nghiên cứu thành phần hóa học thiết lập chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid cho cây trinh nữ hoàng cung (crinum latifolium l amaryllidaceae)

Quy trình đ nh l ng alcaloid và flavonoid ..... 41 Hình 3.2: Hình hoa Trinh n hoàng cung Crinum latifolium L... Vi t Nam, chi Crinum có 6 loài đ c tr ng làm c nh và làm thu c: Crinum ama

I H C Y D C THÀNH PH H CHÍ MINH

*****

NGUY N H U L C TH Y

NGHIÊN C U THÀNH PH N HÓA H C,

QUY TRÌNH KI M NGHI M THÀNH PH N ALCALOID

VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH N HOÀNG CUNG

(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)

Tp H Chí Minh – N m 2014

I H C Y D C THÀNH PH H CHÍ MIINH

NGUY N H U L C TH Y

NGHIÊN C U THÀNH PH N HÓA H C,

QUY TRÌNH KI M NGHI M THÀNH PH N ALCALOID

VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH N HOÀNG CUNG

(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)

Chuyên ngành: KI M NGHI M THU C

Mã s : 62.73.15.01

Ng i h ng d n khoa h c: PGS.TS VÕ TH B CH HU

Tp H Chí Minh – N m 2014

L I CAM OAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên c u c a riêng tôi Các s li u, k t qu

đ c trình bày trong lu n án là trung th c và ch a t ng đ c ai công b trong b t k công trình nào khác

Ng i cam đoan,

Nguy n H u L c Th y

M C L C

M C L C i

B NG CÁC CH VI T T T iii

DANH M C HÌNH NH v

DANH M C S vi

DANH M C CÁC B NG vii

T V N 1

CH NG 1: T NG QUAN TÀI LI U 3

1.1 T ng quan th c v t h c cây Trinh n hoàng cung 3

1.2 T ng quan hóa h c c a chi Crinum và cây TNHC 5

1.3 T ng quan tác d ng sinh h c chi Crinum và TNHC 14

1.4 Chi t ho t ch t t d c li u b ng dung môi CO2 siêu t i h n 21

1.5 Các ph ng pháp nghiên c u hóa h c c a cây Trinh n hoàng cung 22

1.6 Ph ng pháp thi t l p ch t đ i chi u 24

CH NG 2: PH NG PHÁP NGHIÊN C U 27

2.1 Nguyên v t li u 27

2.2 Trang thi t b 28

2.3 Ph ng pháp nghiên c u 29

2.3.1 Chi t xu t – phân l p ho t ch t t cây TNHC 29

2.3.3 Thi t l p ch t đ i chi u 34

2.3.4 Ph ng pháp đ nh tính, đ nh l ng alcaloid và flavonoid 35

2.3.5 xu t m t s ch tiêu c n thi t đ xây d ng TCKN d c li u TNHC 40 CH NG 3: K T QU NGHIÊN C U 41

3.1 Quy trình chi t cao c n, phân đo n alcaloid và flavonoid t cây TNHC 41

3.1.1 Quy trình chi t ho t ch t b ng ph ng pháp ng m ki t 42

3.1.2 Chi t ho t ch t t lá TNHC b ng ph ng pháp SFE và ng m ki t 44

3.2 Phân l p h p ch t tinh khi t t cao chi t TNHC 47

3.2.1 S c ký c t chân không 47

3.2.2 S c ký c t c đi n 48

3.2.3 Xác đ nh c u trúc 53

3.2.3.1 Xác đ nh c u trúc h p ch t (2) 53

3.2.3.2 C u trúc các h p ch t ch a đ c công b t cây TNHC 60

3.2.3.3 C u trúc các h p ch t đã đ c công b t cây TNHC 63

3.3 Thi t l p ch t đ i chi u 70

3.3.1 Xây d ng ph ng pháp đánh giá nguyên li u thi t l p C C 70

3.3.2 Xây d ng tiêu chu n ch t l ng đánh giá các nguyên li u C C 76

3.3.3 Xây d ng tiêu chu n ch t l ng đánh giá các C C 77

3.3.4 óng gói và đánh giá đ ng nh t lô 77

3.3.5 ánh giá đ ng nh t liên phòng thí nghi m 79

3.3.6 Xác đ nh giá tr n đ nh và giá tr công b 79

3.4 Xây d ng ph ng pháp HPLC, CE, d u vân tay 83

3.4.1 Quy trình x lý m u 83

3.4.2 Quy trình đ nh l ng đ ng th i 6 alcaloid b ng ph ng pháp HPLC 84

3.4.3 Quy trình đ nh l ng đ ng th i 2 flavonoid b ng HPLC 89

3.4.4 Quy trình đ nh l ng đ ng th i 6 alcaloid b ng ph ng pháp CE 92

3.4.5 Quy trình đ nh l ng đ ng th i 2 flavonoid b ng ph ng pháp CE 95

3.4.6 Ph ng pháp d u vân tay 98

3.5 xu t m t s ch tiêu c n thi t đ xây d ng TCKN d c li u TNHC 100

CH NG 4: BÀN LU N 103

4.1 Các ph ng pháp chi t xu t ho t ch t t cây TNHC 103

4.2 Phân l p h p ch t tinh khi t 107

4.3 Thi t l p ch t đ i chi u 112

4.4 Quy trình đ nh l ng alcaloid và flavonoid 113

4.5 Tiêu chu n ki m nghi m d c li u TNHC 118

K T LU N

KI N NGH

TÀI LI U THAM KH O

PH N PH L C

B NG CÁC CH VI T T T

ASEAN Association of Southeast Asian Nations

(Hi p h i các qu c gia ông Nam Á)

AL-NK Phân đo n alcaloid chi t t lá TNHC b ng ph ng pháp ng m ki t AL-SA Phân đo n alcaloid chi t t lá TNHC b ng sóng siêu âm

AL-SFE Phân đo n alcaloid chi t t lá TNHC b ng ph ng pháp SFE

AR-96 Phân đo n alcaloid chi t t r TNHC v i dung môi c n 96%

As H s b t đ i

C C Ch t đ i chi u

CE Caplillary Electrophoresis ( i n di mao qu n)

Corr Area Corrected Area (Di n tích pic đ c chu n hóa)

CZE Caplillary Zone Electrophoresis ( i n di mao qu n vùng)

d doublet (đ nh đôi)

D VN IV D c đi n Vi t Nam xu t b n l n th IV

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DSC Differential Scanning Calorimetry (Nhi t vi sai)

DMSO Dimethylsulfoxyd

DVT D u vân tay

FL-NK Phân đo n flavonoid chi t t lá TNHC b ng ph ng pháp ng m ki t FL-SA Phân đo n flavonoid chi t t lá TNHC b ng sóng siêu âm

FL-SFE Phân đo n flavonoid chi t t lá TNHC b ng ph ng pháp SFE

FR-96 Phân đo n flavonoid chi t t r TNHC v i dung môi c n 96%

GC Gas Chromatography (S c ký khí)

GC-MS Gas Chromatography – Mass Spectrometry (S c ký khí ghép kh i ph )

HPLC High Performance Liquid Chromatography (S c ký l ng hi u n ng cao)

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation

IR Infrared (H ng ngo i)

J Coupling constant (H ng s ghép)

LC-MS Liquid Chromatography – Mass Spectrometry

(S c ký l ng ghép kh i ph )

L-SFE Cao toàn ph n chi t t lá TNHC b ng ph ng pháp SFE

MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography (S c ký mixen đi n đ ng)

MS Mass Spectrometry (Kh i ph )

NMR Nuclear Magnetic Resonance (C ng h ng t h t nhân)

P Phân đo n

PDA Photo Diode Array (Dãy diod quang)

PCRS Primary Chemical Reference Standard

(Ch t đ i chi u hóa h c s c p)

PTN Phòng thí nghi m

RSD Relative Standard Deviation ( l ch chu n t ng đ i)

Rs đ phân gi i gi a pic có th i gian l u nh và l n h n k bên

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SFE Supercritical Fluid Extraction (Chi t b ng ch t l ng siêu t i h n)

SKLM S c ký l p m ng

TCKN Tiêu chu n ki m nghi m

TR Th i gian l u (phút)

TM Th i gian di chuy n (phút)

TNHC Trinh n hoàng cung

TGA Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhi t tr ng l ng)

TT Thu c th

UV-Vis Ultraviolet-Visible (T ngo i kh ki n)

VLC Vacuum Liquid Chromatography (S c ký c t chân không)

DANH M C HÌNH NH

Hình 1.1: Hình v cây TNHC 5

Hình 1.2: Các c u trúc hóa h c c a alcaloid khung crinin 6

Hình 1.3: C u trúc hóa h c alcaloid khung lycorin (A) và khung tazettin (B) 6

Hình 1.4: C u trúc hóa h c khung belladin (C) và c u trúc khung galanthamin (D) 7 Hình 1.5: C u trúc hóa h c khung lycorenin (E) và c u trúc khung cheryllin (F) 7

Hình 1.6: C u trúc hóa h c c a các flavonoid trong chi Crinum 8

Hình 1.7: C u trúc hóa h c các h p ch t flavonoid trong cây TNHC 10

Hình 3.1: Hình lá và c m hoa c a cây TNHC (Crinum latifolium L.) 41

Hình 3.2: Hình hoa Trinh n hoàng cung (Crinum latifolium L.) 41

Hình 3.3: SK các h p ch t phân l p t các phân đo n alcaloid 49

Hình 3.4: SK các h p ch t phân l p t phân đo n alcaloid AR và flavonoid 49

Hình 3.5: C u trúc hóa h c và d li u ph NMR (500 MHz, CDCl3) c a (2) 59

Hình 3.6: C u trúc hóa h c c a 6-ethoxyundulatin 59

Hình 3.7: SK xác đ nh đ tinh khi t c a C C crinamidin b ng HPLC 72

Hình 3.8: SK xác đ nh đ tinh khi t C C 6-hydroxycrinamidin HPLC 73

Hình 3.9: SK xác đ nh đ tinh khi t c a C C lycorin b ng HPLC 73

Hình 3.10: SK xác đ nh đ tinh khi t c a C C hippadin b ng HPLC 74

Hình 3.11: SK xác đ nh đ tinh khi t c a C C astragalin b ng HPLC 74

Hình 3.12: SK xác đ nh đ tinh khi t c a C C isoquercitrin b ng HPLC 75

Hình 3.13: Các SK th m đ nh tính đ c hi u trong quy trình đ nh l ng đ ng th i 6 alcaloid trong lá TNHC b ng ph ng pháp HPLC 86

Hình 3.14: Các SK th m đ nh tính đ c hi u trong quy trình đ nh l ng đ ng th i astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC b ng ph ng pháp HPLC 90

Hình 3.15: Các đi n di đ th m đ nh tính đ c hi u c a quy trình đ nh l ng đ ng th i 6 alcaloid trong lá TNHC b ng ph ng pháp CE 93

Hình 3.16: Các đi n di đ th m đ nh tính đ c hi u c a quy trình đ nh l ng đ ng

th i astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC b ng ph ng pháp CE 96

Hình 3.17: S c ký đ DVT – SKLM alcaloid TNHC 98

Hình 3.18: S c ký đ DVT – SKLM flavonoid TNHC 99

Hình 4.1: SK alcaloid TNHC b ng HPLC, k thu t r a gi i isocratic 114

Hình 4.2: SK alcaloid TNHC b ng HPLC, k thu t r a gi i gradient 114

Hình 4.3: i n di đ so sánh m u th alcaloid phân tích b ng CZE và MEKC 115

Hình 4.4: i n di đ m u th alcaloid pha trong methanol 116

Hình 4.5: i n di đ m u th alcaloid pha trong đ m dinatri tetraborat 25 mM 116

Hình 4.6: i n di đ m u th alcaloid pha trong dung d ch acid H3PO4 116

DANH M C S S đ 2.1 S đ kh o sát quy trình chi t ho t ch t t cây TNHC 29

S đ 2.2 S đ kh o sát chi t ho t ch t t lá TNHC k t h p hai ph ng pháp SFE và ph ng pháp chi t ng m ki t v i c n 70% 32

S đ 3.1 S đ chi t cao c n, P alcaloid và P flavonoid t lá TNHC 43

S đ 3.2 S đ chi t alcaloid và flavonoid t r TNHC 43

S đ 3.3 S đ chi t alcaloid và flavonoid b t lá k t h p hai ph ng pháp chi t 46 S đ 3.4 S đ phân l p h p ch t (2) và (3) t P alcaloid AL-SFE 51

S đ 3.5 S đ chi t alcaloid AL-SA ho c flavonoid FL-SA 83

DANH M C CÁC B NG

B ng 1.1: Alcaloid c a TNHC Crinum latifolium L 11

B ng 3.1: Hi u su t chi t (%) ho t ch t b ng ph ng pháp ng m ki t 42

B ng 3.2: K t qu kh o sát nh h ng th i gian lên hi u su t chi t 44

B ng 3.3: K t qu kh o sát nh h ng c a áp su t lên hi u su t chi t 45

B ng 3.4: K t qu tách phân đo n m u AL-SFE và FL-NK b ng VLC 47

B ng 3.5: Các h p ch t tinh khi t phân l p đ c t cao chi t TNHC 48

B ng 3.6: K t qu phân l p alcaloid t phân đo n ALS1 49

B ng 3.7: K t qu tri n khai s c ký c t v i ch t h p ph pha đ o 50

B ng 3.8: K t qu phân l p (2) và (3) t P n–hexan 50

B ng 3.9: K t qu phân l p các (8), (9), (10) t P alcaloid AL-NK 52

B ng 3.10: D li u ph NMR (Máy 500 MHz, CDCl3) c a h p ch t (2) 57

B ng 3.11: Các t ng tác proton trên ph COSY, HMBC c a h p ch t (2) 58

B ng 3.12: K t qu đ tinh khi t; hàm m b ng phân tích nhi t tr ng l ng 70

B ng 3.13: Thành ph n pha đ ng và b c sóng phát hi n c a quy trình xác đ nh đ tinh khi t c a các nguyên li u C C b ng ph ng pháp HPLC 71

B ng 3.14: K t qu kh o sát tính phù h p h th ng quy trình phân tích HPLC 71

B ng 3.15: K t qu xác đ nh đ tinh khi t s c ký (%) các C C b ng HPLC 75

B ng 3.16: D li u ph UV-Vis, MS và đi m ch y c a các C C 76

B ng 3.17: D li u ph IR c a các C C 76

B ng 3.18: K t qu đánh giá đ ng nh t lô c a các C C sau khi đóng gói 78

B ng 3.19: K t qu phân tích robust A c a C C crinamidin 80

B ng 3.20: K t qu phân tích robust A c a C C 6-hydroxycrinamidin 80

B ng 3.21: K t qu phân tích robust A c a C C hippadin 81

B ng 3.22: K t qu phân tích robust A c a C C lycorin 81

B ng 3.23: K t qu phân tích robust A c a C C astragalin 82

B ng 3.24: K t qu phân tích robust A c a C C isoquercitrin 82

B ng 3.25: K t qu xác đ nh giá tr n đ nh và giá tr công b các C C 82

B ng 3.26: Ch ng trình dung môi đ nh l ng 6 alcaloid b ng HPLC 84

B ng 3.30: K t qu kh o sát tình phù h p h th ng c a quy trình đinh l ng đ ng

th i astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC b ng ph ng pháp HPLC (n = 6) 89

B ng 3.31: K t qu kh o sát đ chính xác c a quy trình đ nh l ng đ ng th i astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC b ng HPLC (n = 6) 91

B ng 3.32: K t qu kh o sát đ đúng c a quy trình đ nh l ng đ ng th i astragalin

và isoquercitrin trong lá TNHC b ng ph ng pháp HPLC (n = 9) 91

B ng 3.33: K t qu kh o sát tình phù h p h th ng quy trình đ nh l ng đ ng th i 6 alcaloid trong lá TNHC b ng ph ng pháp CE (n = 6) 92

B ng 3.34: K t qu kh o sát đ chính xác trung gian trong quy trình đ nh l ng đ ng

th i 6 alcaloid trong lá TNHC b ng ph ng pháp CE (n = 6) 94

B ng 3.35: K t qu kh o sát t l ph c h i c a quy trình đ nh l ng đ ng th i 6 alcaloid trong lá TNHC b ng ph ng pháp CE (n = 9) 94

B ng 3.36: K t qu kh o sát tình phù h p h th ng c a quy trình đ nh l ng đ ng

th i astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC b ng CE (n = 6) 95

B ng 3.37: K t qu kh o sát đ chính xác c a quy trình đ nh l ng đ ng th i astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC b ng CE (n = 6) 97

B ng 3.38: K t qu kh o sát đ đúng c a quy trình đ nh l ng đ ng th i astragalin

và isoquercitrin trong lá TNHC b ng ph ng pháp CE (n = 9) 97

T V N

Cây Trinh n hoàng cung (Crinum latifolium L – Amaryllidaceae) là d c li u đang

đ c s d ng ph bi n nh th c ph m ch c n ng ho c d i các d ng bào ch thu c

c truy n và thu c hi n đ i

Công d ng đ c quan tâm và đã đ c th nghi m lâm sàng nh đi u tr u x t cung,

u phì đ i lành tính tuy n ti n li t đ c cho là do tác d ng c a thành ph n alcaloid trong cây v i các ch ph m nh Crila, Tadimax [16], [26]

K đ n là công d ng kháng viêm, ch ng oxi hóa in vitro do nhóm flavonoid c ng đã

đ c nghiên c u [16], [95]

Tuy nhiên, các nhà khoa h c k v ng vào tác d ng kháng kh i u c a loài này Cho

đ n nay đã có nhi u công trình nghiên c u v kh n ng kháng ung th t cao toàn

ph n nh : cao ethanol (có thành ph n alcaloid) làm ch m s phát tri n kh i u gây ra

b i t bào Sarcoma TG 180 [11]; cao methanol c ch NF- B [103]; cao chi t n c kích thích s sinh s n và ho t hóa t bào lympho T [139]; kh n ng c ch s phát tri n c a t bào ung th và h i ph c ch c n ng mi n d ch (in vitro) c a cao chi t n c

là tác d ng đáng chú ý khi gi i thích tính kháng ung th c a loài Crinum latifolium

[31], [95], [139] Các h p ch t alcaloid tinh khi t đ c phân l p t Trinh n hoàng cung (TNHC) nh lycorin, pratorimin, undulatin, crinafolin và crinafolidin đã đ c

th c nghi m ch ng minh là có kh n ng ng n ch n ch n l c s phát tri n c a các t bào ung th th c nghi m

Thành ph n hóa h c và tác d ng sinh h c c a TNHC đ c nhi u tác gi quan tâm và

r t nhi u công trình nghiên c u đã đ c công b v hai l nh v c này – cho đ n n m

2013, có kho ng 30 công trình công b d i d ng bài báo khoa h c Tuy nhiên các nghiên c u v lnh v c ki m nghi m thì h n ch h n (kho ng 6 công trình): ph ng pháp quang ph đ nh l ng alcaloid toàn ph n [22]; ph ng pháp GC đ nh danh thành

ph n alcaloid [11], [106]; ph ng pháp HPLC đ nh l ng alcaloid d a trên 1 ch t đ i chi u [12], [24], [27] Ch a có nghiên c u ng d ng ph ng pháp CE và c ng ch a

có công trình công b vi c đ nh l ng đ ng th i m t s alcaloid hay flavonoid trong

lá TNHC

D c đi n Vi t Nam IV ch a có chuyên lu n cây TNHC Do đó, v n đ qu n lý và

đ m b o ch t l ng c a nguyên li u và các ch ph m có thành ph n TNHC v n ch a

đ c th c hi n m t cách ch t ch

Nguyên nhân ch y u là do thành ph n hóa h c c a d c li u v n ch a đ c nghiên

c u toàn di n; ch t đánh d u trong nguyên li u ch a đ c xác đ nh và hoàn toàn ch a

có b t k ch t đ i chi u có ngu n g c t d c li u này đ c phân ph i trên th tr ng

V i mong mu n góp ph n gi i quy t các b t c p hi n t i và góp ph n vào công tác

“ m b o ch t l ng” cho d c li u Trinh n hoàng cung, chúng tôi ti n hành đ tài:

“Nghiên c u thành ph n hóa h c, thi t l p ch t đ i chi u

và xây d ng quy trình ki m nghi m thành ph n alcaloid và flavonoid

cho cây Trinh n hoàng cung - Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”

v i 4 m c tiêu chính nh sau:

1 Chi t xu t cao c n, các phân đo n alcaloid, phân đo n flavonoid và phân l p các

h p ch t tinh khi t t cây Trinh n hoàng cung

2 Thi t l p m t s ch t đ i chi u hóa h c có ngu n g c t cây Trinh n hoàng cung

3 Xây d ng quy trình đ nh tính, đ nh l ng alcaloid và flavonoid trong lá Trinh n hoàng cung b ng các ph ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao và đi n di mao qu n

4 xu t m t s ch tiêu c n thi t cho vi c xây d ng tiêu chu n ki m nghi m d c

li u Trinh n hoàng cung

CH NG 1: T NG QUAN TÀI LI U

1.1.1. H Amaryllidaceae và chi Crinum

H Amaryllidaceae có tên g i theo đa s tài li u c a các nhà th c v t h c Vi t nam

là h Th y tiên [4], [5], [21], Loa kèn đ [1],Náng [7] hay Lan Hu V trí c a chi

Crinum thu c h Th y tiên theo h th ng phân lo i ngành th c v t h t kín c a A L

Takhtajan công b n m 1987 và đã s a đ i n m 2009 [4], [36] nh sau:

c đi m hình thái c a h Th y tiên: thân c , s ng nhi u n m nh hành hay thân r

Lá m c t g c, m ng hay m ng n c, gân lá song song i v i chi Crinum, các b

lá h p thành thân gi cao 10-15 cm C m hoa d ng chùm, tán, ít hay nhi u hoa và có

m t mo bao l i Tr c c m hoa dài m c t m t đ t Hoa đ u, l ng tính, 5 vòng, m u

3 Bao hoa: 6 phi n cùng màu d ng cánh hoa, dính thành ng dài, ít khi r i Vài lo i

có tràng ph B nh : 6 nh đính trên 2 vòng Ch nh r i hay dính nhau Bao ph n

th ng hay l c l B nh y: 3 lá noãn t o thành b u d i 3 ô, m i ô ch a nhi u noãn, đính noãn trung tr ; 1 vòi nh y, đ u nh y chia 3 thùy Qu : thông th ng là nang n t

l ng H t có n i nh [5]

Chi Crinum có kho ng 130 loài các vùng nhi t đ i, c n nhi t đ i và vùng nóng

Vi t Nam, chi Crinum có 6 loài đ c tr ng làm c nh và làm thu c: Crinum amabile Donn., Crinum asiaticum L., Crinum defixum Ker Gawl., Crinum giganteum Andr.,

Crinum latifolium L., Crinum moorei Hook F [4]

1.1.2 Cây Trinh N Hoàng Cung (TNHC)

Tên khoa h c: Crinum latifolium L

Tên thông th ng: Trinh N Hoàng Cung [11], Hoàng Cung Trinh N [17], T i l i

lá r ng [1], [4], Náng lá r ng [4], [7], [9]

c đi m hình thái: đ c nhi u nhà th c v t h c Vi t nam mô t r t chi ti t [1], [4],

[5], [7], [11], [14], [17], [21] Tài li u [7] phù h p v i h u h t các tài li u khác: c nhi u n m; thân hành, hình c u, phía ngoài có áo m ng, phía trên có thân gi ng n

do các b lá ôm sát nhau làm thành Phi n lá d ng b n, kích th c 60-907-10 cm, màu xanh nh t, n c, m t trên h i lõm xu ng thành hình máng, mép l n sóng, gân

gi a l i lên m t d i, gân bên song song, chóp nh n, g c d ng b C m hoa tán, có 10-20 hoa; cu ng c m dài 60-90 cm, chi u ngang 1,5-2,0 cm, màu xanh, g c tím nh t

Lá b c t ng bao 2, d ng mo, m ng, kích th c 7,5-10,0  2,5-3,0 cm Hoa đ u, l ng tính, màu tím h ng, đ ng th ng; cu ng hoa ng n Bao hoa dài 15-20 cm, 6 m nh,

d ng tràng, ph n d i dính nhau thành ng dài 9-10 cm, th ng đ ng ho c cong lên,

ph n trên 6 thùy, hình m i giáo, gi a l ng có 1 d i màu tím h ng, đ m h n, nh t d n

ra phía mép, chóp nh n ng n, có m i màu h ng Nh 6, r i nhau; ch nh dài 6-7 cm,

d ng s i, màu tr ng, th ng đ ng ho c choãi ra, đính h ng ng bao hoa; bao ph n màu vàng, dài 1,2-1,8 cm, 2 ô, hình d i, đính l ng, h ng trong, m b ng khe d c

B u h , hình thoi, 3 ô, m i ô 5-6 noãn; vòi nh y dài 15-18 cm, d ng s i, dài, m nh, phía trên màu tím th m nh t d n xu ng phía d i; đ u nh y nh , d ng c u Qu nang, hình c u, đ ng kính 4-5 cm

Tài li u [17] mô t b nh c a TNHC có màu đ , trong khi các tài li u khác [7], [11]

mô t b ph n này có màu tr ng Các tài li u còn l i đ u không đ c p chi ti t này

Phân b - Sinh thái: cây TNHC đ c tr ng r ng rãi n , Thái lan, Trung Qu c, Indonexia, Philippin, Campuchia, Lào Vi t Nam, cây đ c tr ng ch y u các

t nh t Qu ng Nam- à N ng tr vào Mùa hoa qu : tháng 8-9 Là lo i cây a m, sáng ho c m t ph n bóng mát Sinh tr ng và phát tri n khí h u nóng và m c a vùng nhi t đ i M i n m cây cho 6-8 lá m i và đ thêm 3-5 hành con Cây ra hoa hàng n m vào kho ng tháng 6-8 B ph n dùng ch y u là lá và thân hành [1]

Cây TNHC đã đ c nghiên c u nhân gi ng b ng ph ng pháp c y mô [20]

Hình 1.1:Hình v cây TNHC: 1 Cây v i thân hành và lá 2 C m hoa;

3 M t ph n bao hoa và b nh ; 4 B nh y “Ngu n: Nguy n Th , 2007” [7]

N m 2012, m t th m i c a loài TNHC do nhóm tác gi Nguy n Th Ng c Trâm,

Tr n Công Khánh xác đ nh trong qu n th Crinum Vi t nam là “Trinh n Crila” có tên khoa h c Crinum latifolium L var Crilae Tram & Khanh, var n [32]

Thành ph n hóa h c c a các loài trong chi Crinum đ c nghiên c u t n m 1950 Nhóm h p ch t chính là alcaloid, k đ n là nhóm non-alcaloid, trong đó đ c bi t là các h p ch t phenolic [116]

Chi Crinum đ c xem là đ i di n cho h Amaryllidaceae do thành ph n hóa h c có

h u h t các h p ch t c a các chi khác trong h Kho ng 180 alcaloid thu c nhi u nhóm c u trúc khác nhau đ c phân l p và đ nh danh Ph n l n chúng thu c các khung alcaloid crinin (5,10 b-enthanophenanthridin), lycorin (benzopyrano-(3,4 g)-indol) và tazettin (2-benzopyrano-(3,4 c)-indol) [116]

Kho ng 100 các h p ch t non-alcaloid đ c phân l p và đ nh danh, chúng thu c các nhóm flavonoid, chromon, coumarin, terpenoid, steroid, ionon, alcohol, aldehyd, ceton, acid, ester và hydrocarbon m ch dài Các h p ch t phenol là nhóm chi m u

th trong nhóm h p ch t non-alcaloid [107], [116]

Thân hành là b ph n đ c nghiên c u nhi u nh t, các h p ch t alcaloid và flavonoid

đ c tìm th y ch y u t b ph n này

1.2.1. Thành ph n hóa h c c a các loài trong chi Crinum

1.2.1.1 Alcaloid c a chi Crinum

Alcaloid khung crinin: đây là nhóm đ i di n cho alcaloid Crinum do ph n l n các

alcaloid đ u thu c khung này v i h n 80 alcaloid đã đ c phân l p C u trúc các alcaloid khung này thay đ i theo 3 c u trúc sau [107], [116]:

Hình 1.2:Các c u trúc hóa h c c a alcaloid khung crinin

Alcaloid khung lycorin: lycorin là nhóm đ c x p th hai sau nhóm crinin v s

l ng alcaloid v i kho ng 40 alcaloid đã đ c phân l p i di n lycorin, đ c tìm

th y trong 30 loài Crinum K đ n là hippadin, pratorimin và pratorinin [107], [116]

Alcaloid khung tazettin: kho ng 13 alcaloid thu c khung này, đ i di n là tazettin và criwellin đ c tìm th y trong 6-7 loài Crinum C u trúc các alcaloid khung tazettin

thay đ i v trí R1, R2, R3, R4, m t s ít (3 alcaloid) có c u trúc vòng methylendioxy

m và đ c thay b ng 2 nhóm CH3O- (ornamin - C18H21NO3); 2 nhóm -OH (ornazidin-C16H20NO3); 1 nhóm -OH và 1 nhóm acetyl (ornazamin - C18H22NO4)

Hình 1.3: C u trúc hóa h c alcaloid khung lycorin (A) và khung tazettin (B)

Alcaloid ki u khung belladin: 7 alcaloid đã đ c tìm th y, đ i di n là belladin [57], latisodin và latisolin [55] đ c phân l p t C asiaticum và C latifolium

Alcaloid khung galanthamin: galanthamin là alcaloid đ i di n cho khung này, đ c

tìm th y trong thân hành c a 8 loài Crinum Các alcaloid còn l i (kho ng 7 alcaloid)

có c u trúc thay đ i theo khung Galanthamin

(C) (D)

Hình 1.4:C u trúc hóa h c khung belladin (C) và c u trúc khung galanthamin (D)

Alcaloid khung lycorenin: các alcaloid có c u trúc thay đ i các v trí R1, R2, R3, R4 Riêng hippeastrin có c u trúc vòng methylendioxy v trí R1 và R2

(E) (F)

Hình 1.5:C u trúc hóa h c khung lycorenin (E) và c u trúc khung cheryllin (F)

Các ki u khung còn l i có ít s l ng alcaloid h n:

Alcaloid khung narciclasin: crinasiadin - C14H9NO3, crinasiatin - C22H17NO4 và narcicrinin - C14H17NO5

Alcaloid khung cheryllin: cheryllin - C17H19NO3 và latifin - C17H19NO3

Alcaloid khung phenanthridin: trisphaeridin - C14H9NO2 và methylendioxyphenanthridin

3-hydroxy-8,9-Alcaloid khung augustamin: augustamin - C17H19NO4.

Alcaloid khung latindin: latindin - C41H31N3O10

1.2.1.2 Các nhóm h p ch t non-alcaloid trong chi Crinum

Kho ng 100 h p ch t đã đ c đ nh danh, flavonoid là nhóm đ c công b v i s h p

ch t đ c phân l p nhi u nh t [107], [116]

Nhóm flavonoid: 24 flavonoid đã đ c phân l p t thân hành và hoa Hai flavonoid 3’4’-dihydroxyflavan và 7-hydroxy-8-methoxyflavanon đ c phân l p t Crinum

latifolium, l n đ u tiên tìm th y trong h Amaryllidaceae [104] Isoliquiritigenin

(2’,4,4’-trihydroxychalcon) t C bulbispermum là c u trúc chalcon đ u tiên đ c tìm

th y trong chi Crinum [112]

Flavonoid trong chi Crinum có c u trúc thu c các nhóm sau:

C u trúc flavonoid nhóm flavan (A) C u trúc flavonoid nhóm flavanon (B)

C u trúc flavonoid nhóm flavon (C) (D) C u trúc flavonoid nhóm chalcon (E)

Hình 1.6:C u trúc hóa h c c a các flavonoid trong chi Crinum

Nhóm coumarin: ch m i đ c tìm th y trong loài C latifolium [104], hai h p ch t

coumarin g m 4-[(senecioyloxy)methyl]-3-4-dimethoxycoumarin - C17H20O6 và [(senecioyloxy)methyl]-6-7-dimethoxycoumarin - C17H20O6

4-Nhóm terpenoid và sterol: các steroid th c v t nh stigmasterol, sitosterol,

dihydrositosterol đã đ c tìm th y trong vài loài c a chi Crinum

Nhóm acid béo: h n 20 acid béo nh linoleic, palmitic, arachidic, myristic, oleic, palmitic, stearic… đ c đ nh danh t d ch chi t n c

R 3

O

R 1

Nhóm carbohydrat: g m resin, pectin, hemicellulose, glucan và polysaccharid Thân

hành loài C amabile ch a 5,4% saccharid; 8,7% pectin, 8,2% hemicellulose Glucan

A và B t loài C latifolium, glucan A ch a 12 đ n v glucose và 110 g c c a glucose Glucose, arabinose, xylose, galacturonic và glucuronic acid đ c phân l p t d ch chi t n c c a thân hành loài C bulbispermum

1.2.2. Thành ph n hóa h c c a TNHC - Crinum latifolium L

- Thành ph n hóa h c loài C latifolium kh o sát t n m 1982 do nhóm tác gi n c ngoài nh Ghosal S [53], [55], [56], [57], [58], [59], [60], [61], [62], Kobayashi S [83], [84] th c hi n

- Nh ng nghiên c u Vi t Nam v thành ph n hóa h c c a loài này ph i k đ n các công trình c a các tác gi Phan T ng S n [9], Nguy n Công Hào [8], [33], [102], Nguy n H i Nam [103], [104], Võ Th B ch Hu [11], [12], [13], [14]

- Tác gi Nguy n Th Ng c Trâm v i các công trình nghiên c u ch y u v tác d ng sinh h c [31], [106], [107], [139]

Alcaloid c a TNHC: đ n nay đã có 36 alcaloid đ c phân l p và đ nh danh, ph n l n

thu c khung crinin và lycorin (B ng 1.1)

- Thành ph n và hàm l ng alcaloid thay đ i đáng k theo th i k sinh tr ng, th i

k tr c và sau khi cây ra hoa [58], [62], [106]

- ã có 12 alcaloid đ c phân l p t TNHC tr ng Vi t nam, tài li u [9] công b nhi u nh t v i 12 alcaloid t d ch chi t lá và thân hành Alcaloid thu c khung crinin chi m s l ng nhi u nh t, g m 7 alcaloid: 6-hydroxybuphanidrin [9], ambellin [8], [9], [11]; crinin [8], [9]; powellin [9]; crinamidin [8], [9], [11]; 6-hydroxycrinamidin [8], [9], [11], [102]; 6-hydroxyundulatin [9]; khung lycorin có pratorinin [9], lycorin [8], [9]; hippadin [9], lycorin-1-OAc [9], khung augustamin có augustamin [9], [11] -Tài li u [11] công b 4 alcaloid t d ch chi t lá, trong đó 6-hydroxycrinamidin là

h p ch t alcaloid t nhiên l n đ u tiên đ c công b (n m 1998)

Nhóm carbohydrat: glucan A và B [60]; lectin (methyl- -mannopyranosid) đ u đ c phân l p t d ch chi t thân hành [78]

Coumarin: t d ch chi t methanol, tài li u [104] công b h p ch t coumarin

4-senecioyloxymethyl-6,7-dimethoxycoumarin Hi n t i thành ph n này ch a đ c

phát hi n trong các loài Crinum khác

Nhóm acid h u c : para-hydroxycinnamic methyl ester và 2,5-dihydroxycinnamic

ethyl ester t d ch chi t lá t i [33]

Flavonoid c a TNHC: so v i nhóm alcaloid thì flavonoid có s l ng các h p ch t

đ c công b ít h n, g m 8 flavonoid sau [33], [103], [104]:

Hình 1.7: C u trúc hóa h c các h p ch t flavonoid trong cây TNHC

O

OH OH

O

OH OH

O

OH OH

OMe

O

OH OH

OCH=CH 2

O

OMe OMe

OH

O OH OH

O

OH OMe

B ng 1.1: Alcaloid c a TNHC Crinum latifolium L

3 Ambellin [9],[11],[57],[92],[100],[126] C18H21NO5 OMe H OMe OH

11 Undulatin [84],[92], [100], [130], [129] C18H21NO5 OMe H OMe H

R 2

H

N O

O

OH OH

OH

N

R4O MeO

R 3

R 1 O

R2

O O

O

CH3

OH

O O

N O

O

O OH

O

O N

O OH

N

1.3. T NG QUAN TÁC D NG SINH H C CHI CRINUM VÀ TNHC

1.3.1. Tác d ng sinh h c c a m t s loài trong chi Crinum

Các loài trong chi Crinum đ c quan tâm do có nhi u tác d ng sinh h c Nhóm đ c chú ý nhi u nh t là alcaloid [52], [58], [107], [116], k đ n là flavonoid [31], [103]

- Tr c đây, các loài này đ c s d ng nh thu c c truy n:

Thân hành và lá t i c a các loài C amabile, C asiaticum, C defixum, C giganteum

đi u tr các ch ng m n nh t, s ng l , s ng do viêm [4], [21], [58]

Cao c n và cao n c chi t t thân hành c a loài C zeylanicum đ c s d ng nh v

thu c c truy n trong đi u tr các ch ng viêm, v t th ng m ng m , tr r n c n D ch

ép t lá t i dùng đ tr ch ng đau tai [107], [125]

- Các công trình khoa h c cho th y các loài trong chi Crinum th hi n ho t tính sinh

h c chung c a h Amaryllidaceae [52], [107], [116] nh sau:

1.3.1.1 Tác d ng kháng acetylcholinesterase:

- Th nghi m sàng l c kh n ng kháng acetylcholinesterase b ng ph ng pháp SKLM, ch t đ i chi u galantamin trên 15 m u cao methanol t thân hành c a 15 loài

trong h Amaryllidaceae K t qu cho th y cao chi t C powellii và Amaryllis

belladonna n ng đ 10 mg/ml th hi n ho t tính cao nh t [117]

- Cao thân hành c a loài C bulbispermum có kh n ng kháng acetylcholinesterase

v i IC50 = 0,14 ± 0,039 µg/ml và C moorei v i IC50 = 21,5 ± 8,40 µg/ml Ho t tính

này đ c gi i thích là do thành ph n alcaloid [34], [51]

- Cao methanol t thân hành c a loài C jagus (45,1%) và C glaucum (40,8%) n ng

đ 100 µg/ml Tính kháng acetylcholinesterase có liên quan đ n s hi n di n c a nhóm hydroxy trong c u trúc c a alcaloid [66]

1.3.1.2 Tác d ng ch ng oxi hóa:

- Li u 200 mg/kg, cao ethanol c a loài C asiaticum làm gi m l ng đ ng trong máu, gi m cholesterol, triglycerid đ c quan sát sau 15 ngày đi u tr ng th i, các

ch s men gan đ u gi m ch ng t cao chi t có th b o v t bào gan theo c ch

ch ng oxi hóa trên mô gan c a chu t b ti u đ ng [71]

- Cao methanol C moorei ch ng oxi hóa v i EC50 = 5,06 ± 1,54 (µg/ml) t ng đ ng

- Cao n c C bulbispermum có ch s kháng oxi hóa là 42,08 ± 2,25 so v i ch t đ i

ch ng d ng butylated hydroxy toluen 77,22 ± 1,27 (0,1 mg/ml) [113]

Các tác gi đ u cho r ng ho t tính ch ng oxi hóa là do vai trò c a nhóm flavonoid và tanin có trong cây

1.3.1.3 Tác d ng kháng viêm:

Các th nghi m đ u th c hi n trên đ ng v t là chu t, m u th là cao chi t n c ho c methanol t thân hành

- Ho t tính kháng viêm theo các c ch khác nhau: cao methanol C asiaticum theo

c ch kháng histamin li u 50 mg/kg khi th c nghi m trên chu t; cao C moorei

kháng enzym COX-1 (IC50 = 99,2 ± 0,96) và COX-2 (IC50 = 75,5 ± 1,5) [51]

- Ho t tính kháng viêm c a cao n c t thân hành C giganteum li u 200 mg/kg t ng

đ ng v i diclofenac li u 5 mg/kg [77]

- Cao chi t n c C glaucum li u 400 mg/kg c ch 60,78% c n d ng ph qu n trên

chu t th nghi m, ch t đ i ch ng natri cromoglycat là 70,41% (50 mg/kg) [109]

1.3.1.4 Tác d ng gi m đau:

Cao n c chi t t thân hành cùa loài C bulbispermum th hi n kh n ng gi m đau theo c ch gi m đau opioid [113], C giganteum li u u ng 200 mg/kg c ch c n đau khi so sánh v i aspirin [77]; phân đo n alcaloid c a loài C augustum th hi n

c hai ho t tính kháng viêm và gi m đau (400 mg/kg) [115]

1.3.2. Tác d ng sinh h c và công d ng c a TNHC (Crinum latifolium L.)

Dân gian s d ng TNHC nh thu c c truy n: thân hành ho c lá TNHC đ c xào nóng ho c giã đ p bên ngoài trong đi u tr đau kh p, m n nh t, áp xe m ng m [1]

D ch ép t lá làm thu c tr đau tai [52] D ch chi t n c đ c s d ng đ ch a ung

th vú, ung th t cung, ung th tuy n ti n li t, ung th h u h ng, ch a b nh đ ng tiêu hóa, tr viêm h ng [1], [4]

R t nhi u công trình khoa h c công b v ho t tính sinh h c c a loài này trên c in

vitro và in vivo Ph n l n các công trình do tác gi Vi t Nam ho c ph i h p v i tác

gi n c ngoài, đ c th c hi n trên cao chi t t lá TNHC và các s n ph m có TNHC Các tác d ng đ c công b là tính kháng kh i u, kháng viêm, kháng oxi hóa và kích

thích mi n d ch

Các công trình nghiên c u tác d ng sinh h c c a TNHC nh sau:

- Cao methanol chi t t lá c ch NF- B, quá trình này liên quan đ n tính kháng viêm

và kháng ung th [103]

- Cao methanol và cao n c chi t t r , thân hành lá và cao alcaloid c a TNHC c

ch s phân bào trên mô hình Allium Test , đ c đ i v i t bào trên mô hình Brine

Shrimp Test K t qu đ c so sánh v i ch t đ i ch ng colchicin [11]

- Trên mô hình gây ung th th c nghi m trên chu t b ng cách c y truy n t bào ung

th sarcoma TG-180: cao c n và cao alcaloid ng n ch n hi u qu giai đo n sinh và phát tri n c a t bào ung th [11]

- Cao chi t b ng n c nóng có tác d ng kích thích s sinh s n c a t bào lympho T

trong th nghi m invitro trên b ch c u đ n nhân to ngo i vi l y t máu ngo i vi ng i

Trong th nghi m in vivo, tác d ng c ng t ng t : kích thích s sinh s n và ho t hóa

t bào lympho T trong máu ngo i vi chu t [139] ng th i cao chi t này c ng c

ch s phát tri n c a t bào sarcoma th c hi n trên chu t [107], ho t tính kháng oxi

hóa, kháng viêm in vitro [95]

- c ch s phát tri n c a t bào ung th và h i ph c ch c n ng mi n d ch in vitro

là hai hi u qu đáng chú ý khi gi i thích tính kháng ung th c a cao chi t t lá Crinum

latifolium [95]

- B nh vi n h u ngh Vi t Xô đã đi u tr cho 158 b nh nhân b u tuy n ti n li t và u

x t cung t d ch chi t lá TNHC, trên 60% b nh nhân đ c ch a kh i [16]

- S n ph m Crillin T ch a thành ph n alcaloid và flavonoid c a TNHC đ c th nghi m trên t bào lympho ng i bình th ng và b nh nhân ung th vòm m i h ng

b suy gi m mi n d ch K t qu cho th y s l ng t bào lympho T t ng g n v i nhóm

s d ng levamisol ho c m nh h n levamisol khi th trên t bào lympho b nh nhân

đã có suy gi m mi n d ch [31]

- S n ph m Panacrin có thành ph n TNHC và m t s d c li u khác đ c nghiên c u lâm sàng v tác d ng b d ng (t ng l c, t ng tr ng, t ng tính v n đ ng trên chu t suy dinh d ng); ch ph m có đ an toàn cao [25] S d ng Panacrin trong h tr

đi u tr ung th d dày sau ph u thu t cho hi u qu rõ r t: các ch tiêu v tr ng l ng

c th , huy t h c có s khác bi t có ý ngh a gi a nhóm ch ng và nhóm nghiên c u, thu c đ c dung n p t t [18]

- Viên nang TNHC tác d ng đi u tr r i lo n ti u ti n b nh nhân phì đ i lành tính tuy n ti n li t, k t qu đ t trên 96% Thu c không gây bi n đ i ch s sinh lý, huy t

h c, hóa sinh, ch c n ng gan, th n, tu n hoàn, máu c ng nh ch a gây tác d ng không mong mu n h tiêu hóa, th n kinh trung ng và th n kinh th c v t [19]

- Viên Tadimax có thành ph n chính là cao chi t t lá TNHC và m t s d c li u khác c i thi n r i lo n ti u ti n c a ch ng phì đ i lành tính tuy n ti n li t Th lâm sàng so sánh v i Tadenan trên 157 b nh nhân: đáp ng t t 42%, khá 48% Thu c tác

d ng ph trên h tiêu hóa, m n ng a, chóng m t (10%) Các bi n đ i v tim m ch, huy t h c, sinh hóa sau 2 tháng đi u tr đ u trong gi i h n bình th ng [26]

- Crilin T là s n ph m m i t TNHC có tác d ng t ng c ng mi n d ch t ng đ ng levamisol hay m nh h n levamisol Thành ph n c a Crilin T bao g m các alcaloid và flavonoid c a Trinh n Crila Nghiên c u đ c ti n hành tr c ti p trên các t bào lympho tách t ng i bình th ng v lâm sàng và t các b nh nhân ung th vòm m i

h ng và nuôi c y in vitro 48 gi áp ng v i m u th nghi m c a t bào lympho b suy gi m mi n d ch m nh h n đáp ng c a t bào lympho ng i bình th ng [31]

Tác d ng sinh h c c a m t vài h p ch t tinh khi t đ c phân l p t TNHC:

Các h p ch t alcaloid:

Alcaloid ki u khung crinin:

- Các th nghi m sàng l c sinh h c ch ng t crinamin và haemanthamin có hi u qu trong th nghi m gây ch t t bào ung th theo ch ng trình n ng đ µM C u n i

v trí C-2 và nhóm –OH t do C-11 là nh ng v trí đóng vai trò quan tr ng trong tác d ng d c lý này [96]

- Pratorimin và undulatin kháng l i s phát tri n c a các t bào gây ung th ph i trên chu t th c nghi m [58]

- Crinafolin và crinafolidin: ho t tính kháng kh i u, làm gi m s t ng tr ng c a t

bào u báng S-180 trên th nghi m in vivo trên chu t [61]

- Lycorin, crinamin và 6-hydroxycrinamin tách t thân hành loài C delagoense ch ng

l i t bào ung th BL-6 trên chu t [101]

- Crinin và 6-hydroxybuphanidrin kháng s t ng sinh t bào, hi u qu trong vi c

ch ng l i s t ng sinh dòng t bào ung th ng i HL-60 và MDA-MB-23 [38]

- Các alcaloid crinin, 6-hydroxybuphanidrin và 6-ethoxybuphanidrin ch ng l i s

t ng sinh trên các dòng ung th ng i [123]

Alcaloid ki u khung lycorin:

i di n là lycorin, alcaloid đ c tìm th y trong r t nhi u loài c a h Amaryllidaceae Nhi u công trình nghiên c u ho t tính c a lycorin cho th y alcaloid này có nhi u tác

d ng nh kháng acetylcholineseterase, kháng ung th , kháng viêm, kháng oxi hóa:

- Lycorin hydroclorid ng n ch n m t cách ch n l c và đ ng th i s phát tri n c a t bào ung th bu ng tr ng (dòng Hey1B) K t qu nghiên c u này h a h n m t li u pháp đi u tr ung th m i [39]

- c ch sinh t ng h p protein và DNA trong t bào chu t, ki m hãm s t ng tr ng

in vivo c a kh i u, làm gi m kh n ng s ng c a t bào ung th [58]

- V i các dòng t bào ung th nh Hep-G2 (ung th gan), FI (ung th màng t cung),

RD (ung th màng tim), lycorin đ u th hi n ho t tính gây đ c t bào v i IC50 là

0,15 µg/ml Các nhóm hydroxy v trí C1 và C2 đóng vai trò quan tr ng đ i v i ho t tính này vì các h p ch t 1,2-di-O-acetyllycorin và lycorin-1,2-di-O- -D-glucosid không còn ho t tính [9]

- Ho t tính kháng acetylcholineseterase in vitro đ c xác đ nh b ng ph ng pháp quang ph v i thu c th Ellman, IC50 = 29,3 ± 3,15 ( g/ml), ch t đ i ch ng physostigmin IC = 1,51 g/ml [49]

- Lycorin c ng can thi p vào s t ng h p acid ascorbic chu t th nghi m, chu t b

xu t huy t d i da khi tiêm lycorin liên ti p trong 10 ngày v i li u 10 µg/g Hi n

t ng này m t đi n u tiêm b sung acid ascorbic [46]

- Ho t tính kháng viêm, gi m đau, b o v gan c a lycorin đ c th nghi m trên chu t

K t qu kh o sát cho th y % ho t tính gi m đau n ng đ 1 mg/kg là 11,30 ± 2,61 (%), so v i morphin 10 mg/kg 51,91 ± 10,57 (%)

- Ho t tính b o v t bào gan n ng đ 2 mg/kg v i các thông s ALT và AST (U/l)

- Lycorin, homolycorin và haemanthamin kháng HIV v i IC50 = 0,4-7,3 g/ml [124]

- 1-O-acetyllycorin gây đ c t bào IC50 = 4,5 µg/ml trên dòngHep-G2 [9]

- Hippadin tác đ ng gi m kh n ng th thai trên chu t khi tác đ ng c ch thu n ngh ch trên t bào m m c a chu t c ng đ c giai đo n tr c khi sinh tinh [53]

- 1,2- -epoxy ambellin li u 5 µg/ml ch t này có tác d ng đi u hòa lympho bào lá lách chu t H n h p c a ambellin và 1,2- -epoxyambellin ch ng phân bào đ c so sánh

v i ch t đ i chi u concavalin [56]

- Hippadin và 6 -hydroxybuphanisin gây đ c t bào khi th nghi m trên t bào b ch

c u T4 [52]

Các h p ch t non-alcaloid:

- Isoquercitrin th hi n kh n ng ch ng oxi hóa đ c xác đ nh b ng ph ng pháp đánh b t g c t do v i thu c th DPPH, IC50 = 17,9 ± 1,7 (µM/l); kháng tyrosinase

v i % c ch 54,55 n ng đ 1000 µM [138]

- Astragalin th hi n ho t tính kháng viêm gây ra b i lipopolysaccharid trên ph i

chu t b t n th ng Sáu gi sau khi tiêm lipopolysaccharid, n ng đ các cytokin nh TNF-a, interleukin-1 (IL-1) và interleukin-6 (IL-6) t trong d ch ph i t ng đ t ng t Tuy nhiên, khi chu t đ c đi u tr d phòng v i astragalin (50 – 75 mg/kg) thì các cytokin này gi m m t cách tuy n tính theo li u s d ng [122] Astragalin còn có tác

đ ng ch ng l i g c t do gây tán huy t trên t bào h ng c u ng i [41]

- Kaempferol là h p ch t polyphenol ch ng oxi hóa đ c tìm th y trong nhi u loài

th c v t, nhi u nghiên c u cho th y kaempferol làm gi m nguy c các b nh mãn tính

đ c bi t là ung th Kaempferol giúp c th ch ng l i g c t do liên quan đ n s phát tri n c a b nh ung th và ng n ch n s phát tri n c a t bào ung th c p đ phân

t , kaempferol đ c cho là có th đi u ch nh m t s y u t quan tr ng trong truy n tín hi u c a t bào liên quan đ n quá trình apoptosis, s hình thành mao m ch, quá trình kháng viêm và s di c n c a t bào [35]

- 4-senecioyloxymethyl-3,4-dimethoxycoumarin c ch m nh dòng t bào HUVEC

in vitro, t l c ch là 53,5% n ng đ 1 µg/ml [104]

- Glucan A và glucan B b o v s gi m b ch c u do nh h ng c a các tác nhân nh

Tween-80 gây ra K t qu này gi i thích vi c s d ng cao chi t toàn ph n t C

latifolium trong vi c đi u tr r i lo n d ng [60]

- Lectin không th hi n kháng các dòng t bào ung th trên ng i Tuy nhiên th hi n

tính kháng khu n in vitro, kháng l i s tái t h p poxvirus [79]

- Esculetin gây t ng mi n d ch trên h th ng đ i th c bào và t bào lympho th

nghi m in vivo và in vitro trên chu t, đây c ng là c ch tác đ ng kháng ung th c a nhóm h p ch t coumarin nói chung [85]

1.4 CHI T CAO TOÀN PH N T D C LI U B NG DUNG MÔI

ch t l ng và hi u qu c a s n ph m [30]

- Th nghi m so sánh ph ng pháp chi t s d ng sóng siêu âm, vi sóng, ph ng pháp SFE cho th y chúng đ u có hi u su t chi t cao h n so v i chi t ng m ki t [111] Hi n nay đã có nh ng thi t b chi t xu t qui mô l n, tuy nhiên vi c ng d ng ch a ph

bi n, ph n l n chúng đ c s d ng đ chu n b m u đ phân tích b ng các ph ng pháp SKLM, HPLC [87], [135], CE [136], UPLC [131]

- Chi t xu t b ng dung môi siêu t i h n (ph ng pháp SFE): là ph ng pháp chi t

b ng các ch t siêu t i h n đã đ c ng d ng thành công trong nhi u l nh v c môi

tr ng, d c ph m, th c ph m và h p ch t t nhiên Hi n nay công ngh này đ c

s d ng ph bi n đ chi t xu t các h p ch t có ho t tính sinh h c Ph ng pháp này

có nhi u u đi m h n so v i ph ng pháp truy n th ng, đ c bi t là s n ph m chi t không ch a dung môi [37] Nguyên lý c b n ph ng pháp chính là đ hòa tan c a các ch t c n chi t vào dung môi nhi t đ và áp su t t i đó dung môi tr ng thái siêu t i h n [6]

Trong công ngh SFE, dung môi thông d ng nh t là CO2 [47] ây là dung môi đ c FDA và EFSA công nh n v m c đ thân thi n v i môi tr ng [65] nhi t đ và

áp su t thông th ng CO2 tr ng thái khí Nh ng khi nhi t đ trên 31,1 oC và áp su t trên 73,9 bar, CO2 r i vào vùng tr ng thái siêu t i h n T i đi u ki n này t tr ng c a hai pha l ng-khí b ng nhau, ranh gi i phân bi t gi a 2 pha bi n m t Lúc này CO2

mang đ c tính c a c ch t l ng và ch t khí [91], [97], [99], tr ng thái v t lý này đ c

mô t nh m t ch t l ng r t l u đ ng nên còn g i là l u ch t [6]

- ng d ng SFE v i dung môi CO2đã đ c ng d ng đ chi t xu t nhi u nhóm h p

ch t t nhiên nh tinh d u [40], lipid [119], phenolic [120], saponin [121], coumarin [118], flavonoid [90], thu c c truy n [75], [137] SFE c ng đ c s d ng nh

ph ng pháp chi t hay làm s ch thu c tr sâu các s n ph m có ngu n g c d c li u [75], [86]

Ngoài trang thi t b t n kém và v n hành ph c t p, nh c đi m l n nh t c a SFE là

c n ph i th c hi n nhi u kh o sát đ tìm các thông s t i u áp su t, th i gian, nhi t

đ , kh i l ng m u, dung môi h tr và t l dung môi h tr [23]

- Ph n l n alcaloid t n t i trong th c v t đ u d ng mu i, đây là tr ng i l n khi ng

d ng ph ng pháp SFE đ chi t xu t Vì v y h u h t các công trình nghiên c u v chi t xu t alcaloid đ u ph i s d ng dung môi h tr Các dung môi h tr thông

d ng đ c kh o sát là methanol, ethanol và n c [64], [89], [99], [128]

Các base h u c nh methylamin, diethylamin, tetrahydrofural c ng th ng đ c nghiên c u đ t ng kh n ng hòa tan c a alcaloid d ng base s phù h p h n trong chi t alcaloid b ng ph ng pháp SFE [82]

- chi t alcaloid c a loài Scopolia japonica c n ph i thêm diethylamin m i c i

thi n hi u su t chi t hyoscyamin và scopolamin [42]

1.5 CÁC PH NG PHÁP NGHIÊN C U THÀNH PH N HÓA H C

C A CÂY TRINH N HOÀNG CUNG

1.5.1 Các ph ng pháp s c ký ng d ng phân l p h p ch t tinh khi t

- Hai ph ng pháp thông d ng đ c s d ng đ phân l p các h p ch t tinh khi t t cao toàn ph n là s c ký c t và s c ký l p m ng đi u ch [8], [9][11], [33], [57], [83], [84]; k t h p s c ký l ng trung áp và s c ký c t nhanh đ tách phân đo n, các h p

ch t tinh khi t t các phân đo n đ c k t tinh l i trong dung môi [9]

Ch t h p ph thông d ng nh t là silica gel, ho c Sephadex LH-20 đ tách các h p

ch t có phân t l ng l n [8] R a gi i b ng h n h p dung môi t ether d u h a, n–hexan, cloroform, ethyl acetat đ n methanol

- Các h p ch t sau khi phân l p đ c ki m tra đ tinh khi t b ng SKLM, phát hi n

b ng ánh sáng t ngo i b c sóng 254 và 365 nm, h i iod và các TT đ c tr ng cho

t ng nhóm ch c nh FeCl3 1% [33], [57] ho c TT Dragendorff [9], [57]

1.5.2 Các ph ng pháp s c ký ng d ng trong đ nh tính và đ nh l ng

1.5.2.1 Ph ng pháp GC-MS:

- Alcaloid c a lá TNHC đ c t o d n ch t trimethyl silyl ether Có 6 h p ch t đ c

đ nh danh: pratorimin, ambellin, crinafolin, cherrylin, powellin, pancrassidin [13]

- Thành ph n alcaloid c a lá TNHC thu hái hai th i k tr c và sau khi ra hoa đ c

đ nh danh b ng k thu t GC–MS Các alcaloid đ c đ nh danh ph n l n có c u trúc thu c khung crinin:

T r c khi cây ra hoa: undulatin chi m hàm l ng cao nh t (19%), đ n crinamidin

(14%) Crinamidin, 6-hydroxycrinamidin gia t ng hàm l ng 6-hydroxycrinamidin

và 6-hydroxypowellin không xu t hi n tr c khi cây ra hoa

Sau khi cây ra hoa: không xu t hi n buphanidrin và 6-hydroxybuphanidrin, đ ng th i

hàm l ng undulatin, 6-hydroxyundulatin gi m đáng k [106]

1.5.2.2 Ph ng pháp HPLC:

nh l ng alcaloid: ch t đ i chi u 6-hydroxycrinamidin ho c crinamidin

- M u th là alcaloid chi t t lá TNHC đ c hòa tan HCl 0,1 N; pha đ ng g m dung

d ch KH2PO4 0,01 M (pH 2,26) – methanol (95 : 5), b c sóng 224 nm Hàm l ng 6-hydroxycrinamidin là 0,024 ± 0,002% tính trên d c li u khô [11], [12]

- M u th đ c r a gi i gradient b ng dung d ch đ m phosphat 100 mM (pH 3) – acetonitril, b c sóng 285 nm Hàm l ng crinamidin trong d c li u, c m và thành

ph m viên Crila l n l t là 989,1± 45,0; 146,0 ± 6,5; 74,7 ± 3,8 (µg/g) [24]

- M u th là alcaloid chi t t hoa TNHC đ c hòa tan trong HCl 0,1 N và đ c x

lý qua SFE v i dung môi là đ m phosphat 100 mM (pH 3)–acetonitril (9: 1) B c sóng phát hi n 212 nm, đ u dò UV-Vis Hàm l ng crinamidin trong n hoa nh , búp

ch a n và hoa đã n l n l t là 0,0262; 0,0263 và 0,0122 (%) [28]

nh l ng flavonoid: ch t đ i chi u là kaempferol M u th là b t lá và hoa TNHC

đ c chi t flavonoid aglycon b ng cách th y phân m u th v i HCl 10%

- Hàm l ng kaempferol đ c xác đ nh b ng HPLC, đ u dò UV-Vis M u th là flavonoid aglycon chi t t hoa TNHC Pha đ ng là dung d ch đ m phosphat 100 mM (pH 3) – acetonitril (gradient) B c sóng 320 nm Hàm l ng kaempferol trong m u

1.5.3 Các ph ng pháp xác đ nh c u trúc

- Sau khi xác đ nh đi m ch y, c u trúc các h p ch t tinh khi t đ c xác đ nh b ng

ph ng pháp ph nghi m: UV, IR, MS, NMR (1H-NMR và 13C-NMR)

- Ch t đ i chi u hóa h c đ c phân lo i theo các m c đ nh sau [132]:

Ch t đ i chi u hóa h c g c (PCRS): là ch t đ c công nh n r ng rãi, các ch tiêu

ch t l ng phù h p v i tài li u công b , có hàm l ng đ c ch p nh n làm chu n

đ nh l ng mà không c n ph i so sánh v i m t ch t hóa h c khác

Ch t đ i chi u hóa h c th c p (SCRS): là ch t đ i chi u mà các tính ch t hay ch

tiêu ch t l ng đ c xác đ nh b ng cách so sánh v i m t ch t đ i chi u s c p Trong quá trình thi t l p SCRS có s d ng PCRS đ so sánh

1.6.2 Thi t l p ch t đ i chi u g c

- Quy trình thi t l p PCRS g m các b c: đánh giá nhu c u, m c đích s d ng, ch n nguyên li u, ph ng pháp ki m nghi m, xác đ nh hàm l ng, đóng gói, phân ph i

Th c hi n theo h ng d n c a tài li u do t ch c y t th gi i (WHO) ban hành [132]

- Tùy vào m c đích s d ng mà hàm l ng c a ch t đ i chi u và s l ng phòng thí nghi m tham gia đánh giá khác nhau V i phép th đ nh tính và th tinh khi t ch c n

1 phòng thí nghi m đ t GLP ho c ISO/IEC 17025 và hàm l ng có th ch kho ng 90% Phép th đ nh l ng, hi u ch nh thi t b thì ít nh t là 3 phòng thí nghi m và hàm l ng là 99,5% ho c cao h n [132]

- Các ch t đ i chi u đóng vai trò quan tr ng trong ho t đ ng s n xu t và đ m b o

ch t l ng c a ngành D c Nh ng trên th c t , các PCRS c a Anh, M , Qu c t , Châu Âu l i quá đ t cho nhu c u phân tích hay nghiên c u th ng qui [98] Chính vì

v y, PCSR đ c các H i đ ng D c đi n c a khu v c, qu c gia ho c các phòng thí nghi m đ t chu n thi t l p trên c s c a quy trình thi t l p ch t đ i chi u th c p

1.6.3 Thi t l p ch t đ i chi u th c p

Theo h ng d n c a ASEAN và m t s tài li u c a ISO [44], [45], ngoài nh ng qui

đ nh chung, quy trình thi t l p SCRS có m t s l u ý:

1.6.3.1 Xác đ nh đ đ ng nh t

Sau khi nguyên li u thi t l p ch t đ i chi u đ c đánh giá đ t yêu c u, ti n hành đóng gói trong các l th y tinh màu nâu Vi c đóng gói đ c th c hi n trong Glove-box Các l đ ng ch t đ i chi u sau khi đóng gói đ c xác đ nh đ đ ng nh t [44], [45], [73] c a lô s n xu t theo trình t nh sau:

- S l c n đánh giá: N+ 1 l , trong đó N là t ng s l đóng đ c Ít nh t là 10 l

- K t qu đ c đánh giá b ng phân tích th ng kê:

phép th ng kê Cochran đ đánh giá đ đ ng nh t trong t ng l

phép th ng kê ANOVA m t y u t đ đánh giá đ đ ng nh t lô

1.6.3.2 ánh giá đ đ ng nh t liên phòng thí nghi m

Ít nh t ph i có 3 phòng thí nghi m tham gia đánh giá đ đ ng nh t c a ch t đ i chi u

[44], [45], [132] Giá tr n đ nh và đ không đ m b o đo c a giá tr n đ nh đ c tính theo

h ng d n c a ISO 13528 [73]

Giá tr công b đ c tính trên các giá tr trung bình có z-score ≤ 2

c l ng đ không đ m b o đo theo h ng d n c a ISO 13528 [73]

d ng sinh h c c a cây TNHC

Lu n án s k th a các k t qu đã đ c các nhà khoa h c công b và phát huy h n

n a các nghiên c u v hóa h c đ đáp ng vi c tiêu chu n hóa ngu n nguyên li u TNHC và các s n ph m có ngu n g c t d c li u này

CH NG 2: P H NG PHÁP NGHIÊN C U

2.1 NGUYÊN V T LI U

2.1.1 Nguyên li u

- Nguyên li u đ c s d ng trong lu n án là lá, thân hành và r c a cây Trinh n

hoàng cung (TNHC) – Crinum latifolium L., h Th y tiên – Amaryllidaceae đ c thu hái t i xã Bình Hòa, huy n Tây S n, t nh Bình nh các cây trên 2 n m tu i vào

các tháng 4, 5, 6 n m 2010, 2011 và 2012 Vi c xác đ nh đúng loài Crinum latifolium

L đ c th c hi n t i b môn Th c v t, Khoa D c, i h c Y D c TpHCM

- Nguyên li u sau khi thu hái đ c r a s ch, ph i khô và xay thành b t m 12%

2.1.2 Dung môi và hóa ch t

Dung môi - hóa ch t s d ng cho th nghi m chi t xu t, phân l p, SKLM: n–hexan,

diethyl ether, cloroform, aceton, ethyl acetat, ethanol, methanol, acid hydrocloric và amoniac đ t tiêu chu n phân tích Các dung môi này do Trung qu c s n xu t

Dung môi - hóa ch t s d ng cho th nghi m tinh ch h p ch t tinh khi t: n–hexan,

diethyl ether, cloroform, aceton, ethyl acetat, methanol đ t tiêu chu n phân tích, do Merck s n xu t

Dung môi - hóa ch t s d ng cho th nghi m b ng ph ng pháp HPLC và CE:

methanol, acetonitril đ t tiêu chu n HPLC; dinatri tetraborat, sodium dodecyl sulfat (SDS), natri hydroxyd, acid phosphoric đ t tiêu chu n phân tích, do Merck s n xu t

đ c xác đ nh c u trúc b ng các ph ng pháp ph nghi m Vi n ki m nghi m thu c TpHCM xác đ nh đ tinh khi t s c ký b ng HPLC

2.2 TRANG THI T B

Các trang thi t b chính:

- H th ng SFE TST 20 L x3 ( ài loan)

- H th ng CE Agilent G7100A, đ u dò DAD

- H th ng HPLC Alliance 2695-2996, đ u dò PDA

- H th ng LC-MS Micro Quattro API ESCi Multi-mode Ionization

- Máy phân tích nhi t tr ng l ng và nhi t vi sai TGA/DSC 1 Mettler Toledo

- Máy c ng h ng t h t nhân Bruker Avance 500 FTNMR Spectrometer

- Máy h ng ngo i FTIR - 8201 PC Shimadzu

- Máy quang ph UV-Vis Shimadzu 2500

- T đóng ng Labconco Protector Glove Box

- B siêu âm Elma S30H, t n s 37kHz, công su t 280W

- C t mao qu n silica nung ch y (64,5 cm; 56 cm; chi u dài hi u qu cm; 50 m)

Và các trang thi t b – d ng c thông th ng dùng trong phòng thí nghi m

- Trung tâm ki m nghi m Vnh Long

- Trung tâm ki m nghi m Bình D ng

- Nhà máy d c li u công ngh cao DOMESCO

- Dung môi – hóa ch t: c n 50%, 70% và 96%; cloroform, ethyl acetat, dung d ch

acid hydrocloric 1%, dung d ch amonoiac 25%

Kh o sát nh h ng c a n ng đ c n lên quá trình ti n hành, hi u su t và đ tinh khi t c a cao c n, P alcaloid và P flavonoid

S đ 2.1 S đ kh o sát quy trình chi t ho t ch t t cây TNHC