Luận văn nghiên cứu quy trình phân tích hàm lượng Carbaryl, Dimethoate va Vitamin C trong cải xanh

Luận văn nghiên cứu quy trình phân tích hàm lượng Carbaryl, Dimethoate va Vitamin C trong cải xanh.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU

 Dân số ngày càng gia tăng do đó nhu cầu về lương thực thực phẩm ngày càng đòihỏi nhiều, cụ thể là các loại rau cung cấp trong các bữa ăn hằng ngày Rau xanh không chỉcung cấp một lượng lớn chất xơ, các sinh tố A, B, C … mà còn cung cấp các nguyên tố vilượng và đa lượng rất cần thiết trong cấu tạo tế bào Rau xanh còn là một loại cây trồng cóhiệu quả kinh tế cao, đồng thời cũng là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của nhiều nước trênthế giới

 Tuy nhiên thất thu hàng năm do các loài dịch hại gây ra cho nông nghiệp chiếmkhoảng 35% sản lượng mùa màng (khoảng 75 tỷ đô la); trong đó thiệt hại do sâu là 13,8%; dobệnh cây là 11,6%; do cỏ dại là 9,5% (theo Cramer H.H., 1967) Nếu tính cho diện tích nôngnghiệp toàn thế giới là 1,5 tỷ hecta không kể đồng cỏ và bãi hoang thì thiệt hại bình quân là47-60 đô la trên một hecta Để tránh thất thu, hiện nay có nhiều biện pháp được áp dụng đểphòng trừ các loài dịch hại Một trong các biện pháp đó là sử dụng thuốc bảo vệ thực vật

 Bên cạnh những ưu điểm của thuốc bảo vệ thực vật như diệt dịch hại nhanh, có khảnăng chặn đứng sự lan tràn phá hoại của sâu, bệnh, cho hiệu quả trực tiếp rõ rệt…nó còn cómột số nhược điểm, nếu sử dụng không đúng cách (phun quá liều hoặc phun gần ngày thuhoạch) đôi khi thuốc có thể gây độc cho thực vật hoăïc còn lưu trong nông sản và gây độc chongười, gia súc ăn phải, gây ô nhiễm môi trường…[3]

 Theo thống kê, hàng năm ở miền Đông – Nam nước ta, tổng lượng thuốc bảo vệthực vật sử dụng lên đến con số 1000 tấn, trong đó thuốc bảo vệ thực vật dùng trên rau rất lớnchiếm từ 50 – 80% tổng lượng thuốc dùng cho các loại cây trồng Điều đó gây ra những mốinguy cho sức khỏe con người Một số nơi xảy ra ngày càng nhiều và phổ biến tình trạng ngộđộc do rau xanh

 Trên thế giới, hàng năm có trên 40000 người chết vì ngộ độc rau trên tổng số 2 triệungười bị ngộ độc (dựa theo thống kê của Tổ chức Lao động Quốc tế ILO) Tuy chưa có thốngkê chính thức về số người ngộ độc do thuốc trừ sâu ở nước ta, nhưng theo những thông báo từnhững năm qua về các trường hợp ngộ độc lẻ tẻ hay hàng loạt ở từng bệnh viện, từng địaphương cho thấy số người bị ngộ độc là một con số đáng kể

 Từ năm 1993 đến tháng 6 năm 1998, có đến hàng chục ngàn người bị nhiễm độc doăn phải rau quả còn dư lượng thuốc trừ sâu, nặng nhất vẫn là ở các tỉnh đồng bằng sông CửuLong Năm 1995, có 13000 người nhiễm độc và trong đó có đến 354 người chết

 Trên cơ sở các tài liệu tham khảo tiếp cận được và kết quả khảo sát sơ bộ của khóatrước, luận văn này sẽ khảo sát thực nghiệm quy trình phân tích hàm lượng Carbaryl,Dimethoate trong cải xanh bằng phương pháp HPLC, với mục đích nâng cao hiệu suất thu hồimẫu các hoạt chất đó từ rau để kết quả phân tích được chính xác hơn, và phù hợp với điềukiện thực tiễn ở PTN Hóa sinh của Bộ môn Công nghệ Thực phẩm

1

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 CẢI XANH [6]



 Tên khoa học: Brassia junecea

 Rau cải có nhiều loại như: cải ngọt, cải đắng, cải bẹ trắng, cải thìa được trồngquanh năm ở nước ta Cải xanh (cải đắng) có hàm lượng các hợp chất chứa lưu huỳnh vàvitamin C cao

 Đặc điểm: Cuống lá hơi nhỏ và tròn, phiến lá nhỏ hẹp Chịu được nóng và mưa,nhanh cho thu hoạch nên có tác dụng giải quyết rau giáp vụ rất tốt



1.1.1 Thu hoạch và bảo quản

 Cải xanh được thu hoặc sau 30 – 50 ngày gieo giống, khi đó lá cải dài khoảng 20 –

30 cm Trong quá trình vận chuyển và buôn bán nên bảo quản cải xanh ở nhiệt độ lạnh, độẩm khoảng 90 – 95%



1.1.2 Sử dụng cải xanh

 Cải xanh có thể dùng để ăn sống, nấu canh, muối mặn, muối chua

 Lợi ích: nhuận trường, trị chứng táo bón, ung thư kết ruột Trong cải xanh có chấtalbumin, vitamin B1, Coban, iot Rễ và lá có nhiều chất kiềm thúc đẩy sự tiêu hoá, thúc đẩy

cơ thể hấp thu albumin bảo vệ gan, chống mỡ trong gan Ăn nhiều cải xanh có tác dụng ngănngừa ung thư gan và kết hợp điều trị bệnh ung thư và xơ cứng gan

2

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng trong 100g lá cải xanh







1.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP [2]

1.2.1 Nguồn gốc, định nghĩa

 Phép sắc ký do chuyên viên thực vật Nga Tswett (1906) đề xuất năm 1903 khinghiên cứu về sắc tố thực vật Ông là người đầu tiên đã tách được sắc tố trong lá cây Mẫuđược trích bằng ether, cho dung dịch qua cột chứa chất hấp phụ CaCO3, trên cột xuất hiệnnhiều vùng có màu sắc khác nhau Do đó phương pháp có tên là sắc ký Từ đó phương phápsắc ký trở thành một kỹ thuật tách chất hữu hiệu và được phát triển nhanh

 Sắc ký lỏng là một kỹ thuật phân tích sắc ký dùng để tách riêng các ion hay phân tửhòa tan trong một dung môi Nếu dung dịch mẫu tiếp xúc với một pha tĩnh và một pha động,các cấu tử trong mẫu sẽ tương tác với hai pha đó theo mức độ khác nhau Mức độ tương táckhác nhau xác định thời gian lưu của các chất khác nhau khi theo pha động qua cột, cho phéptách các cấu tử trong mẫu ban đầu Pha động là chất lỏng Pha tĩnh đa dạng tùy thuộc vàokiểu cột sắc ký (cột sắc ký hấp phụ, cột sắc ký phân bố, cột sắc ký lọc gel, cột sắc ký trao đổiion), vì vậy khả năng ứng dụng rất lớn, đối tượng phân tích đa dạng

Thành phần Hàm lượng

3

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) là một dạng thiết bị sắc ký lỏng hoạt động ở áp suất caohơn áp suất thông thường Kích thước hạt vật liệu nhồi làm pha tĩnh rất bé (1 - 4 μm) nên làmtăng số đĩa lý thuyết và do đó tăng khả năng tách chất của thiết bị Để tăng tốc độ dòng chảytới khoảng 0,1 – 10 ml/phút, người ta phải dùng áp suất cao (P = 100 – 200 bar) Phương phápnày thực hiện ở nhiệt độ phòng nên phù hợp trong phân tích thực phẩm, vì các thành phầncủa thực phẩm đa số là các chất dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao



1.2.2 Hệ thống thiết bị HPLC

 Hệ thống HPLC bao gồm 1 nguồn cung cấp pha động, một bơm, bộ phận nhập mẫu,cột sắc ký, và một đầu dò

 Hình 1.1 Mô hình hệ thống HPLC



Cột sắc ký

 Cột HPLC thường ngắn, vào khoảng 10 – 25 cm và được nhồi pha tĩnh thích hợp.Các hạt pha tĩnh nhồi cột HPLC thường có kích thước rất nhỏ (3, 5, 10 μm) Đường kính trongcủa cột trong khoảng 2 – 4 mm Các cột đều đã được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn quốc tế

4

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

tục, ổn định và không có xung Có thể bố trí nhiều bơm lệch pha hoặc trước khi bơm vào cột,pha động phải được bơm qua một đường nối ống đủ dài (> 1m) Dây nối phải chịu được áplực Bơm thường sử dụng là bơm pittông Các loại bơm HPLC hiện nay có thể cho vận tốcdòng: 0,1 – 10 ml/phút với mức dao động không lớn hơn 1%, áp lực lớn nhất lên đến 5000psi

Đầu dò

 Đầu dò sử dụng trong thiết bị HPLC rất đa dạng Các loại đầu dò thông dụng là đầudò UV – VIS, đầu dò huỳnh quang, đầu dò dẫn nhiệt, đầu dò khúc xạ kế vi sai (RI), … Sự thayđổi về cường độ ánh sáng do sự hấp thu tia UV, sự phát xạ huỳnh quang, … sẽ được ghi nhậnlại dưới sự thay đổi của điện thế đầu ra, biểu diễn trên một đồ thị theo thời gian chạy sắc ký– sắc ký đồ Thời gian lưu và diện tích peak là hai thông số đo quan trọng trong các phép sắcký

Máy ghi:

 Vừa có khả năng vẽ đồ thị, xác định thời gian lưu, tính diện tích peak, ghi lại phươngpháp xác định, đồng thời có thể sử dụng máy ghi để điều khiển, chương trình hóa quá trìnhchạy sắc ký

Bộ phận nhập mẫu ( injector ):

 Có thể nhập mẫu vào thiết bị HPLC một cách thủ công bằng xilanh Cũng có bộphận nhập mẫu tự động hoàn toàn, chương trình hóa từ thể tích mẫu bơm vào, thời gian thayđổi mẫu, thời gian rửa bộ phận nhập mẫu, nhiệt độ bơm mẫu, áp suất bơm mẫu Thường ápsuất bơm mẫu nhỏ hơn 70 bar Lúc đó mẫu mới tập trung vào đầu cột, đạt hiệu quả phân tíchtốt

Bình chứa pha động:

 Thông thường là chai thủy tinh, được nối với bộ phận bài khí và nối với đầu vào củabơm



1.2.3 Nguyên tắc hoạt động

 Bơm cao áp bơm pha động vào cột Pha động được lọc trước bằng màng lọc với kíchthước lỗ xốp thích hợp Có thể tiến hành phân tích ở nhiệt độ phòng, hoặc dùng lò điều nhiệthiệu chỉnh nhiệt độ cột khoảng 40 – 50OC mẫu được bơm vào hệ thống thông qua bộ phậnnhập mẫu Sau đó mẫu được pha động đưa qua cột bảo vệ rồi cột phân tích Trong cột phântích, cấu tử nào của mẫu có ái lực mạnh với pha động sẽ theo pha động đi ra trước, cấu tử nàocó ái lực yếu hơn sẽ đi ra sau Pha động ra khỏi cột sẽ được đưa tới đầu dò Sắc ký đồ, thờicũng như diện tích các peak sẽ được thể hiện trên máy ghi dữ liệu



1.3 THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT (BVTV)[3]

1.3.1 Định nghĩa: thuốc BVTV hay nông dược là những chất độc có nguồn gốc tự nhiên

hay hóa chất tổng hợp được dùng để bảo vệ cây trồng và nông sản chống lại sự phá hoại của

5

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

những sinh vật gây hại đến tài nguyên thực vật Những sinh vật gây hại chính gồm sâu hại,bệnh hại, cỏ dại, chuột và các nhân tố khác

1.2.2 Các nhóm thuốc BVTV

Thuốc BVTV được chia thành nhiều nhóm dựa trên đối tượng sinh vật gây hại:

 Thuốc trừ tuyến trùng

 Thuốc điều hòa sinh trưởng

 Thuốc trừ chuột

6

Phân loại theo tính độc như sau:

 Vạch màu đỏ trên nhãn là thuốc độc nhóm I, rất nguy hiểm

 Vạch màu vàng là thuốc độc nhóm II, cảnh báo có hại

 Vạch màu xanh da trời là thuốc độc nhóm III, lưu ý cẩn thận

 Vạch màu xanh lá cây là thuốc độc nhóm IV, ít độc

 Bảng 1.2 Phân loại thuốc BVTV theo tính độc

Nhóm LD50 qua miệng LD50 qua da LC50 qua hô hấp

II 50 -500mg/kg 200 – 2000 mg/kg 0.05 – 0.5 mg/L

III 500 - 5000 mg/kg 2000 – 5000 mg/kg 0.5 – 2 mg/L

1.3.3 Các dạng thuốc BVTV

 Nhũ dầu (ND, EC): thuốc ở thể lỏng, trong suốt Dễ bắt lửa, cháy nổ

 Dung dịch (DD, SL, L, AS): hoà tan đều trong nước, không chứa chất hoá sữa

 Bột hoà nước (BTN, BHN, WP, DF, WDG, SP): dạng bột mịn, phân tán trong nướcthành dung dịch huyền phù)

 Huyền phù (HP, FL, SC): phải lắc đều trước khi sử dụng

 Hạt (H, G, GR): chủ yếu được sử dụng để rải vào đất

 Viên (P): chủ yếu được rải vào đất làm bả mồi

 Thuốc phun bột (BR, D): dạng bột mịn, không tan trong nước, rắc trực tiếp

 Tên hoạt chất: là thành phần chủ yếu trong thuốc có tác dụng tiêu diệt dịch hại

Độ độc:

 LD50: chỉ số biểu thị độ độc cấp tính của một loại thuốc BVTV đối với động vật máunóng (đơn vị tính là mg chất độc/kg trọng lượng chuột) Chỉ số LD50 chính là lượng chất độcgây chết 50% cá thể chuột trong thí nghiệm LD50 càng thấp thì độ độc càng cao

 LC50: độ độc của một hoạt chất có trong không khí hoặc nước (đơn vị tính là mg chấtđộc/thể tích không khí hoặc nước) Chỉ số LC50 càng thấp thì độ độc càng cao

Thời gian cách ly:

 Là khoảng thời gian từ khi phun thuốc lần cuối đến khi thu hoạch nông sản nhằmbảo đảm cho thuốc BVTV có đủ thời gian phân huỷ đến mức không còn có thể gây ra nhữngtác động xấu đến cơ thể của con người và gia súc khi tiêu thụ nông sản đó.

Dư lượng:

 Là lượng chất độc còn lưu lại trong nông sản hoặc môi trường sau khi phun thuốcBVTV Dư lượng được tính bằng microgram hoặc miligram lượng chất độc trong 1kg nông sảnhoặc thể tích không khí, nước

 MRL (Maximum Residue Limit): mức dư lượng tối đa cho phép lưu tồn trong nôngsản mà không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, vật nuôi

 ADI (Acceptable Daily Intake): lượng chất độc chấp nhận hấp thu vào cơ thể, khônggây hại cho người và vật nuôi trong một ngày, được tính bằng microgram hoặc miligram hợpchất độc trên 1 đơn vị thể trọng



1.4 THUỐC TRỪ SÂU CARBARYL [10,15]

 Carbaryl thuộc nhóm thuốc trừ sâu Carbamate

 Carbaryl là tên gọi thông dụng của 1-napthyl N-methylCarbamate

 Công thức hóa học: CH3NHCOOC10H7

 Công thức cấu tạo:



 Hình 1.3 Carbaryl



1.4.1 Tính chất vật lý

 Carbaryl ở dạng tinh khiết là tinh thể rắn, màu trắng, có mùi nhẹ, độ hoà tan trongnước ở 20oC là dưới 0.1%, nhưng dễ hòa tan trong nhiều dung môi hữu cơ

 Nhiệt độ nóng chảy 138oC, nhiệt độ hóa hơi 193oC

Bảng 1.3 Độ tan của Carbaryl trong một số dung môi

1.4.2 Tính chất hoá học

 Bền trong môi trường acid, phân huỷ trong môi trường kiềm tạo thành 1-napthol

 Ổn định với nhiệt độ lên đến 70oC và ánh sáng Khi bị gia nhiệt nó sẽ phân huỷ tạokhói độc NOx

1.4.3 Tính độc

Đối với người

 Carbaryl dễ dàng được hấp thụ qua đường hô hấp và đường miệng, nhưng ít bị hấpthụ hơn qua tiếp xúc với da Khi tiếp xúc trực tiếp có thể gây bỏng da hoặc mắt Hít vào haynuốt phải Carbaryl với lượng nhất định có thể gây ngộ độc cho hệ thần kinh, hệ hô hấp, gây

ra các triệu chứng nôn mửa, co thắt dạ dày, đau đầu, hôn mê, rối loạn thần kinh, suy hô hấp

 Dấu hiệu nhiễm độc tăng nhanh sau khi hấp thụ và cũng nhanh chóng kết thúc saukhi không còn tiếp xúc nữa Khi bị hấp thụ vào cơ thể người, nó sẽ nhanh chóng được bài tiết

ra theo nước tiểu (bài tiết khoảng 91.5% trong vòng 24h)

 LD50 qua miệng = 614 mg/kg thể trọng, LD50 qua da > 5000 mg/kg thể trọng.

 LC50 = 2.43 mg/l

 ADI = 0.00-0.01mg/kg thể trọng

Đối với động vật [3]

 LD50(chuột) = 560 mg/kg thể trọng



1.4.4 Giới hạn dư lượng trên rau quả

 Dư lượng tối đa cho phép của Carbaryl trong cải xanh là 10mg/kg rau

Bảng 1.4 Giới hạn dư lượng tối đa của Carbaryl trên rau theo FAO/WHO (1994)

 Carbaryl là loại thuốc có tác dụng tiếp xúc và vị độc, có phổ phòng trị rộng hiệu lực

lâu dài Tính độc của thuốc đối với sâu hại tăng lên khi nhiệt độ môi trường tăng cao.Carbaryl thường được dùng để trị nhiều loài sâu hại lúa (rầy xanh, rầy nâu), hại cây ăn quả,rau (sâu cuốn lá, rệp vải, rệp…), sâu hại cây công nghiệp (bông, thuốc lá…), bọ rầy dưa…

 Chế phẩm 15ND thường được dùng ở nồng độ 0,125 – 0,33%, chế phẩm 50BHNdùng ở nồng độ 0,05 – 0,2%; thuốc bột, thuốc hạt hàm lượng 2% được phun với lượng 20 – 25kg/ha.

1.4.6 Phân tích dư lượng Carbaryl

1.4.6.1 Phương pháp quang phổ so màu:[11]

 Carbaryl được trích trong methylen chloride (CH2Cl2), tiến hành loại pha nước bằngNatri sulfate (Na2SO4) dạng bột khan Sau đó, mẫu được cho phản ứng tạo màu với KOH 0.1Ntrong Methanol, Acid acetic (CH3COOH), đồng thời cùng với thuốc thử màu p-nitrobenzendiazonium tetrafluoborate

 Tiến hành đo độ hấp thu tại bước sóng 475 nm, lượng Carbaryl trong mẫu tiến hànhphân tích từ 0,1 – 1 mg/mẫu và ngưỡng phát hiện (LOD) của phương pháp khoảng 0,03mg/mẫu



1.4.6.2 Phương pháp sắc ký khí (GC)

 Carbaryl được trích bằng CH2Cl2, sau đó được làm sạch bằng cách cho qua cộtFlorisil sử dụng cloroform/hexan tỉ lệ 1/1 và 100% cloroform làm dung dịch rửa giải Dưlượng được xác định bằng sắc ký khí đầu dò Nitơ – Phot pho Độ thu hồi mẫu là 85%, LOD từ0.3 đến 0.5 ng và LOQ (ngưỡng định lượng) của đầu dò là 0.1 ppm

 Dư lượng được trích ra khỏi rau bằng Acetonitrile (CH3CN), dịch trích sau đó đượclàm sạch bằng petroleum ete và kết tủa bằng dung dịch H3PO4 – NH4Cl Các tạp chất dạngphenol được tách ra bằng cách: hòa CH2Cl2 vào dịch trích và loại CH2Cl2 bằng cách dùngdung dịch KOH Dư lượng Carbamate được xử lý với 1-flouro-2,4 dinitrobenzen để hình thànhdẫn xuất ete Sau khi tạo dẫn xuất, tiến hành phân tích Carbaryl được pha trong iso-octanbằng thiết bị sắc ký khí đầu dò khối phổ (GC/MS): cột sắc ký khí có kích thước: 30 m x 0.25

mm (id), cột mao quản phim mỏng bằng thạch anh được phủ lớp silicon

 Chế độ vận hành: nhiệt độ cột: 70OC được giữ 1 phút, tăng nhiệt độ 5OOC/1 phút đến16OOC và giữ ở 16OOC trong 1 phút, và tăng cứ 3,5OC lên đến 270OC và giữ ở 270OC trong 10phút Sử dụng khí mang: Heli, độ tinh khiết 99,999% Tốc độ dòng qua cột: 1.2ml/phút [12]

 Dư lượng được trích ra khỏi rau bằng CH2Cl2, tách pha nước bằng dung dịch muốiNaCl và muối Na2S04 khan Dịch trích được cô quay bốc hơi đến khô và tráng lại bằng Hexan,sau đó được cho qua cột làm sạch Sử dụng cột Florisil được rửa giải với trình tự như sau: 6 mlhỗn hợp Hexan/Aceton (4/1), 5 ml Hexan, dịch trích Carbaryl và sau cùng là 6 ml hỗn hợpHexan/Aceton (4/1) Thu dịch rửa giải và cô quay đến khô, tráng lại bằng 0.5 ml Hexan Dưlượng được xác định bằng thiết bị sắc ký khí cột mao quản HP-5 MS (hãng Agilent, USA):kích thước 30 m x 0,25 mm (id) x 0,25 mm lớp phim, sử dụng Heli làm khí mang

 Điều kiện vận hành: 70OC trong 2 phút, tăng nhiệt độ cứ 25OC/ph đến 150OC, sau đótăng cứ 3OC/ph đến 200OC, rồi 8OC/ph đến 280OC, giữ ở nhiệt độ này trong 10 phút Nhiệt độinjector được giữ ở 220OC Đầu dò khối phổ MS: nhiệt độ nguồn ion (ion sourcetemperarture): 230OC, nhiệt độ bề mặt (interface temperature): 280OC.[16]

1.4.6.3 Sắc ký lỏng (HPLC)

 Dư lượng được trích bằng Methanol, làm sạch bằng cột Nuchar Celite và dùng hỗnhợp Toluen – CH3CN (1:3) để rữa giải Sau khi qua cột, mẫu được pha loãng và tiến hànhphân tích bằng sắc ký lỏng cao áp, pha đảo, đầu dò huỳnh quang Sau khi qua cột sắc ký,Carbaryl được tạo dẫn xuất với o-phthalaldehyde và 2-mercaptoethanol tạo thành chất pháthuỳnh quang Độ thu hồi mẫu ≥ 95% Sử dụng cột nhồi: cột C8 pha đảo: 25 cm x 4.6 mm x 6

μm Điều kiện vận hành: tốc độ pha động: 1.5 ml/ph, tỉ lệ pha động: 12% Acetonitile(CH3CN) :88% nước Quá trình thủy phân tạo dẫn xuất ở 100OC và nhiệt độ cột là 35OC Đầudò huỳnh quang đo ở bước sóng 340 và 455 nm Thời gian lưu Carbaryl: khoảng 20 phút

 Sử dụng cột C8: 4 x 250 mm, nhiệt độ cột: 45OC Tốc độ dòng: 0.8 ml/ph, đầu dòhuỳnh quang có tạo dẫn xuất sau cột với OPA Pha động: nước - methanol với chương trìnhtrộn thành phần pha động như sau:

 0 - 2 phút: 15% methanol

 42 phút: 70% methanol

 Thời gian lưu Carbaryl: 32 phút [17]

 Sử dụng cột pha đảo C18: 250 x 4 mm x 5 μm, đầu dò huỳnh quang Tốc độ dòng:0.8 ml/ph, nhiệt độ cột: 37 OC Pha động: nước / methanol CH30H, tỉ lệ thay đổi theo gradient:

 2 phút: 12 % CH30H

 42 phút: 66% CH30H

 Thời gian lưu Carbaryl: khoảng 37-39 phút[13]

 Sử dụng cột Wakosil II-3C18 RS: 150 x 2 mm (id) x 3.5 μm, đầu dò huỳnh quang.Tốc độ dòng: 0.2 ml/ph và nhiệt độ cột: 50 OC Pha động sử dụng: Acetonitrile/nước với thayđổi gradient như sau:

 10 phút: 20-60% acetonitrile

 20 phút: 60-70% acetonitile

 22-30 phút: 100% acetonitrile

 Thời gian lưu Carbaryl khoảng 15-16 phút [14]

 Sử dụng cột Superiorex (monomeric ODS): 150 x 4.6 mm (id) x 5 μm Tốc độ dòng:

1 ml/ph, nhiệt độ cột: nhiệt độ thường, đầu dò UV: bước sóng 220 nm Pha động: 100%Methanol Thời gian lưu Carbaryl: 2.96 phút [19]

 Sử dụng cột Dupont Zorbax ODS: 25 cm x 4.6 mm (id) x 6 μm Tốc độ dòng: 1ml/ph, đầu dò UV: bước sóng 280 nm Pha động: 55% Acetonitrile/45% nước Thời gian lưuCarbaryl: 6.5 phút LOQ của phương pháp (chiều cao peak bằng 5 lần chiều cao của đườngnền): 6.8 ng/lần tiêm thể tích 10 μl Carbaryl được pha trong dung môi là Acetonitrile [20]



1.5 THUỐC TRỪ SÂU DIMETHOATE [21]

 Thuộc nhóm trừ sâu thuộc nhóm lân hữu cơ, có tên gọi theo danh pháp quốc tế làO,O-dimethyl S–methylcarbamoylmethyl – phosphorodithioate

 Công thức hoá học: C5H12NO3PS2

 Công thức cấu tạo:

Hình 1.4 Dimethoate.

 Tên thương mại:Cekuthoate, Chimigor 40, Cygon 400, Daphene, De-Fend, Demos

NF, Devigon, Dimate 267, Dimet, Dimethoat Tech 95%, Dimethopgen, Ferkethion, Fostion

MM, Perfekthion, Rogodan, Rogodial, Rogor, Roxion, Sevigor, Trimetion



1.4.1 Tính chất vật lí [22]

 Dạng tinh khiết là những tinh thể màu trắng nóng chảy ở ~ 45 – 48oC, dạng kỹ nghệlà một chất dễ tan trong dung môi hữu cơ (chloroform, benzene, toluene, rượu, ester, ketone,methylen chloride, acetone và etanol), tan nhiều trong nước, tan ít trong carbon tetrachloride,diethyl eter, hexan, không tan trong xăng ete Độ bay hơi không đáng kể (0.107mg/m3 ở

20oC)

Bảûng 1.5 Độ tan của Dimethoate trong một số dung môi ở 25 0 C.

n-heptane 0,024

1.5.2 Tính chất hoá học [23]

 Dimethoate tương đối bền trong môi trường acid, thuỷ phân nhanh trong môi trườngkiềm, phân huỷ nhanh khi gia nhiệt đến nhiệt độ >800C Sự phân huỷ này tạo ra các khí độchại dimethyl sulfic, carbon monoxide, methyl mercaptane, pentoxide phospho

 Dimethoate phân huỷ trong thời gian ngắn trong đất, nước và cây trồng Thời giantồn tại trong đất của Dimethoate là 4 – 16 ngày, ngắn hơn trong đất ẩm Trong nước sông, sau18h – 8 tuần thì bị giảm một nửa Trong động vật cũng như trong thực vật, cơ chế biến đổicủa Dimethoate là giống nhau Nó bị oxi hoá thành O,O-dimethyl-phosphorothioate và hydrohóa thành O,O-dimethyl-phosphorodithioate, - phosphorothioate, -phosphat Sự oxi hoáDimethoate tạo nên hợp chất omethoate, một chất độc và là chất ức chế enzymecholinesterase mạnh, nó cũng phân huỷ trong môi trường nhanh như Dimethoate



1.5.3 Tính độc của Dimethoate: [24]

Đối với người:

 Dimethoate thuộc nhóm độc II

 LD50 qua miệng là 235mg/kg, qua da >400mg/kg

 ADI: 0.02mg/kg thể trọng / ngày

 Nồng độ cao nhất được chấp nhận của Dimethoate trong nước uống là 0.02mg/L

Đối với một số động vật : [25]

 Qua miệng: LD50 đối với chuột đực là 387, chuột cái 160, thỏ 300, lợn 350, gà 108,vịt 40, chim cút 84 mg/kg, với gấu 0.1 – 0.2 mg/con

 Qua đường hô hấp: LC50(4h) đối với chuột >1.6mg/1L không khí

1.4.4 Giới hạn dư lượng Dimethoate trên rau quả

 Dư lượng tối đa cho phép của Dimethoat trong cải xanh là 2mg/kg rau

Bảng 1.6 Dư lượng tuyệt đối của Dimethoate đối với một số rau quả

 Tác động nội hấp, tiếp xúc và xông hơi, diệt được những loài chích hút nhựa cây,

sâu nhai gặm, cả nhện đỏ và tuyến trùng Rotylenchus similis Coll hại chuối Dimethoate trị

hữu hiệu rệp, bọ xít, bọ cánh tơ, nhện đỏ trên bông, chè, cam, đậu, lạc, ngô…

 Nồng độ thường dùng 0.05-0.075% chế phẩm 50ND Dùng ở nồng độ cao hơn 0.15%) thuốc diệt được các loài sâu đục lá như dòi đục lá đậu, sâu vẽ bùa hại cam…Ở nhiệtđộ cao (>18oC) thuốc tác động lên côn trùng nhanh hơn và mạnh hơn Hiệu lực trừ sâu củathuốc kéo dài từ 2 - 3 tuần Cây sinh trưởng càng mạnh hoạt động sống càng cao, thuốc càngchóng phân huỷ trong cây thành những chất không độc Ngoài ra thuốc còn được dùng trongchăn nuôi thú y

(0.1- Sau khi phun Dimethoate vào rau quả, phải để một thời gian sau mới thu hoạch vàđem tiêu thụ Thời gian cách li đối với một số loại cây rau được cho ở bảng 1.5

Bảng 1.7 Thời gian cách li của Dimethoate cho một số loại nông sản

Loại cây trồng Thời gian cách li (ngày)

 Cân khoảng 10mg chất chuẩn Dimethoate, chính xác đến 4 hoặc 2 số lẻ cho vàobình định mức 10mL, định mức đến vạch bằng toluene, được dung dịch gốc, nồng độ 1mg/mL.

 Dùng pipet lấy chính xác 1mL dung dịch gốc vào bình định mức 10mL, tiếp tục địnhmức bằng dung môi ở trên, được dung dịch nồng độ 0.1mg/mL

 Bằng phương pháp pha loãng liên tục từ dung dịch có nồng dộ thu được, ta được dãydung dịch chuẩn

Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

 Cân khoảng 20g mẫu cho vào cối giã trong 30 phút đồng thời cho nước vào 100ml thêm 200mL aceton + khuấy trong 10 phút  cho vào 8g celite và lọc chân không thu đượcthể tích  thêm 20g NaCl + lắc trong vài phút  lắng 1h để tách pha  thêm 200mLdichloromethane + lắc và để trong 12h  thêm 30g Na2SO4 vào pha hữu cơ khuấy + lắngtrong 20 phút  lọc qua lớp bông thuỷ tinh và lớp Na2SO4 3 – 4cm  cho bay hơi đến khôtrong thiết bị cô quay chân không ở 400C  thêm vào 2mL iso-octane và dung dịch được choqua cột nhồi với 1g silicagel 60 (ký hiệu hỗn hợp số N07734, cỡ hạt 70/ 230 mesh)  thêm

vào 2mL toluene và cho hỗn hợp qua cột, 6mL toluen được cho vào cột và chất lỏng được chobay hơi đến 1mL  thêm vào toluene đến 2mL rồi đem phân tích trên thiết bị sắc kí khí

Điều kiện phân tích

 Sử dụng sắc kí khí với pha tĩnh là chất lỏng

 Cột mao quản: DB-210, 30m  0.32mm i.d, 0.5m film

 Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 2000C

 Nhiệt độ cột: 1600C

 Nhiệt độ detector: 2500C

 Aùp suất đầu (head pressure): 7.5 psi

 Giữ ở nhiệt độ ban đầu trong 1 phút, tăng nhiệt độ 160C/phút đến 2000C, giữ ở nhiệtđộ cuối cùng trong 7 phút

Các điều kiện vận hành đầu dò quang kế ngọn lửa (FPD)

 Tốc độ dòng hydro: 200mL/phút

 Tốc độ dòng không khí: 100mL/phút

 Tốc độ dòng nitơ: 30mL/phút

 Tỷ lệ tách dòng 12.5:1

1.5.6.2 Sắc kí lỏng [27]

 Thiết bị sắc kí LC – MS ( Hewlett – Packard, Waldbronn, Đức), cột đảo pha C18,

250  4.6 mm của Phenomenex.

 Pha động: methanol :nước với thành phần (theo thể tích) của methanol thay đổi 45%

 55%  75% trong quá trình phân tích Còn nước được chỉnh pH 3.8 bằng acid formic

Chuẩn bị mẫu phân tích:

 Lấy 10 mL mẫu nước, chỉnh pH 2.5 bằng HCl, Dimethoat được trích ra bằng 3 phần50mL dichlomethan, loại nước bằng Na2SO4, cô quay đến khô sau đó tráng bình bằng 1mLmethanol : nước = 6:4 (theo thể tích), sau đó lọc qua màng trước khi phân tích trên thiết bịsắc kí

1.5.6.3 Sắc kí lỏng cao áp HPLC [28]

 Thiết bị: thiết bị sắc kí HPLC Hewlett Packard HP 1100 với đầu dò UV , sử dụngcột Phenomenex Shpereclon ODS2, 5m, 120 mm  4.6mm

 Pha động: Acetonitril/dung môi A với tỷ lệ là 1/9 (theo thể tích) Với dung môi Ađược pha như sau: hòa tan 11.32g H3PO4 và 32.86g KH2PO4 bằng 1000mL nước cất, loại dùngcho HPLC Trộn dung dịch vừa chuẩn bị với nước theo tỉ lệ 9 /1 (theo thể tích) Ta được dungmôi A

Vận hành:

 Lượng mẫu bơm vào: 15 L

 Bước sóng: 210 nm

1.5.6.4 Sắc kí bản mỏng

 Dư lượng Dimethoate được chiết tách ra khỏi mẫu bằng aceton và n – hexan, sau đólàm sạch bằng cách cho qua cột Florisil đã làm mất hoạt tính và phản hấp phụ bằng hệ dungmôi rửa giải Xác định dư lượng Dimethoat trên sắc kí lớp mỏng bằng cách so sánh Rf và màusắc vết màu với vết Dimethoat chuẩn sau khi phun thuốc hiện màu đặc hiệu

 Hệ dung môi rửa giải: ete etylic/petroleum ete = 1/1 (theo thể tích)

 Hệ dung môi triển khai sắc kí: n- hexan/aceton = 7/3 (theo thể tích)

 Dung dịch thuốc thử hiện màu: cân 0.2g palladi clorua vào bình định mức 100mL.Hòa tan và định mức đến vạch bằng dung dịch HCl 0.01N

 Ngoài ra hiện nay, để phát hiện nhanh dư lượng thuốc trừ sâu lân hữu cơ, cacbamattrong nông sản, thực phẩm và các mẫu môi trường, các nhà khoa học thuộc Phòng Nghiêncứu Hoá sinh và Sinh học phân tử, viện công nghệ sinh học và thực phẩm (trường Đại họcBách khoa Hà Nội) đã nghiên cứu và chế tạo thành công bộ KIT Enzyme phát hiện nhanh dư

lượng thuốc trừ sâu Nguyên tắc thử: Enzyme acetylcholinesterase (AchE) xúc tác thuỷ phân

cơ chất acetylcholin thành cholin và acetic Acid acetic sẽ phản ứng với chất chỉ thị tạo màuvàng Nếu mẫu phân tích có thuốc trừ sâu lân hữu cơ, cacbamat sẽ kiềm hãm hoạt động củaAchE, hàm lượng acetic giảm, màu sẽ thay đổi Dựa vào sự thay đổi màu so với mẫu đốichứng (không có thuốc trừ sâu), hoặc dựa vào thang màu chuẩn có thể định tính hoặc bánđịnh lượng thuốc trừ sâu trong mẫu phân tích [29]

1.6 VITAMIN C [4]

 Vitamin C tồn tại trong tự nhiên dưới 3 dạng phổ biến là acid ascorbic, aciddehydroascorbic và dạng liên kết ascorbigen Nó chỉ tồn tại ở dạng L trong các sản phẩmthiên nhiên

 Cho tới nay người ta phát hiện thấy 14 đồng phân và đồng đẳng của vitamin C cóhoạt tính chống bệnh hoại huyết và 15 chất đồng phân không có hoạt tính

 Công thức phân tử C6H8O6

Hình 1.5 Acid ascorbic

1.6.1 Tính chất vật lý

 Acid ascorbic tinh khiết tồn tại ở dạng tinh thể, không màu hoặc có màu trắng Acidascorbic thường không có mùi, có vị chua acid, tan vô hạn trong nước, ít tan trong ethanol,không tan trong ether và chloroform Nhiệt độ nóng chảy 190oC

 Acid ascorbic bị hoá đen khi để trực tiếp ngoài ánh sáng mặt trời, tuy nhiên sự biếnmàu nhẹ có thể không làm mất hoạt tính chữa bệnh của acid ascorbic Thậm chí khi không cómặt ánh sáng thì acid ascorbic vẫn dễ dàng bị biến tính khi tiếp xúc với độ ẩm trong khôngkhí và sự phân huỷ này càng nhanh khi nhiệt độ môi trường càng cao



1.6.2 Tính chất hoá học

 Trong dung dịch, acid ascorbic nhanh chóng bị oxi hoá khi có mặt không khí và pHvùng kiềm Acid ascorbic bền trong môi trường trung tính, acid, không bền trong môi trườngcó các ion kim loại như Cu2+, Fe2+, Enzym ascorbatoxydase…



1.6.3 Nguồn gốc

 Acid ascorbic có cả nguồn gốc tự nhiên và nhân tạo Trong tự nhiên, acid ascorbicđược tìm thấy trong các loại rau quả tươi Nguồn thức ăn chứa vitamin C rất tốt là những tráicây thuộc họ citrus hay nước ép từ trái họ citrus, quả mọng, hồ tiêu xanh hay đỏ, cà chua,bông cải, rau cải bó xôi

Bảng 1.8 Thành phần Vitamin C trong một số nguyên liệu thực phẩm

1.6.4 Vai trò của Vitamin C [30]

 Vitamin C được Albert Szent-Gyorgyi phân lập năm 1928 Gần 70 năm sau, các nhànghiên cứu đã khám phá ra nhiều lợi ích của vitamin C trên sức khoẻ Đây là loại vitamin mà

cơ thể cần nhiều nhất Đối với người bình thường cần khoảng 80 – 100mg Vitamin C trong 24giờ Tuỳ thuộc vào hệ di truyền và các yếu tố trong lối sống, một số người đòi hỏi lượngVitamin C nhiều hơn lượng trung bình của một người bình thường nhằm ngăn chặn sự giánđoạn của các phản ứng sinh hoá quan trọng Chẳng hạn như người lớn tuổi, uống rượu, người

bị bệnh tiểu đường, người hút thuốc lá thường bị thiếu Vitamin C

 Không như hầu hết các loại động vật khác, cơ thể người không thể tự sản xuấtvitamin C Một bệnh do thiếu hụt vitamin C phổ biến nhất là bệnh scorbus (scurvy) Các triệuchứng kinh điển của bệnh này gồm: chảy máu nướu răng, chậm lành vết thương, các vết thâmtím rộng trên da (mảng xuất huyết dưới da, dân gian thường gọi là “vết ma cắn”) Thêm vàođó là sự dễ bị nhiễm trùng, hysteria và trầm cảm cũng là những tiêu chuẩn chẩn đoán

 Vitamin C hiện nay là một chế phẩm bổ sung vitamin phổ biến nhất Trong khi cácnhà nghiên cứu và các chuyên gia vẫn còn bàn cãi về nhiều khía cạnh khác nhau của vitamin

C, một điều không thể chối cãi rằng loại vitamin này đóng một vai trò hết sức quan trọngtrong mọi hoạt động của cơ thể người Vitamin C có đặc tính chữa lành bệnh scorbut (bệnhchảy máu) Tạo điều kiện dễ hấp thu Fe nhưng nếu nhiều quá thì vitamin C sẽ ảnh hưởng đếnquá trình hấp thu Cu

 Tăng đào thải các kim loại độc như Pb và các chất ô nhiễm khác, giảm stress dogiúp tổng hợp hormon thượng thận Tham gia vào cơ chế miễn dịch, chống lại nhiễm trùng vikhuẩn và virus Giảm tuần hoàn histamin, một chất trung gian gây dị ứng và một vài tai biếnkhi có thai Vitamin C có khả năng chống oxi hoá: nó ngăn chặn quá trình sản xuất các gốc tự

do, bảo vệ acid béo không no của màng tế bào Ức chế quá trình tạo thành Nitrosamin (chấtgây ung thư trong dạ dày) và trung hoà một số chất độc

 Ức chế quá trình sản xuất các gốc tự do, mà các gốc này sẽ phá huỷ gen Độc tínhcủa Vitamin C hầu như không có bởi dư lượng Vitamin C có thể được đào thải qua nước tiểu.Tuy nhiên, cần thận trọng để tránh dùng nhiều vitamin C với người bị sỏi thận Tác dụng phụchính của quá liều vitamin C là tiêu chảy Kết hợp với sắt hay đồng, vitamin C có thể trởthành tiền oxy hoá thay vì chống oxy hoá Cần tránh cho trẻ sơ sinh dùng vitamin C trong

tháng đầu sau sinh, bởi vì hồng cầu của trẻ sơ sinh bị phá huỷ sẽ giải phóng ra sắt Cung cấpthêm vitamin C cũng bị chống chỉ định ở những người bị nhiễm sắt.



1.6.5 Các phương pháp phân tích Vitamin C

1.6.5.1 Phân tích Vitamin C bằng phương pháp HPLC [5]

 Phương pháp này được giới thiệu trong nhiều tài liệu tham khảo và đã trở thành mộtbài thí nghiệm trong PTN Hóa sinh, bôï môn CN thực phẩm Cột sắc ký sử dụng là cột phađảo ODS C18 Pha động sử dụng là dung dịch đệm phosphate pH = 2,8 trộn với methanol theotỷ lệ thể tích 90/10, lưu lượng pha động qua cột 1 mL/phút Sử dụng đầu dò UV đo độ hấp thụ

ở bước sóng 245 nm

 Mẫu rau quả được nghiền trong dung dịch đệm phosphate pH = 2,8 để trích Vitamin

C ra, pha loãng theo tỷ lệ thích hợp rồi phân tích như với các mẫu chuẩn Hàm lượng Vitamin

C trong mẫu được xác định bằng cách nội / ngoại suy tín hiệu của mẫu từ đường chuẩn



1.6.5.2 Phân tích vitamin C bằng phương pháp chuẩn độ [1]

Chuẩn độ với 2,6- dichloroindophenol (DCP)

 Đây là một phương pháp hữu dụng để định lượng vitamin C trong rau quả Cơ sở củaphương pháp này là phản ứng oxi hóa acid ascorbic trong dung dịch bởi DCP thành dạngdehydroascorbic acid Sản phẩm của phản ứng oxy hóa khử này đều không màu Phương trìnhphản ứng (pH=3)

C6H8O6 (không màu) + C12H7O2NCl2(đỏ) → C6H6O6 (không màu) + C12H9O2NCl2 (không màu)

 Sự chuẩn độ này đặc biệt thuận lợi bởi vì DCP cũng đóng vai trò như chất chỉ thịmàu Khi nhỏ dung dịch DCP vào một dung dịch có chứa vitamin C, thì hỗn hợp phản ứngkhông màu cho đến khi tất cả lượng vitamin C có trong hỗn hợp chuyển hết thành dạngdehydroascorbic acid Giọt dung dịch DCP tiếp theo thêm vào nếu xuất hiện màu đỏ chứng tỏđó là giọt DCP còn dư và phản ứng đã kết thúc Do đó, điểm tương đương được xác định (chỉthị) khi dung dịch chuẩn độ từ không màu chuyển sang màu đỏ của DCP

 Yếu điểm của phương pháp này là dung dịch DCP rất kém bền nên chúng ta chỉ phadung dịch ngay trước khi sử dụng chúng

 Trước khi tiến hành chuẩn độ, cần xử lý mẫu thực phẩm với metaphosphoric acid.Bước xử lý với acid này nhằm làm biến tính và kết tủa protein trong mẫu để tránh ảnh hưởngđến kết quả phân tích, đồng thời cũng nhằm giúp ổn định acid ascorbic tránh bị phân huỷ.Acid hoá đến pH nhỏ hơn 4 cũng nhằm làm giảm phản ứng của DCP với các hợp chất khác

Chuẩn độ bằng iode

 Đây là qui trình chuẩn độ ngược, lượng ion I3 - dư trong dung dịch sau khi đã phảnứng với Vitamin C được xác định bằng cách cho phản ứng với dung dịch thiosulfate Cơ sởcủa phương pháp chuẩn độ Vitamin C bằng Iod là phản ứng oxi hoá Vitamin C thànhdehydroascorbic acid, C6H6O6 theo phương trình sau:

6H + (aq)+KIO 3 (aq)+8KI(s) → 9K + (aq)+3I - (aq)+3H 2 O(l)

 Lượng I3 - tạo thành có thể được tính toán thông qua lượng KI và KIO3 đã sử dụng.Lượng này trừ đi lượng dư trong chuẩn độ với thiosulfate sẽ thu được lượng I 3 - đã phản ứng

với acid ascorbic

CHƯƠNG 2 MÔ TẢ THỰC NGHIỆM2.1 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ

2.1.1 Hóa chất và thiết bị sử dụng

Hóa chất:

 Carbaryl_Bayer_Độ tinh khiết 98%

 Dimethoat (độ tinh sạch >98%)

 Acetonitrile (loại dùng cho HPLC, của J.Baker (USA))

 Aceton_Trung Quốc

 NaCl_Trung Quốc

 KH2PO4 (Trung Quốc)

 H3PO4 (Trung Quốc)

Thiết bị:

 Máy sắc ký lỏng_ hãng Shimazdu SPD – 6AV_ Đầu dò UV – VIS

 Bể đánh siêu âm_ Decon

 Máy cô đặc chân không_ Heidolph WB 2000

 Máy đo quang phổ hấp thu_ Spectronic Genesys 8

 Máy đo độ ẩm _ Scaltec SMO 01

 Máy khuấy từ

 Hệ thống lọc chân không

 Cân phân tích Sartorius 1 số lẻ và 4 số lẻ

 Máy xay Magic Bullet

 Phễu chiết 250mL

 Becher 100mL, 250mL, 500mL

 Ống đong 100 mL, 250mL

 Bình định mức 10, 25, 50, 100 mL

 Cuvette thạch anh

 Màng lọc 0.45µm, giấy lọc



2.1.2 Thiết bị sắc kí lỏng cao áp HPLC

 Hệ thống HPLC (Shimazu) gồm bơm LC -10AS, đầu dò quang phổ SPD-6AV vàmáy ghi Chromatopac CR 6A

 Sử dụng cột C18 của Phenomebex (USA),Gemini 5m – 110A0, 250  4.6mm, thuộcloại sắc kí pha đảo Riêng đối với Vitamin C sử dụng ET 250/8/4 Nucleosil® 120 – 5 C18thuộc loại cột sắc ký lỏng pha đảo còn gọi là cột ODS hay RP – 18



2.2 VẬN HÀNH THIẾT BỊ THIẾT BỊ SẮC KÍ LỎNG CAO ÁP HPLC

2.2.1 Vận hành bơm

 Đặt giá trị áp suất cực đại (P.MAX): 300 kgf/cm2 Mục đích là để bảo vệ cột và cáchệ thống khác, khi áp suất vượt P.MAX, bơm sẽ tự động tắt

 Đặt giới hạn dưới của áp suất (P.MIN) nhằm mục đích không cho không khí vào hệkhi có sự cố hở trên hệ thống và an toàn khi đo.

 Đặt lưu lượng pha động (FLOW RATE): 1mL/phút và không nên đặt quá giá trị nàytrừ trường hợp cần rửa sạch hệ thống



2.2.2 Đầu dò (DETECTOR)

 Detector SPD –6AV của hãng Shimadzu thuộc loại detector hấp thu tử ngoại và khảkiến (UV – VIS)

 Chọn bước sóng đo: chọn bước sóng đo thích hợp với chất cần phân tích nhằm nângcao độ nhạy của quy trình phân tích

 Chọn mức đáp ứng (RESPOND) chuẩn (STD)

 Khi cần chỉnh độ hấp thu về mức không, sử dụng nút ZERO



2.2.3 Máy ghi Chromatopac CR6A

 Máy ghi này gồm các bộ phận: bàn phím cài đặt chương trình với các phím điềukhiển, bộ phận nối với detector để thu nhận tín hiệu, bộ phận nối cảm ứng để khởi động đồngthời hệ thống chạy mẫu và hệ thống ghi, bộ phận in cảm ứng, xử lý dữ liệu theo chương trìnhcài đặt sẵn và in thành sắc kí đồ



2.2.4 Cài đặt các thông số

 ATTEN: có giá trị từ 0 đến 10, giá trị càng nhỏ thì khoảng biểu diễn trên sắc kí đồcàng nhỏ, dùng ATTEN nhỏ khi để đo nồâng độ thấp mà không ảnh hưởng tính diện tích peak,thường dử dụng ATTEN = 10

 METHOD (phương pháp): sử dụng phương pháp 61 để cho kết quả diện tích peak dòđược đồng thời đánh dấu vị trí peak

 SLOPE (độ nhạy): Slope càng nhỏ độ nhạy càng cao, nên đặt <200

 MIN.AREA (diện tích peak tối thiểu)

 STOP.TIME ( thời gian ngừng ghi sắc kí đồ)

 SPEED (tốc độ giấy): thường dùng 5, muốn peak dạng sắc nhọn thì giảm SPEED



2.2.5 Chuẩn bị máy trước khi tiến hành phân tích

 Nước cất hay pha động trước khi bơm vào cột phải được loại khí bằng siêu âm

 Nhấn nút POWER của bơm, để ổn định trong 15 phút Kiểm tra áp suất cực đại vàcực tiểu

 Khi áp suất ổn định, rửa đường ống bằng nước cất 2 lần và pha động trong 10 phút.(xoay nút tháo ở vị trí mở (DRAIN 1800), nhấn nút rửa PURGE).

 Nhấn nút PURGE hoặc PUMP để dừng bơm Xoay van tháo 1800 để khóa chặt Rửađường ống trước cột bằng nước cất và pha động trong 10 phút

 Gắn cột vào, cho vận hành bơm, bơm pha động qua cột 20 – 30 phút Nếu cần thiếtrửa cột bằng dung dịch acetonitril : nước = 90 : 10 (theo thể tích) trong 15 – 20 phút trước khicho pha động chạy qua

 Chỉnh độ hấp thu về không bằng cách nhấn nút ZERO trên detector Kiểm tra đườngnền bằng lệnh SHIFT DOWN PLOT ENTER Trong quá trình kiểm tra nếu đường nếu đườngnền bị lệch vài phút thì nhấn lại ZERO, đợi đường nền thẳng lặp lại nhóm lệnh trên để kếtthúc kiểm tra

2.3 KHẢO SÁT QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CARBARYL, DIMETHOATE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC)

2.3.1 Khảo sát phổ hấp thụ tia UV của Carbaryl, Dimethoate trong dung dịch

 Tiến hành quét phổ dung dịch Carbaryl - 55%Acetonitrile:45%nước ở nồng độ10ppm, dung dịch Dimethoate - 55%Acetonitrile:45%nước nồng độ 10ppm Sử dụng cuvetthạch anh và quy trình quét phổ tự động trong vùng bước sóng từ 190 nm đến 400 nm



2.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần pha động

 Phân tích Carbaryl trong các mẫu chuẩn với sự thay đổi thành phần pha độngAcetonitrile-nước theo các tỷ lệ thể tích 85/15, 70/30, 55/45, 40/60 Tốc độ dòng giữ cố định1mL/phút Thể tích bơm mẫu 20µL Đầu dò UV hoạt động ở bước sóng 220nm Mỗi mẫuchuẩn đo 3 lần, lấy giá trị trung bình của thời gian lưu và diện tích peak

 Tiến hành tương tự với các mẫu chuẩn Dimethoate Tốc độ dòng giữ cố định1mL/phút Thể tích bơm mẫu 20µL Đầu dò UV hoạt động ở bước sóng 204nm

 So sánh diện tích peak, thời gian lưu, hình dạng sắc ký đồ thu được ở các hệ pha độngkhác nhau từ đó lựa chọn tỷ lệ pha động tối ưu



2.3.3 Xây dựng đường chuẩn xác định hàm lượng Carbaryl, Dimethoate trong dung dịch

Đường chuẩn xác định hàm lượng Carbaryl trong dung dịch:

 Pha chuẩn gốc: cân 0.05g carbaryl, hoà tan và định mức 50mL bằng acetonitrile, thuđược dung dịch gốc có nồng độ 1000ppm

 Pha loãng dung dịch gốc thành các nồng độ mong muốn (1, 2, 5, 10, 20) bằng nướccất:



Thể tích dung dịch rút

ra, mL Bình định mức sửdụng, mL Nồng độ dung dịch thuđược, ppm

1

 Từ dung dịch carbaryl 10ppm:

Thể tích dung dịch rút

ra, mL Bình định mức sửdụng, mL Nồng độ dung dịch thuđược, ppm

5

5

1

102510

521

Điều kiện vận hành HPLC:

 Hệ pha động chạy sắc ký: 55%Acetonitrile-45%nước (sử dụng Acetonitrile HPLC,nước cất 2 lần)

 Tốc độ dòng: 1 ml/phút

 Đầu dò UV-VIS: bước sóng 220 nm

 Thể tích tiêm mẫu: 20 l/mẫu

 Mỗi mẫu chuẩn được đo 3 lần, lấy giá trị trung bình của diện tích peak và thời gianlưu

 Phương trình biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ chính là phươngtrình đường chuẩn

Đường chuẩn xác định hàm lượng Dimethoate trong dung dịch:

 Pha chuẩn gốc: cân 0.05g Dimethoate, hoà tan và định mức 50mL bằng Acetonitrile,thu được dung dịch gốc có nồng độ 1000ppm

 Pha loãng dung dịch gốc thành các nồng độ mong muốn (1, 2, 5, 10, 20) bằng phađộng chạy HPLC:

Thể tích dung dịch rút

ra, mL Bình định mức sửdụng, mL Nồng độ dung dịch thuđược, ppm

1

 Từ dung dịch dimethoate 10ppm:

Thể tích dung dịch rút

ra, mL Bình định mức sửdụng, mL Nồng độ dung dịch thuđược, ppm

Điều kiện vận hành HPLC:

 Hệ pha động chạy sắc: dung dịch 55%acetonitrile-45%nước (sử dụng AcetonitrileHPLC, nước cất 2 lần dùng cho phân tích)

 Tốc độ dòng giữ cố định 1mL/phút

 Thể tích bơm mẫu 20µL

 Đầu dò UV hoạt động ở bước sóng 204nm

 Mỗi mẫu chuẩn được đo 3 lần, lấy giá trị trung bình của diện tích peak và thời gianlưu



2.3.4 Nghiên cứu độ thu hồi mẫu qua cột của Carbaryl, Dimethoate

 Sử dụng các mẫu chuẩn Carbaryl, Dimethoate nồng độ 1-20ppm

 Ở chế độ qua cột: mỗi nồng độ phân tích 3 lần lấy giá trị trung bình diện tích peak

 Ở chế độ không qua cột (mẫu được pha động dẫn thẳng đến đầu dò không qua cộtphân tích): sau khoảng 1 phút, ta lại bơm 20 L mẫu vào, sau 5 – 6 phút thì dừng (các lầnbơm từ lần 2 trở đi không nhấn phím START) Tính giá trị trung bình của diện tích peak

 Tỷ số diện tích peak của mẫu qua cột và mẫu không qua cột ở cùng nồng độ cho tađộ thu hồi mẫu qua cột

Trong đó:

 S qc – diện tích peak của mẫu qua cột

 S kqc – diện tích peak của mẫu không qua cột

2.4 KHẢO SÁT QUY TRÌNH XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH HÀM LƯƠNG CARBARYL, DIMETHOATE TRONG CẢI XANH

2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của số bậc trích ly lên hàm lượng Carbaryl, Dimethoate

 Sử dụng mẫu 25ml Carbaryl 20ppm trong nước cất, tiến hành trích ly như đối với rauđến bậc 3 theo sơ đồ:

25mL Carbaryl 20ppm

Lắc 50mL

acetone

Khuấy từ

5 – 7g NaCl

Dịch phân tích

actonitrile

Pha hữu cơ Cô quay chân không

Tráng bình Định mức 50mL

Dịch phân tích

Pha nước

acetone Lắc

NaCl

Pha hữu cơ

Pha nước Lắc Tách pha Cô quay chân không

Tráng bình

(1)

Nước

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình trích các mẫu chuẩn Carbaryl (Dimethoate) trong nước

 Dịch trích thu được ở mỗi bậc trích ly được đem phân tích với thiết bị HPLC, mỗimẫu phân tích 3 lần lấy giá trị trung bình của diện tích peak Tỷ số giữa diện tích peak củadịch trích và diện tích peak của mẫu chuẩn ban đầu quy về nồng độ tương ứng cho ta hiệusuất thu hồi mẫu ở mỗi bậc trích ly.

 Tiến hành thí nghiệm tương tự đối với Dimethoate



2.4.2 Xác định độ thu hồi mẫu Carbaryl, Dimethoate của quá trình trích ly

 Sử dụng mẫu 100g rau, 100g rau có bổ sung 10ml dung dịch Carbaryl 100ppm, 100grau có bổ sung 20ml dung dịch Carbaryl 100ppm, 100g rau có bổ sung 25ml dung dịchCarbaryl 100ppm, để qua đêm sau đó tiến hành xay nhỏ trong 100 mL Aceton, thêm 100mlAceton đem khuấy từ trong 15 phút Tiến hành lọc chân không qua giấy lọc 0.6mm, thu dịch,phần bã cho vào erlen 250 mL, thêm 50mL Aceton, khuấy từ trong 10 phút, lọc loại bã Tổngdịch lọc thu được sẽ được xử lý như quy trình ở hình trên (hình 2.1.) Sau đó được phân tíchbằng thiết bị HPLC, xác định diện tích peak các mẫu không bổ sung, có bổ sung Carbaryl trênrau và mẫu Carbaryl trong nước có cùng nồng độ tương đương để so sánh xác định độ thu hồimẫu (Recovery)

100(%)  

ch

rau bs

S

S S R

Trong đó:

 S bs – Diện tích mẫu bổ sung chuẩn

 S rau – Diện tích mẫu rau không thêm chuẩn

 S ch – Diện tích mẫu chuẩn trong nước nồng độ tương ứng

 Tiến hành tương tự với các mẫu không bổ sung, bổ sung 2.5ml, 5ml, 10ml dung dichDimethoate 100ppm Xác định độ thu hồi mẫu Dimethoate của quá trình trích ly

 Tiến hành thí nghiệm tương tự nhưng không bổ sung chuẩn trực tiếp vào rau mà bổsung vào dịch trích sau quá trình xay và lọc chân không Xác định và so sánh độ thu hồi mẫukhi bổ sung chuẩn vào dịch và khi bổ sung vào rau

 Từ độ thu hồi mẫu khi bổ sung chuẩn vào rau, ta tính được lượng Carbaryl,Dimethoate thực tế có trong rau bằng công thức sau



R H A

S X

 X – Hàm lượng Carbaryl (Dimethoate) thực tế có trong rau (ppm)

 S – Diện tích peak của mẫu trích ly từ rau đo bằng thiết bị HPLC

 H – Đôï thu hồi mẫu qua cột (%)

 R – Độ thu hồi mẫu của quy trình trích khi bổ sung chuẩn vào rau(%)

 A – Hệ số góc của phương trình đường chuẩn



2.4.2 Qui trình trích mẫu Carbaryl, Dimethoate từ cải xanh

 Cân 100 g mẫu rau, xay nhỏ trong 100 mL Aceton, thêm 100ml Aceton đem khuấytừ trong 15 phút Tiến hành lọc chân không qua giấy lọc 0.6mm, dịch lọc thu được cho vàobecher 250 mL, phần bã cho vào erlen 250 mL, thêm 50mL Aceton, khuấy từ trong 10 phút,lọc thu dịch lọc Trộn hai phần dịch lọc lại thêm 25 - 30 g muối NaCl (tùy vào lượng nước cótrong mẫu), khuấy cá từ để hòa tan hoàn toàn muối Dịch sau khuấy từ được cho vào phễuchiết, chờ một thời gian cho tách pha thu pha hữu cơ phía trên Pha nước phía dưới cho vàobecher, thêm 50 mL aceton, được đem đi khuấy từ Tiếp tục tách pha thu pha hữu cơ ở trên.Trộn chung pha hữu cơ ở các lần tách pha lại với nhau, sau đó tiến hành cô đặc chân khôngdịch trích điều kiện nhiệt độ 35oC, vận tốc quay 120 vòng/phút Dịch sau cô quay được tránglại nhiều lần bằng Acetonitrile Định mức dịch trích bằng nước cất 2 lần, sử dụng bình địnhmức 100 mL, đánh siêu âm để đuổi bọt khí và lọc lại bằng màng lọc 0.2µm (đường kính: 13

mm, hãng Agilent) Tiến hành phân tích với thiết bị HPLC, chế độ vận hành thiết bị như khichạy đường chuẩn

2.5 ỨNG DỤNG QUY TRÌNH XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH CARBARYL, ĐỂ XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT PHÂN HUỶ CARBARYL TRONG CẢI XANH SAU QUÁ TRÌNH CHIẾU XẠ

2.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu tới mức độ phân hủy Carbaryl trong nước

 Chiếu xạ các mẫu dung dịch 6, 10, 12, 20ppm Carbaryl trong nước với các liều chiếu

1, 3 kGy Phân tích các mẫu trên cùng với mẫu đối chứng (mẫu không chiếu xạ)

 Tỷ số diện tích peak của mẫu đã chiếu xạ với mẫu đối chứng xác định hiệu suấtphân hủy Carbaryl

2.5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu tới mức độ phân hủy Carbaryl trong cải xanh

Chiếu xạ mẫu cải xanh ở liều chiếu cao hơn ngưỡng cho phép:

 Chuẩn bị mẫu chiếu xạ: cân 100g cải xanh, thêm Carbaryl với lượng gấp đôi dưlượng tối đa cho phép trên cải xanh (20mL dung dịch Carbaryl 100ppm), để qua đêm để thuốcngấm vào rau, sau đó đem mẫu đi chiếu xạ Liều chiếu 1.5 và 3 kGy

 Phân tích mẫu cải xanh đã chiếu xạ cùng với mẫu đối chứng (mẫu cải xanh có tẩmthêm Carbaryl nhưng không chiếu xạ) Tỷ số diện tích peak của mẫu đã chiếu xạ với mẫu đốichứng xác định hiệu suất phân hủy Carbaryl trong rau



Chiếu xạ mẫu cải xanh ở các liều chiếu thấp (bằng và nhỏ hơn ngưỡng cho phép):

 Chuẩn bị mẫu cải xanh tương tự như trên nhưng chỉ tẩm thêm Carbaryl với lượngbằng dư lượng tối đa cho phép trên rau (10mL dung dịch Carbaryl 100ppm), để qua đêm vàđem mẫu đi chiếu xạ Chiếu xạ ở các liều 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 và 1 kGy

 Phân tích và đánh giá kết quả như trên

2.6 KHẢO SÁT QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VITAMIN C BẰNG THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ÁP (HPLC)

2.6.1 Khảo sát phổ hấp thụ tia cực tím của Vitamin C trong dung dịch

 Tiến hành quét phổ dung dịch Vitamin C trong hệ đệm phosphat, pH=2.8 nồng độ10ppm Sử dụng cuvet thạch anh và quy trình quét phổ tự động trong vùng bước sóng từ 190

nm đến 400 nm



2.6.2 Xây dựng đường chuẩn xác định hàm lượng Vitamin C trong dung dịch

 Pha chuẩn gốc: cân 0.05g acid ascorbic, hoà tan và định mức 50mL bằng dung dịchacid H3PO4, pH = 2.8 , thu được dung dịch gốc có nồng độ 1000ppm

 Pha loãng dung dịch gốc thành các nồng độ mong muốn (1, 2, 5, 10, 20) bằng dungdịch acid H3PO4, pH = 2.8

Thể tích dung dịch rút

ra, mL Bình định mức sửdụng, mL Nồng độ dung dịch thuđược, ppm

1

 Từ dung dịch acid ascorbic 10ppm:

Thể tích dung dịch rút

ra, mL

Bình định mức sửdụng, mL

Nồng độ dung dịch thuđược, ppm

5

5

1

102510

521

Điều kiện vận hành hệ thống HPLC:

 Hệ pha động chạy sắc ký là hệ đệm và methanol với tỷ lệ 90/10 (sử dụng methanolHPLC, nước cất 2 lần) Hệ đệm được pha bằng cách hoà tan 6.5g KH2PO4 trong 1L nước cất 2lần, chỉnh pH về 2.8 bằng H3PO4 rồi lọc bằng màng 0.45µm

 Tốc độ dòng giữ cố định 1mL/phút

 Thể tích bơm mẫu 20µL

 Đầu dò UV hoạt động ở bước sóng 245nm

 Mỗi mẫu chuẩn được đo 3 lần, lấy giá trị trung bình của diện tích peak và thời gianlưu Phương trình biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ chính là phươngtrình đường chuẩn



2.6.3 Xác định độ thu hồi Vitamin C qua cột

 Sử dụng các mẫu chuẩn Vitamin C nồng độ 1-20ppm

 Ở chế độ qua cột: mỗi nồng độ phân tích 3 lần lấy giá trị trung bình diện tích peak

 Ở chế độ không qua cột (mẫu được pha động dẫn thẳng đến đầu dò không qua cộtphân tích): sau khoảng 1 phút, ta lại bơm 20 L mẫu vào, sau 5 – 6 phút thì dừng (các lầnbơm từ lần 2 trở đi không nhấn phím START) Tính giá trị trung bình của diện tích peak.

 Tỷ số diện tích peak của mẫu qua cột và mẫu không qua cột ở cùng nồng độ cho tađộ thu hồi mẫu



2.7 PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VITAMIN C TRONG CẢI XANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

2.7.1 Quy trình trích Vitamin C từ cải xanh

 Cân 10g cải xanh, đem nghiền và trích ly bằng 150mL dung dịch đệm photphat Sauđó lọc chân không, thu dịch lọc, phần bã tiếp tục được trích ly bậc hai bằng 50mL dung dịchđệm Dịch lọc thu được từ hai lần trích cho vào bình định mức và định mức 250mL bằng dungdịch đệm phosphat Sau đó được đánh siêu âm để đuổi bọt khí và lọc lại bằng màng lọc 0.2

µm Tiến hành phân tích với thiết bị HPLC theo chế độ vận hành của Vitamin C đã trình bày

ở trên