Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu sản xuất cellulose VK từ Acetobacter xylinum

Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu sản xuất cellulose VK từ Acetobacter xylinum.

LỜI CẢM ƠN

Em chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Vũ Tuân, thầy đãhướng dẫn em suốt quá trình thực hiện đề tài này Trong quátrình làm việc cùng với thầy, em đã học hỏi được nhiều điềubổ ích, không chỉ là những kiến thức chuyên môn mà còn cảnhững kinh nghiệm khi làm việc Khi em gặp khó khăn trong quátrình thực hiện đề tài, thầy đã kịp thời hướng dẫn, chỉ bảotận tình

Em gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lưu Thị Ngọc Anh,những lời truyền đạt của cô thật sự bổ ích cho em trong quátrình em làm luận văn tại trường

Em gửi lời cảm ơn đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt, cô đãgiúp đỡ chúng em về mặt hóa chất phục vụ cho việc thực hiệnđề tài

Em cảm ơn cô Thùy Dương - bộ môn Công nghệ Sinh họccủa trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh đã giúpđỡ em về nguồn vi sinh vật sử dụng trong đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong bộmôn Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa thànhphố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện tốt nhất về mọi mặt giúpchúng em thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp

Tôi cũng muốn bày tỏ sự cảm ơn đến tất cả các bạnbè của tơi, họ đã giúp đỡ, đặc biệt là cho tôi thấy được sự gắnbó, sự chia sẻ, sự cảm thông cũng như là những giây phút thưgiãn trong khi làm việc

Tôi xin cảm ơn với tất cả lòng chân thành

Tp HCM, ngày 07 tháng 01 năm2008

Phan Anh Tuấn

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Acetobacter xylinum (A xylinum) là một vi khuẩn Gram âm,

có thể sản xuất một loại polysaccharide ngoại bào được gọi làcellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn có khả năng được ứng dụngrộng rãi trong công nghệ thực phẩm và các lĩnh vực khác Đểứng dụng cellulose vi khuẩn một cách rộng rãi, đòi hỏi cónguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào và ổn định Gầnđây, ứng dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao thực phẩm đãđược phát hiện và ứng dụng thực tế Với mục đích sản xuấtcellulose vi khuẩn phục vụ mục đích màng bao thực phẩm, với đề

tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” dưới điều kiện tĩnh, chúng tôi thực hiện khảo sát các

yếu tố sau:

- Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum

trên môi trường Hestrin-Schramm (HS)

- Cải thiện hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum Để khảo sát sự sinh tổng hợp cellulose, A xylinum được nuôi

cấy dưới điều kiện tĩnh trên môi trường HS ở các điều kiệnkhác nhau nhằm rút ra điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho chủng

A xylinum có sẵn Khảo sát ảnh hưởng của pH đối với quá trình tạo cellulose của vi khuẩn A xylinum được tiến hành và thấy

rằng, trong khoảng pH từ 4,0 đến pH 5,5, hiệu suất tổng hợp

cellulose của chủng A xylinum này là thích hợp nhất, lượng

cellulose đạt được có thể ~5,2 gl-1 Bên cạnh đó, tiến hành khảosát ảnh hưởng của nguồn carbon bằng cách thay đổi nguồncarbon trong thành phần môi trường nuôi cấy, chọn được nguồn

carbon thích hợp nhất cho chủng A xylinum sinh tổng hợp cellulose

là mannitol Lượng cellulose đạt được ~7,4 gl-1 Để chọn ra nguồnnitơ tốt nhất cho sự tổng hợp cellulose, một thí nghiệm được thựchiện với nguồn carbon là mannitol, nguồn nitơ được thay đổi, kếtquả cho thấy cao nấm men cho kết quả tạo cellulose tốt nhất

Lượng cellulose đạt được ~8 gl-1 g Khi khảo sát ảnh hưởng đồngthời của mannitol và cao nấm men lên quá trình tổng hợp

cellulose của A xylinum, hàm lượng cellulose thu được có thể đạt

được ~8,5 gl-1 khi thành phần môi trường HS được điều chỉnh vớihàm lượng mannitol 15,5 gl-1 và hàm lượng cao nấm men là 6,5 gl-1,

pH môi trường được chỉnh xung quanh giá trị 5,0

Với kết quả thu được trong các thí nghiệm, môi trường

nuôi cấy vi khuẩn A xylinum có tại Phòng Thí nghiệm Sinh học

trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh với mục đíchthu nhận cellulose nên bao gồm các thành phần sau: 15,5 gl-1mannitol; 6,5 gl-1 cao nấm men; 5,0 gl-1 Na2HPO4; 1,115 gl-1 acid citric; pHđược điều chỉnh về 5,0 là thích hợp cho quá trình nuôi cấy Cáckết quả quả thí nghiệm này cung cấp những thông tin hữu íchcho sự phát triển khả năng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quymô công nghiệp

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT LUẬN VĂN ii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 C ELLULOSE VI KHUẨN VÀ VI SINH VẬT TỔNG HỢP CELLULOSE 3 2.1.1 Lịch sử nghiên cứu sự sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 3

2.1.2 Cellulose vi khuẩn và tính chất của cellulose vi khuẩn 3 2.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose 6

2.2 S INH TỔNG HỢP CELLULOSE TỪ VI KHUẨN A XYLINUM 10

2.2.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A xylinum 10

2.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 11

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp cellulose 13

2.3 Ứ NG DỤNG CỦA CELLULOSE VI KHUẨN 24

2.3.1 Thực phẩm 24

2.3.2 Y học 25

2.3.3 Các ngành công nghiệp khác 25

CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28

3.1 N GUYÊN LIỆU 28

3.1.1 Chủng vi sinh vật 28

3.1.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 28

3.2 T HIẾT KẾ THÍ NGHIỆM 29

3.2.1 Khảo sát quá trình nhân giống 29

3.2.2 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose 30

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum 30

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng độc lập của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum 31

3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nguồn carbon

và nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi

khuẩn A xylinum 31

3.3 C ÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 33

3.3.1 Số lượng vi khuẩn 33

3.3.2 Hiệu suất cellulose 33

3.3.3 Phân tích thống kê 34

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35

4.1 K HẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG VI KHUẨN A XYLINUM35 4.2 K HẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CELLULOSE 36

4.3 K HẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA P H LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A XYLINUM 38

4.4 K HẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CARBON VÀ NITƠ LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A XYLINUM 40

4.4.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon 40

4.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 43

4.5 T ỐI ƯU HOÁ NỒNG ĐỘ NGUỒN CARBON VÀ NITƠ 45

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

5.1 K ẾT LUẬN 49

5.2 Đ Ề NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn 4

Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) 6

Hình 2.3: SEM của A xylinum 8

Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A xylinum 11

Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 12

Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài từ A xylinum 13 Hình 2.7: Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh và có khuấy đảo 15

Hình 2.8: Cấu trúc trong điều kiện nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo 16

Hình 4.1: Đường cong sinh trưởng của A xylinum 35

Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn trọng lượng cellulose thu được và giá trị pH tại các ngày lên men thứ 4, 5, 6, 7 36

Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A xylinum .39

Hình 4.4: Trọng lượng cellulose thu được khi nguồn carbon thay đổi 42

Hình 4.5: Trọng lượng cellulose thu được khi nguồn nitơ thay đổi 44

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose 7Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc St-BC và Ag-BC 16

Bảng 2.3: Tính chất St-BC và Ag-BC của A xylinum IFO 13693 17

Bảng 2.4: Aûnh hưởng của nguồn carbon lên sự tổng hợp cellulosecủa 23

Bảng 2.5: Các ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cellulose vi

khuẩn 26Bảng 3.1: Bảng thiết kế thí nghiệm tối ưu nguồn carbon và

nguồn nitơ 33Bảng 3.2: Bảng mã hoá các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát

34

Bảng 4.1: Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu 47Bảng 4.2: Bảng mã hoá các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát

47

DANH MỤC VIẾT TẮT

- Ag-BC: agitated bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu

nhận được dưới điều kiện nuôi cấy có khuấy đảo)

- A xylinum: Acetobacter xylinum

- A xylinus: Acetobacter xylinus

- ATP: adenosine triphosohate

- BASYC®: bacterial synthesised cellulose

- Cel-: non-producing mutants – chủng vi khuẩn đột biến khôngtổng hợp cellulose

- cfu: cololy-forming units – khuẩn lạc

- CS: cellulose synthase

- CSL: corn steep liquor

- DAP: diamon phosphate

- PGM: Phosphoglucomutase

- PTS: Phosphatransferase

- PGA: Phosphogluconic acid

- S/V: surface/volume ratio - tỉ lệ diện tích/thể tích

- SEM: Scanning electronic microscopy

- St-BC: Static bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận

được dưới điều kiện nuôi cấy tĩnh)

- SA: Sulfate amon

- UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase

- UDPG: Uridine diphosephoglucose

- YPM: Yeast extract Peptone Mannitol

- YE: Yeast extract – cao nấm men

Chương 1: MỞ ĐẦU

Cellulose là một hợp chất hóa học thường được biết đếnvới vai trò là bộ khung xương quan trọng trong cơ thể thực vật.Không những cellulose được tổng hợp bởi thực vật, mà cellulosecòn được tổng hợp nên bởi vi sinh vật, với tên gọi là cellulose vikhuẩn Một trong những loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp

cellulose rất tốt đó là A xylinum Cellulose vi khuẩn ngày càng

được quan tâm nhiều hơn bởi khả năng ứng dụng rộng rãi trongnhiều ngành khoa học: công nghiệp thực phẩm, y học, mỹphẩm, khoa học vật liệu, âm thanh, xử lý nước thải, bảo vệmôi trường… Gần đây, khả năng ứng dụng cellulose vi khuẩnkhông ngừng được nghiên cứu, cải tiến bởi các nhà khoa học

trên thế giới (Otomo et al., 2000).

Trong công nghệ đồ uống và thực phẩm, cellulose vi khuẩnđã được ứng dụng làm nhiều sản phẩm như: nước trái cây,thực phẩm chức năng… Đặc biệt, một ứng dụng của cellulose vikhuẩn mới được phát hiện gần đây là khả năng ứng dụnglàm màng bao thực phẩm chống vi sinh vật rất hiệu quả

(Yoshinaga et al., 1997; Okiyama et al., 1993) Việc ứng dụng cellulose

vi khuẩn vào sản xuất công nghiệp nói chung và làm màngbao thực phẩm nói riêng đòi hỏi phải có được các nguồnnguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào, ổn định, và phù hợp vớitính chất của các ứng dụng Nhiều kết quả nghiên cứu đã chothấy khi nuôi cấy dưới điều kiện có khuấy đảo thì hiệu suất

sinh tổng hợp cellulose của A xylinum sẽ cao hơn khi nuôi cấy tĩnh.

Tuy nhiên, với mục đích sử dụng cellulose vi khuẩn làm màng baochống vi sinh vật trong công nghệ thực phẩm, yêu cầu cellulosethu được phải ở dạng màng Với mục đích đó, chúng tôi thựchiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ

Acetobacter xylinum” dưới điều kiện nuôi cấy tĩnh với mong

muốn thu được các kết quả hữu ích cho các nghiên cứu trongtương lai.

Trong nội dung thực hiện, chúng tôi tập trung khảo sát cácyếu tố sau:

- Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum trên môi trường HS.

- Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp

cellulose của A xylinum trên môi trường HS.

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên hiệu suất sinh

tổng hợp cellulose của A xylinum

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ lên hiệu suất sinh

tổng hợp cellulose của A xylinum.

- Tối ưu hoá thành phần môi trường lên men thu nhậncellulose vi khuẩn nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp

cellulose từ A xylinum.

Với kết quả thu được, phần nào sẽ cung cấp những thôngtin hữu ích cho các nghiên cứu tiếp theo, đầy đủ hơn để có thểứng dụng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quy mô công nghiệp

Chương 2: TỔNG QUAN

tổng hợp ra nó là Bacterium xylinum (Brown et al., 1986).

Đến nửa thế kỷ XX các nhà khoa học mới thực sự nghiên

cứu nhiều về cellulose vi khuẩn Đầu tiên, Hestrin et al (1954) đã nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum Ông đã chứng minh rằng vi khuẩn này có thể sử dụng

đường để tổng hợp cellulose Sau đó, Next và Colvin (1957) chứng

minh rằng cellulose được A xylinum tổng hợp trong môi trường có

đường và ATP Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, cấutrúc của cellulose vi khuẩn ngày càng được hiểu khá rõ, đó làcác chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liênkết β-1,4-glucan

Saxena (1990) đã giải thích cơ chế tổng hợp cellulose của A xylinum bằng việc giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose Ông

đã tách chiết được đoạn polypeptide liên quan đến quá trìnhtổng hợp cellulose tinh khiết dài 83kDa Từ đó đến nay đã có

nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm cấu trúc, cơchế tổng hợp, ứng dụng… của cellulose vi khuẩn.

có chiều dày 3 – 4 nm, và chiều dài 130 – 177 nm (Yamanaka et al.,

2000) Các dải siêu mịn của cellulose vi khuẩn có chiều dài từ

1 µm đến 9 µm tạo thành cấu trúc mắt lưới dày đặc, được ổn

định nhờ các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki et al.,

2001)

Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn (Yamanaka et al., 2000)

2.1.2.2 Mức độ polymer hoá (Degree of polymerization

- DP)

Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật tương tự nhau về mặthóa học, cellulose bao gồm các liên kết β-1,4-glucan, nhưng mứcđộ polymer hoá khác nhau DP của cellulose thực vật khoảng

13000 – 14000, và của cellulose vi khuẩn khoảng 2000 – 6000 Tuynhiên, trong một số trường hợp DP của cellulose vi khuẩn có thể

đạt 16000 đến 20000 phân tử glucose (Watanabe et al., 1998).

Đường kính của bacterial cellulose chỉ vào khoảng 1/100 đường

kính của cellulose thực vật (Bielecki et al., 2001) (hình 2.2).

2.1.2.3 Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn.

Ngày nay nhờ vào các kỹ thuật công nghệ hiện đạingười ta đã xác định được cấu trúc của cellulose vi khuẩn.Chẳng hạn như kỹ thuật nhiễu xạ tia X giúp xác định được kíchthước và phân biệt cấu trúc cellulose vi khuẩn Những kỹ thuậtkhác như phổ hồng ngoại, phổ Raman, và phổ cộng hưởng từhạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh của cellulose (Bielecki

et al., 2001).

Như các cellulose tự nhiên khác, cellulose vi khuẩn được tạothành bởi hai loại cấu trúc tinh thể riêng biệt, cellulose Iα và Iβ.Trong vi sợi cellulose đều có sự tham gia của hai loại cấu trúc tinhthể này (Yamamoto & Horii, 1993) Trong khi hầu hết tinh thể Iβ tinhkhiết thu được từ cellulose thực vật thì vẫn chưa có cách nào thunhận được các tinh thể Iα tinh khiết từ nguồn này Cấu trúc

của cellulose được tổng hợp từ vi khuẩn A xylinum chứa nhiều

tinh thể Iα hơn cellulose thực vật, hàm lượng loại tinh thể này cóthể lên đến hơn 60% Tỉ lệ này có thể dao động trong khoảng64% đến 71% tuỳ vào chủng vi sinh vật và nhiệt độ môitrường (Yamamoto & Horii, 1994) Ngược lại Iβ chủ yếu có trongthành phần cellulose hình thành nên thành tế bào của một số

loài thực vật bậc cao như cotton và gai Ở đó, cellulose Iα chỉchiếm khoảng 20%

Nhìn chung, cấu trúc tinh thể được coi như là một yếu tốquan trọng trong việc xác định các tính chất của cellulose mặcdù cho đến bây giờ vẫn có rất ít các nghiên cứu về sự tươngquan giữa cấu trúc tinh thể và những đặc tính riêng biệt củacellulose được thực hiện

2.1.2.4 Tính chất của cellulose vi khuẩn (El-Saied et

al., 2004; Bielecki et al., 2001)

- Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc

mạng tinh thể mịn, thành phần tỉ lệ Iα cao

- Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao,

đặc biệt là cellulose I

- Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp

chọn lọc

- Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không

chứa ligin và hemicellulose

- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật,

là nguồn tài nguyên có thể phục hồi

- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt.

- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể

cellulose vi khuẩn có độ bền cao, ứng suất dài lớn,trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao

- Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì

vậy việc sản xuất một số sản phẩm từ cellulose vikhuẩn không cần qua bước trung gian Đặc biệt vi khuẩncó thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏnghoặc dưới dạng các sợi chỉ cực nhỏ

- Có thể kiểm soát được đặc điểm lý học của cellulose

theo mong muốn bằng cách tác động vào quá trình sinh

tổng hợp cellulose của A xylinum Từ đó có thể kiểm

soát các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử cellulose

Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) (Bielecki et

al., 2001)

Cellulose vi khuẩn được nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong

đó chủng A xylinum được biết đến nhiều nhất, đây cũng là

loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose hiệu quả nhất và được tậptrung nghiên cứu nhiều nhất Cấu trúc của cellulose được tổnghợp bởi các vi sinh vật khác nhau là khác nhau Sau đây là bảngtổng quan về các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợpcellulose

Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose

(Jonas et al., 1998)

Vi sinh vật Cấu trúc cellulose Vai trò sinh học

Acetobacter Lớp màng ngoại

bàoDải cellulose

Để giữ vi khuẩn trong môi trường hiếu khí

Sarcina Cellulose dị hình Không rõ

Zoogloea Chưa xác định rõ

2.1.3.1 Phân loại A xylinum

A xylinum là một vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này bao gồm các giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter và Kozakia Các loài vi khuẩn này trước đây được gọi với các tên gọi Acetobacter xylinus hay Acetobacter xylinum, sau đó được xếp lại vào giống Gluconacetobacter với tên gọi Gluconacetobacter xylynus.

A xylinum có thể được phân lập từ các nguồn khác nhau

như từ nước quả (Kahlon & Vyas, 1971), hay từ một số loài thực

vật như lá của cây cọ (Faparusi et al., 1974), từ giấm (Passmore & Carr, 1975), từ thạch dừa (Bernado et al., 1998), từ nấm Kombucha và trà (Hermann et al., 1928).

2.1.3.2 Đặc điểm hình thái của A xylinum.

 A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di

động hay không di động, không sinh bào tử Là vi khuẩn

Gram âm, chúng có thể đứng riêng rẽ hay xếp thànhchuỗi.

 Nếu A xylinum phát triển trên môi trường thiếu chất

dinh dưỡng, chúng biến đổi thành dạng có hình tháiđặc biệt như: dạng tế bào phình to, kéo dài, phânnhánh hoặc không phân nhánh và dần dần sẽ gâythoái hóa giống làm giảm hoạt tính một cách đáng kể

 Khuẩn lạc của A xylinum có kích thước nhỏ, bề mặt

nhầy và trơn, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn vàsẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạcnhẵn

Hình 2.3: SEM của A xylinum (Forge & Preston, 1977)

2.1.3.3 Đặc điểm sinh lý của A xylinum (Jonas et al.,

1998)

 Oxy hóa ethanol thành acid acetic, CO2, H2O

 Phản ứng catalase dương tính: tạo bọt khí trong dung dịchlên men

 Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer

 Chuyển hóa glucose thành acid gluconic

 Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton.

 Không sinh sắc tố nâu

 Tổng hợp cellulose

2.1.3.4 Đặc điểm sinh trưởng của A xylinum

Lớp màng cellulose tạo ra gây trở ngại đến khả năng biếndưỡng, vận chuyển chất dinh dưỡng và oxi đến tế bào Tuynhiên lớp màng này có thể giữ nước nên giúp vi khuẩn cóthể phân hủy chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế bàochống lại tia UV

A xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau

và tùy thuộc vào chủng vi khuẩn mà nguồn đường nào được

sử dụng tốt nhất Chẳng hạn chủng A xylinum BPR 2001 sử dụng fructose tốt nhất (Matsuoka et al., 1993) trong khi chủng A xylinum IFO 13693 sử dụng glucose hiệu quả hơn (Masaoka et al., 1993)… A xylinum có thể chuyển hóa glucose thành acid gluconic, điều này

là nguyên nhân làm cho pH của môi trường nuôi cấy giảm từ

1 đến 2 đơn vị trong quá trình nuôi cấy

Nhiệt độ tối ưu để A xylinum phát triển từ 250C đến 300C

và pH từ 5,4 đến 6,3 Theo Hestrin (1947) thì pH tối ưu để A xylinum

phát triển là 5,5 và không phát triển ở nhiệt độ 370C ngay cả

trong môi trường dinh dưỡng tối ưu Theo Maccormide et al (1996) cho rằng A xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 đến

8, nhiệt độ từ 120C đến 350C và có thể phát triển trong môitrường có nồng độ ethanol lên tới 10%

Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, lúc còn non khuẩn lạcmọc riêng lẻ, khuẩn lạc nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3đến 5 ngày Khi già tế bào mọc dính thành cụm, và chúng mọctheo đường cấy giống

A xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế người ta

thường bổ sung thêm acid acetic hay acid citric vào môi trường

nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ và tăng hiệu suấttổng hợp cellulose.

2.1.3.5 Vai trò của cellulose vi khuẩn đối với A.

xylinum.

Màng cellulose được sản xuất bởi A xylinum đóng nhiều vai

trò cho sự phát triển và tồn tại của vi sinh vật trong tự nhiên

 Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn trong điều kiện

thiếu thức ăn (Bielecki et al., 2001).

 Sự tổng hợp và tiết cellulose bởi A xylinum giúp tế bào

lơ lửng và tới được bề mặt giàu khí oxy vì đây là vikhuẩn hiếu khí Do đó chỉ những tế bào gần ranh giớilỏng khí của môi trường mới sản xuất cellulose

(Krystynowicz et al., 2002; Watanabe et al., 1998)

 Màng cellulose xúc tiến sự hình thành tập đoàn của A xylinum trên cơ chất và bảo vệ vi khuẩn trước những

đối thủ cạnh tranh sử dụng cùng cơ chất

 Vì độ nhớt và đặc tính ưa nước của lớp cellulose nênkhả năng chống chịu với những thay đổi bất lợi (thayđổi pH, sự có mặt của chất độc và vi sinh vật gâybệnh…) trong môi trường sống tăng lên

 Sợi cellulose giúp chống ảnh hưởng gây chết của tia UV.23% vi khuẩn acetic được bao bọc bởi màng cellulose có

thể sống sót hơn 1 giờ khi bị chiếu tia UV (Bielecki et al.,

2001)

2.2 Sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn A.

xylinum

xylinum

Theo Ross et al (1991), con đường sinh tổng hợp cellulose vi

khuẩn từ glucose thành các sợi kết tinh đòi hỏi phải có sựtổng hợp uridine diphosphoglucose (UDP-Glucose), sau đó là mộtphản ứng tổng hợp cellulose và cuối cùng là sự tập hợp lạithành sợi cellulose nhỏ để hình thành nên các dải tinh thểcellulose

UDP-Glucose là một nucleotide tiền thân của sự tổng hợp

cellulose trong A xylinum Như sơ đồ duới đây, quá trình sinh tổng

hợp UDP-Glucose từ glucose là một quá trình trải qua 3 bước cósự tham gia của 3 loại enzyme Những bước này là sự phosphorylhoá của glucose bởi xúc tác của enzyme glucokinase thànhglucose-6-phosphate, sự izomer hoá của glucose-6-phosphate thànhglucose-1-phosphate bởi phosphoglucomutase, và sự tổng hợp UDP-Glucose bởi UDP-Glucose pyrophosphorylase UDP-Glucosepyrophosphorylase đóng vai trò then chốt trong sự sinh tổng hợp

cellulose của vi khuẩn A xylinum trong khi các chủng A xylinum đột

biến không có khả năng tổng hợp cellulose bị thiếu enzyme này(Valla & Kjosbakken, 1981)

Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A xylinum (Canon &

Anderson, 1991)

Quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum trên được chia

thành hai giai đoạn chính: giai đoạn polymer hóa và giai đoạn kếttinh

2.2.2.1 Giai đoạn polymer hóa

Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứngphosphoryl hóa chuyển glucose thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P).Sau đó enzyme phosphoglucomutase (PGM) tiếp tục chuyển hóaglucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) thông quaphản ứng isomer hóa Glucose-1-phosphate được enzyme UDP-Glucose pyrophospholyase chuyển hóa thành UDP-Glucose Cuốicùng, UDP-Glucose được polymer hóa thành cellulose và celluloseđược tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp proteinmàng là cellulose synthase (Iguchi et al., 2000)

Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng đường fructosehiệu quả hơn sẽ tạo cellulose theo con đường sau: lúc này hệthống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose thànhfructose–1-phosphate Sau đó fructose-1-phosphate sẽ được chuyểnhóa thành fructose-1,6-biphosphate nhờ enzyme fructose–1-phosphatekinase Sau đó, enzyme phosphoglucose isomerase có hoạttính cao, sẽ giúp chuyển hóa fructose-6-phosphate thành glucose-6-phosphate Tiếp theo glucose-6-phosphate lại tham gia vào quá trìnhchuyển hóa tương tự như trên để tạo ra cellulose (Iguchi et al., 2000)

Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn (Iguchi et al.,

2000)

2.2.2.2 Giai đoạn kết tinh

Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết glucan Các chuỗi glucan kết hợp với nhau tạo thành lớp chuỗiglucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals Lớp chuỗi glucan nàychỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp vớinhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16chuỗi glucan Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thànhcác vi sợi, sau đó các vi sợi tiếp tục kết hợp với nhau tạo thànhcác bó sợi và được phun ra ngoài môi trường thông qua các lỗtrên bề mặt của vi khuẩn (hình 2.6) Ảnh chụp kính hiển vi điệntử bề mặt tế bào cho thấy có khoảng 50 – 80 lỗ sắp xếp

β-1,4-thành hàng dọc chiều dài của tế bào (Ross et al., 1991) Các lỗ

này chính là các vị trí sinh tổng hợp cellulose trên bề mặt tếbào Đây là những lỗ có đường kính khoảng 3,5 nm sắp xếpsong song theo đường thẳng dọc trục vi khuẩn Mỗi lỗ bao phủmột tiểu phần 10 nm chứa enzym tổng hợp cellulose Mỗi tiểuphần 10 nm tạo ra các chuỗi glucan hình thành vi sợi 1.5 nm

Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài từ A.

xylinum (Iguchi et al., 2000)

tổng hợp cellulose.

2.2.3.1 Kiểu nuôi cấy

Có 2 kiểu nuôi cấy thường được sử dụng để sản xuấtcellulose vi khuẩn, đó là nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấyđảo

a) Nuôi cấy tĩnh

Đối với nuôi cấy tĩnh, người ta sử dụng những khay nhựa

đã chuẩn bị môi trường và tiến hành nuôi cấy chủng A xylinum ở điều kiện tĩnh.

Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, những thớ sợi thứ cấp liêntục được lộ ra từ lỗ sắp xếp thẳng hàng trên bề mặt của tếbào vi khuẩn, kết thành những vi sợi, lắng sâu xuống môitrường sinh trưởng, sau đó dải cellulose chồng chập và xoắn với

nhau tạo thành tấm cellulose trên bề mặt canh trường dinhdưỡng, ngay mặt phân cách pha lỏng khí giàu oxy.

Dù vẫn được sử dụng để sản xuất cellulose nhưng nuôicấy tĩnh cho sản lượng thấp và mang tính thủ công Do đó, đểsản xuất công nghiệp, cần thiết để thiết lập hệ thống sảnxuất hàng loạt sử dụng kĩ thuật nuôi cấy hiệu quả hơn(Edwards, 1995)

b) Nuôi cấy có khuấy đảo

Tiến hành nuôi cấy trong thiết bị lên men chứa dung dịchmôi trường, có cánh khuấy, thổi khí oxy hoặc lắc Vi khuẩnphân bố đều trong toàn dung dịch và phát triển theo chiều sâucủa môi trường Cellulose được tạo ra có dạng viên hình cầu,elip…

Đây là kĩ thuật nuôi cấy mong đợi sẽ đem lại hiệu quảtạo cellulose cao, có thể ứng dụng trong sản xuất cellulose vikhuẩn thương mại nhưng hiện nay cellulose vi khuẩn chỉ mới được

sản xuất với sản lượng thấp Sản xuất cellulose từ A xylinum

bằng phương pháp nuôi cấy có khuấy đảo gặp phải một sốtrở ngại, trở ngại lớn nhất cho đến nay là tính không ổn địnhkhi nuôi cấy Tính không ổn định được thể hiện bởi sự mất khảnăng sản xuất cellulose và thay thế dần tế bào sản xuấtcellulose bằng chủng đột biến không có khả năng sản xuất

cellulose (Hai-Peng et al., 2002; Chao et al., 1997).

Từ việc quan sát thấy rằng cellulose tổng hợp nhanh khi tế

bào A xylinum được gắn vào những phần tĩnh trong bình lên men như điện cực, cánh khuấy, màng ngăn, Vandamme et al (1998) đã

giới thiệu “điểm dính đa chức năng” trong bình nuôi cấy bằngcách cung cấp vào môi trường những phần tử nhỏ không tannhư diatonit, silicagel, cát biển, những hạt thủy tinh nhỏ, đấtmùn, cellulose thực vật được giã nhỏ Nồng độ phần tử nhỏ

đưa vào được tối ưu tuỳ theo mức độ khuấy, cũng như mức độ

lắc của khay (Yoshinaga et al., 1997).

Sự lựa chọn kỹ thuật nuôi cấy phụ thuộc vào mục đíchthương mại của polymer sinh học, hơn nữa cấu trúc cellulose vàđặc tính cơ lý của nó bị ảnh hưởng rất lớn của phương pháp

nuôi cấy (Hai-Peng et al., 2002) Trong điều kiện nuôi cấy bề

mặt, màng cellulose dày được tạo thành trên bề mặt môitrường nuôi cấy Trong khi dưới điều kiện nuôi cấy chìm,cellulose lại được sản xuất dưới dạng huyền phù thớ sợi, nhữngkhối không đều, dạng viên kết hay dạng cầu kích thước từ 10

µm đến 1000 µm

Hình 2.7: Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh

(trái) và có khuấy đảo (phải)

vài sự khác biệt về hình thái trong những sợi nhỏ và trong cấutrúc này giữa St-BC và Ag-BC Sợi cellulose của St-BC duỗi thẳngtrong khi sợi cellulose Ag-BC cong và rối, làm cấu trúc mắt lướidày hơn so với cấu trúc St-BC Bên cạnh đó, chiều rộng sợi Ag-

BC mỏng hơn so với St-BC, mặc dù rất khó xác định chính xáckích thước của mỗi sợi Hình thái này có được có thể do dòngchảy rối loạn và áp lực do dịch chuyển không ngừng của môitrường khi nuôi cấy dưới điều kiện có khuấy đảo Những thayđổi về hình thái học có liên quan đến những thay đổi trong cấutrúc vi mô như trọng lượng phân tử, độ kết tinh, thành phần Iα,bảng 2.2 cho thấy rõ điều này

Hình 2.8: Cấu trúc trong điều kiện nuôi cấy tĩnh (a) và nuôi

cấy có khuấy đảo (b)

(Watanabe et al., 1998) Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc St-BC và Ag-BC (Watanabe et al., 1998)

a Xác định bằng phương pháp chụp nhiễu xạ tia X

b Ước lượng bằng phương pháp chụp nhiễu xạ tia X kíchthước của mặt phẳng tinh thể học

c Xác định bằng CP/MAS 13C NMR

Do những khác biệt về cấu trúc mà St-BC và Ag-BC cónhững tính chất có liên quan tới những ứng dụng thương mạicũng khác nhau như trình bày ở bảng 2.3

Bảng 2.3: Tính chất St-BC và Ag-BC (Watanabe et al., 1998)

Young module của màng (GPa) 28,3 33,3

Khả năng giữ nước (g nước/g

cellulose)

Chức năng giúp duy trì lọc (%) 43 38

Chỉ số ổn định nhũ tương (%) 83 60

Khả năng giữ nước của cellulose vi khuẩn là khối lượngnước được giữ lại trên một đơn vị khối lượng của sợi cellulose,lượng nước này được giữ trên bề mặt và trong những phần tửtạo nên sợi cellulose

Giá trị của chức năng duy trì lọc được định nghĩa là lượngphân tử CaCO3 bị giữ trên tờ giấy cellulose Phân tử nhỏ hơnvà phân tán hơn của Ag-BC bị phân hủy có hiệu quả hơn phântử của St-BC trong việc giữ lại các hột nhỏ vì phân tử của Ag-

BC bị phân hủy có bề mặt hiệu dụng rộng hơn suốt quá trìnhlọc trong sản xuất giấy Trong trường hợp của chất ổn định nhũtương, phân tử Ag-BC bao phủ bề mặt của những giọt dầu rộnghơn và nhũ tương chứa trong Ag-BC ổn định hơn

Do đó, Ag-BC thể hiện nhiều đặc tính phù hợp hơn chonhững ứng dụng công nghiệp hơn St-BC (Watanabe et al., 1998)

2.2.3.2 Ảnh hưởng của thiết bị đến năng suất

tạo thành cellulose vi khuẩn

Phương pháp sản xuất cellulose vi khuẩn truyền thống lànuôi cấy tĩnh, nhưng phương pháp này đòi hỏi phải có diện tíchlên men lớn và thời gian lên men dài Do đó một số phươngpháp khác được khảo sát để thay thế cho phương pháp nuôicấy tĩnh

Thùng lên men khuấy trộn được dùng rộng rãi trong sảnxuất cellulose vi khuẩn, nuôi cấy liên tục có bổ sung ethanol làmtăng tốc độ tổng hợp cellulose gấp 2 lần so với nuôi cấy mẻ.Hơn nữa trong điều kiện nuôi cấy có khuấy đảo, dễ dàngkiểm soát các yếu tố môi trường Tuy nhiên, khó khăn củaquá trình nuôi cấy lắc là cellulose sinh ra tích lũy trong môitrường làm cho môi trường có độ nhớt cao dẫn đến khó kiểmsoát quá trình khuấy trộn và sục khí Các viên huyền phùcellulose có độ giữ nước cao, nhanh chóng choáng hết thể tíchmôi trường, gây khó khăn cho vi sinh vật phát triển tạo cellulose

(Klemm et al., 2001; Yoshinaga et al., 1997).

Một số thiết bị lên men sản xuất cellulose vi khuẩn: a) Ajinomoto

Được đặt tên theo tên một công ty, phương pháp này sửdụng môi trường bề mặt nhằm cải thiện sự tổng hợp củacellulose Các tế bào đầu tiên được nhân giống trong thiết bịcó sục khí trước khi được cho vào các khay tĩnh Sau 3 ngày trongthiết bị suc khí, mật độ tế bào vào khoảng 2x107 (tế bào/ml).Lúc này, dịch lên men được chuyển vào các khay có sục khí Sosánh với quá trình lên men thông thường tạo cellulose thì thiết bịnay fcho năng suất cao hơn 140% Sản phẩm có khả năng giữnước thấp và chứa khoảng 10% lượng sucrose ban đầu (Okiyama

et al., 1992)

b) Weyerhauser

Được đặt tên theo tên của một công ty Mỹ phát minh ra,một quá trình được phát triển để sản xuất sợi có kích thướcnhỏ, khoảng 1/300 kích thước của bột gỗ Sử dụng các chấtgây đột biến đổi hóa học để thay đổi các mức độ tác động

của enzyme, chủng A xylinum được phân lập để làm giảm lượng

chất phụ sinh ra trong quá trình sản xuất, bao gồm gluconic acidvới việc điều chỉnh pH thấp hơn Rõ rằng hơn, chủng vi sinh vật

được phân lập để sản xuất cellulose khi khuấy đảo Trước đây,khuấy đảo một dịch lên men để cung cấp oxy, và sự trao đổichất, tổng hợ cellulose không ngừng Tuy nhiên, sản phẩm tạo ratừ phương pháp này là một dịch huyền phù sệt, nhớt, tên

thương mại là Cellulon (Black et al., 1990).

c) ICI

ICI (Imperial Chemical Industry) bao gồm 4 bước và sản xuấtmột chất sệt giống với hệ thống Weyerhauser Bước đầu tiênlà bước tích lũy Khi đó vi khuẩn được phép phát triển trongmột thiết bị phản ứng có khuấy đảo đến khi nguồn carbonđược tiêu thụ hết Sau đó bổ sung nguồn carbon với tốc độ phùhợp cho sự tổng hợp cellulose Bước cuối cùng là loại đi cáchuyền phù từ thiết bị phản ứng và sau đó tách các tế bào vi

sinh vật ra khỏi sản phẩm (Serafica et al.,1998).

d) Gengiflex®, Biofill® và BASYC®

Chủng A xylinum thích hợp được đưa vào một thiết bị, trong

đó tạo điều kiện tối ưu cho chúng phát triển Các điều kiệntối ưu cho sự sản xuất cellulose sau đó được áp dụng cho dịchlên men Tất cả các quy trình đều được phát triển trên môitrường cơ bản của Schramm và Hestrin (1954)

Gengiflex® được áp dụng trong công nghiệp nha khoa, cụ thểlà được áp dụng để giúp hồi phục lại mô bao quanh răng

(Novaes et al., 1997)

Biofill®, được sử dụng như là một dải băng, có thể đượcứng dụng băng các vết thương trong trường hợp bị phỏng hay bịloét Biofill® được sử dụng như da nhân tạo cho con người Mặthạn chế lớn nhất của sản phẩm là bị giới hạn bởi tính co giãnkhi ứng dụng để làm các vết băng tai những vùng có cườngđộ vận động cao Ngược lại, ưu điểm của nó là giúp hồi phụcnhanh chóng vết thương, và khả năng chống nhiễm trùng tốt.Cellulose trong suốt cho phép kiểm tra, theo dõi vết thương dẽ

dàng trong khi Biofill® sẽ tách ra khi vết thương hồi phục Vớiviệc rút ngắn thời gian và chi phí điều trị, Biofill® được đánh giá

rất cao (Fontana et al, 1990).

Một nhóm các nhà hóa học, sinh vật học và giải phẫuhọc đã phát triển một sản phẩm gọi là BASYC® (BacterialSynthesised Cellulose) BASYC® là một sản phẩm dạng ống dùngthay cho các mạch máu Các ống có đường kính trong khoảng1mm và dài 5mm, được sử dụng thay thế cho mạch máu Côngdụng khác của loại sản phẩm này là bề mặt trong của ốngBASYC® nhẵn và trơn hơn các vật liệu tổng hợp khác khi sử

dụng cùng mục đích (Klemm et al, 2001).

e) Thiết bị thu nhận cellulose liên tục

Thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm Sử dụng mộtdụng cụ có độ sâu không lớn để lượng môi trường cần thiếtlà tối thiểu, các sợi cellulose được thu bởi một trục quay liên tụcvới tốc độ 35 mmh-1 Sau một thời gian thu nhận cellulose thì đemcellulose đi xử lý Ưu điểm lớn nhất của dạng thiết bị này làcellulose có thể được thu nhân liên tục và môi trường mới được

bổ sung sau mỗi 12 giờ (Sakairi et al., 1997).

f) Thiết bị phản ứng có sục khí tuần hoàn và khuấy đảo

Trong môi trường tĩnh, thời gian nhân đôi số lượng tế bàolà từ 8 – 10 giờ, trong khi trong điều kiện có lắc đảo, thời giannày là 4 – 6 giờ (Canon và Anderson, 1991) Bằng cách tăngkhuấy đảo và cung cấp oxy cho môi trường nuôi cấy, tốc độsinh trưởng tế bào cũng tăng lên Do đó, khả năng sản xuấtvới tỷ lệ lớn là có thể, thiết bị lên men có khuấy đảo vàcó sục khí được nghiên cứu và mong muốn tạo ra cellulose dạng II.Độ nhớt cao của môi trường và sức cản mạnh là trở ngại củaphương pháp Với phương pháp này thì sợi cellulose tạo ra có cấu

trúc không bình thường (Kouda et al., 1997)

2.2.3.3 Aûnh hưởng của áp suất oxy đến quá trình

tổng hợp cellulose vi khuẩn

Sự hình thành cellulose diễn ra tại vị trí mặt phân cách giữakhông khí và lớp màng cellulose chứ không phải tại mặt phâncách giữa môi trường và cellulose Do đó oxy là nhân tố quan

trọng cho quá trình tổng hợp cellulose (Borzano & Desouza et al.,

1995)

Watanabe và Yamanaka (1995) phát hiện ra áp suất oxy ảnhhưởng đến cả sự hình thành cellulose cũng như sức sản xuấtmàng Cellulose tăng trưởng dưới áp suất oxy thấp có sự phânnhánh nhiều hơn so với cellulose tăng trưởng trong điều kiện ápsuất cao hơn Điều này có thể ảnh hưởng trực tiếp đến tính daicủa lớp màng Hơn nữa, với áp suất oxy là 10% tính sản xuấtcellulose cao hơn 25% mà không ảnh hưởng đến sự tăng trưởngcủa tế bào Sự tổng hợp cellulose tại áp suất 10% và 15% caohơn so với điều kiện áp suất khí quyển Tuy nhiên, hàm lượngoxy cao trên 50% lại hạn chế khả năng tổng hợp cellulose của vi

sinh vật (Yamanaka & Watanabe et al., 1995).

2.2.3.4 Aûnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sản

phẩm cellulose vi khuẩn

1 Ảnh hưởng của pH

Sự chuyển hóa glucose thành acid gluconic trong quá trìnhtổng hợp cellulose là nguyên nhân chính của sự giảm pH củamôi trường lên men pH ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển

của tế bào và sự hình thành cellulose (Hwang, J.W et al., 1999).

Các báo cáo trước đây đã đưa ra các kết luận cho thấy pH tối

ưu cho sự tổng hợp cellulose từ A xylinum là trong khoảng 4 – 7 Trong khi đó, trong báo cáo của mình, Fiedler et al (1989) đưa ra khảng pH tối ưu là 5 - 7 Masaoka et al (1993) thì thấy rằng

khoảng này là 4 - 6 Qua các kết quả nghiên cứu đó cho chúng

ta kết luận rằng pH thấp hơn 7 là thích hợp cho sự tổng hợp

cellulose và sự phát triển của tế bào vi sinh vật A xylinum

A xylinum đồng thời tổng hợp cả cellulose và cellulase.

Cellulase ít được tổng hợp ở pH thấp (pH < 5) và được tổng hợpnhiều hơn ở pH cao Độ bền cơ học của tấm cellulose nuôi cấy

tại pH 4 cao hơn độ bền của tấm cellulose nuôi ở pH 6 (Toda et al.,

1997)

2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Sự tổng hợp cellulose phụ thuộc khá nhiều vào nhiệt độ.Nhiệt độ từ 25 - 300C là thích hợp cho sự tổng hợp cellulose (Canon

& Anderson, 1991) Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng khoảngnhiệt độ từ 25 - 300C

Sự thay đổi nhiệt độ không những chỉ thay đổi hiệu suấttổng hợp cellulose mà còn thay đổi cả cấu trúc của cellulose,đặc biệt là khả năng giữ nước và mức độ polymer hóa.cellulose được sản xuất ở 300C có mức độ polymer hóa thấp hơnvà khả năng giữ nước cao hơn so với cellulose được sản xuất ở

nhiệt độ thấp hơn (Geyer et al., 1994)

Nhiệt độ cao (khoảng 1000C trong 3 giờ) không gây ảnhhưởng cho cấu trúc cellulose nhưng nhiệt độ thấp (-20 0C) sẽ làm

tăng tính mềm dẻo của cellulose vi khuẩn (Zou et al., 2006).

2.2.3.5 Ảnh hưởng của thành phần môi trường

nuôi cấy

1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Môi trường cơ bản cho các nghiên cứu về quá trình tổng

hợp cellulose của chủng A xylinum là môi trường do Hestrin và

Schramm (1954) thiết lập, có nguồn nitơ là dịch chiết nấm menvà peptone với tỉ lệ tương ứng là 5:3 Từ khi thành phần môitrường này được đưa ra, nó đã trở thành môi trường cơ bản chohầu hết các nghiên cứu về sản xuất cellulose vi khuẩn Nhiều

nhóm nghiên cứu khác nhau đã có sự thay đổi thành phầnmôi trường liên quan đến phần trăm của nitơ từ các nguồnkhác nhau như dịch chiết nấm men, CSL (corn steep liquor), peptone,trypton, cao thịt, proteopeptone…Tất cả các nguồn nitơ này đềuđược ứng dụng, trong đó CSL là nguồn nitơ được cho là có hiệuquả nhất, tác động tăng trưởng tế bào và tốc độ tạocellulose cao so với các nguồn nitơ khác và đây cũng là nguồn

nitơ có giá thành tương đối rẻ (Klemm et al., 2001; Jonas et al., 1998; Toda et al., 1997).

Một vài amino acid bắt buộc phải có là methionine và

glutamate Masaoka et al (1993) đã chứng minh methionine có tác

dụng quan trọng đến sự tăng trưởng tế bào và tăng hiệu suấttạo cellulose so với môi trường không có amino acid này

Các vitamin pyridoxine, nicotinic acid, p-aminobezoic acid vàbiotin được xác định là cần thiết cho sự tăng trưởng và tổnghợp cellulose, trong khi pantothanate và riboflavin cho kết quả ngược

lại (Yang et al., 1998).

2 Ảnh hưởng của nguồn carbon.

Rất nhiều cơ chất được sử dụng làm nguồn carbon cho sự

hình thành cellulose bởi vi khuẩn A xylinum Các chủng vi khuẩn

khác nhau tổng hợp cellulose với những lượng khác nhau đối vớicác cơ chất khác nhau

Glucose được xem là nguồn carbon tốt nhất cho A xylinum IFO

13693 tổng hợp cellulose, lượng cellulose có thể đạt được lên tới

0,6 g/g glucose/ngày sau 2 - 4 ngày lên men (Masaoka et al., 1993) Tuy nhiên, hàm lượng cellulose được tổng hợp bởi A xylinum Ku-1

khi sử dụng nguồn cơ chất là mannitol và arabitol cao hơn 3 lần so

với khi sử dụng cơ chất là glucose (Oikawa et al., 1995) Bên cạnh đó, fructose lại là nguồn cơ chất thích hợp nhất cho A xylinum BPR2001 tổng hợp cellulose (Matsuoka et al., 1996)