Luận văn nghiên cứ tính sạch pectinase từ canh trường nuôi cây bẻ sau Asperrgillus awamori - chương 3

Luận văn nghiên cứ tính sạch pectinase từ canh trường nuôi cây bẻ sau Asperrgillus awamori - chương 3.

CHƯƠNG 3

Nguyên liệu và phương

pháp

3.1 NGUYÊN LIỆU

3.1.1 Vi sinh vật

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chủng Aspergillus awamori L1 được cung cấp

từ Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh

Chủng nấm sợi được bảo quản trên môi trường thạch nghiêng, theo phương pháp cấy chuyền định kỳ Môi trường giữ giống được được sử dụng là môi trường Czapek (Xem phụ lục A) [16] Điều kiện bảo quản là 30oC Thời gian giữa 2 lần cấy chuyền liên tiếp là 3 tháng

3.1.2 Môi trường nuôi cấy

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bột vỏ bưởi khô như nguồn carbon cho nấm sợi sinh trưởng và tổng hợp pectinase Bột vỏ bưởi khô được thu nhận bằng cách sấy khô vỏ quả bưởi (Năm Roi, Tiền Giang) và nghiền thành bột có độ ẩm 7%

Môi trường cơ bản nuôi cấy nấm mốc Aspergillus awamori L1 sinh tổng hợp pectinase

như sau (g/lít môi trường): hàm lượng pectin trong bột vỏ bưởi khô: 0.788; NH4NO3: 0.402;

KH2PO4: 4.0; Na2HPO4, FeSO4.7H2O: 0.2; CaCl2, H3BO3: 0.01; MnSO4.7H2O: 0.07 Sau quá trình tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, pH môi trường được điều chỉnh đến 5.0 [4, 8,12, 52]

3.1.3 Hóa chất

– Pectin chuẩn (Sigma, St Louis, US): dùng để xác định hoạt tính endo-polygalacturonase

– Sephadex G-75 (Pharmacia, Uppsala, Sweden): dùng để tinh sạch enzyme.

– Chế phẩm Pectinex Ultra SPL (Novodisk, Denmark)

– Hóa chất phân tích các loại

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Giai đoạn 1

Khảo sát quá trình tinh sạch pectinase bằng phương pháp kết tủa với các tác nhân sau:

- Dung môi hữu cơ: ethanol, isopropanol, acetone

- Polymer hữu cơ: PEG 4000, PEG 6000

- Muối vô cơ: (NH 4 ) 2 SO 4 , NaCl Chọn loại tác nhân cho hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch pectinase cao để tiếp tục tinh sạch bằng lọc gel

Giai đoạn 2

Khảo sát tiếp hiệu quả tinh sạch pectinase bằng phương pháp sắc ký lọc gel trên cột Sephadex G-75

Giai đoạn 3

Xác định một số tính chất đặc trưng của chế phẩm thu được:

- Hệ số Km và Vmax

- Nhiệt độ và pH tối thích

- Độ bền nhiệt và pH của chế phẩm

So sánh tính chất của chế phẩm thu được với chế phẩm thương mại

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu

3.2.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu

3.2.2.1 Giai đoạn 1: Tinh sạch enzyme bằng phương pháp kết tủa

Trong giai đoạn đầu, chúng tôi tiến hành thu nhận enzyme pectinase từ nấm sợi Aspergillus theo phương pháp nuôi cấy bề sâu Quá trình nuôi cấy nấm sợi để thu nhận enzyme được thực hiện trong bình lên men (Bio-stat) chứa 2,5 lít môi trường Điều kiện nuôi cấy được tóm tắt như sau: [4, 6]

– Tỉ lệ cấy giống : 34 mg chất khô bào tử/L môi trường

– Nhiệt độ (điều chỉnh) : 36oC

Khi quá trình nuôi cấy kết thúc, canh trường được đem ly tâm và lọc để tách bỏ pha rắn và thu nhận dịch enzyme thô Chúng tôi tiếp tục tinh sạch chế phẩm enzyme thô bằng phương pháp kết tủa với các tác nhân sau đây:

1- Dung môi hữu cơ: ethanol, isopropanol, aceton

Nội dung:

– Khảo sát hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme thu được khi kết tủa với các dung môi kể trên theo tỷ lệ thể tích Venzyme:Vdung môi lần lượt là 10:90; 20:80; 30:70; 40:60; 50:50; 60:40

– Chọn dung môi và tỉ lệ thích hợp để hiệu suất thu hồi enzyme và độ tinh sạch của chế phẩm pectinase là cao nhất

Thực hiện:

– Chuẩn bị dung dịch enzyme thô và các dung môi: ethanol, isopropanol, acetone – Hút dung dịch enzyme (4oC) cần kết tủa, cho vào ống nghiệm và bổ sung dung môi (-18oC) với tỉ lệ như đã dự kiến Để quá trình kết tủa enzyme hoàn toàn cần để yên dung dịch sau khi tủa khoảng 30 phút ở 2 – 4oC

– Sau quá trình kết tủa, tiến hành ly tâm lạnh (4oC) hỗn hợp ở 5500vòng/phút trong

15 phút Sau ly tâm, đổ bỏ phần dịch lỏng phía trên và hòa tan kết tủa vào dung dịch đệm sodium acetate pH 4.5

– Xác định hoạt tính chế phẩm và hàm lượng protein thu được

– Tất cả các nghiệm thức được thực hiện lặp lại 3 lần

2- Các polymer hữu cơ: PEG 6000 và PEG 4000

Nội dung:

– Khảo sát hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme thu được khi kết tủa với polyethylene glycol (PEG-4000 và PEG-6000) ở các nồng độ khác nhau: 5%, 10%, 15%, 20%, 25%

– Chọn loại PEG và tỉ lệ thích hợp để hiệu suất thu hồi enzyme và độ tinh sạch của chế phẩm pectinase là cao nhất

Thực hiện:

– Chuẩn bị dung dịch enzyme thô và các polymer hữu cơ (PEG-4000 và PEG-6000) – Hút 10 mL dung dịch enzyme (4oC) cần kết tủa, cho vào ống nghiệm và bổ sung tác nhân kết tủa ở dạng rắn theo tỉ lệ như đã dự kiến Để quá trình kết tủa enzyme xảy ra hoàn toàn, cần để yên dung dịch sau khi tủa khoảng 30 phút ở 2 – 4oC

– Sau quá trình kết tủa, tiến hành ly tâm lạnh (4oC) hỗn hợp ở 5500vòng/phút trong

15 phút Sau ly tâm, đổ bỏ phần dịch lỏng phía trên và hòa tan kết tủa vào dung dịch đệm sodium acetate pH 4.5

– Xác định hoạt tính chế phẩm và hàm lượng protein thu được

– Tất cả các nghiệm thức được thực hiện lặp lại 3 lần

3- Muối vô cơ: ammonium sulphate và sodium chloride

Nội dung:

– Khảo sát hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme thu được khi kết tủa với các muối vô cơ sau:

o Ammonium sulphate: ở các nồng độ 76.1%, 65.7%, 56.1%, 47.2%, 39%, 31.4% và 25.1% w/v (độ bão hòa tương ứng là 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%)

o Sodium Chloride: ở những nồng độ 35%, 30%, 25%, 20%, 15% (w/v)

– Chọn loại tác nhân thích hợp sao cho hiệu suất thu hồi enzyme và độ tinh sạch của chế phẩm pectinase là cao nhất

Thực hiện:

– Chuẩn bị dung dịch enzyme thô và muối

– Hút 10 mL dung dịch enzyme (4oC) cần kết tủa, cho vào ống nghiệm và bổ sung muối ở dạng tinh thể với hàm lượng như đã dự kiến Khuấy nhẹ để muối hòa tan hoàn toàn trong dung dịch Để quá trình kết tủa enzyme hoàn toàn cần để yên dung dịch sau khi tủa khoảng 30 phút ở 2 – 4oC

– Sau quá trình kết tủa, tiến hành ly tâm lạnh (4oC) hỗn hợp ở 5500vòng/phút trong

15 phút Sau ly tâm, đổ bỏ phần dịch lỏng phía trên và hòa tan kết tủa vào dung dịch đệm sodium acetate pH 4.5

– Xác định hoạt tính chế phẩm và hàm lượng protein thu được

– Tất cả các nghiệm thức được thực hiện lặp lại 3 lần

3.2.2.2 Giai đoạn 2: Tinh sạch endo-PGase bằng phương pháp lọc gel

Nội dung:

Khảo sát hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel (Sephadex G-75), sử dụng chế phẩm pectinase thu được sau giai đoạn tinh sạch bằng phương pháp kết tủa Từ đó, đề xuất quy trình tinh sạch chế phẩm pectinase, sử dụng kết

Thực hiện:

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cột sắc ký có  =2 cm và l=50 cm Cột được nhồi bằng gel sephadex G-75 Phương pháp chuẩn bị cột và phân tích được trình bày trong phần phụ lục C Khi cột gel đã sẵn sàng, chúng tôi triển khai quá trình lọc gel theo từng bước sau đây:

– Bước 1: Kết tủa dịch enzyme thô bằng các tác nhân như ethanol, isopropanol, ammonium sulphate Điều kiện thí nghiệm tương tự như đã trình bày trong phần 3.2.2.1 Sau khi kết tủa enzyme xong, hòa tan kết tủa vào một lượng thể tích nhất định dung dịch đệm acetate 0.05N sao cho nồng độ enzyme dao động trong

khoảng 1-10mg/mL.

– Bước 2: Hút một lượng thể tích enzyme nhất định sau tinh sạch ở bước 1, cho vào cột và triển khai quá trình sắc ký qua cột gel Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần ứng với mỗi loại tác nhân kết tủa để so sánh hiệu quả tinh sạch

Trình tự thực hiện phương pháp sắc ký lọc gel được trình bày trong phụ lục C

3.2.2.3 Giai đoạn 3: Xác định một số tính chất của chế phẩm sau tinh sạch

3.2.2.3.1 Xác định pH tối thích và nhiệt độ tối thích của chế phẩm

Nhiệt độ tối thích của chế phẩm

Tiến hành xác định hoạt tính của chế phẩm ở nhiều giá trị nhiệt độ khác nhau (30, 35,

40, 45, 50, 55, 60, 65, 70oC) tại pH 4.5 Nhiệt độ tối thích của chế phẩm được định nghĩa là nhiệt độ mà tại đó hoạt tính chế phẩm là cao nhất

pH tối thích của chế phẩm

Tiến hành xác định hoạt tính của chế phẩm ở những giá trị pH của dung dịch phản ứng khác nhau: 3.0; 3.5; 4.0; 4.5; 5.0; 5.5; 6.0; 6.5; 7.0 Phản ứng được thực hiện tại nhiệt độ tối thích của chế phẩm

3.2.2.3.2 Khảo sát độ bền nhiệt và pH của chế phẩm

Độ bền nhiệt của chế phẩm

Giữ chế phẩm ở nhiều giá trị nhiệt độ khác nhau từ 40 đến 70oC tại pH 4.5 Sau những khoảng thời gian xác định, tiến hành đo hoạt tính hoạt tính enzyme thu được Khảo sát độ bền nhiệt của chế phẩm trong 4 giờ

Độ bền pH của chế phẩm

Giữ dung dịch chế phẩm ở trong các dung dịch đệm có pH khác nhau từ 4.0 đến 7.0 tại nhiệt độ phòng và nhiệt độ tối thích của chế phẩm Sau những khoảng thời gian xác định, đo hoạt tính của chế phẩm

3.2.2.3.3 Các thông số động học của endo-polygalacturonase

Mục đích:

So sánh khả năng xúc tác của các chế phẩm pectinase thông qua 2 thông số động học quan trọng là Km và Vmax

Nội dung: xác định Km và Vmax theo phương pháp Lineweaver & Burk

Thực hiện:

– Chọn các nồng độ cơ chất ([S]pectin) khác nhau: 0.56.0g/L.

– Thể tích dung dịch cơ chất pectin là 15mL dung dịch pectin Cơ chất được pha trong đệm acetate 0.1N (pH 4.5) Hút 0.5mL chế phẩm pectinase sau quá trình tinh sạch

bằng phương pháp lọc gel và cho vào hỗn hợp Phản ứng được tiến hành ở 55oC và được khuấy liên tục trong suốt thời gian phản ứng Sau những thời điểm khác

nhau (t = 0, 1, 2, 4, 6 phút) lấy mẫu một lần để xác định độ nhớt của dịch thủy

phân Mẫu trước khi tiến hành phân tích phải được vô hoạt ở 100oC trong 5 phút – Ứng với mỗi nồng độ cơ chất, xác định vận tốc ban đầu của phản ứng thuỷ phân Trong nghiên cứu này, chúng tôi định nghĩa vận tốc phản ứng là độ giảm độ nhớt tương đối (tính bằng % so với độ nhớt ban đầu) của dịch thuỷ phân theo thời gian (t) Từ đó, xây dựng đường cong = f(t) biểu diễn tương quan giữa độ nhớt dịch thuỷ phân theo thời gian Vận tốc ban đầu của phản ứng được xác định bởi công

thức: o

0

d V

dt t





o max max

K



    Từ đó, xác định được Km và

Vmax

Tung độ gố ù c Hoà nh độ gố c

Hệ số gó c

1

[S]

Hình 3.2 Đồ thị xác định Km và Vmax theo phương pháp Lineweaver & Burk

3.2.3 Các phương pháp phân tích

3.2.3.1 Xác định hoạt tính endo-polygalacturonase

Endo-polygalacturonase tác dụng phân cắt mạch pectin, làm giảm độ nhớt của dung dịch pectin Dùng nhớt kế, ta sẽ đo được mức độ giảm độ nhớt của dịch pectin và nhờ đó, có thể xác định gián tiếp hoạt tính endo-polygalacturonase

Trong nghiên cứu này, một đơn vị hoạt độ (U) của endo-polygalacturonase được định nghĩa là lượng enzyme cần để thủy phân làm giảm 50% độ nhớt của dịch pectin có nồng độ 1% (w/v) sau thời gian 30 phút ở 45oC

Trình tự tiến hành được trình bày chi tiết ở phụ lục B.1

3.2.3.2 Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry

Nguyên tắc của phương pháp dựa trên phản ứng tạo màu giữa gốc Tyrosine và Tryptophan (2 thành phần acid amin thường gặp trong protein) của phân tử protein với thuốc thử Folin Cường độ màu của hợp chất tạo thành sau phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong 1 phạm vi nhất định Dựa vào phương trình đường chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu thí nghiệm Hợp chất tạo thành có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 750nm

Trình tự tiến hành được trình bày chi tiết ở phụ lục B.2

3.2.4 Các công thức tính toán

3.2.4.1 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp kết tủa

– Hoạt tính riêng của chế phẩm (Hei, U/mg protein):

ei Tổng số đơn vị hoạt độ của enzyme có trong mẫu (U) HTR =

Tổng hàm lượng protein có trong mẫu (mg) Trong đó: Hei: Hoạt tính enzyme thô (i=0) hoặc sau quá trình kết tủa (i=1) (U/mL);

– Hiệu suất thu hồi enzyme sau quá trình kết tủa (HSTHe1):

.100%

e1 Tổng số đơn vị hoạt độ của chế phẩm sau kết tủa (U) HSTH (%) =

Tổng số đơn vị hoạt độ của chế phẩm trước kết tủa (U)

– Độ tinh sạch của chế phẩm sau kết tủa (ĐTSe1, lần)

e1 Hoạt độ riêng của chế phẩm sau kết tủa (U/mg protein) ĐTS =

Hoạt độ riêng của chế phẩm trước kết tủa (U/mg protein)

3.2.4.2 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel

– Tổng hàm lượng protein (C, mg/mL) của dung dịch enzyme sau khi qua lọc gel được

tính như sau:

i i Protein

1 enzyme

CV C

V

n

i 

Trong đó: Cprotein: tổng hàm lượng protein của dung dịch sau khi qua lọc gel (mg/mL);

Ci: nồng độ protein của mỗi phân đoạn hoặc peak (mg/mL);

Vi: thể tích của mỗi phân đoạn hoặc peak (mL);

Venzyme: thể tích dịch enzyme thí nghiệm (mL)

– Tổng hoạt tính enzyme He2 (U/mL) sau khi qua lọc gel được tính như sau:

i i e2

1 enzyme

HV H

V

n

i 

Trong đó: He2: tổng hoạt tính dịch enzyme sau khi qua lọc gel (U/mL);

Hi: Hoạt tính enzyme ở mỗi phân đoạn hoặc peak (U/mL);

Vi: thể tích của mỗi phân đoạn hoặc peak (mL);

Venzyme: thể tích dịch enzyme qua lọc gel (mL)

– Hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme sau lọc gel so với enzyme thô (%H):

2 e0

H

He



Trong đó: He2 và Heo: hoạt tính enzyme sau lọc gel và enzyme thô, U/mL

– Hoạt tính riêng của dung dịch enzyme sau lọc gel (HTRe2, U/mg protein):

e2 e2

protein

H HTR

C



– Độ tinh sạch enzyme sau khi qua lọc gel (ĐTS, lần):

e2 eo

HTR ĐTS

HTR



Trong đó: HTRe2 và HTReo: hoạt tính riêng của enzyme sau quá trình lọc gel và

enzyme thô, U/mg protein