BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID CỦA LÁ, TÂM SE
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID
CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM
Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
Mã số: 62720410
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh- Năm 2015
Trang 2Công trình được hoàn thành tại:
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Người hướng dẫn khoa học :
1 PGS.TS TRẦN HÙNG
2 PGS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN
Phản biện 1: PGS.TS Trịnh Văn Quỳ
Hội Đồng Dược Điển Việt Nam
Phản biện 2: PGS.TS Trần Việt Hùng
Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương
Phản biện 3: PGS.TS Hoàng Minh Châu
Có thể tìm hiểu luận án tại :
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Khoa học Tổng hợp TP Hồ Chí Minh
- Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
Trang 3CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ
alkaloid trong tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae)”, Tạp chí Y học
Tp.HCM, Tập 15 phụ bản của số 1, 2011, 606 - 611.
lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae) bằng HPLC với đầu dò dãy diod quang”, Tạp chí Y học Tp.HCM, Tập 15
phụ bản của số 1, 2011, 628 - 632
định lượng, định tính điểm chỉ một số alkaloid chính có trong tâm sen Việt Nam (Nelumbo
nucifera Gaertn) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang”, Tạp chí Y học thực hành, số 852+853, 303-307.
dựng qui trình chiết cao chuẩn alkaloid lá sen (Nelumbo nucifera Gaertn)” Tạp chí Y học
thực hành, số 852+853, 315-319.
(2012), “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời quercetin, kaempferol, catechin và
quercetin 3-O-β-D-glucuronid trong lá sen bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA”,
Tạp chí Dược học số 3-2012, 17-21.
Stuppner (2012), “Quantitative determination of phenolic compounds in Lotus (Nelumbo
nucifera) leaves by capillary zone electrophoresis”, Planta Medica, 78, 1796-1799.
Stuppner (2013), “Analysis of alkaloids in Lotus (Nelumbo nucifera) leaves by non
aqueous capillary electrophoresis using ultraviolett and mass spectrometric detection”,
Journal of Chromatography A, 1302, 174-180.
quy trình định lượng đồng thời nuciferin, pronuciferin, o-nornuciferin và isoliensinin trong
lá sen bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA”, Tạp chí Dược học số 5-2013, 27-31.
Stuppner (2013), “Analysis of alkaloids in lotus (nelumbo nucifera gaertn.) embryo by
non-aqueous capillary electrophoresis using ultraviolet and mass spectrometric detection”,
Proceeding of the eighth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, Ho Chi Minh
city, Vietnam, December 4-5, 2013, 316-321
các alkaloid có tác dụng sinh học trong lá sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)” Tạp chí Y học
thực hành, số 944-2014, 49-52.
Trang 4GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1 Đặt vấn đề
Cây Sen (Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae) là
cây thuốc quí, có giá trị sinh cao, đang được sử dụng phổ biếndưới dạng thuốc hay thực phẩm chức năng để điều trị mất ngủ,cao huyết áp, giảm cân, điều hòa đường huyết, Các hoạt tính sinh họcnày đã được chứng minh liên quan đến sự hiện diện của thành phầnalkaloid và flavonoid có trong lá, tâm Sen
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phầnhóa học, tác dụng sinh học của lá và tâm Sen Tuy nhiên,các nghiên cứu về lĩnh vực kiểm nghiệm còn nhiều hạn chế mà nguyênnhân chủ yếu là do hai thành phần có tác dụng sinh học chính trong lá,tâm Sen là alkaloid và flavonoid vẫn chưa được nghiên cứu vàcông bố toàn diện; chưa có công trình khoa học nào khẳng định chấtđánh dấu trong nguyên liệu và hoàn toàn chưa có chất đối chiếu
có nguồn gốc từ dược liệu này được phân phối trên thị trường
Do đó, việc nghiên cứu về thành phần alkaloid và flavonoid,phân lập và thiết lập các chất đối chiếu phục vụ cho việc định tính,định lượng alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học trong lá, tâm Sen.Nhằm nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của một dược liệu đang được
sử dụng rộng rãi, cũng như ứng dụng trong công tác đảm bảochất lượng dược liệu và các chế phẩm từ Sen là một việc làm cấp thiết
Với những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng các phương
pháp sắc ký để phân tích thành phần alkaloid, flavonoid của lá, tâm
Sen và các chế phẩm” được thực hiện với các nội dung nghiên cứu sau:
1 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các alkaloid, flavonoid từ
lá và tâm Sen bằng phương pháp sắc ký và phổ nghiệm
Trang 52 Thiết lập và xây dựng tiêu chuẩn một số alkaloid, flavonoid có tácdụng sinh học để dùng làm chất đối chiếu phục vụ cho công táckiểm nghiệm.
3 Xây dựng các qui trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thờimột số alkaloid, flavonoid chính có trong lá, tâm Sen bằng phươngpháp HPLC và CE
4 Áp dụng qui trình để đánh giá thành phần, hàm lượng các alkaloid
và flavonoid trong lá, tâm Sen được thu hái từ các tỉnh, thành khácnhau và trong chế phẩm từ Sen có trên thị trường
2 Tính cấp thiết của đề tài:
Lá và tâm Sen (Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae)
đã và đang được sử dụng rất phổ biến trên thị trường dưới dạng thuốc,thực phẩm chức năng để điều trị hoặc hỗ trợ điều trị trong các bệnh lýkhó ngủ, béo phì, mỡ máu cao, cao huyết áp, loạn nhịp tim…
Tuy nhiên, công tác đảm bảo chất lượng cho nguồn nguyên liệu
và các chế phẩm này hiện vẫn chưa được thực hiện chặt chẽ mà nguyênnhân là do các nghiên cứu toàn diện, chi tiết về hai thành phần chínhalkaloid, flavonoid còn rất hạn chế cũng như việc kiểm soát chất lượngnguồn nguyên liệu thông qua việc định tính, định lượng các thành phầnđánh dấu sinh học này hầu như chưa được thực hiện vì sự khan hiếmcác chất đối chiếu từ dược liệu này Do đó, việc nghiên cứu chiết xuất,phân lập, xác định cấu trúc các nhóm alkaloid, flavonoid có tác dụngsinh học trong lá, tâm Sen nhằm thiết lập các chất đối chiếu ứng dụngcho việc nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của dược liệu Sen và các chếphẩm từ Sen là rất cần thiết, có ý nghĩa khoa học và có giá trị thực tiễn
3 Những đóng góp mới của luận án:
Luận án đã đạt được một số kết quả mới, đóng góp vào công trìnhnghiên cứu cho cây Sen như sau:
Trang 6đặt tên là isoliensinin N 2’ -oxyd và isoliensinin N 2 -oxyd.
- 05 hợp chất đã được công bố có trong những dược liệu khác nhưng
lần đầu tiên được phân lập từ cây Sen: 02 alkaloid (pronuciferin
N-oxyd và apoglaziovin); 03 flavonoid (calycosin, scutellarein
7-O-β-D-GlcA methyl ester, vitexin).
- 02 alkaloid lần đầu tiên được phân lập từ lá Sen (isoliensinin,norarmepavin); 03 alkaloid (nuciferin, armepavin, norarmepavin)
và 03 flavonoid (isorhamnetin, quercitrin, quercetin
3-O-β-D-GlcA) lần đầu tiên được công bố từ tâm Sen
3.2 Thiết lập chất đối chiếu
Thiết lập 06 chất đối chiếu (nuciferin, o-nornuciferin, liensinin,
isoliensinin, neferin, quercetin 3-O-β-D-GlcA) Hiện tại, các CĐC này
đều chưa được phân phối bởi hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia
3.3 Quy trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời các alcaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen
Xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu 08 quy trình phân tíchđồng thời các alkaloid hay flavonoid bằng phương pháp HPLC-PDA
và CE-PDA-MS Các quy trình này đều chưa được công bố bởi bất cứcông trình nào trong nước và thế giới
Các qui trình định tính, định lượng sau khi thẩm định đã được ápdụng để kiểm soát chất lượng 32 mẫu nguyên liệu lá Sen và 32 mẫu
nguyên liệu tâm Sen (Nelumbo nucifera) được thu hái vào mùa thu hái
Trang 7khác nhau từ ba vùng miền khác nhau của Việt Nam cũng như các chếphẩm bào chế từ lá, tâm Sen đang lưu hành trên thị trường.
Xây dựng được các sắc ký đồ, điện di đồ dấu vân tay bằng phươngpháp SKLM, HPLC-PDA, CE-PDA/MS giúp xác định đặc tính điểmchỉ, nhận dạng lá, tâm Sen của từng vùng miền tại Việt Nam
4 Bố cục luận án: có 131 trang chính: Đặt vấn đề (2); chương 1:
Tổng quan tài liệu (24); chương 2: Phương pháp nghiên cứu (22);chương 3: Kết quả nghiên cứu (62), chương 4: Bàn luận (23); kết luận(3); kiến nghị (1) Danh mục công trình (2); Tài liệu tham khảo (9)
NỘI DUNG LUẬN ÁN
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Các nghiên cứu về chiết xuất- phân lập- xác định cấu trúc
- Các alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen được chiết bằng phươngpháp: ngâm lạnh, ngấm kiệt, chiết hỗ trợ vi sóng, chiết siêu tới hạn
- Các hợp chất tinh khiết được phân lập bằng các phương pháp sắcký: sắc ký pha thuận, rây phân tử, sắc ký ngược dòng tốc độ cao
- Cấu trúc các hợp chất phân lập được biện giải bằng các phépphổ nghiệm: UV, IR, MS, NMR
Các nghiên cứu về định tính, định lượng Thành phần alkaloid, flavonoid trong lá và tâm Sen: sử dụng các phương pháp
HPLC-PDA-MS/MS và CE-PDA
Trang 81.3 Tác dụng sinh học
Các tác dụng chính là an thần, hạ cholesterol, hạ đường huyết, hạ huyết
áp, loạn nhịp tim, kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxi hóa vàkích thích miễn dịch
1.4 Phương pháp thiết lập chất đối chiếu: hướng dẫn của ASEAN Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu: đối tượng nghiên cứu là các alkaloid và
flavonoid trong lá, tâm Sen
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Các phương pháp chiết xuất: Chiết ngâm lạnh, chiết với sự hỗ
trợ của sóng siêu âm: nghiên cứu các điều kiện dung môi,
tỷ lệ dung môi/dược liệu
2.2.2 Phương pháp phân lập, xác định độ tinh khiết, cấu trúc hợp chất tinh khiết: Sử dụng phương pháp sắc ký cột pha thuận, pha đảo
Sephadex LH-20, sắc ký lỏng bán điều chế, sắc ký phân bố
ly tâm nhanh Xác định độ tinh khiết bằng phương pháp SKLM,HPLC/PDA, quét nhiệt vi sai Biện giải cấu trúc bằng phép phổ nghiệm:
UV, IR, MS, NMR
2.2.3 Qui trình định tính, định lượng các alkaloid, flavonoid bằng phương pháp HPLC, CE
Qui trình định lượng: phải đạt các yêu cầu về thẩm định theo
hướng dẫn của ICH
- Quy trình xử lý mẫu: khảo sát quy trình chiết alcaloid và flavonoid
từ lá, tâm Sen (dung môi chiết, số lần chiết) và dung môi pha mẫu
- Phương pháp HPLC: khảo sát thành phần pha động, tỷ lệ và pH phađộng, kỹ thuật rửa giải
- Phương pháp CE: kỹ thuật điện di, dung dịch đệm (hệ đệm, nồng độđệm, pH dung dịch đệm ); loại chất diện hoạt, nồng độ chất
Trang 9diện hoạt; điều kiện của đầu dò: bước sóng phân tích với đầu dòPDA; kiểu ion hóa, áp suất khí bao, nhiệt độ buồng ion hóa, thế ápdụng, chất lỏng bao với đầu dò MS.
Định tính điểm chỉ:
Phương pháp SKLM: khảo sát dung môi để xác định các đặc trưng cơbản của hai nhóm hoạt chất chính alcaloid và flavonoid của lá, tâm Senqua hệ số Rf và màu sắc của các vết đặc trưng
Phương pháp HPLC và CE: dựa trên sắc ký đồ (SKĐ), điện di đồ(ĐDĐ) xác định thời gian lưu (tR-HPLC) hay thời gian dịch chuyển(tM-CE) và diện tích đỉnh của các pic chính cũng như tỷ lệ diện tích picgiữa các pic chính của alkaloid và flavonoid trong mẫu nguyên liệu
2.2.4 Phương pháp thiết lập CĐC: Thực hiện theo hướng dẫn của
WHO, ASEAN, ấn bản về quy trình thiết lập CĐC
2.2.5 Ứng dụng qui trình định tính, định lượng
Đánh giá đặc tính điểm chỉ và hàm lượng các alkaloid và flavonoid cótrong nguyên liệu lá, tâm Sen được thu hái từ những vùng thu hái khácnhau về thổ nhưỡng, khí hậu và các chế phẩm thuốc hay thực phẩmchức năng được bào chế từ hai nguyên liệu này
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Chiết cao chiết toàn phần alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen
Chiết cao cồn: dược liệu được làm ẩm bằng cồn 70% acid tartric 1%
khoảng 6 giờ, làm ngập dược liệu 1- 2 cm, ngâm khoảng 48 giờ Rútdịch chiết đến khi âm tính với thuốc thử (TT) Dragendorff và FeCl31% Tỷ lệ dung môi/dược liệu là (10:1) Gộp dịch chiết, lọc và cô đến
cao đặc Chiết flavonoid: cao cồn được acid hóa bằng H2SO4 2% đến
pH 1-2 Loại tạp bằng n-hexan, sau đó lắc với ethyl acetat đến khi âmtính với TT FeCl3 1% Gộp các dịch chiết ethyl acetat, thu hồi dung môi
đến cao đặc chứa flavonoid tủa F từ lá Sen và cao EF từ tâm Sen.
Trang 10Chiết alcaloid: dịch acid sau khi chiết flavonoid được kiềm hóa bằng
amoniac 25% theo gradient pH Lắc với cloroform đến khi âm tính với
TT Dragendorff, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa alkaloid A1, A2,
A3 từ lá Sen và NP5, NP8, P và n-Bu từ tâm Sen tương ứng.
Từ tủa B thu được trong quá trình thu hồi dung môi để thu cao cồn
được acid hóa bằng H2SO4 2% và cho phản ứng đặc hiệu với TTBertrand, tủa thu được rửa loại tạp lần lượt với CHCl3, EtOAc, sau đóhòa trong NaOH 2% và chiết bằng CHCl3 để thu cao N.
3.2 Phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao chiết lá, tâm Sen
Cao A2 và tủa F được tách phân đoạn bằng sắc ký cột chân không;
cao A3, cao N, NP5, NP8, EF được tách phân đoạn bằng cột pha thuận.
Các phân đoạn tinh khiết hơn thu được này được tiếp tục phân lập bằngsắc ký cột Sephadex LH-20, sắc ký lỏng bán điều chế pha đảo, sắc kýphân bố ly tâm nhanh để phân lập được 35 hợp chất với 28 cấu trúcđược biện giải và so sánh các dữ liệu phổ nghiệm UV, IR, MS, NMR.với các tài liệu đã công bố như đã trình bày ở mục 3 Cấu trúc hóa học
và độ dịch chuyển hóa học của C, H của 16 alkaloid và 12 flavonoidphân lập từ lá, tâm Sen được trình bày ở các Hình 3.7-3.15
Trang 123.3 Thiết lập chất đối chiếu (CĐC)
3.3.1 Xây dựng qui trình xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập CĐC
Các alkaloid, flavonoid được lựa chọn để thiết lập CĐC là nhữnghợp chất đại diện, chiếm hàm lượng lớn trong cây, khối lượng phân lậpđược nhiều (> 500 mg) với độ tinh khiết sắc ký cao (> 95%) để thiếtlập CĐC 06 nguyên liệu được chọn để thiết lập CĐC: nuciferin, 2-O-
nornuciferin, isoliensinin, liensinin, neferin, quercetin 3-O-β-D-GlcA
Bảng 3.49 Kết quả khảo sát hàm ẩm bằng phương pháp TGA và
điểm nóng chảy, độ tinh khiết bằng phương pháp DSC (n=3)
Xác định độ tinh khiết bằng HPLC/PDA
Dựa trên cấu trúc hóa học của các hợp chất nghiên cứu, khảo sát cácthông số: bản chất pha tĩnh, pha động, pH, nhiệt độ, tốc độ dòng, bướcsóng phát hiện, nhằm tìm ra các điều kiện sắc ký thích hợp xác định độtinh khiết sắc ký các mẫu nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu
Bảng 3.50 Tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết
HPLC-PDA của 06 CĐC
ACN-TEA 0,1%
Nhiệt độ cột ( o C)
λ (nm)
F (ml/phút) Nuciferin Gemini C18
(150 mm x 4,6; 5µm)
Trang 13Quercetin
3-O-β-D-glcA
ACN- acid formic 0,1 % (20:80)
254 1,0
Xác định tính phù hợp hệ thống: các thông số sắc ký đều đạt yêu cầu
qui định sau 06 lần tiêm liên tiếp, quy trình đạt tính phù hợp hệ thống
Thẩm định quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký các nguyên liệu làm CĐC bằng HPLC
Tính đặc hiệu: SKĐ mẫu trắng không có tín hiệu tại vị trí thời gian lưu
của pic chính trên SKĐ mẫu thử CĐC
Bảng 3.52 Kết quả xác định tính tuyến tính, miền giá trị, độ đúng,
độ chính xác của qui trình phân tích các nguyên liệu thiết lập CĐC.
Hệ số tương quan 0,9995 0,9992 0,9990 0,9989 0,9997 0,9994 Khoảng tuyến tính 15,63-1000 (µg mL -1
101,5- 102,8
99,8- 103,5
98,3- 102,2
97,6- 103,4
98,8-*: Tỉ lệ hồi phục trung bình (%) (1) : nuciferin; (2): 2-O-nornuciferin; (3) : isoliensinin (4) :
Nhận xét: Quy trình xác định độ tinh khiết 06 nguyên liệu làm chất đốichiếu bằng phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, miền giá trị rộng,
độ chính xác và độ đúng cao Do đó có thể áp dụng quy trình này đểtiến hành xác định độ tinh khiết của các nguyên liệu thiết lập CĐC
Kiểm tra độ tinh khiết sắc ký 06 nguyên liệu thiết lập CĐC
Bảng 3.53 Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) các nguyên liệu
thiết lập CĐC
HPLC/PDA
RSD (n=3)
Tạp (%)