tăng chuyển hóa lipidthông qua UCP3 mRNA [103]

Dịch chiết nước lá Sen giàu polyphenol làm giảm xơ vữa động mạch [38]

Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng sốt rét

Quercetin có trong dịch chiết lá Sen có tác dụng kháng khuẩn [125]

Tác dụng kháng sốt rét và kháng nấm của (R)-roemerin và N-methylasimilobin trong lá Sen Tác dụng kháng ký sinh trùng sốt rét của N-methyl asimilobin và (R)-roemerin được tìm thấy ở nồng độ IC50 lần lượt là 0,2 và 4,8 mg/mL [86]

Tác dụng chống oxy hóa: Hiệu quả chống oxy hóa của flavonoid trong lá Sen.

Dịch chiết methanol được tách làm ba phân đoạn: ethyl acetat, n-butanol và nước.

07 flavonoid được phân lập từ phân đoạn nước (catechin, quercetin, quercetin β-D-glc, quercetin 3-O-β-D-gal, quercetin 3-O-β-D-GlcA, kaempferol 3-O- β-D-glc, myricetin 3-O- β-D-glc) có hiệu lực ức chế sự oxy hóa LDL[128]

3-O-Tác dụng kháng HIV: 3-O-Tác dụng kháng HIV của alkaloid từ dịch chiết lá Sen

Nelumbo nucifera Thử nghiệm cho thấy các alkaloid (+)-1-(R)-coclaurin và (S)-norcoclaurin có tác dụng kháng HIV rõ rệt Các alkaloid khung

(-)-1-benzylisoquinolin, aporphin và bisbenzyl isoquinolin khác bao gồm liensinin,neferin, isoliensinin và nuciferin cũng có hiệu lực kháng HIV [99]

Tác dụng trên đường huyết: Dịch chiết lá Sen và thành phần catechin kích thích

tiết insulin Trong đó quercetin glucuronid và quercetin

3-O-β-D-glucopyranosid được xác định là những chất đánh dấu sinh học có vai trò chínhtrong tác dụng này[128]

.

Nuciferin kích thích sự tiết insulin từ tế bào beta - so sánh với glibenclamid.

Kết quả cho thấy nuciferin có tác dụng kích thích sự tiết insulin, làm giảm hàmlượng glucose trong máu So sánh với glibenclamid cho thấy nuciferin có tác dụngtăng tiết insulin mạnh hơn và an toàn hơn cho tế bào beta [65]

Tác dụng trên tim mạch: Lá Sen có tác dụng bảo vệ đối với các rối loạn nhịp tim

gây nên do calci clorid, làm giảm số chuột chết và chuột bị rung tâm thất.Liều 400 mg/kg/ngày cho tác dụng tốt đối với loạn nhịp do isoproterenol[67]

Tác dụng kháng ung thư: Dịch chiết lá Sen giàu flavonoid ức chế sự tăng sinh tế

bào ung thư vú in vitro và in vivo Các polyphenol được xác định trong dịch chiết

lá Sen bao gồm acid gallic, rutin, quercetin đáp ứng tốt với các tế bào MCF-7 [64]

Tác dụng bảo vệ gan: Dịch chiết lá Sen giàu flavonoid cải thiện sự hư hại gan trên

in vivo gây bởi chế độ ăn chứa nhiều chất béo Sự bổ sung dịch chiết lá Sen giúp cải

thiện một cách hiệu quả sự hư hại trong chuyển hóa lipid gây bởi chế độ ăn nhiềuchất béo, làm giảm sự tích tụ lipid ở gan giúp bảo vệ gan và hạ lipid trong máu [52]

1.3.2 Tác dụng sinh học của tâm Sen

Tác dụng của neferin, isoliensinin và liensinin

Trên đường huyết: Neferin kích thích sự nhạy cảm insulin ở chuột kháng insulin [96].Neferin được chứng minh có hiệu quả tương tự rosiglitazon trong việc làm giảmnhanh lượng glucose huyết, insulin huyết, triglycerid và kích thích sự nhạy insulintrên chuột kháng insulin một cách rõ ràng

Tác động hạ đường huyết và hạ lipid huyết Neferin (10 mg/kg) và dịch chiết tâm

Sen (500 mg/kg) được sử dụng qua đường uống có khả năng hạ đường huyết và

hạ lipid huyết ở mô hình thử nghiệm[129]

Tác dụng trên tim mạch: Neferin có hiệu quả trên hoạt động điện tim ở mèo.

Kết quả neferin và quinidin có hiệu quả tương tự trên hoạt động điện tim [49]

Neferin có hiệu quả trên sự kết tập tiểu cầu liên quan đến sự điều hòa cân bằng TXA2/PGI2, cAMP/cGMP [100]

Trên thần kinh trung ương: Ảnh hưởng của dịch chiết tâm Sen và neferin lên hệ

thần kinh trung ương trên chuột thử nghiệm Neferin, alkaloid chính trong dịch

chiết methanol từ tâm Sen có tác dụng ức chế trung tâm vận động [104]

.

Trên huyết học: Hiệu quả của liensinin trên huyết động học của chuột.

Tác dụng chống loạn nhịp của liensinin trên huyết động học tương tự verapamin vàtốt hơn quinidin [130] Alkaloid trong dịch chiết ethanol từ tâm Sen như (S)- armepavin, pronuciferin, liensinin, isoliensinin, cinnamoyl-4-(2-aminoethyl) phenol

có tiềm năng rất lớn cải thiện thực nghiệm viêm tiểu cầu thận hình liềm tự miễn[91]

Tác dụng chống oxy hóa: Khả năng chống oxy hóa và dập tắt gốc tự do.

Các polyphenol trong tâm Sen có hoạt tính ức chế tác dụng của DPPH, là chất sinhgốc tự do [131]

1.6 CÔNG DỤNG CỦA SEN

Sen từ lâu đã được Đông Y sử dụng như là một vị thuốc chữa được nhiều bệnh,

có rất nhiều bài thuốc từ Sen được ghi trong các y văn cổ xưa và được truyền trongnhân gian cho đến hôm nay Tâm Sen (Liên tâm) vị đắng tính lạnh vào kinh tâm cótác dụng thanh tâm, hạ nhiệt chữa băng huyết, thổ huyết, di tinh, mộng tinh,mất ngủ Lá Sen (Liên diệp) có vị đắng, tính mát, vào 3 kinh can, tì, vị có tác dụngthanh thử, lợi thấp, tán ứ, chỉ huyết, thủy chí phù thũng, lôi đầu phong Hạt Sen(Liên nhục) có vị ngọt, tính bình vào 3 kinh tâm, tỳ, thận có tác dụng bổ tì,dưỡng tâm, chữa di tinh mất ngủ, thần kinh suy nhược Hoa Sen (Liên hoa, Hà hoa)

vị ngọt đắng, tính ấm có tác dụng an thần, cầm máu Gương Sen (Liên phòng)

vị chát, tính mát, có tác dụng cố sáp, cầm máu Ngó Sen (Liên ngẫu) vị ngọt, tínhmát, bổ âm, an thần Tua nhị đực của hoa Sen (liên tu) chữa băng huyết thổ quyết,

di mộng tinh[7]

Một số bài thuốc Đông Y có chứa tâm Sen:

Chữa tiểu đường: tâm Sen 8 g, thạch cao sống 20 g, các vị Sa sâm, Mạch môn,Thiên môn, Thạch học, hoài sơn sống, Ý dĩ sống 12 g sắc uống hàng ngày

Chữa suy nhược cơ thể ở người có bệnh đường hô hấp, viêm phế quản mãn tính, lao:tâm Sen 10 g, Đan bì, Ý dĩ, Sinh địa, Bạch thược, Đảng sâm, mỗi vị 12 g; Qui bản,Mạch môn, Ngũ vị tử, mỗi vị 10 g; Trần bì, chích cam thảo mỗi vị 6 g, đại táo 4 quả.Sắc uống, ngày uống 1 thang

Một số bài thuốc Đông Y có chứa lá Sen:

Trị mất ngủ: lá Sen liều 15-20 g/ngày, dạng thuốc sắc uống.

.

Khử ứ tán huyết: lá Sen tươi 80 g, Trắc bá diệp 16 g, Ngải diệp sao đen 12 g,

Sinh địa 40 g Ngày dùng 15-20 g dưới dạng thuốc sắc hoặc hoàn tán [7]

1.7 CHẤT ĐỐI CHIẾU (CĐC)

1.7.1 Mục đích sử dụng chất đối chiếu hóa học

Theo ISO 13528 [41] CĐC hoá học được sử dụng vào bốn mục đích chính:

- Thẩm định phương pháp và độ không chắc chắn của một phép đo

- Xác minh khả năng áp dụng đúng đắn của một phương pháp

- Hiệu chuẩn thiết bị

- Kiểm tra chất lượng và đảm bảo chất lượng

Trong lĩnh vực kiểm tra chất lượng thuốc, các phương pháp phân tích trong cácDược điển hiện hành có yêu cầu chất đối chiếu hoá học trong các phép thử sau:

- Định tính: phản ứng hóa học, phổ hồng ngoại, quang phổ, sắc ký lớp mỏng

- Thử tạp chất liên quan: các phương pháp sắc ký, quang phổ

- Định lượng: sắc lỏng hiệu năng cao, quang phổ

- Hiệu chuẩn thiết bị phân tích: hệ thống LC hay GC, hệ thống quang phổ

- Thẩm định qui trình phân tích, thẩm định phương pháp

- Trong đo lường: hiệu chuẩn pH, hiệu chuẩn độ hoà tan

- Đánh giá thử nghiệm thành thạo

1.7.2 Thiết lập chất đối chiếu

1.7.2.1 Thiết lập chất đối chiếu gốc (PCRS)

Quy trình thiết lập PCRS gồm các bước như đánh giá nhu cầu và mục đích sử dụng,lựa chọn nguyên liệu, xây dựng phương pháp kiểm nghiệm, xác định hàm lượng,đóng gói - phân phối, thực hiện theo tài liệu hướng dẫn do WHO ban hành [123] Tùy vào mục đích sử dụng mà hàm lượng của chất đối chiếu và số lượng phòng thínghiệm tham gia đánh giá khác nhau Với phép thử định tính và thử tinh khiết chỉcần 1 phòng thí nghiệm đạt GLP hoặc ISO/IEC 17025 và hàm lượng có thể chỉkhoảng 90% với phép thử định lượng và hiệu chỉnh thiết bị thì ít nhất là 3 phòngthí nghiệm và hàm lượng là 99,5% hoặc cao hơn

.

Các chất đối chiếu đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sản xuất và đảm bảochất lượng của ngành Dược Nhưng trên thực tế, các PCRS của Anh, Mỹ, Quốc tế,Châu Âu lại quá đắt cho nhu cầu phân tích hay nghiên cứu thường qui Do đó,PCSR được các Hội đồng Dược điển của khu vực, quốc gia hoặc các PTN đạt chuẩnthiết lập trên cơ sở của quy trình thiết lập chất đối chiếu thứ cấp[123]

Lựa chọn phương pháp phân tích để đánh giá PCRS

Các phương pháp lựa chọn để đánh giá các CĐC chia thành 2 nhóm[123]:

- Nhóm các phương pháp định tính: Thường dùng phổ IR Trường hợpkhông có CĐC liên kết hoặc thiếu các dữ liệu về các đặc tính của CĐC, cần phảixác minh nhận dạng chất đó bằng một số kĩ thuật dùng để mô tả đặc tính mộtchất mới, như nghiên cứu tinh thể học, phổ NMR, MS, phân tích nhóm chức vàcác phương pháp khác có thể, để đảm bảo một CĐC được mô tả đặc tính đầy đủ

- Nhóm các phương pháp định lượng: Các phương pháp cần chất CĐC ngoài nhưsắc ký, quang phổ Các phương pháp chỉ phụ thuộc vào tính chất động học nộitại của chất như phương pháp phân tích độ hòa tan của các thành phần rắn trongdung môi, quét nhiệt vi sai

1.7.2.2 Thiết lập chất đối chiếu thứ cấp (SCRS)

- Việc thiết lập SCRS dựa trên PCRS thường được tiến hành do nhu cầu thực tế,khi nguồn PCRS không đủ cung cấp cho nhu cầu sử dụng trong công tác nghiêncứu và đảm bảo chất lượng thuốc Giá trị ấn định (GTAĐ) của SCRS thôngthường được xử lý thống kê từ kết quả của 3 PTN độc lập tham gia thiết lập chấtđối chiếu[41] Một SCRS của khu vực hay quốc gia có thể được coi là chất chuẩngốc để thiết lập chất chuẩn PTN của các PTN hoặc các nhà sản xuất dược phẩm.Trong trường hợp này, các chất chuẩn khu vực hay quốc gia được gọi làchuẩn liên kết

- Theo qui định của ASEAN, chương trình đánh giá lại chất đối chiếu ASEAN(ACRS) được thiết kế để phát hiện các dấu hiệu sớm của quá trình phân hủybằng các kĩ thuật phân tích phù hợp (sử dụng lượng mẫu ít, tiến hành nhanh,

độ nhạy cao) Đối với ACRS tần suất đánh giá lại được qui định như sau:

3 năm đối với CĐC dùng cho phép thử hóa học, 2 năm đối với CĐC dùng cho

.