Luận văn nghiên cứu quy trình phân tích Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C

Luận văn nghiên cứu quy trình phân tích Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C.

LỜI CẢM ƠN

Hơn bốn năm ngồi trên ghế giảng đường đại học, và đặc biệt làkhoảng thời gian làm luận văn tốt nghiệp vừa qua đã giúp cho em rấtnhiều trong việc phát triển khả năng học tập nghiên cứu cũng như làrèn luyện nhân cách của mình Để có được những điều này, em xingửi lời cảm ơn chân thành nhất đến tất cả các quý thầy cô trongtrường Đại học Bách khoa, và đặc biệt là các thầy cô trong Bộ mônCông nghệ thực phẩm, những người đã giảng dạy và chỉ bảo tận tìnhcho em trong suốt thời gian qua

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến thầyNgô Mạnh Thắng và thầy Hoàng Minh Nam đã tận tình hướng dẫn vàchỉ bảo để em có thể hoàn thành tốt luận văn này

Trân trọng cảm ơn Ths.Đoàn Tấn Vinh, giám đốc công ty VIPESCOđã hỗ trợ hoạt chất Dimethoate Trung tâm nông dược thuộc công tyVIPESCO đã phân tích đối chứng một số mẫu Dimethoate từ dịchtrích rau

Con xin cảm ơn bố mẹ đã nuôi dưỡng chăm lo, động viên cho conđể con có thể hoàn thành tốt nhiệm vụ của mình

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè tôi, những người luôn gắnbó, giúp đỡ tôi rất nhiều trong học tập cũng như trong cuộc sống

Tp HCM, ngày 05 tháng 01 năm 2008

Sinh viênĐinh Thị Thu Hằng

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Luận văn đã nghiên cứu quy trình phân tích Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C trong cải bắp với thiết bị HPLC Cụ thể:

Đối với Carbaryl, Dimethoate:

Tiến hành quét phổ hấp thu bước sóng UV -VIS của Carbaryl, Dimethoate trongdung dịch

Lựa chọn pha động với tỷ lệ Axetonitril/nước thích hợp để phân tích Carbaryl,Dimethoate

Xây dựng đường chuẩn xác định hàm lượng Carbaryl, Dimethoate trong dung dịchvới bước sóng hấp thu cực đại và tỷ lệ Axetonitril/nước đã chọn

Khảo sát, cải thiện quy trình trích ly Carbaryl, Dimethoate trong các mẫu rau cảibắp

Ứng dụng quy trình trích ly xử lý và phân tích hàm lượng Carbaryl, Dimethoate đểxác định dư lượng trong mẫu rau mua ở chợ và hiệu suất phân huỷ Carbaryl trong cảibắp sau quá trình chiếu xạ

Đối với Vitamin C:

Tiến hành quét phổ hấp thu UV của Vitamin C trong dung dịch

Xây dựng đường chuẩn xác định hàm lượng Vitamin C trong dung dịch với bướcsóng hấp thu cực đại đã xác định

Khảo sát độ thu hồi của quy trình trích ly Vitamin C trong cải bắp

MỤC LỤC

Chương 1 : MỞ ĐẦU 1

Chương 2 : TỔNG QUAN 3

2.1 Thuốc bảo vệ thực vật: [1, 4, 7] 3

2.1.1 Định nghĩa: 3

2.1.2 Phân loại: 3

2.1.3 Cách tác động của thuốc lên dịch hại: 3

2.1.5 Dư lượng thuốc trên cây trồng và nông sản: [7] 4

2.1.6 Tình hình sử dụng thuốc BVTV: [9, 20] 4

2.1.7 Tình hình ngộ độc thuốc BVTV: [20] 5

2.2 Thuốc trừ sâu Carbaryl: 5

2.2.1 Đặc tính sinh học Ứng dụng [1] 5

2.2.2 Tính chất lý hóa: [4] 5

2.2.3 Độc tính: [4] 6

2.3 Thuốc trừ sâu Dimethoate: 7

2.3.1 Đặc tính sinh học Ứng dụng [1] 7

2.3.2 Tính chất lý hóa: 7

2.3.3 Độc tính: [4] 9

2.4 Cải bắp: 9

2.5 Vitamin C: [15, 18, 17, 19] 11

2.5.1 Giới thiệu chung về Vitamin C: [15] 11

2.5.2 Tính chất vật lý: [18] 11

2.5.3 Tính chất hoá học: [18] 12

2.5.4 Nguồn gốc: [15] 12

2.5.4 Vai trò của Vitamin C : [17] 12

2.6 Phương pháp phân tích HPLC: [8] 13

2.6.1 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp: 13

2.6.2 Hệ thống thiết bị sắc ký lỏng cao áp: 15

2.7 Các phương pháp phân tích Vitamin C: [10, 11, 12] 18

2.7.1 Phân tích Vitamin C bằng phương pháp HPLC 18

2.7.2 Phân tích Vitamin C bằng phương pháp chuẩn độ: 18

2.7.3 Phương pháp so màu: 19

2.7.4 Phương pháp sử dụng enzim: 20

2.8 Phương pháp phân tích thuốc trừ sâu: [7] 21

Chương 3 : MÔ TẢ THỰC NGHIỆM 22

3.1 Hóa chất và thiết bị sử dụng 22

3.1.1 Hóa chất: 22

3.1.2 Thiết bị: 22

3.2 Khảo sát phổ hấp thu UV-VIS Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C 23

3.3 Thiết lập các thông số cho hệ thống HPLC 23

3.4 Khảo sát thành phần pha động phân tích hai chất Carbaryl và Dimethoate 24

3.5 Xây dựng các đường chuẩn của các chất phân tích 24

3.6 Xác định độ thu hồi mẫu qua cột của mỗi chất ứng với điều kiện chọn phân tích 24 3.7 Khảo sát các bậc trích ly Carbaryl, Dimethoate và xác định hiệu suất thu hồi qua các bậc 25

3.7.1 Lựa chọn quy trình trích ly đối với Carbaryl và Dimethoate 25

3.7.2 Khảo sát hiệu suất trích ly dịch Carbaryl và Dimethoate trong nước qua các bậc trích ly 27

3.7.3 Khảo sát độ thu hồi mẫu của quy trình trích ly Carbaryl và Dimethoate trên mẫu cải bắp 27

3.8 Ứng dụng quy trình phân tích Carbaryl để khảo sát sự phân hủy Carbaryl trong cải bắp sau khi chiếu xạ liều thấp 30

3.9 Khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình trích ly Vitamin C trong cải bắp 30

3.9.1 Quy trình trích ly Vitamin C trong cải bắp 30

3.9.2 Khảo sát hiệu suất trích ly đối với quy trình trích ly Vitamin C trong cải bắp 30 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

4.1 Kết quả khảo sát phổ hấp thu của Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C: 33

4.1.1 Phổ hấp thu UV của Carbaryl trong nước 33

4.1.2 Phổ hấp thu UV của Dimethoate trong nước 33

4.1.3 Phổ hấp thu UV của Vitamin C trong đệm: 34

4.2 Kết quả khảo sát pha động đối với Carbaryl và Dimethoate 34

4.2.1 Kết quả khảo sát pha động của Carbaryl: 34

4.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng thành phần pha động phân tích Dimethoate 35

4.3 Kết quả xây dựng đường chuẩn Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C 36

4.3.1 Đường chuẩn của carabryl trong dung dịch nước: 36

4.3.2 Đường chuẩn Dimethoate trong dung dịch nước: 37

4.3.3 Đường chuẩn dung dịch Vitamin C trong đệm: 38

4.3 Kết quả độ thu hồi mẫu Carbaryl, Dimthoate và Vitamin C: 39

4.3.1 Độ thu hồi mẫu Dimethoate qua cột: 39

4.3.2 Độ thu hồi qua cột của Carbaryl: 39

4.3.3.Độ thu hồi qua cột của Vitamin C: 40

4.4 Kết quả khảo sát hiệu suất trích ly dịch Carbaryl và Dimethoate trong nước qua các bậc trích ly 41

4.5 Kết quả khảo sát độ thu hồi mẫu của quy trình trích ly Carbaryl và Dimethoate trên mẫu cải bắp: 42

4.5.1 Kết quả độ thu hồi Carbaryl của cải bắp 42

4.5.2 Kết quả độ thu hồi Dimethoate của cải bắp: 44

4.6 Kết quả khảo sát sự phân hủy Carbaryl dưới tác dụng của chiếu xạ: 47

4.7 Kết quả khảo sát độ thu hồi của quy trình trích Vitamin C từ cải bắp: 48

4.7.1 Độ thu hồi Vitamin C khi bổ sung thêm chuẩn vào rau: 48

4.7.2 Độ thu hồi Vitamin C khi bổ sung vào dịch rau: 50

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

5.1 Kết luận: 52

5.2 Kiến nghị: 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 55

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Một số tính chất vật lý của Carbaryl 6

Bảng 2.2: Độ tan của Dimethoate trong một số dung môi ở 250C 8

Bảng 2.3: Độ tan trong nước của Dimethoate ở 200C 9

Bảng 2.4: Thành phần các chất dinh dưỡng có trong 100 g cải bắp: [20] 10

Bảng 2.5: Giới hạn dư lượng thuốc trừ sâu trong cải bắp 11

Bảng 2.6: Thành phần Vitamin C trong một số nguyên liệu thực phẩm 12

Bảng 4.1: Diện tích peak và thời gian lưu của Carbaryl ở các pha động 35

Bảng 4.2: Diện tích và thời gian lưu của Dimethoate ở các pha động 35

Bảng 4.3: Độ thu hồi qua cột của Dimethoate: 39

Bảng 4.4: Độ thu hồi qua cột của Carbaryl 40

Bảng 4.5: Độ thu hồi qua cột của Vitamin C 40

Bảng 4.6: Kết quả khảo sát các bậc trích ly Dimethoate 41

Bảng 4.7: Kết quả khảo sát các bậc trích ly Carbaryl 41

Bảng 4.8: Kết quả đo mẫu xác định độ thu hồi của Carbaryl 42

Bảng 4.9: Kết quả đo mẫu xác định độ thu hồi Carbaryl thêm vào dịch 44

Bảng 4.10: Kết quả đo mẫu xác định độ thu hồi của Dimethoate 45

Bảng 4.11: Kết quả đo mẫu Dimethoate bổ sung vào dịch sau lọc 45

Bảng 4.12: Kết quả đo mẫu bổ sung Vitamin C 49

Bảng 4.13: Kết quả đo mẫu bổ sung Vitamin C vào dịch 50

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 2.1: Công thức cấu tạo của Carbaryl 5

Hình 2.2: Công thức cấu tạo của Dimethoate 7

Hình 2.3: Cải bắp 10

Hình 2.4: (a)-Acid Ascorbi, (b)-Acid Dehydroascorbic……… 11

Hình 2.5: Cột sắc ký 16

Hình 2.6: Hệ thống máy sắc ký lỏng cao áp 17

Hình 2.7: Ống dẫn FIA sử dụng để định lượng acid ascorbic bằng phương pháp quang phổ 20 Hình 3.1: Sơ đồ quy trình trích ly Carbaryl và Dimethoate……….26

Hình 3.2: Sơ đồ trích ly 3 bậc……… 28

Hình 3.3: Quy trình trích ly Vitamin C 31

Hình 4.1: Phổ hấp thu UV của dung dịch Carbaryl trong nước 33

Hình 4.2: Phổ hấp thu UV của dung dịch chuẩn Dimethoate trong Axetonitril: nước 33

Hình 4.3: Phổ hấp thu UV của Vitamin C trong dung dịch đệm……… 34

Hình 4.4: Sắc ký đồ đo chuẩn Carbaryl ở nồng độ 10 ppm (a) và 5 ppm (b) 36

Hình 4.5: Đường chuẩn phân tích Carbaryl trong nước 36

Hình 4.6: Sắc ký đồ đo chuẩn Dimethoate ở nồng độ 5 ppm (a) và 1 ppm (b) 37

Hình 4.7: Đường chuẩn phân tích Dimethoate trong dung dịch Axetonitril: nước 37

Hình 4.8: Sắc ký đồ đo chuẩn Vitamin C 1ppm và 2 ppm 38

Hình 4.9: Đường chuẩn Vitamin C trong dung dịch đệm 38

Hình 4.10: Quy trình trích ly cải bắp……… 43

Hình 4.11: Hiệu suất phân hủy trên cải bắp ở các liều chiếu khác nhau 48

Chương 1 : MỞ ĐẦU

Rau xanh là nhu cầu không thể thiếu trong cơ cấu bữa ăn hàng ngày của conngười trên khắp hành tinh Đặc biệt khi lương thực và các thức ăn giàu đạm đã đượcđảm bảo thì yêu cầu về số lượng và chất lượng rau lại càng gia tăng Rau không chỉcung cấp một lượng chất xơ, các sinh tố A, B, C… mà còn cung cấp các nguyên tố vilượng và đa lượng rất cần thiết trong cấu tạo tế bào Có nhiều chủng loại rau như rauăn lá (cải bắp, cải xanh…), rau ăn quả (dưa leo), rau ăn củ… [9]

Hiện nay, do muốn thu lợi nhuận cao nên người nông dân sử dụng rất nhiều cácloại thuốc trừ sâu, thuốc trừ bệnh… gọi chung là thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) lên cácloại rau để tăng năng suất cây trồng Các loại thuốc trừ sâu được sử dụng rộng rãitrong nông nghiệp nhằm bảo vệ mùa màng khỏi sự phá hoại của côn trùng, trị cácbệnh trên thực vật do côn trùng hoặc các vật kí sinh bên ngoài gây ra Tuy nhiên, việcsử dụng quá liều và phun gần ngày thu hoạch khiến cho lượng thuốc tồn dư cao trênsản phẩm sau khi thu hoạch Theo thống kê, hàng năm ở miền Đông – Nam nước ta,tổng lượng thuốc bảo vệ thực vật sử dụng lên đến con số 1000 tấn, trong đó thuốc bảovệ thực vật dùng trên rau rất lớn chiếm từ 50 – 80% tổng lượng thuốc dùng cho cácloại cây trồng Điều đó gây ra những mối nguy cho sức khỏe con người Một số nơingười sử dụng rau bị ngộ độc xảy ra ngày càng nhiều và phổ biến

Vì vậy để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng rau, cần thiết phải có biện phápquản lý, kiểm soát các nguồn rau cung cấp Vấn đề xác định dư lượng thuốc trừ sâucòn tồn đọng trong rau quả có chính xác thì mới có thể kết luận đúng về độ an toàncủa rau đem đi kiểm tra Như vậy phương pháp phân tích dư lượng thuốc trừ sâu trongrau cũng cần nghiên cứu để có thể phân tích được nhanh chóng và chính xác dư lượngthuốc có trong rau Từ đó vấn đề kiểm soát nguồn rau sạch cũng đơn giản và dễ dànghơn

Mỗi phương pháp, qui trình phân tích dư lượng thuốc trừ sâu trong rau đều bao gồm

2 phần chính: Tách dư lượng thuốc trừ sâu cần phân tích, và xác định dư lượng này vớithiết bị phân tích phù hợp Với thiết bị sắc ký lỏng hiện có ở bộ môn Công nghệ thựcphẩm, bước đầu đã có một vài nghiên cứu khả năng ứng dụng để phân tích dư lượng

Carbaryl, Dimethoat [5, 6] trong rau mà không phải tốn kém nhiều về tiền thuê thiết

bị phân tích Tuy nhiên, kết quả đạt được còn hạn chế do độ thu hồi mẫu của giai đoạntrích ly từ rau và giai đoạn phân tích qua cột HPLC còn thấp Mục tiêu của luận vănnày là khảo sát khả năng cải tiến qui trình trích ly Carbaryl, Dimethoat từ rau cải bắpbằng cách nâng số bậc trích ly nhằm đạt độ thu hồi các hoạt chất đó từ rau cao hơn, từđó làm tăng độ chính xác, độ tin cậy của kết quả phân tích dư lượng hai chất này trongrau Bên cạnh đó cải bắp có chứa một lượng Vitamin C đáng kể nên cũng cần cóphương pháp định lượng chính xác hàm lượng Vitamin C trong đó

Chương 2 : TỔNG QUAN

2.1 Thuốc bảo vệ thực vật: [1, 4, 7]

2.1.1 Định nghĩa:

Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) còn gọi là thuốc trừ dịch hại hoặc sản phẩm nôngdược, bao gồm những chế phẩm dùng để phòng trừ các sinh vật gây hại tài nguyênthực vật, các chế phẩm có tác dụng điều hòa sinh trưởng thực vật, các chế phẩm cótác dụng xua đuổi hoặc thu hút các sinh vật gây hại hoặc tài nguyên thực vật đến đểtiêu diệt

- Thuốc trừ ốc sên

- Thuốc điều tiết sinh trưởng cây trồng

2.1.3 Cách tác động của thuốc lên dịch hại:

Cách tác động là đường xâm nhập gây hại của thuốc vào cơ thể dịch hại ThuốcBVTV có cách tác động chủ yếu là:

- Tiếp xúc: thuốc trừ sâu tiếp xúc xâm nhập vào cơ thể sâu qua biểu bì

- Vị độc: Là tác động của thuốc khi xâm nhập vào bộ phận tiêu hóa của động vật(côn trùng, chuột, chim) Chất độc ăn qua đường miệng vào trong ruột, hòa tanvào trong dịch vị ở dạ dày và ruột giữa, thấm qua thành ruột và di chuyển đếncác cơ quan trong cơ thể để gây hại

- Xông hơi: thuốc có thể sinh ra khí, khói, mù có tác dụng diệt côn trùng, nấm, vikhuẩn, chuột Thuốc có tác động xông hơi có thể dùng phun lên cây, xông hơitrong nhà ở, nhà kho, kho tàng, nhà kính, hàng hóa hoặc trong đất để tiêu diệtcác vi sinh vật gây hại Hơi thuốc độc xâm nhập qua lỗ thở hoặc trực tiếp tiêudiệt dịch hại

- Nội hấp (lưu dẫn): là khả năng của thuốc có thể xâm nhập và di chuyển trongcây để để diệt dịch hại bằng cách tiếp xúc hay vị độc.

- Thấm sâu: thuốc có khả năng thấm qua các lớp tế bào biểu bì cây để giết dịchhại nằm dưới lớp biểu bì, mà không có khả năng di chuyển trong cây

2.1.5 Dư lượng thuốc trên cây trồng và nông sản: [7]

Thuốc bảo vệ thực vật tồn tại trên cây trồng và nông sản trên một thời gian là điềucần thiết để bảo vệ cây trồng và nông sản chống lại sự gây hại của dịch hại ở trênruộng, trong quá trình vận chuyển và bảo quản Nhưng dư lượng thuốc có trên nôngsản sẽ là nguồn gây hại cho người tiêu dùng

Dư lượng thuốc có thể gồm những chất tan được trong lipit, nhưng không tan đượctrong nước, thường tồn tại ở lớp biểu bì nên có tên là dư lượng biểu bì Dư lượng gồmnhững chất tan trong nước nhưng không tan trong lipit, tồn tại dưới lớp biểu bì gọi là

dư lượng nội bì Còn dư lượng là những chất không tan cả trong lipit và nước, nằm ởphần ngoài biểu bì mang tên dư lượng ngoại bì Dư lượng thuốc thường có trong tựcphẩm và chúng chỉ gây hại khi vượt ngưỡng cho phép

Dư lượng thuốc BVTV được tính bằng mg thuốc có trong 1 kg nông sản

Dư lượng tối đa cho phép (Maximum Residue Limit, viết tắt MRL): là dư lượngthuốc BVTV tối đa được phép tồn tại trong nông sản mà không gây độc cho người vàvật nuôi khi sử dụng nông sản đó làm thức ăn

2.1.6 Tình hình sử dụng thuốc BVTV: [9, 20]

Vì mục đích bảo vệ cây trồng, thuốc BVTV được sử dụng ngày càng rộng rãi vànhiều Theo một số điều tra gần đây, ở nước ta nông dân sử dụng khoảng 28 loại thuốctrừ sâu, 19 loại thuốc trừ bệnh khác nhau Hầu hết nông dân xem biện pháp hoá học làcách chủ yếu để phòng trừ sâu bệnh trên rau.Có tới 43,8% nông dân sử dụng thuốc cóđộc tính cao đã cấm sử dụng trên rau, 48,42% lại không đảm bảo thời gian cách li antoàn, có khi chỉ sau một hoặc hai ngày phun đã mang ra chợ bán

Kết quả nghiên cứu khảo sát về dư lượng thuốc bảo vệ thực vật và chất bảo quảntrong rau quả năm 2002 – 2003 của TS Hà Thị Anh Đào (Viện Dinh dưỡng quốc gia)và cộng sự [18] cho thấy: Với 240 mẫu rau thu thập tại các khu vực buôn bán rau quảlớn ở Hà Nội và TP Hồ Chí Minh, tỉ lệ rau quả có dư lượng hoá chất là 30,4%, với cácchất Dimethoat, Diazinon, Cypermethin… Trong đó dư lượng Dimethoat, Carbendazin,Cypermethin vuợt quá giới hạn cho phép

2.1.7 Tình hình ngộ độc thuốc BVTV: [20]

Trên thế giới, hàng năm có trên 40000 người chết vì ngộ độc rau tên tổng số 2triệu người bị ngộ độc (dựa theo thống kê của tổ chứa Lao động Quốc tế ILO) Tuychưa có thống kê chính thức về số người ngộ độc do thuốc trừ sâu ở nước ta, nhưngtheo những thông báo từ những năm qua về các trường hợp ngộ độc lẻ tẻ hay hàngloạt ở từng bệnh viện, từng địa phương cho thấy số người ngộ độc là con số đáng kể.Từ năm 2000 đến tháng 6 năm 2003, có nhiều thông báo về người bị nhiễm độc doăn phải rau quả còn dư lượng thuốc trừ sâu, nặng nhất vẫn là các tỉnh đồng bằng sôngCửu Long Năm 2005, có 13000 người nhiễm độc và trong đó có đến 354 người chết.Nguyên nhân ngộ độc chủ yếu là ăn phải thực phẩm có lượng thuốc trừ sâu chưa phânhủy hết hoặc thực phẩm có sử dụng chất độc để bào quản, làm hấp dẫn về hình thứcvà mùi vị …

2.2 Thuốc trừ sâu Carbaryl:

2.2.1 Đặ c tính sinh học Ứng dụng [1]

Carbaryl là thuốc trừ sâu tiếp xúc, vị độc và nội hấp nhẹ, với phổ tác động diệt trừsâu bệnh khá rộng Nó là một trong những thuốc trừ sâu họ Carbamat lâu đời nhất (bắtđầu sử dụng từ năm 1956) nhưng được sử dụng nhiều nhất và thay thế thuốc trừ sâuclo hữu cơ (Hiện nay thuốc trừ sâu nhóm bông cúc sử dụng thay thế dần nhómCarbamate) Thường dùng để trừ các loài sâu, rầy hại lúa, cây công nghiệp, cây ănquả Nó được đánh giá có độ độc trung bình, LD50 (cấp tính đối với chuột đực) 850mg/kg, LD50 (mãn tính) > 2000 mg/kg Tuy nhiên, sản phẩm gia công có thể độc hơnnhiều, ví dụ Tecyl 85 WP có độ độc loại I Độc với ong Không tích lũy trong mỡ

2.2.2 Tính chất lý hóa: [4]

Công thức phân tử: C12H11NO2

Công thức cấu tạo:

Hình 2.1: Công thức cấu tạo của Carbaryl

Khối lượng phân tử: 201,22

Tên hoá học: 1-naphtol-N-metyl carbamate hoặc 1-naphtyl-N-metyl carbamine

Tên thương mại và các tên khác: Sevin, Atoxan, Caprotin, Gamonil, Panam, Sevidol

Carbaryl 99% là tinh thể màu trắng có điểm nóng chảy 142 C, áp lực hơi 0,002mmHg (40oC) Không tan trong nước, tan trong phần lớn các dung môi phân cực nhưAxeton, Cyclohexanon Bản thân bền với ánh sáng và độ ẩm, nhưng bị thủy phântrong môi trường kiềm mạnh thành α - naphtol và metylamin.

Trong cơ thể côn trùng, Carbaryl bị oxy hóa thành 4-hydroxyCarbaryl, sau đó bịthải ra ngoài dưới dạng liên kết với axít glucuronic [4]

Bảng 2.1: Một số tính chất vật lý của Carbaryl

Nhiệt độ nóng chảy 1380C (độ tinh khiết 99.1%)

Hòa tan trong các dung

môi hữu cơ Acetone (200 - 300 g/kg), Methanol (79.6 g/kg),Dicloromethan (242.6 g/kg), Hexan (0.214g/kg)

Độ ổn định - Ổn định trong môi trường trung tính và acid yếu

nhưng dễ dàng bị thủy phân trong môi trường kiềmtạo thành 1-naphthol

- Ổn định với nhiệt độ lên đến 700C và ánh sáng

Khi bị gia nhiệt để phân hủy nó tạo ra khói độcNOx

2.2.3 Độc tính: [4]

Thuộc nhóm độc loại II, liều lượng Carbaryl tiêu diệt 50% số sinh vật tiếp xúc(LD50): LD50 qua miệng 246-283 mg/kg, LD50 qua da > 2000 mg/kg; nồng độ Carbaryltiêu diệt 50% số sinh vật tiếp xúc (LC50): LC50 xông hơi > 6,08 mg/l

Carbaryl dễ dàng được hấp thụ qua đường hô hấp và đường miệng, nhưng ít bị hấpthụ hơn qua tiếp xúc với da Khi tiếp xúc trực tiếp có thể gây bỏng da hoặc mắt Hítvào hay nuốt phải Carbaryl với lượng nhất định có thể gây ngộ độc cho hệ thần kinh,hệ hô hấp, gây ra các triệu chứng nôn mửa, co thắt dạ dày, đau đầu, hôn mê, rối loạnthần kinh, suy hô hấp, … Dấu hiệu nhiễm độc tăng nhanh sau khi hấp thụ và cũng

nhanh chóng kết thúc sau khi không còn tiếp xúc nữa Khi bị hấp thụ vào cơ thể người,nó sẽ nhanh chóng được bài tiết ra theo nước tiểu (bài tiết khoảng 91,5% trong vòng24h) Carbaryl rất có hại cho con người nếu vào miệng (LD50 = 614 mg/kg thể trọng)và hít vào (LC50 = 2,43 mg/l) Carbaryl có độ độc qua da thấp (LD50 > 5000 mg/kg thểtrọng).

2.3 Thuốc trừ sâu Dimethoate:

2.3.1 Đặc tính sinh học Ứng dụng [1]

Dimethoate là thuốc trừ sâu có tác dụng tiếp xúc và lưu dẫn với phổ tác động rộng.Nó còn có tác dụng trừ nhện Độ độc thấp đối với động vật máu nóng, LD50 185- 245mg/kg, không gây cháy lá Do vậy có thể dùng Dimethoate trong nhiều lĩnh vực: rauquả, ngũ cốc, chăn nuôi…

Tại Việt Nam, Dimethoate vẫn được sử dụng nhiều Thường ở dạng hỗn hợp cácthuốc BVTV khác Tuy nhiên, thuốc có mùi hôi nên ảnh hưởng đến môi trường

2.3.2 Tính chất lý hóa:

Dimethoat là thuốc BVTV thuộc nhóm lân hữu cơ, có tên gọi theo danh pháp quốctế là O,O-dimethyl S–methylcarbamoylmethyl – phosphorodithioate, số CAS: 60-51-5.Công thức hoá học: C5H12NO3PS2,

Khối lượng phân tử: 229,2

Công thức cấu tạo:

Hình 2.2: Công thức cấu tạo của Dimethoate

Dimethoate ở dạng rắn, điểm nóng chảy 51-52oC; áp lực hơi 1,1 mPa (25oC) Tantrong nước và các dung môi hữu cơ chủ yếu, khó tan trong hydrocacbon Bị thủy phântrong môi trường kiềm, nhưng tương đối bền trong môi trường trung tính (2< pH < 7)

Bị phân hủy khi đun nóng, đầu tiên tạo dẫn xuất của O,S-dimetyl [4]

Bảng 2.2 Độ tan của Dimethoate trong một số dung môi ở 25 C.

Bảng 2.3 Độ tan trong nước của Dimethoate ở 20 C

2.3.3 Độc tính: [4]

Dimethoate thuộc nhóm độc II Đối với nguời, LD50 qua miệng là 235mg/kg, qua da

>400mg/kg ADI: 0.02mg/kg thể trọng / ngày Nồng độ cao nhất được chấp nhận củaDimethoate trong nước uống là 0,02mg/L

Các nghiên cứu mới đây tại Viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt đã phát hiện bằngchứng biến loạn nhiễm sắc thể trên tế bào limpho người ở một nhóm dân cư sản xuấtnông nghiệp ở Lâm Đồng gây ra bởi thuốc trừ sâu BAI 58 Thành phần chính của BAI

58 là Dimethoate 40EC và 60% chất tạo nhũ

Dimethoate là đối tượng nghiên cứu độc chất môi trường của thế giới từ nhữngnăm 60 Mặc dù, BAI 58 là loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ đang được xem xét lại ởnhiều nước trên thế giới, song ở Việt Nam vẫn đang được cấp phép sử dụng và đangđược sử dụng phổ biến trong nông nghiệp Việt Nam, nhất là những vùng cây côngnhiệp như cà phê, dâu tằm…

2.4 Cải bắp:

Tên khoa học: Brassica oleracea

var capitata.

Họ: Cruciferae.

Hình 2.3:Cải bắp

Đặc điểm bắp cải trắng

Lá ngoài có nhiệm vụ quang hợp nên có màu xanh Lá trong không tiếp xúc trựctiếp với ánh sáng, có màu trắng ngà Chúng có nhiệm vụ dự trữ chất dinh dưỡng và làbộ phận dùng làm thực phẩm Hàm lượng Vitamin ở lá già cao hơn

Thu hoạch và bảo quản:

Cải bắp được trồng từ tháng 9 đến tháng 10, vụ muộn từ tháng 11 đến tháng 12.Thời gian sinh trưởng từ 80 – 90 ngày Khi bắp cải cuộn chặt thì có thể thu hoạch Tadùng dao cắt và để lại vài lá già bên ngoài Nhiệt độ thích hợp để bảo quản cải bắp là

0 – 10C

Sử dụng cải bắp

Cải bắp là loại rau nhiều chất dinh dưỡng, có thể chế biến được nhiều món ăn như:ăn sống, luộc, xào với thịt, muối chua…

Theo Đông y, cải bắp vị ngọt, tính bình, có công dụng bổ cốt tuỷ, khoẻ gân cốt Nócó tác dụng cắt cơn đau và thúc cho mau lành đối với chứng loét dạ dày

Bảng 2.4: Thành phần các chất dinh dưỡng có trong 100 g cải bắp: [20]

Nước ép từ cải bắp là loại "máy lọc" tuyệt vời và giúp giảm cân vì chứa ít calo.Chất sulfur và chlorine trong cải bắp giúp tẩy sạch màng nhầy bám ở bao tử và ruột.Ngoài ra, nước cải bắp cũng chứa đủ lượng iốt cần thiết cho cơ thể người, đồng thời rấttốt cho việc chữa viêm dạ dày, ung loét dạ dày, viêm miệng và viêm lợi Một sốnghiên cứu cho thấy chất isothiocyanates chứa nhiều trong các loại rau nhà họ cải cótác dụng tiêu diệt các khối u gây ung thư phổi

Bảng 2.5: Giới hạn dư lượng thuốc trừ sâu trong cải bắp

Thuốc trừ sâu Giới hạn dư lượng

MRL(ppm)

2.5 Vitamin C: [15, 18, 17, 19]

2.5.1 Giới thiệu chung về Vitamin C: [15]

Vitamin C là tên gọi thông dụng của acid ascorbic Các tên gọi hoá học là Ascorbic acid, L-xyloascorbic acid, 3-oxo-L-gulofuranolactone (dạng enol), L-3-ketothreohexuronic acid lactone Với công thức phân tử C6H8O6 Vitamin C có khốilượng phân tử 176,1 Hình 2.4 cho thấy công thức cấu tạo và mô hình cấu trúc phân tửVitamin C

L-2.5.2 Tính chất vật lý: [18]

Acid ascorbic tinh khiết tồn tại ở dạng tinh thể, không màu hoặc có màu trắng.Acid ascorbic thường không có mùi, có vị chua acid, tan vô hạn trong nước, ít tan trongethanol, không tan trong ether và chloroform Nhiệt độ nóng chảy 190oC

Acid ascorbic bị hoá đen khi để trực tiếp ngoài ánh sáng mặt trời, tuy nhiên sựbiến màu nhẹ có thể không làm mất hoạt tính chữa bệnh của acid ascorbic Thậm chíkhi không có mặt ánh sáng thì acid ascorbic vẫn dễ dàng bị biến tính khi tiếp xúc vớiđộ ẩm trong không khí và sự phân huỷ này càng nhanh khi nhiệt độ môi trường càngcao

Hình 2.4: (a)-Acid Ascorbic; (b)-Acid Dehydroascorbic

2.5.3 Tính chất hoá học: [18]

Acid ascorbic có các giá trị pKa là 4,2 và 11,6 Trong dung môi nước, dung dịchacid ascorbic 5% có pH = 2,2 – 2,5

Trong dung dịch, acid ascorbic nhanh chóng bị oxi hoá khi có mặt không khí và

pH vùng kiềm Acid ascorbic bền trong môi trường trung tính, acid, không bền trongmôi trường có các ion kim loại như Cu2+, Fe2+, Enzym ascorbatoxydase…

2.5.4 Nguồn gốc: [15]

Acid ascorbic có cả nguồn gốc tự nhiên và nhân tạo Trong tự nhiên, acidascorbic được tìm thấy trong các loại rau quả tươi Nguồn thức ăn chứa Vitamin C rấttốt là những trái cây thuộc họ citrus hay nước ép từ trái họ citrus, quả mọng, hồ tiêuxanh hay đỏ, cà chua, bông cải, rau cải bó xôi

Bảng 2.6: Thành phần Vitamin C trong một số nguyên liệu thực phẩm

2.5.4 Vai trò của Vitamin C : [17]

Vitamin C được Albert Szent-Gyorgyi phân lập năm 1928 Gần 70 năm sau, cácnhà nghiên cứu đã khám phá ra nhiều lợi ích của Vitamin C trên sức khoẻ Đây là loại

Vitamin mà cơ thể cần nhiều nhất Đối với người bình thường cần khoảng 80 ÷100mgVitamin C trong 24 giờ Tuỳ thuộc vào hệ di truyền và các yếu tố trong lối sống, mộtsố người đòi hỏi lượng Vitamin C nhiều hơn lượng trung bình của một người bìnhthường nhằm ngăn chặn sự gián đoạn của các phản ứng sinh hoá quan trọng Chẳnghạn như người lớn tuổi, uống rượu, người bị bệnh tiểu đường, người hút thuốc láthường bị thiếu Vitamin C.

Không như hầu hết các loại động vật khác, cơ thể người không thể tự sản xuấtVitamin C Một bệnh do thiếu hụt Vitamin C phổ biến nhất là bệnh scorbus (scurvy)

2.6 Phương pháp phân tích HPLC: [8]

2.6.1 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp:

Sắc ký lỏng cao áp (High pressure liquid chromatography_HPLC) hay sắc ký lỏnghiệu năng cao là một phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiện đại, được sử dụng rộngrãi trong kỹ thuật phân tích để phân tích các chất có hàm lượng nhỏ như: Vitamin, acidamin, độc tố của vi sinh vật, dư lượng thuốc trừ sâu trong thực phẩm

 Nguyên tắc:

Sắc kí lỏng là kỹ thuật phân tích sắc ký dùng để tách các ion hoặc các phân tử hòatan trong dung dịch Khi dung dịch mẫu tiếp xúc với một pha rắn hay một pha lỏng thứhai, các chất hòa tan khác nhau trong dung dịch mẫu sẽ tương tác với các pha đó vớimột mức độ khác nhau dựa trên sự khác nhau về khả năng hấp phụ, khả năng trao đổiion, khả năng phân bố hay dựa trên sự khác nhau về cấu trúc phân tử của các chất(sắc kí lọc gel) Sự khác nhau này sẽ tách các cấu tử ra khỏi hỗn hợp Cấu tử nào có áilực với pha động mạnh sẽ đi ra trước, cấu tử nào có ái lực với pha động yếu hơn sẽ đi

ra sau Các cấu tử được xác định thông qua thời gian lưu của cấu tử trong cột sắc kí.Để định danh các cấu tử đóù, chúng ta phải được hỗ trợ bởi một phương pháp khác, vídụ như sử dụng đầu dò hồng ngoại IR, đầu dò tử ngoại UV…

 Đặc điểm:

- Sử dụng cột sắc ký: kích thước của cột sắc ký nhằm mục đích phân tích thường bé(Chiều dài: 10-25cm, đường kính: 2-4mm)

- Pha động là chất lỏng

- Pha tĩnh đa dạng tùy vào kiểu cột sắc ký như sắc ký hấp phụ, phân bố, lọc gel, traođổi ion Do đó khả năng ứng dụng của phương pháp này rất lớn và đa dạng

- Hạt vật liệu nhồi có kích thước rất bé, khoảng 1 – 4 µm Do đó, tốc độ chảy của phađộng sẽ rất chậm Vì vậy phải sử dụng áp suất cao (100 – 400 bar), tốc độ dòng khi đó

đạt khoảng 0,1 đến 10 ml/phút Thời gian phân tích mẫu thường dao động trongkhoảng tới 30 phút.

 Phân loại: Có thể chia phương pháp HPLC ra làm 2 loại:

 Sắc ký pha thuận (Normal-phase HPLC): là phương pháp sắc ký có phađộng là dung môi không phân cực như hexane, còn pha tĩnh là các hạt chất mang bằngsilicagel trên đó có gắn các gốc phân cực như _CN hoặc _NH2

 Sắc ký pha đảo (Reversed-phase HPLC): là phương pháp sắc ký có phađộng là dung môi phân cực như nước hoặc nước cùng với các dung môi phân cực khácnhư methanol hay Axetonitril, còn pha tĩnh là các hạt chất mang bằng silicagel trên đócó gắn các gốc không phân cực như octadecyl- hay octylsilane

Thường sử dụng sắc ký pha đảo cho sắc ký lỏng cao áp:

 pha động phân cực

 pha tĩnh kém phân cực

Nguyên nhân là do pha động phân cực cho phép sử dụng nhiều loại pha động đadạng, ngoài ra có thể bổ sung thêm các thành phần khác nhau vào pha động để tạo racác độ phân cực khác nhau Thành phần chính của pha động là nước, là một dung môirẻ, ít gây ô nhiễm môi trường và không độc hại

 Phạm vi ứng dụng của phương pháp:

Phân tích các thành phần hoá học trong thực phẩm như các thành phần dinhdưỡng, phụ gia, độc tố, theo dõi sự biến đổi của thực phẩm trong quá trình bảo quảnvà chế biến

Cụ thể:

 Vitamin

 Acid amin

 Thuốc, kháng sinh, dược liệu

 Độc tố (aflatoxin)

 Thuốc trừ sâu

 Thuốc trừ cỏ

 Phụ gia công nghiệp và thực phẩm

 Acid hữu cơ

 Các loại đường

 Chất kích thích

2.6.2 Hệ thống thiết bị sắc ký lỏng cao áp:

 Nguyên tắc hoạt động:

Pha động sau khi được bài khí được bơm đưa vào hệ thống sắc ký Hệ thống tựđộng bơm mẫu vào cột (hoặc chúng ta tự bơm mẫu vào) Pha động khi đi ngang qua sẽcuốn mẫu cần phân tích đi theo Khi vào trong cột sắc ký, chất nào có ái lực mạnh vớipha động sẽ theo pha động đi ra trước, chất nào có ái lực yếu hơn sẽ đi ra sau Đầu dòphát hiện các cấu tử đi ra khỏi cột, chuyển tín hiệu cho máy ghi kết quả

 Cấu tạo:

 Bơm :

 Là bộ phận có tính quan trọng hàng đầu trong hệ thống HPLC Bơm áp lực caođược sử dụng để đẩy dung môi đi xuyên qua pha tĩnh Kích thước vật liệu chất nhồicột càng nhỏ thì áp suất phải càng cao

 Yêu cầu: tạo được dòng pha liên tục, ổn định và không có xung

 Bơm thường sử dụng là bơm pittong

 Các loại bơm hiện đại co những thông số sau:

 Vận tốc dòng: 0,1 – 10 ml/phút

 Độ ổn định của dòng lưu lượng: Dao động không lớn hơn 1%

 Aùp lực lớn nhất: lên đến 5000psi

(Hệ thống HPLC trong phòng thí nghiệm Hóa sinh của khoa sử dụng bơm 10AS)

LC- Bộ phận nhập mẫu:

Cho phép lấy chính xác lượng mẫu đưa vào cột sắc ký một một cách tự động vàđược chương trình hóa:

 Thể tích mẫu bơm vào

 Thời gian thay đổi mẫu

 Thời gian rửa bộ phận nhập mẫu

 Nhiệt độ bơm mẫu

 Aùp suất bơm mẫu (Chú ý áp suất bơm mẫu phải nhỏ hơn 70bar thì mẫumới tập trung được vào cột, khả năng phân tích mẫu mới tốt).

Ngoài ra, ta có thể bơm mẫu thủ công bằng cách dùng xilanh bơm mẫu vào cột

 Cột sắc ký :

Hình 2.5: Cột sắc ký

Là bộ phận chính của hệ thống thiết bị HPLC, đó chính là nơi diễn ra sự phântách các cấu tử trong hỗn hợp nhờ khả năng hấp phụï hay phân bố của các cấu tử giữapha động và pha tĩnh Phổ biến nhất là cột ODS (Octadodecyl siloxane)

Rất ngắn, khoảng 10 – 25 cm, đường kính trong 2 – 4 mm

Vật liệu nhồi cột:

 Đối với sắc ký hấp phụ: chất mang rắn thường là silicagel hay oxytnhôm

 Đối với sắc ký phân bố: chất mang rắn là dẫn xuất của silicagel (các hạtsilicagel được gắn với các nhóm chức khác nhau tạo ra các hạt có chức năngphù hợp với mẫu cần phân tích) Ví dụ như: Siloxanes (C18, C8…)

Yêu cầu đối với chất mang:

 Có tính chọn lọc cần thiết đối với thành phần mẫu nghiên cứu

 Bền nhiệt

 Bền cơ học

 Bền và trơ về mặt hóa học với các cấu tử khác trong mẫu phân tích

 Đầu dò:

 Ngày nay các đầu dò quang học được sử dụng phổ biến trong các hệ thống sắc kýlỏng Những đầu dò này đưa một tia sáng xuyên qua dòng chảy ra khỏi cột Sự thayđổi về cường độ ánh sáng do sự hấp thu tia UV, sự phát xạ huỳnh quang từ các thànhphần… sẽ được ghi nhận lại ở dạng thay đổi của điện thế đầu ra Những điện thế nàyđược biểu diễn trên một đồ thị và đưa vào máy tính để hiển thị thời gian lưu và peak

 Đầu dò trong HPLC rất đa dạng:

 Đầu dò UV

 Đầu dò UV – VIS

 Đầu dò huỳnh quang.

 Đầu dò dẫn nhiệt

 Đầu dò khúc xạ kế vi sai (RI)

Hệ thống HPLC trong phòng thí nghiệm Hoá sinh của khoa sử dụng đầu dòquang phổ UV-VIS loại SPD - 6VA

Các đặc trưng quan trọng của một đầu dò là:

 Độ nhạy

 Giới hạn dò tìm

 Quán tính và phạm vi phụ thuộc tuyến tính giữa cường độ tín hiệu vớinồng độ

 Máy ghi :

Có thể vẽ sắc ký đồ, ghi lại thời gian lưu, tính diện tích peak, ghi lại phương phápxác định, đồng thời có thể sử dụng máy ghi để điều khiển, chương trình hóa quá trìnhchạy sắc ký

Hệ thống HPLC trong phòng thí nghiệm Hóa sinh của khoa sử dụng máy ghiChromatopac CR 6A

 Sơ đồ hệ thống:

Hình 2.6: Hệ thống máy sắc ký lỏng cao áp

Cột sắc ký Đầu dò

Máy ghi

Bơm

Pha động Valve phun

Máy trộn

2.7 Các phương pháp phân tích Vitamin C: [10, 11, 12]

Vitamin C có thể được phân tích bằng nhiều phương pháp, tùy thuộc vào đặc điểmcủa mẫu cần phân tích, thời gian phân tích và thiết bị có thể tiếp cận được Cácphương pháp thường được sử dụng để phân tích Vitamin C là:

- Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

- Phương pháp chuẩn độ

- Phương pháp so màu

- Phương pháp sử dụng enzim

2.7.1 Phân tích Vitamin C bằng phương pháp HPLC

Phương pháp này được giới thiệu trong nhiều tài liệu tham khảo và đã trở thànhmột bài thí nghiệm trong PTN Hóa sinh, B/m CN thực phẩm Cột sắc ký sử dụng là cộtpha đảo ODS C18 Pha động sử dụng là dung dịch đệm phosphate pH = 2,8 trộn vớimethanol theo tỷ lệ thể tích 90/10, lưu lượng pha động qua cột 1 mL/phút Sử dụng đầudò UV đo độ hấp thụ ở bước sóng 245 nm Pha động được đánh siêu âm để đuổi khíhòa tan trước khi sử dụng, và được lọc liên tục trong quá trình chạy sắc ký bằng mànglọc 450 nm Xây dựng đường chuẩn với các mẫu acid ascorbic tinh khiết với năm nồngđộ khác nhau Mẫu rau quả được nghiền trong dung dịch đệm phosphate pH = 2,8 đểtrích Vit.C ra, pha loãng theo tỷ lệ thích hợp rồi phân tích như với các mẫu chuẩn.Hàm lượng Vitamin C trong mẫu được xác định bằng cách nội / ngoại suy tín hiệu củamẫu từ đường chuẩn [10]

2.7.2 Phân tích Vitamin C bằng phương pháp chuẩn độ:

 Chuẩn độ với 2,6- dichloroindophenol (DCP)

Đây là một phương pháp hữu dụng để định lượng Vitamin C trong rau quả Cơ sởcủa phương pháp này là phản ứng oxi hóa acid ascorbic trong dung dịch bởi DCPthành dạng dehydroascorbic acid Sản phẩm của phản ứng oxy hóa khử này đều khôngmàu

Phương trình phản ứng:

(pH=3)C6H8O6 (không màu) + C12H7O2NCl2(đỏ) C6H6O6 (không màu) + C12H9O2NCl2 (không màu)Sự chuẩn độ này đặc biệt thuận lợi bởi vì DCP cũng đóng vai trò như chất chỉ thịmàu Khi nhỏ dung dịch DCP vào một dung dịch có chứa Vitamin C, thì hỗn hợp phảnứng không màu cho đến khi tất cả lượng Vitamin C có trong hỗn hợp chuyển hết thành

dạng dehydroascorbic acid Giọt dung dịch DCP tiếp theo thêm vào nếu xuất hiệnmàu đỏ chứng tỏ đó là giọt DCP còn dư và phản ứng đã kết thúc Do đó, điểm tươngđương được xác định (chỉ thị) khi dung dịch chuẩn độ từ không màu chuyển sang màuđỏ của DCP.

Yếu điểm của phương pháp này là dung dịch DCP rất kém bền nên chúng ta chỉpha dung dịch ngay trước khi sử dụng chúng

Trước khi tiến hành chuẩn độ, cần xử lý mẫu thực phẩm với metaphosphoricacid Bước xử lý với acid này nhằm làm biến tính và kết tủa protein trong mẫu đểtránh ảnh hưởng đến kết quả phân tích, đồng thời cũng nhằm giúp ổn định acidascorbic tránh bị phân huỷ Acid hoá đến pH nhỏ hơn 4 cũng nhằm làm giảm phản ứngcủa DCP với các hợp chất khác

 Chuẩn độ bằng iode

Đây là qui trình chuẩn độ ngược, lượng ion 

3

I dư trong dung dịch sau khi đãphản ứng với Vitamin C được xác định bằng cách cho phản ứng với dung dịchthiosulfate Cơ sở của phương pháp chuẩn độ Vitamin C bằng Iod là phản ứng oxi hoáVitamin C thành dehydroascorbic acid, C6H6O6 theo phương trình sau :

3 2

3 2 S O 3I S O I

Có một khó khăn là phải pha chế dung dịch 

3

I từ dung dịch KIO3 và muối rắn KItrong điều kiện acid như phương trình sau:

) ( 3 ) ( 3 ) ( 9 ) ( 8 ) ( )

đã phản ứng với acid ascorbic

2.7.3 Phương pháp so màu:

 Cơ sở của phương pháp là phản ứng khử Fe(III) thành Fe(II) bởi acid ascorbic.Sản phẩm Fe(II) có thể được đo dễ dàng sau khi kết hợp với tác nhân màu như 1,10-phenanthroline hoặc neocuproline Ở đây, mono (1,10-phenanthroline)-Fe(III) bị khử

trực tiếp thành tri(1,10-phenanthroline)-Fe(II) bởi acid ascorbic, sản phẩm tạo thànhhấp thu ánh sáng ở bước sóng 510 nm.

Phương pháp này rất nhạy, nhanh, và đã được nghiên cứu tự động hóa bởi kỹthuật tiêm dòng (FIA), cho hiệu suất phân tích 200 mẫu/giờ Đường chuẩn của acidascorbic trên dãy 0 - 50ppm trong điều kiện lý tưởng được ghi nhận RSD = 0,5%(n=15)

Mono(1,10-phenanthroline)-Fe(III) cũng có thể được sử dụng để định lượngadrenaline

Hình 2.7: Ống dẫn FIA sử dụng để định lượng acid ascorbic bằng phương pháp

quang phổ.

 Cơ sở của phương pháp là phản ứng khử muối tetrazolium MTT dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] thành một Formazan bởi acidL-ascorbic (L-ascorbate) khi có mặt của chất mang điện tử PMS (5-methylphenazinium methosulfate) tại pH = 3,5 MTT-Formazan được xác định thôngqua đo độ hấp thụ ánh sáng thấy được tại bước sóng 578 nm

[3-(4,5-Trong thí nghiệm với mẫu thử tổng lượng chất khử sẽ được tính toán theo:

Để định lượng L-ascorbate, sử dụng đồng thời một mẫu trắng Mẫu trắng nàyđược cho phản ứng với enzym ascorbate oxidase (AAO) với sự có mặt của O2 để loại

đi sự có mặt của L-Ascorbte (2.5) Dạng dehydroascorbate không phản ứng vớiMTT/PMS

O H orbate Dehydroasc O

Ascorbate

Sự khác nhau về độ hấp thu giữa mẫu thử và mẫu trắng sẽ chính là lượng Ascorbate có trong mẫu

L-2.7.4 Phương pháp sử dụng enzim:

Phương pháp enzyme sử dụng ascorbate oxidase để xúc tác phản ứng oxi hoáacid L-ascorbic bằng O2trong môi trường acid theo phản ứng sau:

2 L-ascorbate + O2 + 2H+  Ascrobate oxydase   2 dehydro-L-ascorbate + 2H2O

Nồng độ của acid ascorbic được xác định gián tiếp thông qua mức độ tiêu thụ O2,xác định bởi điện cực oxy Đường chuẩn của phương pháp có dạng đường thẳng trongkhoảng nồng độ 1,2.10-4 đến 1,0.10-3 mol/L acid ascorbic.

2.8 Phương pháp phân tích thuốc trừ sâu: [7]

Phân tích dư lượng thuốc BVTV là một lĩnh vực đặc biệt Dư lượng có trong nôngsản, đất đai và môi truờng có hàm lượng rất thấp (ppm hay ppb) thường được phân tíchbằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký khí hiện đại với các detector cộngkết điện tử Quá trình chuẩn bị mẫu tách chiết phải làm rất cẩn thận và chính xác đểtránh sai số, phải lựa chọn dung môi thích hợp với đặc tính lý hóa từng loại thuốcBVTV để có thể tách chiết được dư lượng tối đa và tách được dư lượng này khỏi hợpchất khác trong cây như glucosit, clorophyl…

 Phân tích dư lượng Carbaryl:

Hiện nay có nhiều tài liệu tham khảo mô tả phương pháp để phân tích Carbary: sắcký khí, sắc ký lỏng, quang phổ so màu Tuy nhiên, các hợp chất thuộc họ Carbamatelà những chất không ổn định khi gia nhiệt, dễ bị phân hủy khi nhiệt độ cao nên đa sốsử dụng sắc ký lỏng HPLC để phân tích Carbaryl [11]

 Phân tích dư lượng Dimethoate:

Các phương pháp phân tích hàm lượng Dimethoate sau được tìm thấy trong tài liệutham khảo:

- Phướng pháp sắc kí khí

- Phương pháp sắc kí lỏng cao áp

- Phương pháp sắc kí bản mỏng

- Phương pháp dùng bộ KIT enzym

Chương 3 : MÔ TẢ THỰC NGHIỆM

3.1 Hóa chất và thiết bị sử dụng

3.1.1 Hóa chất:

- Carbaryl_ Đô tinh khiết > 98%

- Dimethoate_ Độ tinh khiết > 98%

- Nước cất 2 lần

Dung dịch chuẩn gốc Carbaryl, Dimethoate: Cân chính xác lượng 0,1000 g mỗichất, hòa tan trong Axetonitril và định mức lên 100 ml bằng Axetonitril thu được dungdịch chuẩn gốc nồng độ 1000 ppm, bảo quản trong tủ lạnh để sử dụng cho các thínghiệm

Dung dịch chuẩn gốc Vitamin C 1000 ppm mỗi lần thí nghiệm sẽ được pha mới.Cân 0,1000 g Acid ascorbic định mức lên 100 ml bằng dung dịch đệm KH2PO4 pH=2,8

3.1.2 Thiết bị:

- Máy sắc ký lỏng_ hãng Shimazdu SPD – 6AV_ Đầu dò UV – VIS

- Bể đánh siêu âm_ Decon

- Máy cô đặc chân không_ Heidolph WB 2000

- Máy đo quang phổ vùng UV – VIS

- Máy xay sinh tố Gali

- Máy khuấy từ

- Hệ thống lọc chân không

- Phiễu chiết 250 ml

- Màng lọc 0,45 µm, giấy lọc 0,6 µm

- Bình định mức 10, 25, 50, 100 ml

- Ống đong 100, 500 ml

3.2 Khảo sát phổ hấp thu UV-VIS Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C.

Chuẩn bị các dung dịch Carbaryl, Dimethoate trong nước và dung dịch Vitamin Ctrong đệm pH = 2,8 với nồng độ khoảng 3ppm Sử dụng cuvet thạch anh để đo Tiếnhành quét phổ bằng máy quét phổ tự động có bước sóng từ 200 nm đến 350 nm Ghinhận số liệu đo được và vẽ các đồ thị biểu diễn phổ hấp thu vùng UV của 3 chất trên Dựa vào đồ thị phổ thu được chọn bước sóng hấp thu cực đại cho mỗi chất Sau đóđặt bước sóng cho máy HPLC tương ứng khi phân tích từng chất trên

3.3 Thiết lập các thông số cho hệ thống HPLC

Luận văn này sử dụng hệ thống máy sắc ký lỏng của hãng Shimazdu: đầu dò VIS SPD – 6AV, bơm LC – 10AS, máy ghi sắc ký đồ C – R6A.Cột phân tích Geminipha đảo C18: 250 x 4,6 mm x 5 µm x 110 Ao

UV-Các thông số chính của hệ thống:

- Đặt giá trị áp suất cực đại (P.MAX): 300 kgf/cm2 Mục đích là để bảo vệ cột và cáchệ thống khác, khi áp suất vượt P.MAX bơm sẽ tự động tắt

- Đặt giới hạn dưới của áp suất (P.MIN): thường là 0 Mục đích là không cho khôngkhí vào hệ thống khi có sự cố hở trên hệ thống và an toàn khi đo

- Aùp suất đạt được khi hệ thống ổn định: 98 – 110kgf/cm2

- Tốc độ dòng pha động 1ml/phút

- Thể tích bơm mẫu 20 µl

- Atten: có giá trị từ 0 đến 10, giá trị càng nhỏ thì khoảng biểu diễn trên sắc ký đồcàng nhỏ, dùng atten nhỏ khi đo nồng độ thấp mà không ảnh hưởng tới diện tích peak

đo được, thường sử dụng atten =10

- Speed (tốc độ giấy): thường dùng là 5, muốn peak sắc nhọn thì giảm Speed

- Bước sóng của đầu dò: - Đối với Carbaryl: 220 nm

- Đối với Dimethoate: 204 nm

- Đối với Vitamin C: 245 nm

3.4 Khảo sát thành phần pha động phân tích hai chất Carbaryl và Dimethoate.

Từ dung dịch chuẩn gốc Carbaryl và Dimethoate 1000 ppm pha sẵn, tiến hành phaloãng bằng nước được dung dịch có nồng độ10 ppm của Carbaryl và Dimethoate trongnước

Chuẩn bị pha động khảo sát: ở đây chúng ta tiến hành khảo sát khả năng táchCarbaryl và Dimethoate của các pha động có thành phần Axetonitril và nước theonhững tỉ lệ 85/15, 70/30, 55/45, 40/60

Tiến hành pha các pha động với tỉ lệ về thể tích Axetonitril: nước = 85/15, 70/30,55/45, 40/60 Ứng với mỗi pha động này ta thực hiện phân tích cho cả Carbaryl vàDimethoate ở nồng độ 10 ppm đã pha ở trên Mỗi pha động khi phân tích với từng chấtsẽ cho số liệu về thời gian lưu và diện tích peak tương ứng

3.5 Xây dựng các đường chuẩn của các chất phân tích

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C với các nồng độ 1,

2, 5, 10, 20 ppm bằng cách pha loãng ra từ dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm

Pha động chọn để xây dựng đường chuẩn dựa vào kết quả của thí nghiệm mục 3.4.Đối với Carbaryl và Dimethoate chọn pha động là Axetonitril: nước theo tỉ lệ thể tích55: 45 Còn đối với pha động phân tích Vitamin C sử dụng là methanol: hệ đệmKH2PO4 có pH = 2,8 theo thể tích 10 : 90

Hệ đệm được pha bằng cách hoà tan 6,5g KH2PO4 trong 1l nước cất 2 lần, chỉnh pHvề 2,8 bằng H3PO4 rồi lọc bằng màng 0,45µm

Tiến hành đo các dung dịch Carbaryl và Dimethoate trên máy sắc ký với các thôngsố như mục 3.3 trên Mỗi mẫu chuẩn phân tích 3 lần, lấy giá trị trung bình của diệntích peak Thiết lập đường chuẩn phụ thuộc của diện tích peak thu được vào nồng độchất phân tích trong dung dịch mẫu chuẩn

3.6 Xác định độ thu hồi mẫu qua cột của mỗi chất ứng với điều kiện chọn phân tích.

Để xác định độ thu hồi mẫu cùa các chất qua cột phân tích ta tiến hành phân tích ớcác nồng độ từ 1 đến 20 ppm

Ở chế độ có đi qua cột: mỗi nồng độ phân tích 3 lần theo chế độ ứng với chất đãnêu ở trên, tính diện tích peak trung bình (Xc)

Ở chế độ không cho qua cột: cứ khoảng 1 phút ta tiêm mẫu vào cột một lần vớithể tích 20 µl, sau 5 -6 phút thì dừng (các lần bơm từ lần 2 trở đi không nhấn phímSTART) Tính giá trị trung bình của diện tích peak ở mỗi nồng độ (X0)

Giá trị hiệu suất thu hồi qua cột Hc(%) được tính theo công thức:

3.7.1 Lựa chọn quy trình trích ly đối với Carbaryl và Dimethoate.

Tài liệu tham khảo từ AOAC và các luận văn tốt nghiệp đại học năm trước chothấy, quy trình phân tích dựa trên các bước cơ bản: trích ly, làm sạch, phân tích trênthiết bị Trong quy trình trích ly các chất Carbaryl và Dimethoate thì quan trọng nhấtphải chọn được dung môi trích ly tốt nhất Ở đây chúng tôi chọn dung môi trích ly làAxeton Các bước tiến hành của qúa trình trích ly Carbaryl và Dimethoate được thựchiện như sau:

- Bước 1: Cân 100g mẫu rau cho vào máy xay Magic bullet, thêm 200 ml Aceton

vào, nghiền trong thời gian 1 phút

- Bước 2: Chuyển hỗn hợp sau khi nghiền vào trong bercher 500 ml, tráng sạch

máy xay bằng Axeton, sau đó đem đi khuấy từ trong thời gian 15 phút

- Bước 3: Tiến hành lọc chân không qua giấy lọc trên phễu lọc Buchner, thu dịch

lọc vào Bercher 500 ml Bã giữ lại ở trên phễu Cân khoảng 20g muối NaCl (tùyvào lượng nước có trong mẫu) cho vào dịch trích, khuấy cá từ để hòa tan hoàntoàn muối

- Bước 4: Chuyển dịch đã bổ sung muối vào trong phiễu chiết, tách pha hữu cơ ra

khỏi pha nước

- Bước 5: Lấy pha hữu cơ phía trên đem đi cô quay chân không cho đến khi cạn và

dịch không còn thay đổi thể tích nữa thì dừng

- Bước 6: Chuyển phần dịch sau cô quay vào bình định mức 100 ml, tráng bình cô

quay bằng 25 ml Axetonitril vào bình định mức tiếp tục định mức đến vạch

- Bước 7: Dịch sau khi định mức đem đi lọc với màng lọc 0,45 µm sau đó đánh

siêu âm loại bọt khí và tiến hành phân tích trên máy HPLC

Sau đây là sơ đồ khối của quy trình trên: (xem hình 3.1, trang 26)

Hình 3.1: Sơ đồ quy trình trích ly

Carbaryl và Dimethoate.

Cô quay chân không