Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu sản xuất enzyme celllulase từ nấm mốc - Chương 2

Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu sản xuất enzyme celllulase từ nấm mốc - Chương 2.

2.1 Cấu tạo và tính chất của ligno-cellulose

Trong tự nhiên phế liệu chứa ligno-cellulose là nguồnchất hữu cơ thay thế được tạo ra trong quá trình quang hóa ởthực vật Trong công nghiệp nó được tạo ra trong quá trìnhsản xuất gỗ, giấy và bột giấy Ligno-cellulose chiếm khoảng60% toàn bộ phế liệu từ gỗ được sản xuất trên trái đất

Ligno-cellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khóđể phân cắt Tuy nhiên nó là nguồn giàu carbon và nănglượng hóa học, do đó việc tận dụng nguồn phế liệu ligno-cellulose là vấn đề rất cần thiết để duy trì vòng tuần hoàncarbon toàn cầu Về mặt hóa học, chúng gồm 2 polymermạch thẳng cellulose và hemicellulose và một polymer có cấutrúc 3 chiều lignin Cellulose được bao quanh bởi phân tửhemicellulose và lignin

Hình 2.1– Cấu trúc của ligno-cellulose

2.1.1 Cellulose [2]

Cellulose là polysaccharide chủ yếu của thành tế bàothực vật Trong bông nó chiếm trên 90%, còn trong gỗ hơn50% Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bàomột số loài VSV Ơû tế bào thực vật và ở tế bào một sốloài VSV, chúng tồn tại ở dạng sợi Khi đun sôi với acid sulfuricđặc, cellulose sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy phântrong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo thành disacarit cellobiose

Cellulose không có trong tế bào động vật Chúng làmột homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các -D-glucose-pyranose Các thành phần này liên kết với nhau bởiliên kết -1,4 glucoside Tinh bột cũng được cấu tạo bởi cácglucose này và bằng liên kết -1,4 glucoside Điểm khác biệtlà tinh bột chứa các gốc glucose phân nhánh còn cellulosechứa các glucose không phân nhánh Các gốc glucose trongcellulose thường lệch một góc 1800 và có dạng như một chiếcghế bành Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường vàđược cấu tạo như sau:

Hình 2.2- Cấu tạo phân tử cellulose

Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ

50000-2500000 Dalton Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờlực hút Van der war và liên kết hydro

Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kínhkhoảng 3nm Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi

Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không đồng nhất,chúng thường tồn tại 2 vùng:

- Vùng kết tinh: các mạch cellulose kết với nhau theomột trật tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối nhómhydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ởmạch cacbon của mạch khác Ơû û vùng này celluloserất bền vững dưới tác động của điều kiện bênngoài Enzym cellulase chỉ có tác dụng ở bề mặt hệsợi ở vùng này

- Vùng vô định hình: các mạch liên kết với nhau nhờlực Vander Waals Ở vùng này cellulose có cấu trúckhông chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bênngoài Khi gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên,enzym cellulase rất dễ tác động, làm thay đổi toàn bộcấu trúc của chúng

Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hìnhthường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài của phântử cellulose kết tinh Các cây gỗ lâu năm thường chứa lượngcellulose kết tinh nhiều, các cây thảo mộc ngược lại, chứanhiều cellulose vô định hình

Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tạidưới dạng tự do, hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi mộtsố gốc hoá học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên các dẫnxuất ete hoặc este của cellulose Một trong những dẫn xuấtđược ứng dụng rất nhiều là CMC, trong đó một số nhómhydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc –OCH2COOH

Hình 2.3–Cấu trúc của CMCTrong thiên nhiên, khi thực vật và VSV có chứa cellulose

bị chết, cellulose của chúng chỉ bị phân hủy bởi cả mộttập đoàn VSV Các loài VSV sẽ thay phiên nhau phân hủycellulose để tạo ra mùn và từ đó các thành phần cấu tạocủa cellulose lại được đi vào các con đường chuyển hóa trongchu trình chuyển hóa vô tận của thiên nhiên

Trong thực vật, cellulose thường tồn tại một lượng rấtlớn Số lượng cellulose thường không đều ở các cơ quan khácnhau trong thực vật Người ta thấy rằng, lượng cellulose ít nhất

ở lá và nhiều nhất ở thân cây, đặc biệt ở sợi bông,cellulose có thể chiếm đến 80-90%

Ơû VSV cấu trúc của cellulose không bền và không theomột trật tự như ở thực vật Ơû đó, cellulose thường thuộc loạivô định hình Chính vì thế việc phân hủy chúng thường rấtdễ thực hiện

2.1.2 Hemicellulose [1]

Hemicellulose là polysaccharide có phân tử lượng nhỏ hơnphân tử lượng của cellulose rất nhiều Chúng thường đượccấu tạo từ 150 gốc đường Các gốc đường này được nối vớinhau bằng các liên kết -1,4; -1,3; -1,6 glucoside Chúngthường là những mạch ngắn, phân nhánh Cấu trúc củahemicellulose không bền, chúng không hòa tan trong nướcnhưng dễ dàng bị phân giải bởi acid loãng hoặc kiềm

Hemicellulose cũng là thành phần của tế bào thực vậtvà tồn tại chủ yếu ở các phần như: vỏ hạt, bẹ ngô, cám,rơm rạ, trấu Khi thủy phân hemicellulose sẽ thu được cácmonosaccharide thuộc nhóm hexose như manose, galactose, nhómpentose như arabinose, xilose Tùy theo trong thành phần củahemicellulose có chứa monosaccharide nào mà nó sẽ cónhững tên tương ứng như mannan, galactan, và pentozan Cácpolysaccharide như mannan, galactan, araban và xilan đều là cácchất phổ biến trong thực vật, chủ yếu ở các thành phần

của màng tế bào của các cơ quan khác nhau như: gỗ, rơm rạ,

…

Trong thiên nhiên, loại hemicellulose dễ gặp nhất làxylan Xylan thường thấy nhiều trong rơm, rạ (chiếm khoảng30%), cây lá rộng (chiếm khoảng 20-25%) Ơû những cây lákim thường chứa ít xylan

2.1.3 Lignin [21]

Lignin là một hợp chất cao phân tử, chúng có nhiều ởthực vật bậc cao Ơû cây gỗ, lignin chiếm tới 20-30% Trongthành phần của lignin, carbon chiếm tới 69%, hydro chiếm 7%và oxy chiếm 24%

Lignin có cấu tạo vô định hình, không tan trong nước vàtrong acid vô cơ Dưới tác dụng của bisulfite natri và H2SO4 lignin

bị phân giải tạo ra các hợp chất thơm Trong thực vật chúngnhư chất ximang liên kết các tế bào lại với nhau, làm tăngđộ bền cơ học cho tế bào, tăng khả năng chống thấmnước, ngăn chặn các độc tố, các VSV từ bên ngoài

Trong suốt quá trình phát triển của thực vật, lignin đượctạo ra, không bị biến đổi sinh lý Chúng có cấu tạo rấtphức tạp, tạo thành từ sự ngưng tụ của các loại rượu khácnhau

Hình 2.4–Cấu tạo phân tử lignin

2.2 Enzym cellulase [1,2,4,23]

2.2.1 Phân loại enzym cellulase [4]

Tên gọi cellulase dùng để chỉ chung cho các enzym thamgia phân cắt hợp chất cellulose Tất cả các enzym cellulaseđều có tác dụng phân cắt liên kết -1,4 giữa 2 đơn vị glucose

và được các nhà khoa học phân ra làm 3 nhóm chủ yếu sauđây:

 1,4 -D-glucan cellobiohydrolase (EC.3.2.1.91) (CBH) Enzymcắt đầu cuối của chuỗi cellulose để tạo thànhcellobiose Enzym này còn có một loạt các tên khácnhư: cellobiohydrolase, cellobiosidase và avicellase

 1,4 -D-glucan –4- glucanohydrolase (EC.3.2.1.4) (EG).Enzym này tham gia phân giải liên kết -1,4 glucosidetrong cellulose và -D-glucanase Sản phẩm của quátrình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose.Enzym này còn có một loạt tên khác như:endoglucanase, endo 1,4 -D-glucanase, C-cellulase

 -D-glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21) Enzym nàytham gia phân hủy cellobiose tạo thành glucose.Chúng không có khả năng phân hủy cellulosenguyên thủy Trong các tài liệu khoa học, chúng cótên là cellobiase và -glucosidase

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các enzym EG có tácdụng phân cắt tốt trên cellulose vô định hình và đặc biệt cótác dụng trên cellulose biến tính như CMC, HEC Vì vậy, để xácđịnh hoạt tính enzym này người ta thường sử dụng cơ chất làCMC Còn các enzym CBH thì có tác dụng trên cellulose kếttinh, ít trên cellulose vô định hình và hầu như không có tácdụng phân cắt cellulose biến tính Trong hệ thống enzym CBH thìenzym CBH I tấn công từ đầu khử, trong khi CBH II tấn côngvào đầu không khử của chuỗi cellulose

Sự thủy phân cellulose là sự kết hợp của 3 loại enzymtrên Đầu tiên enzym EG tấn công vào giữa mạch cellulose vàgiải phóng các đầu cuối của chuỗi Tiếp sau đó các enzymCBH tiếp tục phân cắt để tạo sản phẩm cuối là cellobiose.Việc phân cắt cuối cùng tạo thành glucose là nhờ vàoenzym thứ ba -glucosidase Vì vậy tuy rằng enzym -glucosidasekhông có tác dụng trên chuỗi cellulose nhưng nó vẫn đượcxếp vào hệ thống enzym cellulase

Bảng 2.1 –Sự phân loại enzym phân cắt 1,4--glucans

Tên hệthống Tên thườnggọi EC No. Cơ chất

Liênkếtthủyphân

Sảnphẩm chínhEndo 1,4--D-glucan-

4-glucanohydrola

se

Cellulase,endoglucanase

Cellulose,1,3-1,4--

glucans

1,4-

1,4--dextrins, 1,4--

1,3-dextrins1,3-1,4--D-

glucan-4-glucanohydrola

se

Lichenase, glucanase 3.2.1.73 1,3-1,4--Lichenin,

-glucans

Kế1,4-

sau

1,3-

-Hỗn hợp1,3-1,4--dextrins1,3--D-glucan-

kết

1,4-- hoặc1,3--và sau1,3--

Hỗn hợp1,3-1,4--dextrins

1,3-

1,3--dextrins

(1,4--dextrins)Exo 1,4--D-glucan-

-glucosidase Cellobiase

3.2.1.21 glucosides -D- 1,4-1,3-

1,6-

glucose

Tuy nhiên sự phân loại này chưa thật sự thỏa đáng khimột vài enzym CBH cũng có hoạt tính như enzym EG Sự phânloại enzym cellulase trở nên phức tạp hơn khi chúng có hoạttính trên polysaccharide như xylan Do đó khóa phân loại mớicho những enzym này cũng như các enzym thủy phân liên kếtglucoside là dựa trên sự tương đồng về cấu trúc của chúng.Điều này cần những thông tin về trật tự sắp xếp cácaminoacid của chúng Hiện nay người ta phân loại các enzymthủy phân liên kết glycoside thành 111 nhóm, trong đó enzymcellulase có trong 11 nhóm (từ nhóm 5 đến nhóm 10, 12, 26,

44, 45, và 48) [23] Trong bài này, tên enzym được sử dụngtheo cách phân loại cũ

2.2.2 Mối quan hệ cấu trúc-chức năng trong enzym cellulase[4]

Enzym có cấu trúc 2 phần gồm phần xúc tác và phầnliên kết với cơ chất là đặc trưng cho enzym phân cắt celluloseđược thu nhận từ cả nấm mốc và vi khuẩn Sự tồn tại củaphần liên kết với cơ chất cũng phổ biến trên những enzymkhác tham gia phân cắt cơ chất rắn Trong enzym của nấmmốc, phần liên kết với cellulose (CBD) được liên kết vớiphần xúc tác bởi những liên kết tách biệt hoàn toàn giữa

2 phần này CBD có thể là đầu C hoặc đầu N của enzym.Trong một vài trường hợp như trong enzym E4 của vi khuẩn

Thermomonospora fusca, CBD là một phần cấu trúc bên trong

của enzym Một vài vi khuẩn được nghiên cứu sản xuấtenzym có cấu trúc 2 phần như trên Nhưng có điểm khácbiệt là các phần được liên kết đồng hoá trị và phần xúctác tham gia thủy phân cellulose và hemicellulose cũng nhưvùng liên kết với cơ chất

Hình 2.7– Cấu trúc 2 phần của enzym CBH từ Trichoderma reesei.

Phần xúc tác lớn được liên kết với phần liên kết với

cellulose nhỏ hơn

Nhiều VSV hiếu khí sản xuất số lượng lớn phức chấtcellulosome – gồm nhiều bó sợi protein liên kết không đồnghóa trị Cellulosome có thể bao gồm vài enzym EG, CBH, vànhững glycanase khác nhưng những protein cũng tham gia trongliên kết giữa cellulosome với cơ chất Mỗi một enzym riêngbiệt trong phức hệ enzym thông thường không có hoạt tínhtrên cellulose kết tinh, nhưng cellulosome thì có thể Mỗi mộtthành phần enzym được gắn với protein không phải enzymđược gọi là scaffoldin Polypeptide của scaffoldin gồm nhữngphần CBD lặp lại bên trong cấu trúc phân tử, phần nàytương tác với enzym Trọng lượng phân tử của cellulosome cóthể đến 2000kDa

Mặc dù hiện nay đã có 13 loại CBD đã được xác địnhdựa vào sự tương đồng của chúng nhưng chỉ một trong chúngtồn tại trong enzym từ nấm mốc CBD nấm mốc được phânbiệt do kích thước nhỏ của chúng (<40 aminoacid) Giống nhưphần lớn protein liên kết với carbonhydrate, sự liên kết vớicellulose chiếm ưu thế do tương tác từ các amino acid còn lại.CBD là thành phần quan trọng tạo chức năng của cellulasetrên cơ chất rắn Nếu chúng bị loại bỏ bằng các kỹ thuậtprotein thì cả hoạt tính và liên kết giữa cellulase và cơ chấtrắn đều bị giảm nghiêm trọng Trong nhiều nghiên cứu chothấy rằng liên kết giữa cellulase và cellulose là không thuận

nghịch, và đôi khi người ta cho rằng nguyên nhân là do CBD.Sự tương tác rất phức tạp, tuy nhiên được xem như là sự tácđộng lẫn nhau giữa phần xúc tác và phần liên kết, và tạo

ra kết quả trong việc liên kết với cellulose Trong enzym củanấm mốc không có bằng chứng cho rằng sự hiện diện củaCBD có vai trò tác động trong việc thủy phân cellulose kếttinh

Cấu trúc không gian của protein thể hiện chi tiết tínhchất hóa sinh của enzym Vì vậy nhiều mô hình cấu trúc của

cellulase đã được đề ra Ví dụ EG I và CBH II của T.reesei có

cấu trúc giống nhau 45% So sánh cấu trúc của chúng tathấy rằng trung tâm hoạt động của CBH I được đặt bên trongống (tunnel) được tạo thành bởi các vòng xoắn ở bề mặt.Trong khi đó ở EG I thì các vòng xoắn này ít hơn, chính vì thếenzym này có trung tâm hoạt động có diện tích tiếp xúcrộng hơn Hình dáng ống của trung tâm hoạt động trong CBH Icũng như trong các CBH khác, giải thích về mặt cấu trúc chosự hoạt động của enzym Những tunnel này càng dài giữenzym liên kết với chuỗi cellulose càng lâu và vì vậy sự tươngtác nhiều hơn khi nó di chuyển dọc theo chuỗi để thủy phânđơn vị cellobiose Trung tâm hoạt động mở của EG cho phépchúng thủy phân ở giữa mạch cellulose

Hình 2.8- Cấu trúc của EG và CBH của Trichoderma reesei

Cấu trúc này cho thấy nhóm xúc tác của CBH I đượcbao quanh rất chặt chẽ còn trong EG thì lỏng lẻo hơn.

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng củaenzym [1]

2.2.3.1 Nồng độ enzym

Trong điều kiện thừa cơ chất thì tốc độ phản ứng enzym

tỉ lệ tuyến tính với nồng độ enzym Nhưng khi nồng độenzym quá lớn tốc độ phản ứng enzym cũng tăng chậm

V= k [E]

Với v: vận tốc phản ứng

[E] nồng độ enzym

Hình 2.9– Aûnh hưởng nồng độ enzym đến tốc độ phản ứng

2.2.3.2 Nồng độ cơ chất

Mở đầu phản ứng phải tạo thành phức enzym-cơ chất,sau đó phức ES chuyển hóa tiếp tạo thành sản phẩm cuốicùng của phản ứng enzym tự do, enzym lại kết hợp với phântử cơ chất khác bắt đầu vòng xúc tác mới Nồng độ cơchất càng cao tốc độ phản ứng càng tăng nhưng nồng độ

cơ chất tăng đến mức độ nào đó thì dù nồng độ cơ chấtcó tăng nhưng tốc độ phản ứng vẫn không đổi

Hình 2.10-Aûnh hưởng nồng độ cơ chất đối với tốc độ xúc

tác ban đầu Vmax

2.2.3.3 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm

Các chất kìm hãm hoạt động của enzym thường là cácchất có mặt trong các phản ứng enzym, làm giảm hoạt tínhenzym nhưng lại không bị enzym làm thay đổi tính chất hóahọc, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng

Các chất gây kìm hãm hoạt động của các enzym baogồm các ion, các phần tử vô cơ, các chất vô cơ, các chấthữu cơ và cả protein Các chất kìm hãm có ý nghĩa lớntrong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào sinh vật

Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể làthuận nghịch hoặc không thuận nghịch Trong trường hợp cácchất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng enzym và chất kìmhãm sẽ nhanh chóng đạt được trạng thái cân bằng

Trong trường hợp chất kìm hãm không thuận nghịch, cácchất kìm hãm kết hợp với enzym bằng liên kết đồng hóatrị Ngoài ra các chất kìm hãm kết hợp với enzym còn theomột cơ chế khác mà hiện nay các nhà khoa học vẫn chưagiải thích trọn vẹn Theo đó các chất kìm hãm gắn rất chặt

với enzym tạo thành phức hợp EI Phức hợp này bị phân rãrất chậm.

 Chất kìm hãm cạnh tranh là các chất có cấu trúctương tự như cấu trúc của cơ chất Chúng thường lànhững chất kìm hãm thuận nghịch Chúng có khảnăng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzym.Khi đó chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trungtâm hoạt động Do đó cơ chất không còn cơ hộitiếp xúc với trung tâm này Và hoạt động củaenzym sẽ bị giảm

 Chất kìm hãm không cạnh tranh: nếu như trong cơchế kìm hãm cạnh tranh, các chất kìm hãm chiếmtrung tâm hoạt động của enzym thì trong cơ chế kìmhãm không cạnh tranh, chất kìm hãm không chiếmtrung tâm hoạt động của enzym mà là ở một vị tríngoài trung tâm hoạt động của enzym Kết quả sựkết hợp này chất kìm hãm làm thay đổi cấu trúckhông gian của phân tử enzym theo chiều hướngbất lợi cho hoạt động xúc tác Vì thế, các chất kìmhãm làm giảm hoạt động của enzym

2.2.3.4 Các chất hoạt hóa

Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính enzym gọi làcác chất hoạt hóa enzym Các chất hoạt hóa enzym có bảnchất hóa học rất khác nhau Chúng có thể là những anion,các kim loại từ ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng hệ thốngtuần hoàn Mendeleev, các chất hữu cơ có cấu trúc phứctạp Các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng hoạt hóa ở mộtnồng độ nhất định Vượt quá nồng độ này, chúng sẽ gâyức chế hoạt động của enzym

Ơû nồng độ hoạt hóa, các chất hoạt hóa thường làmnhiệm vụ chuyển nhóm hydrogen hoặc những chất có khảnăng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzymhoặc các chất có tác dụng phục hồi các nhóm chức trongtrung tâm hoạt động của enzym

2.2.3.5 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzym.Tốc độ phản ứng enzym không phải lúc nào cũng tỉ lệthuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ tăngđến một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt quá nhiệt độđó, tốc độ phản ứng enzym sẽ giảm và dần đến mứctriệt tiêu

Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tínhenzym sẽ giảm Khi đó enzym không có khả năng phục hồilại hoạt tính Nhiệt độ tối ưu của enzym phụ thuộc nhiều vàosự có mặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo vệ

Trong quá trình phản ứng, người ta thường cho enzymphản ứng ở nhiệt độ dưới nhiệt độ tối ưu vì nếu ta để ởnhiệt độ tối ưu thì chỉ cần sự thay đổi nhỏ cũng làm choenzym mất hoạt tính Nhiệt độ tối ưu cho enzym cellulase hoạtđộng là 45-600C

2.2.3.6 pH môi trường

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa

cơ chất, enzym và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền củaenzym Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phảnứng của enzym