Luận văn nghiên cứ tính sạch pectinase từ canh trường nuôi cây bẻ sau Asperrgillus awamori - chương 4

Luận văn nghiên cứ tính sạch pectinase từ canh trường nuôi cây bẻ sau Asperrgillus awamori - chương 4.

Trang 1

CHƯƠNG 4

KẾT QUẢ VÀ BÀN

LUẬN

4.1 KHẢO SÁT TINH SẠCH PECTINASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA

4.1.1 Kết tủa pectinase bởi các loại dung môi hữu cơ

Trong thí nghiệm này, chúng tôi thực hiện quá trình kết tủa pectinase từ dịch enzymethô sau 24 giờ nuôi cấy trong canh trường bề sâu (xem hình 4.1) Tại thời điểm này, hoạttính endo-PGase thu được là cao nhất và đạt giá trị 1.2240.003U/mL Nồng độ protein

của dịch enzyme tương ứng là 0.4890.0006mg/mL Sau quá trình ly tâm và lọc để tách tạp chất thô và hệ sợi mốc, dịch enzyme thô sẽ được kết tủa lần lượt với các tác nhân

ethanol, isopropanol và acetone

0.00.20.40.60.81.01.21.4

Trang 2

Hình 4.1 Hoạt tính endo-polygalaturonase từ canh trường nuôi cấy Asp Awamori theo thời

gian

4.1.1.1 Kết tủa endo-PGase bởi ethanol

Kết quả thí nghiệm: Tiến hành kết tủa enzyme thô bằng ethanol theo trình tự đã trình

bày trong phần 3.2.2.1 Kết quả được trình bày trong bảng 4.1 và hình 4.2:

Bảng 4.1 Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng ethanol

Tỷ lệ

V enzyme / V dung môi

Nồng độ protein*

(mg/mL)

Hoạt tính endo-Pgase*

(U/mL)

Hoạt tính riêng (U/mg protein)

Hiệu suất thu hồi (%)

Độ tinh sạch (lần)

Chú thích: Các giá trị có cùng ký tự (được ký hiệu phía trên) thì sự khác nhau giữa chúng là không

có ý nghĩa (α = 0,05)

(*) Nồng độ protein và hoạt tính enzyme trong dung dịch sau khi tái hòa tan kết tủa

Trang 3

Nhận xét: Từ kết quả thu được, chúng tôi có những nhận xét như sau:

– Nhìn chung, khi tăng thể tích ethanol sử dụng (tỷ lệ thể tích Venzyme:Vdung môi thay đổitừ 60:40 đến 20:80) thì hàm lượng protein kết tủa cũng tăng dần (từ 0.004mg/mLđến 0.078mg/mL) và hiệu suất thu hồi enzyme cũng tăng dần (từ 2.9% đến92.2%) Điều này cho thấy rằng, khi nồng độ dung môi càng cao thì khả năng gâybiến tính protein càng rõ rệt Nhờø đó, lượng protein bị kết tủa càng nhiều và tổngsố đơn vị hoạt độ thu hồi được cũng tăng lên Tuy nhiên, nếu tăng tỷ lệ thể tíchethanol sử dụng lên quá cao (tỷ lệ Venzyme:Vdung môi là 10:90) thì lượng protein kết tủa

có tăng theo (0.078mg/mL) nhưng hiệu suất thu hồi endo-PGase lại giảm xuống

(92.21%) Kết quả này khẳng định là hàm lượng cồn cao làm cho protein kết tủatriệt để hơn nhưng có thể làm vô hoạt một số phân tử enzyme

– Chúng tôi thấy rằng, tỷ lệ thích hợp để kết tủa enzyme: Venzyme:Vdung môi nằm trongkhoảng từ 30:70 đến 10:90 Khi đó, hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của chế phẩmdao động trong khoảng 81-97% và 5.77-6.43 lần

– Từ kết quả trên, chúng tôi chọn tỷ lệ Venzyme:Vdung môi = 20:80 là tỷ lệ thích hợp để kếttủa enzyme với tác nhân ethanol là 20:80 (v/v) Khi đó hiệu suất thu hồi hoạt tínhvà độ tinh sạch của chế phẩm cùng đạt giá trị cực đại (97.0% và 6.43 lần) Hoạttính riêng của chế phẩm đạt 16.924 U/mg protein

Theo nghiên cứu của Manachini P.L và cộng sự (1988), khi tinh sạch endo-PGase từ

Rhizopus stolonifer, hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của chế phẩm sau khi kết tủa với

ethanol theo tỷ lệ 1:2 đạt được lần lượt là 77% và 9.2 lần Khi so sánh với kết quả của

chúng tôi, nhận thấy rằng, thể tích ethanol dùng để tinh sạch endo-PGase từ Asp awamori trong nghiên cứu này cao hơn Dù hiệu suất thu hồi enzyme của chúng tôi đạt giá

trị cao hơn (97.0% và 77%) nhưng độ tinh sạch của chế phẩm thu được thấp hơn 1.43 lần

Vì thế, chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát thêm một vài tác nhân kết tủa khác để lựa chọntác nhân kết tủa enzyme tốt nhất

4.1.1.2 Kết tủa endo-PGase bởi iso-propanol

Kết quả thí nghiệm: Tiến hành kết tủa dịch enzyme thô bằng isopropanol theo trình tự

đã trình bày trong phần 3.2.2.1 Kết quả được trình bày trong bảng 4.2 và hình 4.3

Trang 4

Bảng 4.2 Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng iso-propanol

Tỷ lệ

(mg/mL)

(U/mL)

Trang 5

– So với ethanol, isopropanol có phân tử lượng và chiều dài mạch carbon lớn hơn.Nhờ đó, tính kỵ nước của isopropanol cũng cao hơn Điều này làm cho nó có khảnăng làm kết tủa một lượng protein nhiều hơn so với ethanol khi sử dụng với cùngmột hàm lượng như nhau Thật vậy, hàm lượng protein thu được tăng dần từ 0.015

đến 0.118mg/mL khi thay đổi tỷ lệ Venzyme:Vdung môi từ 40:60 đến 10:90 Hiệu suất thuhồi của chế phẩm pectinase bởi isopropanol cũng cao hơn khi so sánh với tác nhânkết tủa là ethanol

– Khi tỷ lệ Venzyme:Vdung môi là 20:80, hoạt tính endo-PGase gần như được thu hồi hoàntoàn (99.6%) Tuy nhiên, độ tinh sạch của chế phẩm thu được không cao (4.9 lần).Có lẽ do ở nồng độ dung môi này, ngoài protein-enzyme, các protein tạp kháctrong dung dịch cũng có khuynh hướng bị kết tủa theo làm giảm hoạt tính riêng củachế phẩm Ngoài ra, tương tự như ethanol, khi nồng độ isopropanol quá cao, khảnăng gây biến tính bất thuận nghịch protein của isopropanol cũng xảy ra và làmgiảm hiệu suất thu hồi enzyme và hoạt tính riêng của chế phẩm

– Dựa trên khả năng tinh sạch chế phẩm và chi phí dung môi, chúng tôi quyết địnhchọn tỷ lệ Venzyme:Vdung môi = 40:60 để tinh sạch endo-PGase Ở tỷ lệ này, độ tinhsạch của chế phẩm là cao nhất (8.43 lần) và hiệu suất thu hồi hoạt tính chế phẩmlà 88.95%

4.1.1.3 Kết tủa endo-PGase bởi acetone

Kết quả thí nghiệm: Tiến hành kết tủa dịch enzyme thô với tác nhân là acetone theo

trình tự đã trình bày trong phần 3.2.2.1 Kết quả được trình bày trong bảng 4.3 và hình 4.4:

Bảng 4.3 Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng acetone

Tỷ lệ

(mg/mL)

(U/mL)

Trang 6

– Kết quả trình bày trong bảng 4.3 cho thấy, endo-PGase kết tủa rấtù tốt với acetone.Hàm lượng protein và hiệu suất thu hồi được cũng tương đối cao Theo quy luật,hiệu suất thu hồi hoạt tính endo-PGase tăng lên khi tăng lượng acetone sử dụng (tỷlệ Venzyme:Vdung môi thay đổi từ 40:60 đến 20:80 Ở tỷ lệ Venzyme:Vdung môi = 10:90, hàmlượng protein kết tủa tăng cao nhất nhưng hiệu suất thu hồi giảm do acetone gâybiến tính bất thuận nghịch một số phân tử enzyme Tác động này cũng xảy ratương tự với trường hợp kết tủa bằng ethanol và isopropanol.

– Tỷ lệ Venzyme:Vdung môi thích hợp để hiệu suất thu hồi endo-PGase cao nhất là 20:80.Trong khi đó, độ tinh sạch của chế phẩm đạt được cao nhất khi Venzyme:Vdung môi là30:70

– Từ những nhận xét trên, chúng tôi có kết luận sơ bộ như sau: So với 2 tác nhânethanol và isopropanol, acetone tỏ ra kém hiệu quả hơn trong quá trình tinh sạchendo-PGase Độ tinh sạch cao nhất đạt được trong trường hợp kết tủa với tác nhân

Trang 7

này (tỷ lệ Venzyme:Vdung môi = 30:70) chỉ bằng 0.64 và 0.55 lần so với trường hợp kếttủa bằng ethanol và isopropanol và hiệu suất thu hồi tương ứng cũng thấp hơn 1.18và 1.08 lần.

4.1.2 Kết tủa pectinase bởi polymer hữu cơ

4.1.2.1 Kết tủa endo-PGase bởi PEG-6000

Kết quả thí nghiệm: Tiến hành kết tủa dịch enzyme thô với tác nhân là polyethylene

glycol (PEG 6000) theo trình tự đã trình bày trong phần 3.2.2.2 Kết quả thí nghiệm đượctrình bày trong bảng 4.4 và hình 4.5:

Bảng 4.4 Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng PEG-6000

Nồng độ

tác nhân

Nồng độ protein (mg/mL)

Hoạt tính endo-PGase (U/mL)

Trang 8

Nhận xét:

– PEG là dung môi có tính háo nước lớn Khi bổ sung vào dung dịch chứa protein,chúng có thể tương tác với lớp vỏ hydrate bao quanh phân tử protein và làm giảmkhả năng hòa tan của protein Nhờ đó, các phân tử protein và enzyme sẽ kết tủavà tách ra khỏi hỗn hợp

– Tuy nhiên, nhược điểm PEG là làm tăng độ nhớt dịch enzyme, gây khó khăn choviệc tách kết tủa ra khỏi dung dịch Nếu sử dụng phương pháp lọc để phân riêng,thời gian lọc sẽ kéo dài, còn nếu sử dụng phương pháp ly tâm thì phải tác động lêndung dịch một lực ly tâm rất lớn Điều này rất khó thực hiện khi triển khai ở quy môsản xuất lớn Nếu lực ly tâm nhỏ thì có thể không thu hồi hết được lượng kết tủa

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng thiết bị ly tâm có bán kính quay là 0.3m và tốc độ quay là 5500vòng/phút, tương đương với gia tốc ly tâm làø 10000g (m/s 2 )

nhưng hiệu suất thu hồi pectinase chỉ dao động trong khoảng từ 4.8% đến 8.7%.– Nhận xét về khả năng tinh sạch của chế phẩm, chúng tôi thấy rằng, độ tinh sạchcủa chế phẩm tăng chỉ dao động từ 1.16 đến 1.57 lần

– Như vậy, theo đánh giá chung, hiệu quả sử dụng PEG để tinh sạch endo-PGase làkhông cao

4.1.2.2 Kết tủa endo-PGase bởi PG-4000

Kết quả thí nghiệm: Tiến hành kết tủa dịch enzyme thô với tác nhân là polyethylene

glycol (PEG 4000) theo trình tự đã trình bày trong phần 3.2.2.2 Kết quả thu được trình bàytrong bảng 4.5 và hình 4.6:

Bảng 4.5 Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng PEG-4000

Nồng độ

tác nhân

(mg/mL)

Hoạt tính endo-PGase*

(U/mL)

Trang 9

– Từ các kết quả thu được, chúng tôi đánh giá phương án tinh sạch endo-PGase bởi

2 loại polymer trên là không khả thi

4.1.3 Kết tủa pectinase bởi các loại muối

4.1.3.1 Kết tủa endo-PGase bởi Sodium chloride (NaCl)

Kết quả thí nghiệm: Tiến hành kết tủa dịch enzyme thô với tác nhân là muối sodium

chloride theo trình tự đã trình bày trong phần 3.2.2.1 Chúng tôi thu được kết quả như sau(xem bảng 4.6 và hình 4.7):

Trang 10

Bảng 4.6 Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng sodium chloride

Nồng độ

NaCl, % (w/v)

(mg/mL)

Hoạt tính endo-PGase*

(U/mL)

Trang 11

– Từ kết quả thí nghiệm, chúng tôi chọn ra nồng độ sodium chloride thích hợp để kếttủa endo-PGase là 35%.

– Tuy nhiên, nếu so sánh với kết quả thu được với phương pháp kết tủa bằng tácnhân dung môi hữu cơ thì hiệu suất thu hồi hoạt tính pectinase đạt được trong thínghiệm này vẫn thấp hơn nhiều

4.1.3.2 Kết tủa endo-PGase bởi ammonium sulphate (NH 4 ) 2 SO 4

Kết quả thí nghiệm: Tiếp theo, chúng tôi tiến hành kết tủa dịch enzyme thô với tác

nhân là muối ammonium sulphate Ammonium sulphate được bổ sung vào dung dịchenzyme ở dạng tinh thể và hòa tan đến độ bão hòa cần thiết (xem bảng 4.7) Kết quả thínghiệm thu được như sau:

Bảng 4.7 Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng ammonium sulphate

Độ bão hòa của

(NH 4 ) 2 SO 4 , %

Nồng độ protein (mg/mL)

Hoạt tính endo-PGase (U/mL)

Nhận xét:

– Kết quả thí nghiệm cho thấy, hiệu suất thu hồi hoạt tính endo-PGase tăng dần từ16.67% ở độ bão hòa 40% đến 85.68% ở độ bão hòa tuyệt đối Điều này cho thấyđược ưu điểm của ammonium sulphate so với các tác nhân kết tủa khác

– Lượng protein trong dung dịch enzyme kết tủa càng nhiều khi tăng nồng độammonium sulphate sử dụng cũng có nghĩa là hàm lượng các loại protein tạp trongkết tủa cũng tăng theo Từ đó, độ tinh sạch của chế phẩm cũng giảm Thật vậy, độtinh sạch của chế phẩm tăng dần từ 2.01 đến 5.26 lần khi độ bão hòa tăng từ 40%đến 80% Sau đó, độ tinh sạch giảm nhẹ xuống còn 4.87 khi ammonium sulphateđạt đến độ bão hòa 100%

Trang 12

– Từ kết quả thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy, ở độ bão hòa của ammonium sulphatethích hợp để tinh sạch endo-PGase là 70% Khi đó, hiệu suất thu hồi pectinase là78.17% và độ tinh sạch của chế phẩm đạt giá trị cao nhất là 5.26 lần.

trường bề sâu A awamori cũng tương tự như kết quả thực nghiệm của các tác giả

đi trước khi khảo sát trên các đối tượng vi sinh vật khác [14, 35, 42, 62]

4.1.4 Kết luận chung

Để thuận tiện cho đánh giá hiệu quả tinh sạch bằng phương pháp kết tủa, các kết quảthí nghiệm với các loại tác nhân khác nhau được chúng tôi tóm tắt trong bảng 4.8:

Trang 13

Bảng 4.8 Tổng kết quá trình tinh sạch endo-PGase bằng phương pháp kết tủa

Dung môi hữu cơ

Acetone 60% (v/v)

PEG-4000 20% (w/w)

PEG-6000 25% w/w

(NH4)2SO4 70% độ bão hoà

Hình 4.9 So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của chế phẩm pectinase sau tinh

sạch bằng phương pháp kết tủa với các tác nhân khác nhau

Trang 14

Từ kết quả khảo sát hiệu quả tinh sạch của các tác nhân kết tủa khác nhau, chúng tôi

đi đến những kết luận như sau:

– Nhìn chung, các dung môi hữu cơ cho hiệu suất thu hồi enzyme tốt hơn so với muốivà polymer hữu cơ Trong tất cả các tác nhân kết tủa, ethanol là tác nhân cho hiệusuất thu hồi cao nhất (97.02%) Các tác nhân khác như isopropanol, acetone và(NH4)2SO4 cho hiệu suất thu hồi khá cao (từ 70.74 đến 88.95%) PEG 4000 và

6000 cho hiệu suất thu hồi rất thấp

– Xét về khả năng tinh sạch, isopropanol là tác nhân cho độ tinh sạch cao nhất (8.43lần) Ethanol và ammonium sulphate cũng cho độ sạch khá cao (6.43 và 5.26 lần).Thấp nhất là PEG với độ tinh sạch xấp xỉ 1.5 lần so với enzyme thô

– Dựa trên cơ sở hiệu suất thu hồi hoạt tính và độ tinh sạch của chế phẩm, chúng tôiquyết định chọn 3 loại tác nhân là isopropanol, ethanol và ammonium sulphate đểkết tủa enzyme, sau đó tách kết tủa và tái hòa tan để thực hiện bước tinh sạch tiếptheo bằng phương pháp sắc ký lọc gel

Trang 15

4.2 KHẢO SÁT HIỆU QUẢ TINH SẠCH ENDO-PGase BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL

4.2.1 Kết quả lọc gel đối với enzyme đã qua kết tủa với isopropanol

Theo kết quả nghiên cứu ở phần 4.1, hiệu suất thu hồi enzyme khi kết tủa vớiisopropanol theo tỉ lệ 4:6 (v/v) là 88.95% và độ tinh sạch tăng lên tương ứng là 8.43 lần.Trên cơ sở đó, ở bước thí nghiệm này, chúng tôi khảo sát tiếp quá trình tinh sạch endo-PGase bằng sắc ký lọc gel (sử dụng Sephadex G-75) với mẫu enzyme kết tủa đã trìnhbày ở trên

Dịch enzyme thô (dịch nuôi cấy nấm sợi đã qua ly tâm và lọc để tách bỏ sinh khối và

tạp chất) có hàm lượng protein là 0.532mg/mL và hoạt tính endo-PGase tương ứng là 1.275U/mL được kết tủa với isopropanol theo tỷ lệ Venzyme:Vdung môi = 4:6 Phần kết tủa sau ly

tâm ở 5500 vòng/phút được hòa tan trở lại với một thể tích xác định dung dịch đệm acetate 0.05N sao cho hàm lượng protein nằm trong khoảng 1-10mg/mL Trong thí nghiệm này,

chúng tôi sử dụng thể tích dung dịch đệm bằng 1/20 so với thể tích dịch enzyme ban đầu.Enzyme sau kết tủa với isopropanol có độ tinh sạch là 8.6 lần và hiệu suất thu hồi đạtđược là 88.5%

0.00.51.01.52.02.53.0

Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn độ hấp thu ( = 280nm) và hoạt tính endo-PGase của các

phân đoạn trong quá trình lọc gel (Mẫu enzyme đã qua kết tủa với isopropanoltheo tỉ lệ Venzyme:Visopropanol là 4:6)

I

II

III

Trang 16

Quá trình triển khai sắc ký được tiến hành theo trình tự đã trình bày trong phần 3.2.3.3.Kết quả đo độ hấp thu OD280 và hoạt tính enzyme của các phân đoạn được biểu diễntrên hình 4.10.

Từ đồ thị biễu diễn tương quan giữa giá trị OD280nm và thứ tự các phân đoạn, chúng tôighi nhận được 2 peak lớn (I và III) có chỉ số OD cao và 1 peak nhỏ (II) Như vậy, theo dựđoán sơ bộ, hỗn hợp enzyme qua lọc gel gồm 3 loại protein có khối lượng phân tử khácnhau Sau khi quá trình lọc gel kết thúc, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính và hàmlượng protein của các phân đoạn và thu được kết quả như sau (xem bảng 4.9 và hình4.10)

Bảng 4.9 Hoạt độ và hoạt tính riêng của một số phân đoạn đo được sau khi lọc gel (Mẫudịch enzyme đã qua kết tủa bằng isopropanol theo tỷ lệ Venzyme:Visppropanol = 4:6)

Phân đoạn Hoạt độ tổng

(U)

Lượng protein (mg)

Mẫu trước khi lọc gel 67.61 3.295 20.51

Nhận xét: Kết quả đo hàm lượng protein và hoạt tính endo-PGase cho thấy:

– So với trước khi tiến hành sắc ký, tổng số đơn vị hoạt độ cũng như lượng protein

trong chế phẩm thu được giảm đi từ 67.61U và 3.295mg xuống còn 47.739U và 1.705mg tương ứng Điều này có thể giải thích là do sự tổn thất và biến tính bất

thuận nghịch của một số phân tử protein chế phẩm trong suốt quá trình sắc ký (dùquá trình tinh sạch luôn được thực hiện ở nhiệt độ 18oC) Như vậy, từ 60mL dịchenzyme thô ban đầu, tổng hiệu suất thu hồi enzyme sau lọc gel đạt được là 62.55%và độ tinh sạch chung tăng lên 11.74 lần

Tiêu đề	Luận Văn Nghiên Cứu Tính Sạch Pectinase Từ Canh Trường Nuôi Cấy Aspergillus Awamori - Chương 4
Trường học	Trường Đại Học
Thể loại	Luận Văn Tốt Nghiệp

Định dạng
Số trang	32
Dung lượng	1,09 MB